药学学报

Cell line	c-KIT RNA expression (RNA-seq TPM)	c-KIT protein expression (IHC score)	IC₅₀/μmol·L^-1
GIST-882	125.5	High	0.37 ± 0.06	2.17 ± 0.91
MKN45	0.5	None	5.14 ± 0.29	8.56 ± 1.31
A549	0	None	9.44 ± 1.45	15.31 ± 0.52
HepG2	1.2	Low	6.82 ± 0.27	8.43 ± 1.06
H1975	0	None	11.97 ± 0.18	12.21 ± 1.31
HEK-293T			8.59 ± 0.87	6.70 ± 0.67

Cell line

c-KIT RNA expression
(RNA-seq TPM)

c-KIT protein expression
(IHC score)

IC₅₀/μmol·L^-1

PN17-1

Imatinib

GIST-882

125.5

High

0.37 ± 0.06

2.17 ± 0.91

MKN45

0.5

None

5.14 ± 0.29

8.56 ± 1.31

A549

None

9.44 ± 1.45

15.31 ± 0.52

HepG2

1.2

Low

6.82 ± 0.27

8.43 ± 1.06

H1975

None

11.97 ± 0.18

12.21 ± 1.31

HEK-293T

8.59 ± 0.87

6.70 ± 0.67

Cell line	c-KIT RNA expression (RNA-seq TPM)	c-KIT protein expression (IHC score)	IC₅₀/μmol·L^-1
GIST-882	125.5	High	0.37 ± 0.06	2.17 ± 0.91
MKN45	0.5	None	5.14 ± 0.29	8.56 ± 1.31
A549	0	None	9.44 ± 1.45	15.31 ± 0.52
HepG2	1.2	Low	6.82 ± 0.27	8.43 ± 1.06
H1975	0	None	11.97 ± 0.18	12.21 ± 1.31
HEK-293T			8.59 ± 0.87	6.70 ± 0.67

Cell line

c-KIT RNA expression
(RNA-seq TPM)

c-KIT protein expression
(IHC score)

IC₅₀/μmol·L^-1

PN17-1

Imatinib

GIST-882

125.5

High

0.37 ± 0.06

2.17 ± 0.91

MKN45

0.5

None

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8.56 ± 1.31

A549

None

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15.31 ± 0.52

HepG2

1.2

Low

6.82 ± 0.27

8.43 ± 1.06

H1975

None

11.97 ± 0.18

12.21 ± 1.31

HEK-293T

8.59 ± 0.87

6.70 ± 0.67

Compd.	M_W	nHA	nHD	TPSA	logP	GASA	Lipinski rule
PN17-1	504.64	7.0	2.0	77.15	4.28	0.0	0.0
Imatinib	493.26	8.0	2.0	86.28	2.59	0.0	0.0

Compd.

M_W

nHA

nHD

TPSA

logP

GASA

Lipinski rule

PN17-1

504.64

7.0

2.0

77.15

4.28

0.0

Imatinib

493.26

8.0

2.0

86.28

2.59

0.0

Compd.	M_W	nHA	nHD	TPSA	logP	GASA	Lipinski rule
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Compd.

M_W

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GASA

Lipinski rule

PN17-1

504.64

7.0

2.0

77.15

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0.0

Imatinib

493.26

8.0

2.0

86.28

2.59

0.0

Compd.	PAMPA	P-gp inhibitor	HIA	F_30%	BBB	OATP1B1 inhibitor	OATP1B3 inhibitor	MRP1 inhibitor
PN17-1	0.01	Yes	0.0	0.002	0.004	Yes	Yes	Yes
Imatinib	0.0	Yes	0.0	0.002	0.031	No	No	Yes

Compd.

PAMPA

P-gp inhibitor

HIA

F_30%

BBB

OATP1B1 inhibitor

OATP1B3 inhibitor

MRP1 inhibitor

PN17-1

0.01

Yes

0.0

0.002

0.004

Yes

Imatinib

0.0

Yes

0.0

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0.031

Yes

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Compd.

PAMPA

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HIA

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BBB

OATP1B1 inhibitor

OATP1B3 inhibitor

MRP1 inhibitor

PN17-1

0.01

Yes

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Yes

Imatinib

0.0

Yes

0.0

0.002

0.031

Yes

Compd.	CYP1A2 inhibitor	CYP2C19 inhibitor	CYP2C9 inhibitor	CYP2D6 inhibitor	CYP3A4 inhibitor	CYP2B6 inhibitor	HLM stability	CL_plasma	T_1/2
PN17-1	No	No	No	No	No	No	0.18	3.57	1.03
Imatinib	No	No	No	Yes	No	Yes	0.30	2.74	0.91

Compd.

CYP1A2 inhibitor

CYP2C19 inhibitor

CYP2C9 inhibitor

CYP2D6 inhibitor

CYP3A4 inhibitor

CYP2B6 inhibitor

HLM stability

CL_plasma

T_1/2

PN17-1

0.18

3.57

1.03

Imatinib

Yes

0.30

2.74

0.91

Compd.	CYP1A2 inhibitor	CYP2C19 inhibitor	CYP2C9 inhibitor	CYP2D6 inhibitor	CYP3A4 inhibitor	CYP2B6 inhibitor	HLM stability	CL_plasma	T_1/2
PN17-1	No	No	No	No	No	No	0.18	3.57	1.03
Imatinib	No	No	No	Yes	No	Yes	0.30	2.74	0.91

Compd.

CYP1A2 inhibitor

CYP2C19 inhibitor

CYP2C9 inhibitor

CYP2D6 inhibitor

CYP3A4 inhibitor

CYP2B6 inhibitor

HLM stability

CL_plasma

T_1/2

PN17-1

0.18

3.57

1.03

Imatinib

Yes

0.30

2.74

0.91

新型c-KIT抑制剂PN17-1对胃肠道间质瘤GIST-882细胞的体外抗肿瘤作用及机制研究

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沈继伟 ¹^,² , 吴爽 ¹ , 李军 ¹ , 周云鹏 ¹^,² , 陈烨 ¹^,²^,^* , 刘举 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2025,60(2): 379-387

收起

药学学报 | 研究论文 2025, 60(2): 379-387

新型c-KIT抑制剂PN17-1对胃肠道间质瘤GIST-882细胞的体外抗肿瘤作用及机制研究

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沈继伟¹^,², 吴爽¹, 李军¹, 周云鹏¹^,², 陈烨¹^,²^,^*, 刘举¹^,²^,^*

作者信息

1.辽宁大学药学院, 辽宁沈阳 110036

2.辽宁省小分子靶向药物研发工程研究中心, 辽宁沈阳 110036

通讯作者:

^*陈烨, Tel: 13998821581, E-mail: sy-chenye@163.com

刘举, Tel: 13840579525, E-mail: liuju1216@126.com

In vitro anti-tumor effects and mechanisms of a novel c-KIT inhibitor PN17-1 on gastrointestinal stromal tumor GIST-882 cells

Ji-wei SHEN¹^,², Shuang WU¹, Jun LI¹, Yun-peng ZHOU¹^,², Ye CHEN¹^,²^,^*, Ju LIU¹^,²^,^*

Affiliations

1. College of Pharmacy of Liaoning University, Shenyang 110036, China

2. Small Molecular Targeted Drug R&D Engineering Research Center of Liaoning Province, Shenyang 110036, China

出版时间: 2025-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0779

文章导航

摘要

收起

近年来, 胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST) 具有上升的发病率和死亡率, 大多数GIST是由c-KIT基因的激活突变引起的, 因此, c-KIT已成为GIST有前景的治疗靶点。目前, 批准用于治疗GIST的药物包括伊马替尼、舒尼替尼、瑞戈非尼和瑞派替尼等大多易产生耐药性并伴有不同程度的不良反应, 因此迫切需要开发新型c-KIT抑制剂来解决耐药问题。本研究探究了新型c-KIT抑制剂PN17-1在体外对胃肠道间质瘤GIST-882细胞的抗肿瘤作用, 发现PN17-1能够显著抑制GIST-882细胞增殖、克隆形成和迁移能力, 并且能够显著下调GIST-882细胞p-c-KIT及其下游信号蛋白p-AKT、p-STAT5和p-ERK的表达水平。此外, PN17-1还可诱导GIST-882细胞发生凋亡, PN17-1诱导的凋亡可能主要与线粒体依赖的内源性途径有关。综上所述, 新型c-KIT抑制剂PN17-1是一个有潜力的抗胃肠道间质瘤药物, 本研究为今后进一步开发c-KIT抑制剂提供了新的思路。

关键词

胃肠道间质瘤 / c-KIT抑制剂 / GIST-882细胞 / 增殖 / 凋亡

Abstract

收起

In recent years, gastrointestinal stromal tumors (GIST) have increased incidence and mortality, and most GIST is caused by the activation mutation of the c-KIT gene. Therefore, c-KIT has become a promising therapeutic target of GIST. At present, the drugs approved for the treatment of GIST including imatinib, sunitinib, regorafenib and ripretinib, are mostly prone to developing resistance and accompanied by various degrees of adverse reactions. Therefore, there is an urgent need to develop new c-KIT inhibitors to solve the problem of resistance. In this study, we investigated the anti-tumor effect of a novel c-KIT inhibitor PN17-1 on gastrointestinal stromal tumor GIST-882 cells in vitro. We found that PN17-1 significantly inhibited the proliferation, colony formation and migration ability of GIST-882 cells, and significantly downregulated the protein expression levels of p-c-KIT and its downstream signals p-AKT, p-STAT5 and p-ERK in GIST-882 cells. In addition, PN17-1 induced apoptosis in GIST-882 cells, and the apoptosis may be mainly related to the mitochondrial-dependent endogenous pathway. In conclusion, the novel c-KIT inhibitor PN17-1 is a promising anti-GIST drug, and this study provides new ideas for further development of c-KIT inhibitors in the future.

Key words

gastrointestinal stromal tumor / c-KIT inhibitor / GIST-882 cell / proliferation / apoptosis

引用本文

沈继伟, 吴爽, 李军, 周云鹏, 陈烨, 刘举. 新型c-KIT抑制剂PN17-1对胃肠道间质瘤GIST-882细胞的体外抗肿瘤作用及机制研究. 药学学报, 2025 , 60 (2) : 379 -387 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0779

Ji-wei SHEN, Shuang WU, Jun LI, Yun-peng ZHOU, Ye CHEN, Ju LIU. In vitro anti-tumor effects and mechanisms of a novel c-KIT inhibitor PN17-1 on gastrointestinal stromal tumor GIST-882 cells[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2025 , 60 (2) : 379 -387 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0779

正文

收起

胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST) 是胃肠道中最常见的间叶性肿瘤, 从间质Cajal细胞发展而来^[1], 全球患病率约为每百万人中有10~15例^[2], 其高发人群主要是40岁以上的中老年人, 主要的发生部位在胃(55%~60%) 和小肠(30%~35%), 偶发于结肠和食道, 少部分患者的发病在直肠(4%~5%) 和十二指肠(4%~5%), 极少数病例发生在食管(< 1%)^[3]。胃肠道间质瘤的早期诊断通常很困难, 手术切除仍然是最有效的治疗方法, 但术后经常发生复发和转移, 此外, GIST对放化疗不敏感, 预后较差。

c-KIT受体(CD117) 是一种跨膜蛋白, 最初被鉴定为Hardy-Zuckerman 4-猫科肉瘤病毒中逆转录病毒癌基因v-KIT的细胞同源物, 它是III型受体酪氨酸激酶家族的重要成员, 由胞外结构域、跨膜蛋白、近膜结构域和细胞质区域组成^[4], 在与其配体结合后能激活自身酪氨酸蛋白酶活性, 通过一系列反应激活下游信号转导通路, 从而调节细胞的生长与增殖。越来越多的证据表明, c-KIT的过表达或突变引起的c-KIT功能失调, 促进了各种癌症的发生和发展^{[5, 6]}。据报道GIST肿瘤的发生绝大多数是c-KIT基因突变驱动的, 在所有病例中约占80%~85%, 而PDGFRA基因突变占5%~10%^[7]。因此, c-KIT已成为治疗GIST药物开发的一个有希望的靶标。

伊马替尼(imatinib) 作为GIST的一线治疗药物, 显著改善了GIST患者的预后, 但仍有部分患者对伊马替尼具有原发性耐药性, 且约有一半的患者在治疗后2年内出现获得性耐药^[8-10]。目前, 已被批准用于治疗胃肠道间质瘤的其他药物包括舒尼替尼、瑞戈非尼和瑞派替尼等虽然能够显著改善患者的无进展生存期和总生存期^[11-14], 但都伴有严重的不良反应且最终都不可避免地产生耐药性^{[15, 16]}, 因此迫切需要开发靶向c-KIT的新型酪氨酸激酶抑制剂, 为GIST患者带来更多的治疗选择和希望。

本研究初步探讨了新型c-KIT抑制剂PN17-1在体外对胃肠道间质瘤GIST-882细胞增殖抑制效果及作用机制, 发现PN17-1能够显著抑制GIST-882细胞增殖、克隆形成和迁移能力, 并诱导GIST-882细胞以线粒体依赖的内源性途径发生凋亡, 为今后进一步开发c-KIT抑制剂提供了新的思路。

材料与方法

收起

细胞与试剂 人胃肠道间质瘤GIST-882细胞、人胃癌MKN45细胞、人非小细胞肺癌A549细胞、人肺腺癌H1975细胞、人肝癌HepG2细胞和人胚胎肾细胞HEK-293T均购自上海ATCC细胞库; imatinib (HY-15463) 购自美国MedChemExpress公司; PN17-1由辽宁省小分子靶向药物研发工程研究中心提供, 淡黄色粉末、化学式C₃₁H₃₂N₆O, 分子量504.64, 熔点219.7~221.4 ℃, HPLC测定纯度≥ 98%; MTT购自美国Sigma-Aldrich公司; 结晶紫染色液(C0121)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010)、超敏ECL化学发光试剂盒(P0018S)、rhodamine 123 (C2007)、细胞线粒体分离试剂盒(C3601) 和Hoechst 33258染色液(C1018) 均购自上海碧云天生物技术有限公司; Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(KGA1102) 购自江苏凯基生物技术有限公司; 抗c-KIT (3074) 和p-c-KIT (3073) 抗体购自美国Cell Signaling Technology公司; 抗p-AKT (66444-1-Ig)、p-STAT5 (28951-1-AP)、p-ERK (28733-1-AP)、PARP (66520-1-Ig)、caspase 9 (10380-1-AP)、caspase 3 (66470-2-Ig)、Bax (50599-2-Ig)、Bcl-2 (12789-1-AP)、cytochrome C (66264-1-Ig) 和β-actin (60008-1-Ig) 抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司。

细胞培养 GIST-882细胞、MKN45细胞、A549细胞、H1975细胞和HEK-293T细胞培养于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 及100 u·mL^-1青霉素、100 μg·mL^-1链霉素的1640培养基中, HepG2细胞培养于含10%胎牛血清及100 u·mL^-1青霉素、100 μg·mL^-1链霉素的DMEM培养基中, 所有细胞放置在含5% CO₂、37 ℃培养箱内培养, 视细胞生长情况, 每2~3天进行传代。

MTT法^[17] 取对数生长期且生长状态良好的细胞, 接种于96孔板中, 细胞密度为4×10³个/孔, 培养箱中孵育过夜。次日, 加入不同浓度的PN17-1及阳性对照药imatinib, 继续培养72 h, 每孔加入20 μL浓度为5 mg·mL^-1 MTT溶液, 孵育4 h后加入150 μL DMSO溶液, 震荡至甲瓒完全溶解后使用多功能酶标仪在波长490 nm处测定吸光度(A) 值, 最后通过SPSS软件计算IC₅₀值。

平板克隆形成实验^[18] 不同浓度的PN17-1及阳性对照药imatinib处理GIST-882细胞24 h后, 换成新鲜培养液继续培养14天, 待克隆形成后, 吸去原培养液, 用1.5 mL 4%多聚甲醛固定20 min, PBS洗涤细胞2次, 加入1.5 mL结晶紫染液染色20 min, PBS洗涤细胞数次后室温晾干, 拍照观察。

细胞划痕实验 以2×10⁵个/孔的密度将对数生长期且生长状态良好的GIST-882细胞接种在6孔板中, 当细胞生长至单层平铺板底后用200 μL枪头垂直在每孔中划“十”字, PBS洗涤两遍, 加入新鲜的完全培养液, 同时加入指定浓度的PN17-1, 显微镜下拍照后放入培养箱中, 继续培养24 h后拍照并用Image J软件计算划痕面积。

Transwell实验^[19] 收集生长状态良好的GIST-882细胞, 用无血清培养基重悬后调整细胞密度, 以2×10⁴个/200 μL的密度接种到上室中, 加入指定浓度的PN17-1, 放于培养箱中继续培养24 h。将上室取出, 用4%多聚甲醛固定20 min, 再用结晶紫室温染色20 min, PBS洗涤细胞数次后将小室倒置晾干, 光学显微镜下观察拍照。

凋亡细胞形态观察 GIST-882细胞经过指定浓度的PN17-1处理48 h。

Hoechst 33258染色: 弃去培养液, 每孔加入1.5 mL浓度为4%的多聚甲醛固定15 min, PBS洗涤细胞, 每孔加入Hoechst 33258染色液0.5 mL, 染色20 min后用PBS洗涤细胞2次, 倒置荧光显微镜下观察、拍照。

AO/EB染色: 弃去培养液, 每孔加入500 μL PBS, 同时加入20 μL AO/EB工作液, 室温避光染色20 min, 于倒置荧光显微镜下观察、拍照。

Western blot^[20] 收集PN17-1处理后的GIST-882细胞, 提取细胞总蛋白并定量, 然后进行SDS-PAGE凝胶电泳, 将蛋白转移到PVDF膜上, 封闭液封闭30 min后加入相应的一抗, 4 ℃孵育过夜。次日, 用TBST缓冲液洗膜3次, 加入HRP标记的相应二抗, 室温孵育2 h, 用TBST缓冲液洗膜3次, 滴加适量ECL发光液后通过凝胶成像拍照, 并使用Image J计算蛋白条带灰度值。

线粒体膜电位检测^[21] 收集PN17-1处理48 h后的GIST-882细胞, PBS洗涤细胞1次, 加入2 mL浓度为50 μg·mL^-1 rhodamine 123染色液, 室温避光孵育30 min后过200目筛网到上样管中, 通过流式细胞仪检测。

细胞凋亡实验^[22] 收集PN17-1处理48 h后的GIST-882细胞, 按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书进行染色, 最后用流式细胞仪检测分析。

ADME参数预测分析 PN17-1的吸收、分布、代谢、排泄等特性通过ADMETLAB 3.0数据库进行分析(https://admetlab3.scbdd.com/)。

The Human Protein Atlas数据库 MKN45细胞、A549细胞、HepG2细胞、H1975细胞和GIST-882细胞中的c-KIT表达情况来源于一个交互式开放获取数据库(https://www.proteinatlas.org/)。

统计学分析 所有结果均表示为平均值±标准差($\bar{x} \pm s$, n = 3), 数据分析通过SPSS 22.0软件完成, 两组间比较采用t检验分析, 多组间比较采用单因素方差分析(one-way analysis of variance, one-way ANOVA), P < 0.05代表具有显著性差异。

结果

收起

1 PN17-1抑制GIST-882细胞增殖活性

本研究通过The Human Protein Atlas数据库筛查, 选取了几种c-KIT表达水平不同的肿瘤细胞, 包括人胃癌MKN45细胞、人非小细胞肺癌A549细胞、人肝癌HepG2细胞、人肺腺癌H1975细胞及人胃肠道间质瘤GIST-882细胞, 采用MTT法检测了PN17-1对几种肿瘤细胞的增殖抑制活性。结果如表 1所示, PN17-1能够显著抑制c-KIT高表达的人胃肠道间质瘤GIST-882细胞增殖(IC₅₀为0.37 ± 0.06 μmol·L^-1), 但PN17-1对其他c-KIT表达水平较低或几乎不表达的肿瘤细胞的细胞毒性较弱, 表明PN17-1可能对c-KIT高表达的胃肠道间质瘤GIST-882细胞具有一定的选择性, 且抑制活性明显优于阳性对照药imatinib (IC₅₀为2.17 ± 0.91 μmol·L^-1)。此外, 本研究还考察了PN17-1对人胚胎肾细胞HEK-293T的毒性影响, 结果显示, 与阳性对照药imatinib相比, PN17-1对HEK-293T细胞的IC₅₀值(8.59 ± 0.87 μmol·L^-1) 较高, 提示PN17-1对胃肠道间质瘤的治疗可能具有一定的安全性。

2 PN17-1显著抑制GIST-882细胞克隆和生长

光学显微镜下观察发现, GIST-882细胞空白组贴壁生长, 形态呈梭形, 边界清晰, 经PN17-1 (图 1A) 处理48 h后, 细胞逐渐变圆、变小, 而随着PN17-1作用浓度的增加, 细胞甚至皱缩, 呈破裂状(图 1B), 进一步表明PN17-1能够抑制GIST-882细胞增殖、生长。

平板克隆实验结果显示, GIST-882细胞空白组克隆数量较多, 而经PN17-1处理后细胞克隆数量明显减少(图 1C), 且呈浓度依赖性, 表明PN17-1能够抑制GIST-882细胞的克隆形成能力。

3 PN17-1抑制c-KIT及其下游信号蛋白活化

已知KIT突变通常导致下游信号PI3K/AKT/mTOR、JAK/STAT、MAPK/ERK通路的异常活化, 介导细胞增殖和抗凋亡反应, 从而促使肿瘤的发展^[23]。本研究探讨了PN17-1是否能抑制c-KIT及其下游信号通路的活化。结果显示, PN17-1显著下调了GIST-882细胞中p-c-KIT、p-AKT、p-STAT5和p-ERK的蛋白表达水平(图 2), 且呈浓度依赖性, 也进一步证明了PN17-1是一种c-KIT选择性抑制剂, 能够抑制GIST-882细胞c-KIT及其下游信号通路蛋白的活化。

4 PN17-1诱导GIST-882细胞发生凋亡

为了进一步探究PN17-1对GIST-882细胞的作用机制, 本研究考察了PN17-1对GIST-882细胞凋亡的影响。AO/EB染色结果显示空白组GIST-882细胞呈均一的绿色荧光, 经PN17-1处理48 h后, 细胞呈现橙红色的凋亡样特征并且细胞数量明显减少。Hoechst 33258染色结果显示, 空白组GIST-882细胞核呈均一的蓝色荧光, 经PN17-1处理48 h后, 染色质浓缩, 细胞核呈碎片化并出现浓染的块状荧光(图 3A)。

Annexin V-FITC/PI流式结果显示, 随着PN17-1作用浓度的增加, GIST-882细胞的凋亡比例逐渐增加, 在1 μmol·L^-1浓度下, 细胞凋亡率为63.7% (图 3B)。此外, Western blot实验结果显示, PN17-1浓度依赖性上调了GIST-882细胞凋亡标志蛋白cleaved PARP和cleaved caspase 3的表达水平(图 3C), 以上结果表明PN17-1能够以浓度依赖的方式诱导GIST-882细胞发生凋亡。

5 PN17-1诱导GIST-882细胞线粒体破坏和细胞色素c的释放

Rhodamine 123染色结果如图 4A所示, GIST-882细胞经PN17-1处理48 h后, 细胞线粒体膜电位逐渐降低, 且呈浓度依赖性。线粒体膜电位的改变与细胞线粒体凋亡通路密切相关, 随后采用Western blot考察了PN17-1对线粒体凋亡途径相关蛋白表达的影响。结果显示, GIST-882细胞经PN17-1处理后, 线粒体中cytochrome c蛋白表达逐渐降低, 而细胞质中的cytochrome c蛋白表达显著增加, 且呈浓度依赖性(图 4B)。与此同时, cleaved caspase 9和促凋亡蛋白Bax的表达水平逐渐增加, 抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平逐渐降低(图 5), 以上结果表明PN17-1诱导的细胞凋亡可能是通过线粒体凋亡途径所执行的。

6 PN17-1抑制GIST-882细胞迁移能力

划痕实验结果如图 6A所示, GIST-882空白对照组的细胞明显向中间划痕生长, 细胞愈合率高达73%, 随着PN17-1浓度的增加, 伤口愈合率逐渐降低。Transwell实验结果显示, GIST-882细胞经PN17-1处理24 h后, 随着PN17-1作用浓度的增加, GIST-882细胞的迁移数量逐渐减少, 且呈浓度依赖性(图 6B), 以上结果表明PN17-1能够抑制GIST-882细胞的迁移能力。

7 PN17-1物理化学和ADME参数

通过ADMETLAB 3.0数据库对PN17-1的吸收、分布、代谢、排泄(ADME) 参数进行预测, 根据分子量、logP值、氢键供体和受体数量以及拓扑极性表面积等参数发现PN17-1符合Lipinski规则, 意味着PN17-1可能具有良好的吸收性或渗透性, 此外, 基于GASA的预测评估表明合成PN17-1相对容易(表 2)。表 3预测结果显示, PN17-1的血脑屏障穿透性几乎为0, 与imatinib一样, 其是P-gp和MRP1的抑制剂, 同时口服生物利用度与imatinib相当, 在肠道吸收的效果较好。如表 4预测, PN17-1不是P450酶的抑制剂, 与imatinib相比, PN17-1具有较好的人肝微粒体稳定性和较长的半衰期。

讨论

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原癌基因蛋白c-KIT在调节细胞转化和分化过程中起着至关重要的作用, 如增殖、存活、黏附和趋化性。c-KIT的过度表达和突变可导致其失调, 并促进各种癌症发生, 特别是胃肠道间质瘤, 抑制c-KIT已经成为胃肠道间质瘤有希望的治疗靶点^[24]。

酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs) 的出现显著改善了GIST患者的预后, 包括imatinib作为复发、转移和不可切除GIST的一线治疗^{[25, 26]}, 然而, 尽管临床受益率为80%, 但大多数GIST患者在imatinib治疗2~3年后会经历疾病进展, 虽然TKIs已经发展到第四代, 但是获得性耐药仍然是一个问题^{[27, 28]}, 目前, 研究者们正在积极探索新的GIST的治疗策略^{[29, 30]}。

本研究探究了新型c-KIT抑制剂PN17-1, 其通过imatinib结构修饰改造合成, 对胃肠道间质瘤GIST-882细胞的体外抗肿瘤活性及作用机制。细胞毒性实验发现, PN17-1对几种c-KIT表达水平不同的肿瘤细胞包括MKN45细胞、A549细胞、HepG2细胞、H1975细胞和GIST-882细胞的增殖抑制活性与细胞内c-KIT的表达情况具有一定的相关性, PN17-1对c-KIT高表达的GIST-882细胞IC₅₀值< c-KIT低表达的HepG2细胞IC₅₀值< c-KIT不表达的A549细胞和H1975细胞IC₅₀值。非常有趣的是, PN17-1对c-KIT蛋白不表达的MKN45细胞的抑制活性好于c-KIT蛋白低表达的HepG2细胞, 这可能与MKN45细胞中c-KIT mRNA的表达水平有关, 这值得研究者今后进一步探究。PN17-1对正常HEK293T细胞的毒性低于imatinib, 提示PN17-1可能具有较好的安全性, 但是其安全性今后还需进一步验证。此外, PN17-1能够显著抑制p-c-KIT及其下游信号p-AKT、p-ERK和p-STAT5蛋白的表达水平, 诱导GIST-882细胞发生凋亡, 并且抑制GIST-882细胞的迁移能力。据预测, PN17-1具有良好的吸收、分布、代谢和排泄特性, 符合Lipinski规则^[31]。此外, GASA预测表明PN17-1的合成相对容易, 如果最终被批准为可上市的药物, 成本会更低。

在后续的研究中, 本课题组会通过建立动物模型考察PN17-1的体内抗肿瘤活性, 并通过多种胃肠道间质瘤细胞株进行验证。值得注意的是, 本研究还发现PN17-1对imatinib耐药的胃肠道间质瘤GIST-1210细胞具有较好的增殖抑制活性, 提示PN17-1可能具有一定的克服耐药能力, 有望在克服耐药领域发挥作用, 今后本课题组将继续深入探究PN17-1克服耐药的能力及其克服耐药的潜在机制。综上, 本研究为今后开发PN17-1成为一个有潜力的抗胃肠道间质瘤药物提供了前期的实验依据, 为胃肠道间质瘤患者的临床治疗带来了新的希望。

作者贡献: 沈继伟负责实验研究、文章撰写; 吴爽完成部分实验操作、数据分析; 李军负责化合物合成及结构改造; 周云鹏负责部分实验设计、提供技术支持; 陈烨提出研究思路、实验指导与文章校对; 刘举负责化合物合成、实验指导与文章修改。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

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辽宁省科技厅应用基础研究计划项目(2022JH2/101300090)
辽宁省教育厅基本科研项目(LJKFZ20220177)
沈阳市自然科学基金基础研究项目(23-503-6-12)

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2025年第60卷第2期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0779

接收时间：2024-08-13
首发时间：2025-11-07
出版时间：2025-02-12

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收稿日期：2024-08-13
修回日期：2024-11-07

基金

辽宁省科技厅应用基础研究计划项目(2022JH2/101300090)

辽宁省教育厅基本科研项目(LJKFZ20220177)

沈阳市自然科学基金基础研究项目(23-503-6-12)

作者信息

1.辽宁大学药学院, 辽宁沈阳 110036

2.辽宁省小分子靶向药物研发工程研究中心, 辽宁沈阳 110036

通讯作者:

^*陈烨, Tel: 13998821581, E-mail: sy-chenye@163.com

刘举, Tel: 13840579525, E-mail: liuju1216@126.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Cell line	c-KIT RNA expression (RNA-seq TPM)	c-KIT protein expression (IHC score)	IC₅₀/μmol·L^-1
GIST-882	125.5	High	0.37 ± 0.06	2.17 ± 0.91
MKN45	0.5	None	5.14 ± 0.29	8.56 ± 1.31
A549	0	None	9.44 ± 1.45	15.31 ± 0.52
HepG2	1.2	Low	6.82 ± 0.27	8.43 ± 1.06
H1975	0	None	11.97 ± 0.18	12.21 ± 1.31
HEK-293T			8.59 ± 0.87	6.70 ± 0.67

Cell line

c-KIT RNA expression
(RNA-seq TPM)

c-KIT protein expression
(IHC score)

IC₅₀/μmol·L^-1

PN17-1

Imatinib

GIST-882

125.5

High

0.37 ± 0.06

2.17 ± 0.91

MKN45

0.5

None

5.14 ± 0.29

8.56 ± 1.31

A549

None

9.44 ± 1.45

15.31 ± 0.52

HepG2

1.2

Low

6.82 ± 0.27

8.43 ± 1.06

H1975

None

11.97 ± 0.18

12.21 ± 1.31

HEK-293T

8.59 ± 0.87

6.70 ± 0.67

Compd.	M_W	nHA	nHD	TPSA	logP	GASA	Lipinski rule
PN17-1	504.64	7.0	2.0	77.15	4.28	0.0	0.0
Imatinib	493.26	8.0	2.0	86.28	2.59	0.0	0.0

Compd.

M_W

nHA

nHD

TPSA

logP

GASA

Lipinski rule

PN17-1

504.64

7.0

2.0

77.15

4.28

0.0

Imatinib

493.26

8.0

2.0

86.28

2.59

0.0

Compd.	PAMPA	P-gp inhibitor	HIA	F_30%	BBB	OATP1B1 inhibitor	OATP1B3 inhibitor	MRP1 inhibitor
PN17-1	0.01	Yes	0.0	0.002	0.004	Yes	Yes	Yes
Imatinib	0.0	Yes	0.0	0.002	0.031	No	No	Yes

Compd.

PAMPA

P-gp inhibitor

HIA

F_30%

BBB

OATP1B1 inhibitor

OATP1B3 inhibitor

MRP1 inhibitor

PN17-1

0.01

Yes

0.0

0.002

0.004

Yes

Imatinib

0.0

Yes

0.0

0.002

0.031

Yes

Compd.	CYP1A2 inhibitor	CYP2C19 inhibitor	CYP2C9 inhibitor	CYP2D6 inhibitor	CYP3A4 inhibitor	CYP2B6 inhibitor	HLM stability	CL_plasma	T_1/2
PN17-1	No	No	No	No	No	No	0.18	3.57	1.03
Imatinib	No	No	No	Yes	No	Yes	0.30	2.74	0.91

Compd.

CYP1A2 inhibitor

CYP2C19 inhibitor

CYP2C9 inhibitor

CYP2D6 inhibitor

CYP3A4 inhibitor

CYP2B6 inhibitor

HLM stability

CL_plasma

T_1/2

PN17-1

0.18

3.57

1.03

Imatinib

Yes

0.30

2.74

0.91