药学学报

Primer name	Sequence (5' to 3')	Length/bp
TLR4-F	CACTGTTCTTCTCCTGCCTGAC	149
TLR4-R	CCTGGGGAAAAACTCTGGATAG	149
MYD88-F	GATGACCCCCTAGGACAAACG	70
MYD88-R	ACTCGATATCGTTGGGGCAG	70
TRAF6-F	CAGTGCAAACACCATGTGGC	73
TRAF6-R	TTGTGCCCTGCATCCCTTAT	73
NF-κB-F	CTCTGGCACAGAAGTTGGGT	102
NF-κB-R	TCCCGGAGTTCATCTCATAGT	102
β-actin-F	CCAGCCTTCCTTCTTGGGTAT	103
β-actin-R	GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG	103

Primer name	Sequence (5' to 3')	Length/bp
TLR4-F	CACTGTTCTTCTCCTGCCTGAC	149
TLR4-R	CCTGGGGAAAAACTCTGGATAG	149
MYD88-F	GATGACCCCCTAGGACAAACG	70
MYD88-R	ACTCGATATCGTTGGGGCAG	70
TRAF6-F	CAGTGCAAACACCATGTGGC	73
TRAF6-R	TTGTGCCCTGCATCCCTTAT	73
NF-κB-F	CTCTGGCACAGAAGTTGGGT	102
NF-κB-R	TCCCGGAGTTCATCTCATAGT	102
β-actin-F	CCAGCCTTCCTTCTTGGGTAT	103
β-actin-R	GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG	103

当归多糖作为潜在佐剂对细胞的免疫激活及机制研究

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何沅聪 ¹ , 尤朋涛 ¹^,² , 黄雅宁 ¹ , 张剑锋 ³ , 苟君波 ¹^,⁴^,^* , 王建 ¹^,⁴^,^*

药学学报 | 专题报道: 以多学科交叉探寻中药现代化发展之路 2025,60(3): 637-645

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药学学报 | 专题报道: 以多学科交叉探寻中药现代化发展之路 2025, 60(3): 637-645

当归多糖作为潜在佐剂对细胞的免疫激活及机制研究

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何沅聪¹, 尤朋涛¹^,², 黄雅宁¹, 张剑锋³, 苟君波¹^,⁴^,^*, 王建¹^,⁴^,^*

作者信息

1.湖北中医药大学药学院, 湖北武汉 430065

2.湖北中医药大学中药资源与中药化学湖北省重点实验室, 湖北武汉 430065

3.宣城市食品药品检验中心, 安徽宣城 242000

4.湖北时珍实验室, 湖北武汉 430061

通讯作者:

^*苟君波, Tel: 13476298773, E-mail: Junbogou@163.com

王建, Tel: 13618656486, E-mail: 1249519827@qq.com

Research on immune activation and mechanism of Angelica sinensis polysaccharide as potential adjuvant in cells

Yuan-cong HE¹, Peng-tao YOU¹^,², Ya-ning HUANG¹, Jian-feng ZHANG³, Jun-bo GOU¹^,⁴^,^*, Jian WANG¹^,⁴^,^*

Affiliations

1. School of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China

2. Hubei Key Laboratory of Resources and Chemistry of Chinese Medicine, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China

3. Xuancheng Institutes of Food and Drug Control, Xuancheng 242000, China

4. Hubei Shizhen Laboratory, Wuhan 430061, China

出版时间: 2025-03-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0739

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摘要

收起

本研究旨在探讨当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide, ASP) 作为潜在疫苗佐剂对巨噬细胞RAW264.7免疫激活作用及其释放细胞因子的影响, 同时阐明其潜在的信号通路作用机制。采用细胞计数试剂(cell counting kit-8, CCK-8) 法检测细胞活力, 流式细胞术检测5个浓度梯度的ASP对RAW264.7细胞表面分子白细胞分化抗原(cluster of differentiation, CD) 80、CD86和主要组织相容性复合物Ⅱ (major histocompatibility complex Ⅱ, MHC Ⅱ) 表达的影响, ELISA法测定细胞上清液中白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 等细胞因子的含量; quantitative polymerase chain reaction (qPCR) 检测Toll样受体4 (Toll-like receptor 4, TLR4)、髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88, MyD88)、TNF受体相关因子6 (TNF receptor associated factor 6, TRAF6)、核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB) 信号通路的mRNA表达水平, Western blot检测TRAF6、IκB激酶(IκB kinase, IKK) 和p65蛋白磷酸化水平。结果显示, 不同浓度的ASP对RAW264.7无细胞毒性。ASP均能浓度依赖性地促进RAW264.7细胞表面分子CD80、CD86和MHC Ⅱ的表达上调(P < 0.05)。不同浓度的ASP组均使得IL-6和TNF-α等的分泌水平有显著的提升(P < 0.05), 且在一定范围内存在量-效关系。qPCR结果显示, 不同浓度的ASP均使得TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB的mRNA表达水平上调。不同浓度的ASP均能提高TRAF6、p-IKK和p-p65的表达水平。TLR4受体抑制剂TAK-242能显著降低ASP诱导的细胞因子分泌量(P < 0.05)。本研究揭示了ASP可通过TLR4等信号通路显著增强共刺激分子和细胞因子的表达, 显示出作为疫苗佐剂的潜力。

关键词

当归多糖 / 佐剂 / 免疫活性 / TLR4信号通路 / RAW264.7细胞

Abstract

收起

The purpose of this study is not only to investigate the effects of Angelica sinensis polysaccharide (ASP) as a potential vaccine adjuvant on immune activation and cytokine release in RAW264.7 macrophages, but also to elucidate its underlying involved signaling mechanisms. Cell viability was evaluated by the CCK-8 assay. Flow cytometry was used to analyze the influence of ASP at five distinct concentration gradients on the expression of cluster of differentiation (CD) 80, CD86, and major histocompatibility complex Ⅱ (MHC Ⅱ) on RAW264.7 cell surfaces. The levels of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in cell culture supernatant were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. Molecular techniques, including quantitative polymerase chain reaction (qPCR) were utilized to assess the mRNA expression levels of Toll-like receptor 4 (TLR4)-myeloid differentiation factor 88 (MyD88)-TNF receptor associated factor 6 (TRAF6)-nuclear factor kappa-B (NF-κB) signaling pathway. The levels of TRAF6, and the phosphorylation levels of IκB kinase (IKK) and p65 proteins were detected by Western blot. The results show that ASP at varying concentrations promote the proliferation of RAW264.7 cells without cytotoxicity. Surface molecules CD80, CD86, and MHC Ⅱ on RAW264.7 cells showed statistically significant up-regulation in response to ASP compared to the blank control (P < 0.05), with a dose-dependent effect within an optimal range. Furthermore, ASP also elevated cytokines IL-6 and TNF-α secretion levels by RAW264.7 cells compared to the normal control (P < 0.05), exhibiting a dose-response relationship within a specific concentration span. The qPCR results indicated that ASP groups at different concentrations all led to upregulation of mRNA expression levels of TLR4, MyD88, TRAF6, and NF-κB signaling pathway. The expression levels of TRAF6, p-IKK and p-p65 were increased by different concentrations of ASP. The TLR4 inhibitor TAK-242 significantly reduced the secretion of cytokines induced by APS (P < 0.05). This study highlights the immunostimulatory properties of ASP, emphasizing its potential as a vaccine adjuvant. By significantly enhancing the expression of co-stimulatory molecules and cytokines via the TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB signaling pathway, ASP offers a promising approach for modulating immune responses.

Key words

Angelica sinensis polysaccharide / adjuvant / immune activity / TLR4 signaling pathway / RAW264.7 cell

引用本文

何沅聪, 尤朋涛, 黄雅宁, 张剑锋, 苟君波, 王建. 当归多糖作为潜在佐剂对细胞的免疫激活及机制研究. 药学学报, 2025 , 60 (3) : 637 -645 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0739

Yuan-cong HE, Peng-tao YOU, Ya-ning HUANG, Jian-feng ZHANG, Jun-bo GOU, Jian WANG. Research on immune activation and mechanism of Angelica sinensis polysaccharide as potential adjuvant in cells[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2025 , 60 (3) : 637 -645 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0739

正文

收起

当归[Angelica sinensis (Oliv.) Diels] 是常用的重要传统中药材之一, 性温, 味甘、辛。在传统医学中, 当归被认为能够归入心、脾、肝经, 具有补血活血、调经止痛、润肠通便等功效^{[1, 2]}。现代研究证实当归中含有多种活性成分, 如当归多糖(Angelica sinensis polysaccharide, ASP)、挥发油、阿魏酸、氨基酸、黄酮等^[3]; 其中, ASP被确定为主要活性成分之一^[4], 具有抗肿瘤^{[5, 6]}、改善贫血^[7]、免疫调节^{[4, 8]}等多种药理作用。

抗原递呈细胞(antigen presenting cells, APC) 是机体重要的免疫细胞, 其激活后会表达上调共刺激分子B7 (CD80和CD86) 和主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex, MHC) 的表达, 同时释放肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素(interleukin, IL) 等活性因子^[9]。而RAW264.7细胞是APC细胞的一种, 且该细胞是研究中药多糖作用的主要靶细胞^{[10, 11]}, 其细胞膜上富含Toll样受体(Toll like receptors, TLRs), 使得其成为研究TLR信号通路的理想模型^{[12, 13]}。

近年来, 中药多糖因其免疫调节潜力而成为疫苗佐剂研究的热点^{[14, 15]}。然而, 关于ASP作为佐剂在免疫调节中的作用及其与TLR4的关系, 研究较少。本研究利用RAW264.7细胞模型, 深入考察ASP的体外免疫调节功能。测定ASP刺激后RAW264.7细胞的存活率、共刺激分子(CD80、CD86) 和MHC Ⅱ的表达水平, 以及细胞因子(如IL-6、TNF-α和IL-1β等) 的释放水平。采用qPCR技术和Western blot检测TLR4等相关信号通路的mRNA和蛋白的表达, 并通过TLR4抑制剂实验, 进一步验证ASP激活RAW264.7细胞是否通过TLR4信号通路。该研究揭示了ASP的免疫调节作用, 为其在疫苗佐剂开发中的应用提供了分子机制依据, 有助于ASP的物质基础开发和临床应用。

材料与方法

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仪器与设备 多功能酶标仪(美国BioTek公司, Synergy H1), CO₂细胞培养箱(新加坡Esco公司, Celsafe), 流式细胞仪(美国贝克曼公司, CytoFLEX LX), 荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司, ABI OneStepPlus), 化学发光成像仪(美国FluorChem公司, proteinsimple)。

药品与试剂 ASP (纯度 > 90%) 购于四川省维克奇生物科技有限公司(批号: WP23111007); 脂多糖(LPS, 货号: BS904, 纯度98%) 购于白鲨生物科技有限公司; 小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 (货号: CL-0190) 购于武汉普诺赛生命科技有限公司; TAK-242, 纯度98% (货号: 243984-11-4) 购于上海毕得医药科技股份有限公司; PE-CD86流式荧光抗体、APC-CD80流式荧光抗体、PerCP/cyanine5.5-MHC Ⅱ流式荧光抗体、APC-CD206流式荧光抗体、TNF受体相关因子6 (TNF receptor associated factor 6, TRAF6) 一抗、p65一抗、β-actin一抗、二抗(货号: E-AB-F0994D、E-AB-F0992E、E-AB-F0990J、E-AB-F1135E、E-AB-18251、E-AB-32233、E-AB-40338、E-AB-1003) 均购于武汉Elabscience公司; 小鼠的IL-6和TNF-α ELSIA试剂盒(货号: abs552203、abs552204) 均购于爱必信(上海) 生物科技有限公司; 小鼠的IL-1β ELISA试剂盒(货号: 1210122) 购于达科为生物技术股份有限公司; CCK-8试剂盒、细胞总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、SYBR Green (货号: A311、RC112、R312、Q712) 均购于南京诺维赞生物科技股份有限公司; IκB激酶(IκB kinase, IKK) 一抗、p-IKK一抗、p-p65一抗(货号: 8943T、2078T、3033T) 均购自美国Cell Signaling Technology公司。

药物与LPS配制 将当归多糖和LPS分别溶解于PBS中, 制备浓度为1 mg·mL^-1母液, 再将母液稀释至实验所需的最终给药浓度。

细胞培养 RAW264.7和DC2.4细胞分别采用DMEM高糖培养基和RMPI-1640培养基(含10% FBS和1%双抗) 在37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养, 并以1∶4的比例进行传代。

CCK-8法检测细胞活性 将RAW264.7细胞培养铺板24 h后, 弃去孔内的培养基, 并加入100 μL不同浓度的药物处理细胞。再培养24或48 h后, 加入CCK-8溶液, 孵育1 h, 然后在450 nm波长处测定吸光度(A) 值。细胞活力按照以下公式计算: 细胞活力= [(实验孔A值-空白孔A值) / (对照孔A值-空白孔A值)] × 100%。

ASP对RAW264.7和DC2.4细胞表面分子表达的影响 分别用不同浓度的ASP或LPS与RAW264.7或DC2.4共孵育24 h, 然后收集处理后的细胞, 使用荧光抗体PE-CD86、APC-CD80和PerCP/cyanine5.5-MHC Ⅱ对细胞表面分子进行染色; 或在固定破膜后, 再使用荧光抗体APC-CD206对RAW264.7进行染色。通过流式细胞仪检测RAW264.7或DC2.4细胞表面分子CD86、CD80、MHC Ⅱ或CD206的表达情况。

ELISA法测定IL-6、TNF-α和IL-1β 接种RAW264.7细胞在24孔细胞培养板中, 用ASP或LPS (100 ng·mL^-1) 孵育24 h后, 收集细胞上清液。使用ELISA法对各组细胞上清液中IL-6、TNF-α和IL-1β含量进行检测, 严格按照试剂盒说明书进行操作。

荧光定量PCR 根据总RNA提取试剂盒的指南提取总RNA, 使用琼脂糖凝胶电泳验证RNA的完整性。然后, 通过逆转录试剂盒将1 μg总RNA反转录为cDNA模板, 使用SYBR Green和ABI OneStepPlus以10 μL的反应体积进行荧光定量PCR (qPCR)。反应条件设置为: 95 ℃预变性30 s, 循环反应: 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 共40个循环; 融解曲线: 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 95 ℃ 15 s。以β-actin作为内参基因, 采用2^-ΔΔCt方法计算目标基因的相对表达水平。具体的引物设计序列见表 1。

蛋白免疫印迹实验 将RAW264.7细胞铺到6孔板内, 24 h后分别给予25、50、100、200、400 μg·mL^-1 ASP刺激, 阴性对照组给予等量的PBS, 阳性对照组给予100 ng·mL^-1 LPS进行刺激, 24 h后弃去上清液并提取蛋白。用凝胶电泳依据蛋白分子量大小分离蛋白, 再将蛋白转印到硝酸纤维素膜中。使用封闭液封闭后分别用TARF6、p-IKK、p-p65、β-actin一抗和对应的二抗进行孵育, 然后显影。磷酸化蛋白显影之后使用抗体剥离液孵育10 min, 室温下孵育IKK、p65一抗和对应的二抗后, 再显影。使用ImageJ软件对TARF6、IKK、p-IKK、p65、p-p65进行归一化处理后进行数据统计。

TAK-242预孵育后ELISA法测定IL-6、TNF-α RAW264.7细胞先用5 μg·mL^-1 TAK-242预培养1 h, 然后用400 μg·mL^-1 ASP或100 ng·mL^-1 LPS孵育12 h。使用ELISA法对各组细胞上清液中IL-6、TNF-α含量进行检测。

统计学方法 采用GraphPad Prism 6.0软件进行数据统计分析, 实验数据以均值±标准差($\bar{x} \pm s$) 表示, 多组数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA) 和Dunn多重比较检验确定统计学意义, 以P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

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1 当归多糖对RAW264.7细胞存活率的影响

本实验利用CCK-8法检测ASP对巨噬细胞RAW264.7作用24和48 h的存活率。一般认为细胞存活率为90%以上时, 为非细胞毒性浓度。在查阅文献的基础上, 选择25~400 μg·mL^-1作为ASP的工作浓度^[16]。从图 1A可看出, RAW264.7细胞在ASP作用24 h后, 其细胞存活率均大于100%; 且采用400 μg·mL^-1 ASP处理细胞24 h后, 细胞存活率达到111.2%, 与阴性对照组相比无显著性差异, 说明细胞处于正常的生长水平; 从图 1B可看出, RAW264.7细胞在ASP作用48 h后, 其细胞存活率均大于90%。该实验结果显示, 在25~400 μg·mL^-1内, ASP对RAW264.7细胞无细胞毒性, 且存活率均高于90%。

2 当归多糖诱导RAW264.7和DC2.4细胞表面分子表达的影响

如图 2所示, 与阴性对照组相比, 5种不同浓度的ASP均可显著提高RAW264.7细胞表面分子CD80、CD86和MHC Ⅱ的表达。随着给药浓度从25 μg·mL^-1增加至400 μg·mL^-1, CD80⁺、CD86⁺和MHC Ⅱ⁺细胞比例逐渐升高, 且在400 μg·mL^-1 ASP组时, 这些阳性细胞比例最高。在低浓度(25 μg·mL^-1) 时, ASP显著提高了RAW264.7细胞CD80 (图 2A、B) 和CD86 (图 2C、D) 的表达(P < 0.001); 然而, 相同浓度下的ASP对RAW264.7细胞MHC Ⅱ的表达无显著影响(P > 0.05), 而100 μg·mL^-1 ASP组则显著提高了细胞表面MHC Ⅱ的表达量(P < 0.05, 图 2E、F)。在图 2G、H中, 与阴性对照组相比, 25 μg·mL^-1 ASP组能够显著增加RAW264.7细胞中CD80⁺和CD86⁺双阳性细胞比例(P < 0.001), 增加了11.9倍。与阳性对照组相比, 400 μg·mL^-1 ASP组均能显著增强RAW264.7细胞表面分子表达。这些数据表明, ASP对RAW264.7细胞具有显著的免疫刺激作用。

CD206的高表达通常被作为RAW264.7细胞朝M2方向极化的指标, 因此, 本研究进一步探究了不同浓度的ASP对RAW264.7细胞表面CD206表达水平的影响。如图 3所示, 与阴性对照组相比, 不同浓度的ASP处理后, RAW264.7细胞在CD206表达上并未显示出统计学上的显著性差异。因此, 本实验结果表明在所给的浓度范围内, ASP对RAW264.7细胞的CD206表达无显著影响, 且不会促进RAW264.7细胞向M2型巨噬细胞方向发生极化。

本研究同时测定了ASP对DC2.4细胞的激活情况。从图 4中可以看出, 与未处理的阴性对照组相比, 使用不同浓度的APS处理后, DC2.4表面的CD80、CD86和MHC Ⅱ分子表达量均上升; 且随着给药浓度从25 μg·mL^-1增加至400 μg·mL^-1, CD80⁺、CD86⁺和MHC Ⅱ⁺阳性细胞比例逐渐升高。与阴性对照组相比, 使用400 μg·mL^-1 ASP处理后, DC2.4细胞表面的CD80占比从18.2%提高至59.7%, CD86的占比从1.77%提高至42.7%, MHC Ⅱ的占比从0.46%提高至37.0%, 且其效果比阳性对照组的更好。因此, 本实验说明ASP能有效激活DC2.4细胞, 提高DC2.4细胞的CD80、CD86和MHC Ⅱ表达, 促进DC2.4细胞的抗原提呈作用。

3 当归多糖诱导RAW264.7细胞产生细胞因子的影响

如图 5所示, 不同浓度的ASP对RAW264.7细胞分泌的IL-6、TNF-α和IL-1β显示出显著的促进作用。随着给药浓度的增加, ASP对RAW264.7细胞分泌这3种细胞因子的促进作用逐渐增强, 且呈现出良好的浓度依赖性。在图 5A中, 相比于200 μg·mL^-1 ASP组, 400 μg·mL^-1 ASP组使RAW264.7细胞分泌IL-6水平增加了1.16倍; 而相比于LPS组, 400 μg·mL^-1 ASP组使IL-6的分泌水平增加了6.20倍(P < 0.05)。在图 5B中, 相比于阴性对照组, 25 μg·mL^-1 ASP组使RAW264.7细胞分泌的TNF-α水平增加了9 934.12倍, 表现出显著性差异; 而相比于200 μg·mL^-1 ASP组, 400 μg·mL^-1 ASP组使TNF-α的分泌水平增加了1.20倍。与LPS组相比, 400 μg·mL^-1 ASP组使TNF-α的分泌水平增加了4.51倍(P < 0.000 1)。在图 5C中, 与阴性对照组相比, 50 μg·mL^-1 ASP组使RAW264.7细胞分泌IL-1β水平增加了约125倍, 呈现出显著性差异, 且随着给药浓度的增加, IL-1β的含量也在逐渐地升高。体外细胞实验结果证实, ASP能够浓度依赖性地激活RAW264.7细胞, 使其释放IL-6、TNF-α和IL-1β等细胞因子。

4 当归多糖对RAW264.7细胞TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB的mRNA含量的影响

为了探究ASP的免疫调控机制, 本研究采用qPCR技术检测了不同浓度的ASP刺激RAW264.7细胞24 h后对TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB信号通路mRNA表达水平的影响。实验结果如图 6A~D所示, 与空白对照组相比, 不同浓度的ASP刺激后, TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB信号通路的mRNA表达水平均显著升高(P < 0.05), 且随着剂量的增加, 该实验结果中TLR4等mRNA表达水平的升高趋势与细胞表面分子CD80、CD86和MHC Ⅱ的检测结果以及细胞上清液中IL-6、TNF-α和IL-1β的含量结果一致。

5 当归多糖对RAW264.7细胞TRAF6蛋白、IKK和p65的磷酸化蛋白表达水平的影响

为了进一步探究ASP对RAW264.7细胞激活后TRAF6蛋白、IKK和p65的磷酸化蛋白表达水平, 本研究采用Western blot检测了这些蛋白的变化。如图 6E、F所示, 与阴性对照组相比, 不同浓度的ASP均能使得TRAF6蛋白的表达水平提高; 并且在ASP浓度为400 μg·mL^-1时, TRAF6的表达水平达到最高; 说明ASP能够显著提高RAW264.7细胞中TRAF6的表达。此外, 如图 6E、G、H所示, ASP能够以浓度依赖性使p65磷酸化水平提高。而磷酸化通常意味着蛋白被激活而行使蛋白的正常功能, 由此推测, ASP能够通过使TRAF6表达上调, 激活IKK, 进而促进p65蛋白磷酸化。磷酸化的NF-κB进入细胞核后, 使RAW264.7分泌IL-6、TNF-α和IL-1β, 最终达到激活RAW264.7细胞的目的。

6 TAK-242抑制剂对当归多糖诱导的RAW264.7细胞分泌的细胞因子影响

为了进一步分析ASP是否通过TLR4信号通路激活RAW264.7细胞, 本研究采用TLR4特异性抑制剂TAK-242预处理RAW264.7细胞。TAK-242抑制剂已被广泛用于TLR4信号通路的验证^{[13, 17]}。如图 7所示, 与对照组相比, 在未使用抑制剂的情况下, ASP和LPS均能显著促进IL-6和TNF-α的产生(P < 0.000 1)。然而, 在TAK-242存在的情况下, ASP诱导的IL-6和TNF-α的产生受到明显抑制, 并显著低于无抑制剂组(P < 0.000 1)。上述实验结果表明, ASP对RAW264.7细胞的激活可能是通过TLR4信号通路起作用的。

讨论

收起

巨噬细胞RAW264.7在先天性免疫系统中起着关键作用, 其抗原递呈功能对于增强适应性免疫系统至关重要。目前研究证明, 中药多糖对巨噬细胞的免疫调节是其发挥免疫功能的途径之一。

本研究发现, 在25~400 μg·mL^-1内, ASP对RAW264.7细胞无细胞毒性, 且能促进RAW264.7细胞的分化, 而免疫细胞分化是其发挥免疫应答的前提与基础。五种不同浓度的ASP均能显著上调细胞表面共刺激分子CD80、CD86和MHC Ⅱ表达水平, 且呈现浓度依赖性。上调的共刺激分子CD80和CD86, 通常与T细胞的激活密切相关。尽管本研究未直接观察到T细胞的激活, 但CD80和CD86的上调表明ASP可通过增强T细胞的共刺激信号, 促进T细胞的激活。此外, MHC Ⅰ类分子几乎在所有细胞上均有表达, 主要呈递的是胞内抗原; 而MHC Ⅱ类分子则主要在激活的B细胞、巨噬细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞上表达, 负责呈递胞外抗原^[18]。因此, ASP对MHC Ⅱ类分子表达的增强, 有助于巨噬细胞对外源性抗原的更有效呈递。总之, ASP通过激活巨噬细胞, 使其表面MHC Ⅱ、CD80和CD86表达增强, 促进了巨噬细胞对外来抗原的识别、处理和呈递能力, 从而发挥ASP作为疫苗佐剂的潜在效应。

在观察到ASP对巨噬细胞表面分子表达的显著影响之后, 本研究还进一步探讨了ASP对RAW264.7细胞分泌细胞因子的影响。RAW264.7细胞通常通过分泌多种细胞因子而发挥重要的免疫调节作用^[12]。本研究结果显示, 5种不同浓度的ASP均能显著促进RAW264.7细胞分泌IL-6、TNF-α和IL-1β。其中, TNF-α主要是由TLR4-MyD88依赖信号通路的激活产生^[19], 其能杀死肿瘤细胞和被病毒感染的细胞, 也能辅助激活免疫系统细胞。

近期研究表明, 中药多糖的免疫调节活性与TLR4信号通路的激活密切相关^{[20, 21]}。如枸杞多糖能够与巨噬细胞表面的TLR4受体结合, 进而激活下游的MyD88-NF-κB信号通路, 并促进了IL-12p40、TNF-α等细胞因子的分泌^[22]; 新型人参多糖(GSPA-0.3) 通过TLR4-MyD88-NF-κB信号通路的激活, 显著提高了小鼠体内H1N1疫苗的中和抗体水平, 显示出优于传统铝佐剂的免疫增强效果^[23]。在本研究中, ASP增加了RAW264.7细胞中TLR4、MyD88、TRAF6和NF-κB的mRNA的表达。不同浓度的ASP均能使得RAW264.7细胞中TRAF6、p-IKK和p-p65蛋白的表达水平提高。同时, TLR4受体抑制剂TAK-242能显著降低ASP诱导的细胞因子IL-6和TNF-α的分泌。该结果表明, ASP可能通过特异性激活TLR4信号通路来增强巨噬细胞的免疫反应。本研究的发现与其他中药多糖通过TLR4信号通路激活免疫细胞的研究结果相一致^{[22, 23]}, 这进一步证实了ASP可通过相似的机制发挥其免疫调节作用。

文献研究表明, 当归多糖可以促进巨噬细胞和树突状细胞分泌细胞因子, 通过TLR4途径进一步激活NK细胞, 增强IFN-γ的含量, 从而提高其抗肿瘤的免疫反应, 但在该研究中当归多糖的具体成分及其作用的信号通路尚未完全阐明^[4]。进一步的研究表明, 不同结构的当归多糖对TLR4信号通路具有不同影响。如Liu的研究^[24]发现, 当归多糖APS-2Ⅰ可降低LPS诱导的巨噬细胞中MyD88和NF-κB的表达, 抑制TLR4复合物的形成, 显示出对TLR4信号通路的抑制作用。而同样的, 该团队也发现当归多糖APS-4Ⅰ和APS-4Ⅱ可提高其抗黑色素瘤的能力^[5], 这表明ASP-4Ⅰ和ASP-4Ⅱ是一类对TLR4信号通路具有促进作用的多糖类型。这些结果表明, 当归多糖可通过TLR4发挥双向的免疫调节作用, 而这种调节作用的差异可能是由于当归多糖的来源不同导致的结构差异而造成的。此外, 黄芪多糖也因其结构差异对TLR4信号通路也表现出双向调节作用^[10]。这进一步强调了中药多糖结构多样性对其免疫调节功能的重要性。

综上, 当归多糖可经TLR4-MyD88-TRAF6-NF-κB通路激活并诱导巨噬细胞RAW264.7分化成熟, 上调共刺激分子CD80、CD86和MHC Ⅱ等, 产生IL-6、TNF-α和IL-1β细胞因子。该研究结果初步揭示了当归多糖在细胞水平的免疫调节作用机制, 为其作为疫苗佐剂的潜在应用价值提供了理论基础。

尽管本研究取得了积极的结果, 但仍存在一定的局限性, 需要进一步的多糖结构解析, 以及小鼠体内实验来验证ASP的免疫调节效果, 以及与其他免疫激动剂的协同效应, 以期开发出更安全、更有效的疫苗佐剂。

作者贡献: 何沅聪和王建负责实验方案设计; 何沅聪负责实验实施、数据收集、结果分析和文章修改等; 王建负责提供文章思路和文章撰写, 并在文章写作方面进行指导和修改; 尤朋涛、黄雅宁、张剑锋负责文中数据分析的指导; 苟君波对整个实验内容给予监督并负责对文章内容的修改完善。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

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湖北省科技厅自然科学基金青年项目(2023AFB389)
湖北省药品监督检验研究院重点实验室开放课题项目(2023HBKFZ002)
湖北中医药大学重大科技攻关项目(2023ZDXM007)
湖北中医药大学博士启动项目(2023ZXB012)

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参考文献引证文献

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2025年第60卷第3期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0739

接收时间：2024-07-31
首发时间：2025-11-06
出版时间：2025-03-12

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收稿日期：2024-07-31
修回日期：2024-12-20

基金

湖北省科技厅自然科学基金青年项目(2023AFB389)

湖北省药品监督检验研究院重点实验室开放课题项目(2023HBKFZ002)

湖北中医药大学重大科技攻关项目(2023ZDXM007)

湖北中医药大学博士启动项目(2023ZXB012)

作者信息

1.湖北中医药大学药学院, 湖北武汉 430065

2.湖北中医药大学中药资源与中药化学湖北省重点实验室, 湖北武汉 430065

3.宣城市食品药品检验中心, 安徽宣城 242000

4.湖北时珍实验室, 湖北武汉 430061

通讯作者:

^*苟君波, Tel: 13476298773, E-mail: Junbogou@163.com

王建, Tel: 13618656486, E-mail: 1249519827@qq.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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