药学学报

No.	Origin	DNA identification		No.	Origin	DNA identification
S1	Anhui	Pheretima vulgaris		S28	Shanghai^*	P. aspergillum
S2	Shanghai	P. vulgaris	S29	Shanghai^*	P. aspergillum
S3	Shanghai	P. vulgaris	S30	Shanghai^*	P. aspergillum
S4	Shanghai	P. vulgaris	S31	Shanghai^*	P. aspergillum
S5	Shanghai	P. vulgaris	S32	Shanghai^*	P. aspergillum
S6	Shanghai	Pheretima guillelmi	S33	Shanghai^*	P. aspergillum
S7	Anhui	P. vulgaris	S34	Shanghai^*	P. aspergillum
S8	Anhui	P. vulgaris	S35	Shanghai^*	P. aspergillum
S9	Shanghai	P. vulgaris	S36	Guangdong	P. aspergillum
S10	Anhui	P. vulgaris	S37	Shanghai^*	P. aspergillum
S11	Shanghai	P. vulgaris	S38	Guangdong	Not assigned
S12	Anhui	P. vulgaris	S39	Guangdong	Metaphire magna
S13	Anhui	P. vulgaris	S40	Guangxi	M. magna
S14	Shanghai	P. vulgaris	S41	Fujian	M. magna
S15	Shanghai	P. vulgaris	S42	Hubei	M. magna
S16	Shanghai	P. vulgaris	S43	Guangxi	M. magna
S17	Shanghai	P. vulgaris	S44	Guangdong	M. magna
S18	Shanghai	P. vulgaris	S45	Guangdong	M. magna
S19	Hainan	Pheretima aspergillum	S46	Anhui	Amynthas amis
S20	Guangxi	P. aspergillum	S47	Anhui	A. amis
S21	Guangxi	P. aspergillum	S48	Shanghai	Amynthas carnosus
S22	Guangxi	P. aspergillum	S49	Shanghai	Metaphire tschiliensis
S23	Guangdong	P. aspergillum	S50	Hebei	Amynthas hupeiensis
S24	Anhui^*	P. aspergillum	S51	Thailand	Metaphire birmanica
S25	Anhui^*	P. aspergillum	S52	Guangdong	Amynthas
S26	Guangxi	P. aspergillum	S53	Unknown	Amynthas
S27	Shanghai^*	P. aspergillum	S54	Shanghai^*	Not assigned

No.	Origin	DNA identification		No.	Origin	DNA identification
S1	Anhui	Pheretima vulgaris		S28	Shanghai^*	P. aspergillum
S2	Shanghai	P. vulgaris	S29	Shanghai^*	P. aspergillum
S3	Shanghai	P. vulgaris	S30	Shanghai^*	P. aspergillum
S4	Shanghai	P. vulgaris	S31	Shanghai^*	P. aspergillum
S5	Shanghai	P. vulgaris	S32	Shanghai^*	P. aspergillum
S6	Shanghai	Pheretima guillelmi	S33	Shanghai^*	P. aspergillum
S7	Anhui	P. vulgaris	S34	Shanghai^*	P. aspergillum
S8	Anhui	P. vulgaris	S35	Shanghai^*	P. aspergillum
S9	Shanghai	P. vulgaris	S36	Guangdong	P. aspergillum
S10	Anhui	P. vulgaris	S37	Shanghai^*	P. aspergillum
S11	Shanghai	P. vulgaris	S38	Guangdong	Not assigned
S12	Anhui	P. vulgaris	S39	Guangdong	Metaphire magna
S13	Anhui	P. vulgaris	S40	Guangxi	M. magna
S14	Shanghai	P. vulgaris	S41	Fujian	M. magna
S15	Shanghai	P. vulgaris	S42	Hubei	M. magna
S16	Shanghai	P. vulgaris	S43	Guangxi	M. magna
S17	Shanghai	P. vulgaris	S44	Guangdong	M. magna
S18	Shanghai	P. vulgaris	S45	Guangdong	M. magna
S19	Hainan	Pheretima aspergillum	S46	Anhui	Amynthas amis
S20	Guangxi	P. aspergillum	S47	Anhui	A. amis
S21	Guangxi	P. aspergillum	S48	Shanghai	Amynthas carnosus
S22	Guangxi	P. aspergillum	S49	Shanghai	Metaphire tschiliensis
S23	Guangdong	P. aspergillum	S50	Hebei	Amynthas hupeiensis
S24	Anhui^*	P. aspergillum	S51	Thailand	Metaphire birmanica
S25	Anhui^*	P. aspergillum	S52	Guangdong	Amynthas
S26	Guangxi	P. aspergillum	S53	Unknown	Amynthas
S27	Shanghai^*	P. aspergillum	S54	Shanghai^*	Not assigned

Name	Sequence	Precursor ion (m/z)	Product ion (m/z)	Collision energy/eV
Peptide G	LITVWENYLK	639.9	1 052.5^*	21
852.4	29
Peptide H	FEELLLGLQLQK	715.9	686.4^*	19
799.5	31
Peptide M	VLEGELAEAVER	658.1	1 102.5^*	17
674.3	29

Name	Sequence	Precursor ion (m/z)	Product ion (m/z)	Collision energy/eV
Peptide G	LITVWENYLK	639.9	1 052.5^*	21
852.4	29
Peptide H	FEELLLGLQLQK	715.9	686.4^*	19
799.5	31
Peptide M	VLEGELAEAVER	658.1	1 102.5^*	17
674.3	29

基于特征多肽的地龙鉴别与伪品保宁腔蚓检查方法的建立及应用

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刘蕊 ¹^,² , 张静娴 ²^,^* , 胡青 ² , 孙健 ² , 于泓 ² , 冉莹瑛 ² , 黄帆 ² , 毛秀红 ² , 季申 ¹^,²^,^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(10): 2842-2848

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(10): 2842-2848

基于特征多肽的地龙鉴别与伪品保宁腔蚓检查方法的建立及应用

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刘蕊¹^,², 张静娴²^,^*, 胡青², 孙健², 于泓², 冉莹瑛², 黄帆², 毛秀红², 季申¹^,²^,^*

作者信息

1.上海中医药大学, 上海 201203

2.上海市食品药品检验研究院, 上海 201203

通讯作者:

^*张静娴, Tel: 86-21-38839900-26126, E-mail: zhjx_2003@163.com;

季申, Tel: 86-21-50798195, E-mail: jishen2013@163.com

Development and application of a method for identifying Pheretima and a common counterfeit of Metaphire magna based on signature peptides

Rui LIU¹^,², Jing-xian ZHANG²^,^*, Qing HU², Jian SUN², Hong YU², Ying-ying RAN², Fan HUANG², Xiu-hong MAO², Shen JI¹^,²^,^*

Affiliations

1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

2. Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201203, China

出版时间: 2024-10-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0316

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摘要

收起

基于种属特异性多肽, 采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱(UHPLC-MS/MS) 建立了地龙鉴别和伪品保宁腔蚓的检查方法, 并应用于地龙及两种成方制剂的检测分析。采用CORTECS T3 C18色谱柱分离, 以0.1%甲酸溶液-乙腈为流动相, 梯度洗脱, 采用ESI⁺离子源、多重反应监测(MRM) 模式, 同时监测3组离子对。结果表明, 本方法具有良好的专属性, 可以鉴定出广地龙、沪地龙、保宁腔蚓, 鉴定结果与DNA条形码分子鉴定结果一致。掺伪检查研究表明, 保宁腔蚓多肽M的检出限为1 μg·g^-1, 广地龙中掺入1%保宁腔蚓时即可检出, 方法灵敏度高。54批市售地龙样品中广地龙占比35%、沪地龙35%、保宁腔蚓15%, 另外15%未检出任何目标离子, 经DNA条形码分子鉴定发现这些样品主要来源为远盲蚓属, 部分样品性状与沪地龙相似。成方制剂分析结果显示, 3批小活络丸(3/6) 未检出任何多肽离子, 2批伸筋丹胶囊(2/4) 中检出保宁腔蚓。本研究所建立的方法专属性好、灵敏度高、可行性强, 可以用于地龙及其相关制剂的质量控制研究中, 对于提高质量标准、规范地龙药材市场具有重要意义。

关键词

地龙 / 保宁腔蚓 / 特征多肽 / 质量标准 / 小活络丸 / 伸筋丹胶囊

Abstract

收起

Based on the species-specific peptides of Pheretima and its common counterfeit (Metaphire magna), an identification method was established using ultra-high performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometry (UHPLC-MS/MS) for quality evaluation of Pheretima and its preparations. Separation was performed on a CORTECS T3 C18 column with 0.1% formic acid and acetonitrile as the mobile phases. Mass spectrometry with multiple reaction monitoring (MRM) using ESI⁺ mode was used to simultaneously monitor three ion pairs. The results indicated that the method was specific and could distinguish Guang Dilong, Hu Dilong, and M. magna, which were consistent with those of DNA barcode identification. The adulteration test showed that the LOD of peptide M was 1 μg·g^-1. Peptide M could be detected when 1% M. magna was added to Guang Dilong, indicating the high sensitivity of the method. Fifty-four batches of commercially available samples contained 35% Guang Dilong, 35% Hu Dilong, and 15% M. magna. No ions were detected in 15% of the samples, and DNA barcode identification revealed that they were mainly from Amynthas, with similar appearance to Hu Dilong. The analysis results of the formulation showed that no peptide ions were detected in 3 batches of Xiaohuoluo pills (3/6) and M. magna were detected in 2 batches of Shenjindan capsules (2/4). The developed method in the study has good specificity, sensitivity, and feasibility, and could be used for quality control of Pheretima and its related preparations. It is of great significance for improving quality standards and regulating the medicinal market of Pheretima.

Key words

Pheretima / Metaphire magna / signature peptide / quality standard / Xiaohuoluo pill / Shenjindan capsule

引用本文

刘蕊, 张静娴, 胡青, 孙健, 于泓, 冉莹瑛, 黄帆, 毛秀红, 季申. 基于特征多肽的地龙鉴别与伪品保宁腔蚓检查方法的建立及应用. 药学学报, 2024 , 59 (10) : 2842 -2848 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0316

Rui LIU, Jing-xian ZHANG, Qing HU, Jian SUN, Hong YU, Ying-ying RAN, Fan HUANG, Xiu-hong MAO, Shen JI. Development and application of a method for identifying Pheretima and a common counterfeit of Metaphire magna based on signature peptides[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (10) : 2842 -2848 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0316

正文

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地龙原动物为蚯蚓, 是传统动物来源中药, 在东亚地区有着悠久而广泛的使用历史。中国药典(2020年版) 收载地龙来源为钜蚓科参环毛蚓Pheretima aspergillum (E. Perrier)、通俗环毛蚓Pheretima vulgaris Chen、威廉环毛蚓Pheretima guillelmi (Michaelsen) 或栉盲环毛蚓Pheretima pectinifera Michaelsen的干燥体, 前一种习称“广地龙”, 后三种习称“沪地龙”^[1]。地龙具有清热定惊、通络、平喘、利尿的传统功效, 临床应用广泛。近些年来, 药用地龙资源紧张, 价格逐渐上涨, 非药用蚯蚓加工成的样品混入地龙药材市场。文献^[2]报道目前市售地龙药材伪品和掺伪现象严重, 22%来源为参环毛蚓, 22%为通俗环毛蚓, 威廉环毛蚓和栉盲环毛蚓稀见, 而55%为非药典基原品种, 以保宁腔蚓(Metaphire magna) 为主。另有文献^[3]报道48批市售地龙饮片中20批为正品, 其中18批为参环毛蚓, 2批为通俗环毛蚓, 26批为伪品, 其中14批为暗孔远盲蚓(Amynthas obscuritoporus), 12批为大腔蚓(即保宁腔蚓), 可见市场上地龙药材混伪品众多, 以保宁腔蚓居多。

地龙为典型的动物来源中药, 主要化学成分为蛋白质、多肽、氨基酸、核苷及其碱基等初级代谢产物^{[4, 5]}。中国药典中理化鉴别, 采用薄层色谱法鉴定赖氨酸、亮氨酸、缬氨酸或者与对照药材比较, 文献^[6]还报道了高效液相色谱方法测定氨基酸、核苷等, 由于质控指标缺乏专属性, 正品与伪品无法区分; 分子鉴定技术可以准确鉴定药材、饮片种属来源^[7-10], 目前主要用于单品种样本的基原鉴定, 对于混合样本, 基于Sanger测序的DNA条形码分子鉴定法往往会给出套峰的结果, 无法进行序列读取, 因此该方法目前难以应用于混合样本(掺伪样品、含地龙的成方制剂) 的鉴定中。由于缺乏有效的质控方法, 市场上地龙药材混伪品众多。中国药典(2020年版) 收载的含地龙的成方制剂有50个^[1], 但是普遍缺少地龙的相关质控项目。因此, 很有必要建立地龙专属性鉴别方法、伪品保宁腔蚓的检查方法, 并将其应用于成方制剂中。

特征多肽是基于高分辨质谱结合组学、生物信息学、数学集合比较等研究策略发现的不同物种之间差异氨基酸序列^[11-13], 可以在质谱上表现为母离子和子离子不同, 实现鉴别, 因此具有物种的准确溯源性, 作为分子鉴定技术的补充, 特征多肽用于质控研究的报道越来越多^[14-16]。课题组前期研究^[17]中, 筛选出了广地龙、沪地龙及保宁腔蚓的特征多肽, 本文以这些特征多肽作为检测指标, 建立了地龙的鉴别方法和伪品保宁腔蚓的检查方法。选择以原粉入药, 且使用广泛的小活络丸和伸筋丹胶囊作为研究对象, 二者均收载于中国药典(2020年版) 一部^[1]。小活络丸具有祛风散寒、化痰除湿、活血止痛的功效, 处方含有六味药, 包括胆南星、制川乌、制草乌、地龙、乳香和没药, 关于地龙的质量标准项目为薄层鉴别, 以地龙对照药材为对照, 对其中非极性成分进行鉴别。伸筋丹胶囊具有舒筋通络、活血祛瘀、消肿止痛的功效, 处方含有八味药, 包括地龙、制马钱子、红花、乳香、防己、没药、香加皮和烫骨碎补, 关于地龙的质量标准项目仅有显微鉴别。本文在建立药材鉴别和伪品保宁腔蚓检查方法的基础上, 将其应用于制剂质控研究中, 研究成果对于提高地龙及相关制剂的质量标准、规范药材市场具有重要的作用。

材料与方法

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仪器 1290高效液相色谱仪, 6495三重四极杆质谱仪(QQQ-MS, 美国Agilent公司); Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司); 电子分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司); 离心机(德国Eppendorf公司); 恒温混匀仪MATRIX Orbital Delta F1.5和涡旋仪(德国IKA公司); 超声波清洗仪(德国Elma公司)。

试剂乙腈(质谱纯) 购自德国Merck公司; 甲酸(色谱纯) 购自阿拉丁试剂有限公司; 十二烷基硫酸钠(SDS) 购自德国Serva公司; 二硫苏糖醇(DTT)、三(羟甲基) 氨基甲烷、碘乙酰胺(IAA)、尿素、碳酸氢铵、胰蛋白酶均购自德国默克Sigma公司。保宁腔蚓多肽M对照品由上海吉尔生化有限公司合成, 纯度大于95%。地龙对照药材(来源参环毛蚓, 批号120987-202109) 购自中国食品药品检定研究院。

地龙样品收集 共收集到地龙药材54批(表 1), 代表性样品性状见图 1, 主要混伪品来源包括保宁腔蚓(Metaphire magna)、直隶腔蚓(M. tschiliensis)、多肉远盲蚓(Amynthas carnosus)、阿美远盲蚓(A. amis) 以及湖北远盲蚓(A. hupeiensis) 等, 其中保宁腔蚓与广地龙性状相似, 宽度一般大于2 cm, 较广地龙略宽, 背部棕褐色至黑褐色, 腹部黄棕色, 较广地龙颜色深; 直隶腔蚓、多肉远盲蚓、阿美远盲蚓与沪地龙相似。选择基原明确的广地龙和保宁腔蚓各5批, 分别等比例混合后, 按照保宁腔蚓占比1%、3%、5%、7%、10%与广地龙混合样混合均匀, 作为自制掺伪样品, 用于掺伪检查方法的建立。

含地龙中成药收集 收集到小活络丸6批XHLW1~6 (其中1、5为大蜜丸, 2~4、6为小蜜丸), 伸筋丹胶囊4批SJD1~4。收集处方中除地龙外的药材各一批, 包括胆南星、制川乌、制草乌、乳香、没药、制马钱子、红花、防己、香加皮、烫骨碎补, 按照各自处方量比例和制法自制阳性样品(含地龙对照药材) 和阴性样品, 用于专属性考察。

基原鉴定 依据中国药典(2020年版) 四部通则9107中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则进行品种鉴定。使用COI通用引物进行PCR扩增, 扩增产物委托苏州金唯智生物科技有限公司进行双向测序, 测序结果拼接后与NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 和中草药DNA条形码鉴定数据库(http://www.gpgenome.com/blast) 进行序列比对来鉴定样品基原。

特征多肽序列鉴定 课题组前期研究^[17]中, 收集了多批次地龙药材, 通过DNA条形码技术进行基原鉴定, 包含中国药典收载的四个品种, 还包括四种来源的伪品, 即广地龙常见伪品保宁腔蚓, 沪地龙常见伪品多肉远盲蚓、直隶腔蚓、阿美远盲蚓, 开展非标记定量蛋白质组学研究, 通过多元统计分析, 筛选出了广地龙、沪地龙及保宁腔蚓的特征多肽, 合成对照品, 并验证特征多肽序列结构, 序列信息详见表 2。

供试品溶液的制备 药材与饮片: 取本品粉末0.3 g, 加入蛋白裂解液[4%十二烷基硫酸钠(SDS), 20 mmol·L^-1二硫苏糖醇(DTT), 50 mmol·L^-1三(羟甲基) 氨基甲烷盐酸溶液(pH 8.8)] 5 mL, 置于80 ℃超声处理1 h, 放置至室温, 离心20 min (12 000 r·min^-1), 取上清液200 μL, 加入0.5 mol·L^-1碘乙酰胺(IAA) 溶液20 μL, 室温避光封闭放置45 min, 加入丙酮900 μL (-20 ℃预冷), 充分混匀, -20 ℃沉淀4 h, 于4 ℃离心20 min (12 000 r·min^-1), 弃去上清液, 残渣用丙酮(-20 ℃预冷) 洗涤2次, 每次200 μL, 丙酮挥干, 残渣加8 mol·L^-1尿素溶液50 μL, 超声处理30 min, 加50 mmol·L^-1碳酸氢铵溶液400 μL, 混匀, 加胰蛋白酶溶液20 μL (1 mg·mL^-1), 混匀, 37 ℃恒温酶解18 h, 作为供试品溶液。地龙对照药材及自制掺伪样品按照上述相同方法制备供试品溶液。成方制剂: 按照处方量计算相当于0.3 g地龙的制剂量, 按照药材供试品制备方法制备成制剂供试品溶液。

保宁腔蚓多肽M基质标准溶液的制备 取地龙对照药材, 按照“供试品溶液的制备”方法至酶解处理前, 得地龙基质溶液。取保宁腔蚓多肽M适量, 加地龙基质溶液制成浓度为1 μg·mL^-1的溶液, 作为标准储备溶液, 用地龙基质溶液配置浓度分别为0.01、0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1 μg·mL^-1的系列标准溶液。分别取上述溶液90 μL, 加入胰蛋白酶溶液(1 mg·mL^-1) 4 μL, 摇匀, 37 ℃恒温酶解18 h, 即得。

色谱条件 采用CORTECS T3 C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 2.7 μm); 以乙腈为流动相A, 以0.1%甲酸溶液为流动相B, 洗脱梯度为0~15 min, 13%~32% A; 进样量5 μL; 流速0.4 mL·min^-1。

质谱条件 采用电喷雾正离子模式(ESI⁺), 进行多反应监测(MRM), 干燥气温度200 ℃, 气体流速13.0 L·min^-1, 雾化气35 psi, 鞘气流速12 L·min^-1, 碎裂电压380 V, 母离子均为双电荷, 选择二级质谱图中响应好、碎片归属明确的子离子作为监测离子, 详见表 2。

专属性 分别精密吸取空白溶剂、广地龙(S19)、沪地龙(S1)、保宁腔蚓(S39) 以及沪地龙常见伪品(直隶腔蚓、多肉远盲蚓、阿美远盲蚓)、湖北远盲蚓等的供试品溶液, 按照上述色谱条件和质谱条件测定, 同时记录广地龙多肽G、沪地龙多肽H和保宁腔蚓多肽M相应的监测离子对, 来考察方法的专属性。

重复性 分别取广地龙样品(S19)、沪地龙样品(S1) 和自制掺伪样品(保宁腔蚓掺入量5%), 按照供试品溶液制备方法平行制备6份, 分别进样测定, 同时记录广地龙多肽G、沪地龙多肽H与保宁腔蚓多肽M的定量离子的保留时间和峰强度, 计算相对标准偏差(RSD) 值。

稳定性 分别取广地龙(S19)、沪地龙(S1) 和自制掺伪样品(保宁腔蚓掺入量5%) 的供试品溶液, 室温放置2、4、6、8、12、16、24 h后进样测定, 同时记录广地龙多肽G、沪地龙多肽H与保宁腔蚓多肽M的定量离子的保留时间和峰强度, 计算RSD值。

保宁腔蚓伪品检查方法基质效应 地龙总蛋白酶解后的混合溶液多肽组成复杂, 可能会干扰目标多肽离子响应, 以对照品溶液的峰面积与基质加标溶液的峰面积之比来考察方法的基质效应。

伪品保宁腔蚓检查方法基质标准曲线、线性范围及检出限 分别精密吸取系列标准溶液, 进样分析, 测得峰面积。通过稀释保宁腔蚓多肽M对照品溶液, 以实际观察信噪比分别为3、10时相应的浓度, 作为检出限(LOD) 和定量限(LOQ)。

耐用性 考察了三根色谱柱, CORTECS T3 C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 2.7 μm)、Agilent C18色谱柱(150 mm × 2.1 mm, 2.7 μm) 和WATERS BEH C18色谱柱(100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm), 按照上述色谱条件和质谱条件进样分析空白溶剂、地龙对照药材、保宁腔蚓多肽M基质对照品溶液(浓度100 ng·mL^-1)、广地龙样品(S19)、沪地龙样品(S1) 和保宁腔蚓样品(S39)。

结果

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1 方法学考察

1.1 专属性

在广地龙多肽G的监测离子对m/z 639.9→1 052.5和m/z 639.9→852.4提取的色谱图中, 广地龙呈现相应的色谱峰, 空白溶剂、沪地龙、保宁腔蚓以及沪地龙常见伪品(直隶腔蚓、多肉远盲蚓、阿美远盲蚓)、湖北远盲蚓等均未呈现相应色谱峰, 结果见图 2。在沪地龙多肽H的监测离子对m/z 715.9→686.4和m/z 715.9→799.5提取的色谱图中, 沪地龙呈现相应色谱峰, 空白溶剂、广地龙、保宁腔蚓以及沪地龙常见伪品(直隶腔蚓、多肉远盲蚓、阿美远盲蚓)、湖北远盲蚓等均未呈现相应色谱峰。在保宁腔蚓多肽M的监测离子对m/z 658.1→1 102.5和m/z 658.1→674.3提取的色谱图中, 保宁腔蚓呈现相应的色谱峰, 空白溶剂、广地龙、沪地龙以及沪地龙常见伪品(直隶腔蚓、多肉远盲蚓、阿美远盲蚓)、湖北远盲蚓等均未呈现相应色谱峰。以上结果表明地龙鉴别和伪品保宁腔蚓检查方法的专属性良好。

1.2 重复性

广地龙多肽G、沪地龙多肽H与保宁腔蚓多肽M的保留时间RSD分别为0.46%、0.52%和0.55%, 峰强度RSD分别为5.0%、6.4%和4.1%, 说明该方法重复性良好。

1.3 稳定性

广地龙多肽G、沪地龙多肽H与保宁腔蚓多肽M的保留时间RSD分别为2.5%、2.4%和2.6%, 峰强度RSD分别为3.4%、5.2%和7.0%, 表明供试品溶液室温放置24 h内基本稳定。

1.4 保宁腔蚓伪品检查方法基质效应

保宁腔蚓多肽M在标准曲线各浓度水平均存在较强的基质抑制效应(比值为16%~27%), 因此配制基质对照品溶液可更准确地反映保宁腔蚓的含量。

1.5 伪品保宁腔蚓检查方法基质标准曲线、线性范围及检出限

以峰面积为纵坐标(Y), 保宁腔蚓多肽M对照品浓度(X) 为横坐标, 绘制标准曲线, 线性方程为Y=342.918 951X-14 708.880 87、相关系数(r) 为0.999 4, 在0.05~1 μg·mL^-1内线性关系良好, LOD和LOQ分别为1和2 μg·g^-1。

1.6 耐用性

不同色谱柱考察结果显示方法专属性良好、参比溶液的信噪比均大于10, 可满足检验要求。

1.7 伪品保宁腔蚓检查方法判定原则

自制掺伪样品测定结果显示, 当保宁腔蚓掺入量为1%时, 即可检出保宁腔蚓多肽M的反应离子对m/z 658.1→1 102.5和m/z 658.1→674.3, 即检出保宁腔蚓; 掺入量1%~10%内呈现良好的线性关系(r = 0.997)。考虑到地龙以野生为主, 同一区域内可能同时有广地龙、保宁腔蚓, 以广地龙中掺入5%保宁腔蚓时的对照品浓度作为限度要求, 浓度约为100 ng·mL^-1。结果判定原则: ①供试品的提取离子流色谱中, 未同时出现与对照品溶液色谱相应的色谱峰, 视为未检出; ②供试品的提取离子流色谱中, 同时出现与对照品溶液色谱相应的色谱峰, 且供试品色谱中m/z 658.1→1 102.5的色谱峰面积值不大于对照品溶液中相应的峰面积值, 视为未检出; ③供试品的提取离子流色谱中, 同时出现与对照品溶液色谱相应的色谱峰, 且供试品色谱中m/z 658.1→1 102.5的色谱峰面积值大于对照品溶液中相应的峰面积值, 视为检出。

2 地龙药材测定

应用建立好的方法对54批市售地龙药材进行了分析, 结果显示19批(S1~S18、S54) 检出沪地龙多肽H, 占比35%, 绝大部分来源为通俗环毛蚓, 其中S54 DNA条形码分子鉴定结果显示为套峰, 除了检出威廉环毛蚓之外, 还检出了远盲蚓属未知品种; 19批(S19~S37) 检出广地龙多肽G, 占比35%; 8批(S38~S45) 检出保宁腔蚓多肽M, 占比15%, 其中S38还同时检出了多肽G和多肽H, 证明该样品为三种地龙混合样; 8批(S46~S53) 未检出任何多肽, 占比15%。可见地龙药材市场约30%样品为非药典规定的基原品种, 其中最主要的伪品来源为保宁腔蚓。

3 成方制剂中地龙的鉴别与伪品保宁腔蚓的检查分析

在广地龙多肽G离子对提取的色谱图中, 阳性样品均呈现与地龙对照药材保留时间一致的色谱峰, 阴性样品中均未呈现相应色谱峰, 表明方法的专属性良好。检测结果显示6批小活络丸中2批检出广地龙, 1批检出沪地龙, 3批样品未检出任何监测离子; 4批伸筋丹胶囊中, 2批检出广地龙, 1批检出保宁腔蚓, 1批同时检出了广地龙和保宁腔蚓。

讨论

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供试品溶液制备过程包括蛋白提取、纯化、还原烷基化、酶解等过程, 提取溶剂考察了水、0.9%氯化钠溶液和1%碳酸氢铵溶液, 参考中国药典(2020年版) 中阿胶^[1]的前处理方法, 结果显示均未检测到目标离子, 可见水溶液直接超声处理无法获取目标蛋白。参考文献^[18]方法, 考察了蛋白裂解液超声处理, 结果可检测到目标离子, 考察了超声温度对提取效率的影响, 以离子m/z 639.9→1 052.5和m/z 715.9→686.4的峰面积为指标, 结果显示, 随着温度的升高, 提取量逐渐增加, 80和90 ℃时差异不明显, 因此确定超声温度为80 ℃。

结果显示, 市场上地龙混伪品众多, 主要存在以下原因: 蚯蚓在我国品种繁多、产地分布广泛, 同一区域可能分布有多种蚯蚓品种。目前地龙药材来源仍以野生为主, 缺乏正品药用蚯蚓的养殖基地。同时, 因药用资源匮乏, 地龙收购价格水涨船高, 导致部分农户采用电击方式灭绝式捕杀, 更是加剧了正品资源的急剧减少。保宁腔蚓等伪品并非传统药用地龙来源, 缺乏药效及毒理作用的系统研究。因此, 建立规范的药用蚯蚓养殖和加工基地, 从源头把控药材质量是目前解决地龙混伪品众多的根本方法。

因地域差异, 中国药典中将地龙分为广地龙和沪地龙, 质量标准项目中薄层鉴别项以对照药材为对照, 来源为参环毛蚓, 即广地龙, 尚无沪地龙对照药材。本课题组前期研究发现广地龙和沪地龙在小分子初级代谢产物、蛋白多肽大分子成分以及溶栓活性物质分布方面均具有较大的差异, 因此有必要增加沪地龙对照药材, 建议选择市场主流品种通俗环毛蚓作为对照药材来源。

综上所述, 本研究采用UHPLC-MS/MS建立了地龙的鉴别和伪品保宁腔蚓特征多肽的检查方法, 检测结果与DNA条形码分子鉴定结果一致, 方法准确性好, 可用于地龙及其相关制剂的质量控制, 同时本研究对于推广动物类中药中特征多肽质控方法研究具有一定的参考价值。

作者贡献: 刘蕊负责实验操作、数据采集与分析、文章撰写; 张静娴负责总体方向、数据分析与文章撰写; 胡青、孙健负责数据分析和阐释; 于泓、冉莹瑛、黄帆负责方法考察和优化; 毛秀红负责审阅文章与行政支持; 季申负责技术与材料支持和获取研究经费。

利益冲突: 本文无任何利益冲突。

基金

收起

上海市中药和保健食品品质与安全检测专业技术服务平台(21DZ2290200)
2024年国家药品标准提高项目地龙(2024Z010)
上海市人才发展资金(2021085)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2024年第59卷第10期

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201

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0316

接收时间：2024-04-03
首发时间：2025-11-24
出版时间：2024-10-12

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出版历史

收稿日期：2024-04-03
修回日期：2024-07-28

基金

上海市中药和保健食品品质与安全检测专业技术服务平台(21DZ2290200)

2024年国家药品标准提高项目地龙(2024Z010)

上海市人才发展资金(2021085)

作者信息

1.上海中医药大学, 上海 201203

2.上海市食品药品检验研究院, 上海 201203

通讯作者:

^*张静娴, Tel: 86-21-38839900-26126, E-mail: zhjx_2003@163.com;

季申, Tel: 86-21-50798195, E-mail: jishen2013@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

No.	Origin	DNA identification		No.	Origin	DNA identification
S1	Anhui	Pheretima vulgaris		S28	Shanghai^*	P. aspergillum
S2	Shanghai	P. vulgaris	S29	Shanghai^*	P. aspergillum
S3	Shanghai	P. vulgaris	S30	Shanghai^*	P. aspergillum
S4	Shanghai	P. vulgaris	S31	Shanghai^*	P. aspergillum
S5	Shanghai	P. vulgaris	S32	Shanghai^*	P. aspergillum
S6	Shanghai	Pheretima guillelmi	S33	Shanghai^*	P. aspergillum
S7	Anhui	P. vulgaris	S34	Shanghai^*	P. aspergillum
S8	Anhui	P. vulgaris	S35	Shanghai^*	P. aspergillum
S9	Shanghai	P. vulgaris	S36	Guangdong	P. aspergillum
S10	Anhui	P. vulgaris	S37	Shanghai^*	P. aspergillum
S11	Shanghai	P. vulgaris	S38	Guangdong	Not assigned
S12	Anhui	P. vulgaris	S39	Guangdong	Metaphire magna
S13	Anhui	P. vulgaris	S40	Guangxi	M. magna
S14	Shanghai	P. vulgaris	S41	Fujian	M. magna
S15	Shanghai	P. vulgaris	S42	Hubei	M. magna
S16	Shanghai	P. vulgaris	S43	Guangxi	M. magna
S17	Shanghai	P. vulgaris	S44	Guangdong	M. magna
S18	Shanghai	P. vulgaris	S45	Guangdong	M. magna
S19	Hainan	Pheretima aspergillum	S46	Anhui	Amynthas amis
S20	Guangxi	P. aspergillum	S47	Anhui	A. amis
S21	Guangxi	P. aspergillum	S48	Shanghai	Amynthas carnosus
S22	Guangxi	P. aspergillum	S49	Shanghai	Metaphire tschiliensis
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S24	Anhui^*	P. aspergillum	S51	Thailand	Metaphire birmanica
S25	Anhui^*	P. aspergillum	S52	Guangdong	Amynthas
S26	Guangxi	P. aspergillum	S53	Unknown	Amynthas
S27	Shanghai^*	P. aspergillum	S54	Shanghai^*	Not assigned

No.

Origin

DNA identification

No.

Origin

DNA identification

Anhui

Pheretima vulgaris

S28

Shanghai^*

P. aspergillum

Shanghai

P. vulgaris

S29

Shanghai^*

P. aspergillum

Shanghai

P. vulgaris

S30

Shanghai^*

P. aspergillum

Shanghai

P. vulgaris

S31

Shanghai^*

P. aspergillum

Shanghai

P. vulgaris

S32

Shanghai^*

P. aspergillum

Shanghai

Pheretima guillelmi

S33

Shanghai^*

P. aspergillum

Anhui

P. vulgaris

S34

Shanghai^*

P. aspergillum

Anhui

P. vulgaris

S35

Shanghai^*

P. aspergillum

Shanghai

P. vulgaris

S36

Guangdong

P. aspergillum

S10

Anhui

P. vulgaris

S37

Shanghai^*

P. aspergillum

S11

Shanghai

P. vulgaris

S38

Guangdong

Not assigned

S12

Anhui

P. vulgaris

S39

Guangdong

Metaphire magna

S13

Anhui

P. vulgaris

S40

Guangxi

M. magna

S14

Shanghai

P. vulgaris

S41

Fujian

M. magna

S15

Shanghai

P. vulgaris

S42

Hubei

M. magna

S16

Shanghai

P. vulgaris

S43

Guangxi

M. magna

S17

Shanghai

P. vulgaris

S44

Guangdong

M. magna

S18

Shanghai

P. vulgaris

S45

Guangdong

M. magna

S19

Hainan

Pheretima aspergillum

S46

Anhui

Amynthas amis

S20

Guangxi

P. aspergillum

S47

Anhui

A. amis

S21

Guangxi

P. aspergillum

S48

Shanghai

Amynthas carnosus

S22

Guangxi

P. aspergillum

S49

Shanghai

Metaphire tschiliensis

S23

Guangdong

P. aspergillum

S50

Hebei

Amynthas hupeiensis

S24

Anhui^*

P. aspergillum

S51

Thailand

Metaphire birmanica

S25

Anhui^*

P. aspergillum

S52

Guangdong

Amynthas

S26

Guangxi

P. aspergillum

S53

Unknown

Amynthas

S27

Shanghai^*

P. aspergillum

S54

Shanghai^*

Not assigned

Name	Sequence	Precursor ion (m/z)	Product ion (m/z)	Collision energy/eV
Peptide G	LITVWENYLK	639.9	1 052.5^*	21
852.4	29
Peptide H	FEELLLGLQLQK	715.9	686.4^*	19
799.5	31
Peptide M	VLEGELAEAVER	658.1	1 102.5^*	17
674.3	29

Name

Sequence

Precursor ion (m/z)

Product ion (m/z)

Collision energy/eV

Peptide G

LITVWENYLK

639.9

1 052.5^*

852.4

Peptide H

FEELLLGLQLQK

715.9

686.4^*

799.5

Peptide M

VLEGELAEAVER

658.1

1 102.5^*

674.3