药学学报

Gene	Sequence (5' to 3')
NLRP3	F: CTTGCAGAAGCTGGGGTTG
R: GAGTCCTGTGTCTCCAAGGG
pro-IL-1β	F: CGCAGCAGCACATCAACAAGAGC
R: TGTCCTCATCCTGGAAGGTCCACG
pro-IL-18	F: CAGCATCAGGACAAAGAAAG
R: CAGTGTGCCCGAATAAAGAG
pro-caspase-1	F: TCAACATCTTTCTCCGAGG
R: GCAAGGCTTCTGTAACATCTC
β-Actin	F: CACCATGTACCCAGGCATTG
R: CCTGCTTGCTGATCCACATC

Gene	Sequence (5' to 3')
NLRP3	F: CTTGCAGAAGCTGGGGTTG
R: GAGTCCTGTGTCTCCAAGGG
pro-IL-1β	F: CGCAGCAGCACATCAACAAGAGC
R: TGTCCTCATCCTGGAAGGTCCACG
pro-IL-18	F: CAGCATCAGGACAAAGAAAG
R: CAGTGTGCCCGAATAAAGAG
pro-caspase-1	F: TCAACATCTTTCTCCGAGG
R: GCAAGGCTTCTGTAACATCTC
β-Actin	F: CACCATGTACCCAGGCATTG
R: CCTGCTTGCTGATCCACATC

田蓟苷下调TLR4/Myd88/NF-κB信号通路抑制NLRP3炎症小体和炎症反应

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张兴宇 ¹ , 徐磊 ² , 卡德尔业·卡德尔 ² , 王守宝 ³ , 邢建国 ²^,^* , 郑瑞芳 ²^,⁴^,^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(7): 2012-2019

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(7): 2012-2019

田蓟苷下调TLR4/Myd88/NF-κB信号通路抑制NLRP3炎症小体和炎症反应

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张兴宇¹, 徐磊², 卡德尔业·卡德尔², 王守宝³, 邢建国²^,^*, 郑瑞芳²^,⁴^,^*

作者信息

1.新疆医科大学药学院, 新疆乌鲁木齐 830011

2.新疆药物研究所, 新疆乌鲁木齐 830002

3.中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

4.中国药科大学基础医学与临床药学学院, 江苏南京 211198

通讯作者:

^*邢建国, Tel: 13999178585, E-mail: xjguodd@163.com;

郑瑞芳, E-mail: 872780352@qq.com

Tilianin downregulated TLR4/Myd88/NF-κB signaling pathway to inhibit NLRP3 inflammasome and inflammatory response

Xing-yu ZHANG¹, Lei XU², Kaderyea KADER², Shou-bao WANG³, Jian-guo XING²^,^*, Rui-fang ZHENG²^,⁴^,^*

Affiliations

1. College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China

2. Xinjiang Institute of Pharmacy, Urumqi 830002, China

3. Institute of Materia Medica, Peking Union Medical College and Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

4. School of Basic Medicine and Clinical Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China

出版时间: 2024-07-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0228

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摘要

收起

本研究通过脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 诱导RAW264.7细胞建立炎症反应模型, 探讨田蓟苷(tilianin) 对炎症反应的影响及其作用机制。通过CCK-8 (cell counting kit-8) 实验检测细胞活力, 酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA) 检测肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 和白细胞介素6 (interleukin 6, IL-6) 含量; Griess试剂法检测一氧化氮(nitric oxide, NO) 含量; 2', 7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA) 荧光探针检测细胞内活性氧(reactive oxygen radical, ROS) 水平; Western blot检测Toll样受体4 (Toll-like receptor 4, TLR4)、髓样分化因子88 (myeloid differentiation primary response gene 88, Myd88)、核转录因子-κB p65 (nuclear factor-κB p65, NF-κB p65)、磷酸化核转录因子-κB (phospho-nuclear factor-κB, p-NF-κB)、NF-κB抑制蛋白α (inhibitor of NF-κB α, ⅠκBα) 和磷酸化NF-κB抑制蛋白α (phospho-inhibitor of NF-κB α, p-ⅠκBα) 的蛋白表达水平; qRT-PCR法和Western blot检测Nod样受体蛋白3 (Nod-like receptor protein 3, NLRP3)、IL-1β前体(pro-IL-1β)、IL-18前体(pro-IL-18) 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前体(pro-caspase-1) 的mRNA和蛋白水平。免疫荧光染色检测NF-κB p65核转位; 使用TLR4抑制剂resatorvid (TAK242) 进一步验证田蓟苷对TLR4/Myd88/NF-κB信号通路的影响。结果显示, 田蓟苷显著降低了RAW264.7细胞上清中TNF-α、IL-6和NO水平以及细胞内ROS含量。田蓟苷降低了TLR4、Myd88、p-NF-κB p65和p-ⅠκBα蛋白表达水平, 抑制了NF-κB p65的核转位, 同时显著降低了NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-caspase-1的蛋白表达水平以及NLRP3和pro-IL-1β的mRNA水平。上述研究结果表明, 田蓟苷能明显减轻LPS诱导RAW264.7细胞产生的炎症反应, 其机制可能与下调TLR4/Myd88/NF-κB信号通路从而抑制NLRP3炎症小体有关。

关键词

田蓟苷 / 脂多糖 / RAW264.7细胞 / TLR4/Myd88/NF-κB通路 / NLRP3炎症小体

Abstract

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In this study, we investigated the anti-inflammatory effect and mechanism of tilianin in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW264.7 cells. The cell viability was detected by cell counting kit-8 (CCK-8) assay. The content of tumor necrosis factor α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) were detected by enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) kits. The content of nitric oxide (NO) was assayed by Griess reagent method. The level of intracellular reactive oxygen species (ROS) was detected by 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) fluorescent probe. The protein levels of Toll like receptor 4 (TLR4), myeloid differentiation primary response gene 88 (Myd88), nuclear factors κB p65 (NF-κB p65), phosphorylated nuclear factor κB p65 (p-NF-κB p65), nuclear factor κB inhibitory protein α (ⅠκBα) and phosphorylation nuclear factor κB inhibitory protein α (p-ⅠκBα) were detected by Western blot. The mRNA and protein levels of NLRP3, pro-IL-1β, pro-IL-18 and pro-caspase-1 were detected by qRT-PCR and Western blot. Immunofluorescence staining was used to detect the nuclear translocation of NF-κB p65. The effect of tilianin on the TLR4/Myd88/NF-κB signaling pathway was further validated by using the TLR4 signaling inhibitor restatorvid (TAK242). The results showed that tilianin significantly reduced the levels of TNF-α, IL-6 and NO in the supernatant of RAW264.7 cells and decreased the content of intracellular ROS. Tilianin reduced the levels of TLR4, Myd88, p-NF-κB p65 and p-ⅠκBα protein and nuclear translocation of NF-κB p65. Tilianin could reduce the protein levels of NLRP3, pro-IL-1β, pro-IL-18 and pro-caspase-1. Tilianin significantly inhibited the mRNA levels of NLRP3 and pro-IL-1β. The above research results indicated that tilianin could significantly alleviate the LPS-induced inflammatory response in RAW264.7 cells and its mechanism might be related to downregulate the TLR4/Myd88/NF-κB signaling pathway to inhibit NLRP3 inflammasome.

Key words

tilianin / lipopolysaccharide / RAW264.7 cell / TLR4/Myd88/NF-κB pathway / NLRP3 inflammasome

引用本文

张兴宇, 徐磊, 卡德尔业·卡德尔, 王守宝, 邢建国, 郑瑞芳. 田蓟苷下调TLR4/Myd88/NF-κB信号通路抑制NLRP3炎症小体和炎症反应. 药学学报, 2024 , 59 (7) : 2012 -2019 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0228

Xing-yu ZHANG, Lei XU, Kaderyea KADER, Shou-bao WANG, Jian-guo XING, Rui-fang ZHENG. Tilianin downregulated TLR4/Myd88/NF-κB signaling pathway to inhibit NLRP3 inflammasome and inflammatory response[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (7) : 2012 -2019 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2024-0228

正文

收起

田蓟苷(tilianin) 是新疆民族药香青兰中的主要活性成分, 属于黄酮类化合物, 本课题组在前期研究中发现^[1-3], 田蓟苷在心、脑缺血再灌注损伤以及动脉粥样硬化等疾病中均表现出一定的保护作用。在心肌缺血再灌注损伤中, 田蓟苷的保护作用主要与改善线粒体能量代谢、减轻氧化应激^[4]、抑制线粒体凋亡和减轻炎症反应有关^[5]。

炎症是对多种胞外病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs) 和损伤相关分子模式(damage/danger-associated molecular patterns, DAMPs) 诱导宿主免疫系统释放多种细胞因子和趋化因子的保护性反应^[6], 炎症的发生与Nod样受体蛋白3 (Nod-like receptor protein 3, NLRP3) 炎症小体的调控密切相关。NLRP3炎症小体是病原体感染或损伤的炎症反应中重要的组成部分^[7], 作为一种免疫传感器, 可检测到多种微生物和宿主来源的信号, 其活化需要启动和激活两个过程^{[8, 9]}。在启动阶段, 微生物分子或内源性细胞因子通过激活核转录因子-κB (nuclear factor-κB, NF-κB) 触发NLRP3、IL-1β前体(pro-IL-1β)、IL-18前体(pro-IL-18) 和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1前体(pro-caspase-1) 的转录。在激活阶段, 多种刺激促进NLRP3的寡聚化以及NLRP3炎症小体的组装, 随后启动一系列下游炎症反应。课题组发现田蓟苷能够抑制炎症反应, 但对NLRP3炎症小体的研究尚未进行, 因此本研究针对田蓟苷与NLRP3炎症小体的关系展开实验。

巨噬细胞是一种先天免疫细胞, 在炎症反应中发挥重要的作用, 而NLRP3炎症小体可以介导宿主对微生物感染和细胞损伤的免疫反应^[10], 选用巨噬细胞可以更好地研究NLRP3炎症小体导致的炎症反应。RAW264.7细胞具有巨噬细胞的特征, 包括吞噬功能和免疫调节能力, 常用于研究炎症和免疫反应^[11], 因此本研究选取RAW264.7细胞作为研究对象。

脂多糖(lipopolysaccharide, LPS) 是革兰阴性菌细胞壁的主要组成成分, 是导致机体炎症损伤的重要致病因子, 能够激活巨噬细胞产生多种促炎介质^[11]。根据报道可知, LPS能够识别Toll样受体4 (Toll-like receptor 4, TLR4), 随后通过信号转导至髓样分化因子88 (myeloid differentiation primary response gene 88, Myd88) 导致NF-κB的活化, 调节炎症基因的表达, 进而引发炎症, 分泌大量促炎介质。TLR4信号通路的启动导致了复杂的生物反应, 触发一系列炎症过程^{[12, 13]}。

本研究旨在从NLRP3炎症小体的视角深入研究田蓟苷在抗炎过程中的作用机制。通过利用LPS刺激RAW264.7细胞以诱发炎症反应, 观察田蓟苷在炎症过程中的表现, 并探讨其发挥抗炎作用的具体机制。这一发现为了解田蓟苷在抗炎作用中的机制提供了新的视角, 并可能为开发新的抗炎药物提供思路。

材料与方法

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药品与试剂 田蓟苷(HPLC纯度98%) 由新疆维吾尔自治区药物研究所自制(批号: 20170805); LPS (L2880, 纯度: ≥99%; 美国Sigma公司); 活性氧(reactive oxygen radical, ROS) 检测试剂盒、一氧化氮(nitric oxide, NO) 检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司); cell counting kit-8 (CCK-8) 试剂、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6) ELISA检测试剂盒、免疫荧光染色试剂盒-抗兔Elab Fluor®594 (武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司); 胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM高糖培养基、Bicinchoninicacid (BCA) 蛋白定量试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司); Radio Immunoprecipitation Assay (RIPA) (强) 裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(北京索莱宝科技有限公司); 磷酸酶蛋白抑制剂(兰杰柯科技有限公司); resatorvid (TAK-242) (美国MedChemExpres公司); p-NF-κB p65、inhibitor of NF-κB α (ⅠκBα)、phospho-ⅠκBα (p-ⅠκBα)、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 标记山羊抗兔lgG、HRP标记山羊抗小鼠lgG抗体(江苏亲科生物研究中心有限公司); RNA提取试剂盒、EasyScript® One-Step gDNA Remover and cDNA Synthesis SuperMix、PerfectStart® Green qPCR SuperMix、Passive Refrence Dye Ⅱ (50×) (北京全式金生物技术有限公司); TLR4、Myd88、IL-1β、IL-18、NLRP3抗体(英国Abcam公司); NF-κB p65抗体(美国Cell Signaling Technology公司); β-Tubulin抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司); ECL发光液、PVDF膜(孔径0.45 μm) (美国Millipore公司)。

仪器多功能微孔板检测仪(瑞士TECAN SPARK公司); 多功能成像系统(法国VILBER公司); 电泳仪和电泳槽(美国Bio-Rad公司); 台式高速冷冻离心机TGL-16k (湖南湘仪实验室仪器开发有限公司); 光学显微镜(日本OLYMPUS公司); 制冰机(杭州中冷电气有限公司); 超微量分光光度计(德国Implen公司); 旋涡振荡器(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司); 荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司); 微量移液器(德国艾本德股份公司)。

细胞株及细胞培养 RAW264.7细胞来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。在37 ℃、5% CO₂条件下, 用含10% FBS的DMEM高糖培养基传代培养, 实验用细胞均处于对数生长期。

模型建立及分组 将细胞分为control组、LPS组(1 µg·mL^-1)、田蓟苷组(5、10、20 µg·mL^-1) 和TAK242组(10 μmol·L^-1)。Control组不做处理, LPS组用1 µg·mL^-1 LPS处理, 田蓟苷组和TAK242组分别用5、10、20 µg·mL^-1田蓟苷和10 μmol·L^-1 TAK242预处理RAW264.7细胞12 h后, 用浓度为1 µg·mL^-1 LPS刺激6 h。

细胞活力检测 将RAW264.7细胞接种于96孔板中, 用田蓟苷(0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 µg·mL^-1) 干预24 h后, 将含有10% CCK-8试剂的DMEM高糖培养基加入每个孔中, 避光孵育60 min。用酶标仪在450 nm处测定每个孔的吸光度(A) 值, 计算细胞活力(cell viability)。

$ \mathrm{C}\mathrm{e}\mathrm{l}\mathrm{l}\;\mathrm{ }\mathrm{v}\mathrm{i}\mathrm{a}\mathrm{b}\mathrm{i}\mathrm{l}\mathrm{i}\mathrm{t}\mathrm{y}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{{A}_{\mathrm{药}\mathrm{物}\mathrm{处}\mathrm{理}\mathrm{孔}}-{A}_{\mathrm{空}\mathrm{白}\mathrm{孔}}}{{A}_{\mathrm{对}\mathrm{照}\mathrm{孔}}-{A}_{\mathrm{空}\mathrm{白}\mathrm{孔}}}\times 100 $

酶联免疫吸附实验(ELISA) 检测IL-6、TNF-α的含量 将RAW264.7细胞接种于96孔板中, 细胞给药后, 收集细胞上清, 1 000 ×g、4 ℃离心10 min后取上清, 选用相应ELISA检测试剂盒分别检测上清中TNF-α和IL-6含量。

GRIESS法测定NO的含量 取出Griess Reagent Ⅰ和Ⅱ, 使恢复室温。样品为细胞培养液上清, 用完全培养基稀释标准品。标准品的浓度取0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol·L^-1。在96孔板中, 每孔按50 μL加入标准品及样品, 接着在各孔中加入50 μL Griess Reagent Ⅰ和Griess Reagent Ⅱ, 随后立即在540 nm处测定A值。

ROS水平检测 去除6孔板中不同处理组的细胞培养基, 用无血清高糖培养基将2', 7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA) 稀释成终浓度为10 μmol·L^-1溶液, 将1 mL稀释后的溶液加入到孔中。在37 ℃细胞培养箱内孵育20 min, 用无血清高糖培养基洗涤细胞3次, 荧光显微镜下观察并拍照, 使用酶标仪在激发波长488 nm和发射波长525 nm条件下检测细胞平均荧光强度(mean fluorescence intensity, MFI)。

细胞免疫荧光 药物处理细胞后, 加入1 mL 4%多聚甲醛固定15 min, 去除固定液, 用TBST工作液洗3次, 每次5 min, 使用0.5% TritonX-100室温通透细胞15 min, 使用TBST浸洗玻片3次, 每次3 min, 用山羊血清封闭液封闭30 min, 去除封闭液, 滴加一抗100 μL NF-κB (1∶400) 4 ℃孵育过夜。去除一抗, 用TBST工作液洗涤3次, 每次5 min; 在盖玻片上加入100 μL含有Elab Fluor® 594标记的山羊抗兔IgG(H+L) 抗体(1∶50) 湿盒内37 ℃避光孵育60 min, 用TBST工作液洗涤5次, 每次5 min, 期间适当注意避光操作。后滴加DAPI染色液避光孵育5 min用于染细胞核, 用TBST工作液洗涤玻片5 min, 洗涤4次, 滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上, 盖上盖玻片, 在荧光显微镜下拍照。

qRT-PCR检测 按照RNA抽提试剂盒说明书进行提取, 进行RNA浓度测定后, 根据说明书进行逆转录反应。使用QuantStudio 3 Flex型实时荧光定量PCR仪进行扩增及检测设置, 引物见表 1。以β-actin为内参基因, 由2^-∆∆CT法计算基因的相对表达量。

Western blot检测 药物干预后, 加入RIPA细胞裂解液, 冰上裂解30 min后, 离心收集上清, 提取细胞蛋白, BCA法测定总蛋白浓度。各孔取30 μg蛋白上样, 于12%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离(浓缩胶电压70 V, 30 min; 分离胶电压120 V, 50 min)。将分离后的蛋白电转移(120 V, 90 min) 至PVDF膜。加入5%脱脂牛奶于摇床上室温封闭2 h; TBST洗膜3次, 每次5 min; 分别加入相应一抗(均1∶1 000), 4 ℃孵育过夜; 次日先以TBST洗膜3次, 每次10 min; 后加入HRP标记的二抗(1∶2 000), 室温孵育2 h; 再用TBST洗膜3次, 每次10 min。随后按ECL试剂盒说明进行曝光显影, 并用Image J软件分析条带灰度。

统计学分析 采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理和作图, 结果均以x ± s表示, 采用单因素方差ANOVA进行多组数据间比较分析, 认为P < 0.05差异具有统计学意义。

结果

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1 田蓟苷减轻LPS诱导的RAW264.7细胞NO和炎症因子释放

如图 1A所示, 0、0.625、1.25、2.5、5、10、20 µg·mL^-1质量浓度的田蓟苷作用于RAW264.7细胞24 h, 用CCK-8法测定细胞活力, 根据图 1A所示, 各浓度条件下对RAW264.7细胞均未显示出明显的损伤效应。结合前期实验室的相关研究, 本研究选定田蓟苷的质量浓度为5、10、20 µg·mL^-1, 用于后续的深入实验研究。

LPS刺激后产生NO是炎症过程的重要反映, 许多炎症性疾病都会导致巨噬细胞产生过量的NO^[14]。用LPS刺激6 h后, 检测细胞培养上清液中NO的含量变化, 图 1B所示, 田蓟苷处理组NO释放量显著降低。细胞因子是调节宿主对炎症反应的重要介质。为了进一步研究田蓟苷的抗炎作用, 采用ELISA试剂盒检测了IL-6和TNF-α的含量变化。图 1C中结果显示, 在田蓟苷的作用下, IL-6和TNF-α的释放量都明显下降。

2 田蓟苷显著降低LPS诱导RAW264.7细胞的ROS水平

炎性细胞在受到刺激时, 会产生损伤细胞和组织的ROS, 过量的ROS还可以激活参与炎症过程的信号通路。消除ROS可能对治疗炎症相关疾病有益^[15]。为了研究田蓟苷对ROS的影响, 采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS的含量, DCF荧光强度MFI与细胞内ROS水平成正比。结果显示, 与control组比较, LPS组细胞内ROS水平升高(P < 0.01); 与LPS组比较, 田蓟苷处理组细胞内ROS水平降低(图 2)。

3 田蓟苷在LPS诱导的RAW264.7细胞中抑制NF-κB活化与核转位

NF-κB是调节大多数促炎细胞因子表达的重要转录因子, 是引起炎症反应的关键因素^[16]。为了探讨NF-κB的激活状态, 通过Western blot检测了NF-κB的磷酸化水平变化, 根据图 3A、B结果显示, 在LPS组中, p-NF-κB p65的蛋白表达升高(P < 0.05), 经过田蓟苷处理后, NF-κB p65的磷酸化受到抑制。同时, 通过免疫荧光结果分析(图 3C), 观察到LPS组中的NF-κB p65入核现象明显, 而在田蓟苷处理组中, 核转位现象得到了有效抑制。这些结果表明, 田蓟苷能够抑制NF-κB的活化, 因此可以减轻NF-κB通路介导的炎症反应。

4 田蓟苷在LPS诱导的RAW264.7细胞中抑制NLRP3炎症小体启动

NF-κB的激活能够上调NLRP3炎症小体中NLRP3和pro-IL-1β等蛋白的表达^[17]。本研究采用Western blot和qRT-PCR检测NLRP3炎症小体启动阶段的蛋白和mRNA水平。如图 4A、B所示, 田蓟苷处理组中NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-casepase-1等蛋白的表达明显降低; 根据图 4C, 田蓟苷处理组中NLRP3和pro-IL-1β的mRNA水平也有显著下降, 说明田蓟苷能够抑制NLRP3炎症小体的启动。

5 田蓟苷下调LPS诱导的RAW264.7细胞中TLR4/Myd88/NF-κB信号通路

为了研究田蓟苷抑制炎症反应的作用机制, 采用Western blot和免疫荧光技术检测在LPS诱导RAW264.7细胞的炎症反应模型中TLR4和Myd88的表达、ⅠκBα的磷酸化以及NF-κB的核转位。结果显示, LPS处理激活了TLR4/Myd88通路, 该通路被田蓟苷显著抑制。如图 5所示, 与control组比较, LPS组中TLR4和Myd88的蛋白表达升高, ⅠκBα的磷酸化水平升高, NF-κB的入核现象明显增加, 田蓟苷处理组抑制了TLR4、Myd88、p-ⅠκBα的蛋白表达和NF-κB的入核现象。TAK242作为TLR4抑制剂, 能有效抑制TLR4下游蛋白的表达, 从图 5可知, 在降低TLR4、Myd88、p-ⅠκBα的蛋白表达和抑制NF-κB p65核转位等方面, 田蓟苷均表现出与TAK242一致的作用。

讨论

收起

炎症是对外来刺激的一种防御性免疫反应, 是一些疾病的共有基础病理机制^[18], 会导致肺损伤、心脑血管疾病、神经退行性疾病, 甚至死亡的发生^[19]。LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分, 可诱导哺乳动物细胞产生免疫反应, 释放促炎性细胞因子。在本研究中使用小鼠巨噬细胞RAW264.7来研究田蓟苷的抗炎作用。本研究结果发现, 田蓟苷显著降低了LPS诱导RAW264.7细胞产生NO、IL-6和TNF-α的含量, 表明田蓟苷可以减轻LPS诱导的炎症反应, 具有良好的抗炎活性。细胞内ROS水平的降低表明田蓟苷可能抑制细胞中的氧化应激反应。

NLRP3炎症小体的启动是由于LPS激活NF-κB上调NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-caspase-1蛋白表达^[20]。本研究通过LPS刺激RAW264.7细胞后检测到NLRP3炎症小体启动过程相关蛋白表达的升高, 表明NLRP3炎症小体被成功启动, 随后加入田蓟苷保护, 田蓟苷处理组能够明显降低NLRP3、pro-IL-1β、pro-IL-18和pro-caspase-1的蛋白表达水平以及NLRP3和pro-IL-1β的mRNA水平, 因此田蓟苷抑制了炎症反应中NLRP3炎症小体的启动过程。

在NLRP3炎症小体的启动阶段中, TLR4/Myd88/NF-κB信号通路是主要的调控通路^[21]。根据研究显示^{[17, 22, 23]}, TLR4在免疫细胞表面具有广泛的表达, 通过识别特定的结构分子来介导免疫和炎症反应。在LPS的刺激下, TLR4及其下游通路被激活, 进而募集Myd88到TLR4上, 随后Myd88通过与下游衔接分子的相互作用来激活ⅠκB激酶, 并导致ⅠκBα的磷酸化和降解。这一系列反应应答最终诱导NF-κB二聚体进入细胞核, 使NF-κB活化, 随后NLRP3炎症小体被启动。有研究表明, 根据一些天然产物结构作为模板设计合成的NZ^[19]就是通过TLR4/NF-κB信号通路抑制了NLRP3炎症小体, 改善了炎症反应。

在本研究中, 田蓟苷处理组降低了TLR4和Myd88的蛋白表达, 并且抑制了ⅠκBα和NF-κB p65的磷酸化水平, NF-κB的核转位减弱, 抑制了NF-κB的入核现象。为了进一步探讨田蓟苷在TLR4/Myd88/NF-κB信号通路中的作用, 使用TLR4抑制剂resatorvid (TAK-242) 阻断了TLR4下游信号分子的表达, 而田蓟苷也发挥了类似的作用。

综上所述, 田蓟苷可以在炎症反应中起到抗炎作用, 其机制可能是通过下调TLR4/Myd88/NF-κB信号通路抑制NLRP3炎症小体有关。未来, 本课题组将进一步研究田蓟苷对NLRP3炎症小体的影响, 挖掘其在炎症性疾病中的应用潜力。

作者贡献: 张兴宇进行实验操作、数据分析和统计, 并撰写论文; 王守宝进行实验设计; 卡德尔业·卡德尔、徐磊监督和协助实验进行以及实验数据分析和统计; 郑瑞芳和邢建国指导和监督实验过程并协助论文的撰写。

利益冲突: 本文所有作者声明不存在利益冲突关系。

基金

收起

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2022D01D50)
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2023D01B46)
新疆维吾尔自治区自然科学基金(2023D01E10)
国家自然科学基金资助项目(82204767)
中央引导地方科技发展专项(ZYYD2022A02)
第二批天山英才培养计划青年托举人才项目(2023TSYCQNTJ0010)
新疆维吾尔自治区科研业务费(ky2023091)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2024年第59卷第7期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2024-0228

接收时间：2024-03-13
首发时间：2025-11-26
出版时间：2024-07-12

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出版历史

收稿日期：2024-03-13
修回日期：2024-04-26

基金

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2022D01D50)

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2023D01B46)

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2023D01E10)

国家自然科学基金资助项目(82204767)

中央引导地方科技发展专项(ZYYD2022A02)

第二批天山英才培养计划青年托举人才项目(2023TSYCQNTJ0010)

新疆维吾尔自治区科研业务费(ky2023091)

作者信息

1.新疆医科大学药学院, 新疆乌鲁木齐 830011

2.新疆药物研究所, 新疆乌鲁木齐 830002

3.中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

4.中国药科大学基础医学与临床药学学院, 江苏南京 211198

通讯作者:

^*邢建国, Tel: 13999178585, E-mail: xjguodd@163.com;

郑瑞芳, E-mail: 872780352@qq.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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