药学学报

富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽体内外mRNA基因递送能力及安全性评价

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王一醇 ¹ , 蒲艺瑶 ¹ , 毕群杰 ¹ , 宋相容 ² , 金蓉蓉 ¹ , 聂宇 ¹^,^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(4): 1079-1086

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(4): 1079-1086

富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽体内外mRNA基因递送能力及安全性评价

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王一醇¹, 蒲艺瑶¹, 毕群杰¹, 宋相容², 金蓉蓉¹, 聂宇¹^,^*

作者信息

1.四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心/四川大学生物医学工程学院, 四川成都 610064

2.四川大学, 生物治疗全国重点实验室, 四川成都 610041

通讯作者:

^*聂宇, Tel: 13699024669, E-mail: nie_yu@scu.edu.cn

mRNA delivery and safety evaluation of arginine-rich amphipathic cationic lipopeptides in vivo and in vitro

Yi-chun WANG¹, Yi-yao PU¹, Qun-jie BI¹, Xiang-rong SONG², Rong-rong JIN¹, Yu NIE¹^,^*

Affiliations

1. National Engineering Research Centre for Biomaterials/College of Biomedical Engineering, Sichuan University, Chengdu 610064, China

2. State Key Laboratory of Biotherapy, Sichuan University, Chengdu 610041, China

出版时间: 2024-04-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1443

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摘要

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mRNA基因治疗因其可扩展、修饰, 不需要进入细胞核及不整合宿主遗传基因等优势而备受关注。在基因治疗中, 将mRNA安全有效地递送到细胞内对于基因治疗的成功至关重要。本研究基于前期设计合成的富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽(dendritic arginine & disulfide bond-containing cationic lipopeptide, RLS) 基因载体在斑马鱼体内成功实现比商品化试剂Lipofectamine 2000高1.5倍的mRNA转染效果, 并通过体外细胞毒性和斑马鱼体内生物安全性研究证实其具有良好的生物安全性。首先, 通过核磁共振氢谱(¹H NMR) 及飞行时间质谱(MALDI-TOF) 对阳离子脂质肽的化学成分进行表征。通过动态光散射粒度分析仪(DLS) 测试的粒径和电位结果显示, 在氮磷(N/P) 比为20时, RLS与mRNA复合组装体形成平均粒径约220 nm、表面ζ电位约+21 mV的均匀纳米粒子。体外基因转染中, RLS在人胚肾293细胞(HEK293) 和大鼠间充质干细胞(MSC) 中的转染效率较Lipofectamine 2000分别提高1.2和3倍。此外, 将RLS显微注射至斑马鱼胚胎后, 通过评价生存率、孵化率和致畸率等指标, 进一步证实了其在体内良好的安全性。综上所述, 该富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽RLS具有优良的mRNA递送性能和安全性。

关键词

支化精氨酸 / 两亲性阳离子脂质肽 / 基因载体 / mRNA递送 / 斑马鱼

Abstract

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mRNA gene therapy has attracted much attention due to its advantages such as scalability, modification, no need to enter the nucleus and no integration of host genes. In gene therapy, safe and effective delivery of mRNA into cells is critical for the success of gene therapy. In this study, we designed and synthesized an amphiphilic cationic lipopeptide gene vector (dendritic arginine & disulfide bond-containing cationic lipopeptide, RLS) enriched with branched arginine. We achieved a 1.5-fold higher mRNA transfection efficiency in zebrafish compared to the commercial reagent Lipofectamine 2000, and confirmed its good biosafety by in vitro cytotoxicity and in vivo biosafety. First, we characterized the chemical composition of the cationic lipid peptides by nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy (¹H NMR) and time-of-flight mass spectrometry (MS). The results of particle size and potential tested by dynamic light scattering particle size analysis showed that at a nitrogen/phosphorus (N/P) ratio of 20, the RLS/mRNA composite assemblies formed homogeneous nanoparticles with an average particle size of about 220 nm and a surface ζ potential of about +21 mV. In vitro gene transfection, the transfection experiments demonstrated that RLS exhibited 1.2-fold higher transfection efficiency in human embryonic kidney 293 cells (HEK293) and 3-fold higher transfection efficiency in rat mesenchymal stem cells (MSC) compared to Lipofectamine 2000. In addition, after microinjection of RLS into zebrafish embryos, we evaluated the survival, hatching, and teratogenicity rates, all of which confirmed its favorable in vivo safety profile. Thus, this amphiphilic cationic lipid peptide RLS, enriched with branched arginine, exhibits excellent mRNA delivery properties and safety. These findings highlight its potential as a promising gene therapy tool.

Key words

branched arginine / amphiphilic cationic lipid / gene vector / mRNA delivery / zebrafish

引用本文

王一醇, 蒲艺瑶, 毕群杰, 宋相容, 金蓉蓉, 聂宇. 富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽体内外mRNA基因递送能力及安全性评价. 药学学报, 2024 , 59 (4) : 1079 -1086 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1443

Yi-chun WANG, Yi-yao PU, Qun-jie BI, Xiang-rong SONG, Rong-rong JIN, Yu NIE. mRNA delivery and safety evaluation of arginine-rich amphipathic cationic lipopeptides in vivo and in vitro[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (4) : 1079 -1086 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1443

正文

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mRNA有着可扩展、可修饰、不需要进入细胞核发挥作用及不整合宿主遗传基因组的优势, 近年来在基因治疗中受到广泛关注^[1]。目前, 尽管病毒性载体用于mRNA递送具有高转染效率, 但依然存在免疫原性和病毒性重组等安全性问题^[2]。相比之下, 非病毒性载体在递送mRNA时, 其免疫原性和细胞毒性较低^{[3, 4]}, 同时也不限制载体容量且化学结构可控制。因此, 基于非病毒载体的基因(mRNA) 治疗现已成为广泛应用于肿瘤^[5]、心血管^[6]及其他免疫缺陷疾病的治疗手段^[7-9]。2019年冠状病毒的流行加速了基于可电离脂质(LNP) 的mRNA疫苗生产, 其中Moderna公司的Spikevax和辉瑞公司/BioNTech的Comirnaty在2021年获得批准^[10]。阳离子脂质是LNP的核心组分, 通常约占总脂质体的50%, 同时显著影响载体的基因递送性能。作为目前使用最广泛的非病毒载体, 阳离子脂质主要由亲水性头部、连接键和疏水性尾部组成, 基因递送效率和生物安全性与上述组成成分密切相关。

带正电荷的亲水性头部通过静电相互作用与带负电荷的基因复合, 起到包封、保护和递送mRNA的作用。然而, 过强的正电性会导致核酸结合过紧, 从而降低基因传递效率, 增加细胞毒性^{[11, 12]}。此外, 在血清存在的条件下, 为了达到最佳的转染效果, 往往需要设置较高的氮磷比, 这会进一步增加载体的用量, 并增加细胞毒性^[13]。连接键作为基因递送中的关键组分, 具有环境响应特性^[14-16], 除了影响转染效果^[17-20], 还会影响阳离子脂质的稳定性^[21], 可降解性和细胞毒性^[22]。其中, 具有高氧化还原灵敏度的二硫键作为阳离子脂质连接键, 已显示出诸多优点, 包括易于制备、降低载体细胞毒性和高效释放基因^{[23, 24]}。阳离子脂质的疏水性尾部通常具有C8∶0到C18∶1的碳链长度和不饱和度, 其中C18∶1单不饱和脂肪酸链可以提高膜流动性, 从而实现最佳的转染效果^[25]。然而, 有研究表明, 短饱和烃链或长不饱和烃链可能降低双分子层的流动性, 并且增加烷基链的长度不利于脂质单体的膜间转移和脂质膜混合, 导致DNA难以逃逸^[26]。因此, 设计一个具有高效基因转染效率和良好安全性的阳离子脂质体至关重要。

目前对阳离子脂质的安全性评估仍局限于细胞层面, 缺乏对体内安全性的全面评价, 尤其是对动物生长发育的影响方面的研究尚不充分。为了填补这一研究空白, 作者选择了斑马鱼作为动物模型, 因其具有低饲养成本、短繁殖周期、胚体透明和体外发育等特点, 在生命科学领域已被广泛应用^[27]。并且, 斑马鱼基因与人类基因的相似性高达87%, 因此将其作为安全性评估的动物模型, 可以较为准确地反映材料在人体内的毒性和作用^{[28, 29]}。此外, 斑马鱼的胚体发育可以通过光学显微镜实时观察, 这有利于实现药物对有机体影响的实时评价, 为药物安全性评估和药物筛选提供了有利平台。

根据之前的研究, 本课题组设计合成了一种富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽(dendritic arginine & disulfide bond-containing cationic lipopeptide, RLS)。该载体由精氨酸头部、油酸疏水尾部和二硫键连接部分组成, 具有良好的基因压缩、内体逃逸性能及良好的环境响应性, 在多个细胞中已被证实具有出色的pDNA^{[23, 30, 31]}和siRNA^[32]基因递送效果。为进一步研究该基因载体的性能和安全性, 本研究对其进行了物理性能分析, 并在体内外评估了其mRNA递送效率及在细胞和动物层面的生物安全性。

材料与方法

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材料与动物 二甲基亚砜(DMSO, 99%, 中国Adamas); Lipofectamine 2000 (Lipo 2000, 美国Invitrogen); 人胚肾293细胞(HEK293)、大鼠间充质干细胞(MSC) (中国科学院上海库); CCK-8试剂盒(日本Dojin); Minimum Essential Medium培养基(MEM培养基)、α-Minimum Essential Medium培养基(α-MEM培养基)、PBS缓冲液、南美血清(美国Gibco); 琼脂糖(西班牙Biowest); 绿色荧光蛋白mRNA (EGFP mRNA, 本实验室合成); 野生型斑马鱼(AB line, 国家斑马鱼资源中心)。

仪器磁力搅拌器(德国IKA); 移液器(德国Eppendorf); 倒置荧光显微镜(德国Leica); 细胞培养箱(美国ThermoFisher); 纳米粒度-电位测试仪(英国Malvern); LSM 880激光共聚焦扫描显微镜(LSM 880)、S9 E体式显微镜、Discovery. V20体式显微镜(德国Zeiss); P-2000型拉针仪(美国Axon); SYS-PV830显微注射系统(美国Word Precision Instruments); DC2200型高能LED光源(美国THORLABS)。

两亲性阳离子脂质肽/基因复合物的制备及物理表征

RLS自组装体的制备采用注入法制备得到1 mg·mL^-1 RLS自组装体。具体实验步骤如下: 称取1 mg RLS固体粉末, 将其完全溶于100 μL DMSO, 用10 μL移液枪将其缓慢滴加入快速搅拌下的900 μL去离子水中, 滴加完后继续搅拌1 h, 使RLS形成自组装脂质纳米颗粒。

RLS/EGFP mRNA复合物的制备将200 ng EGFP mRNA (100 μg·mL^-1) 加入到不同浓度的RLS中, 以获得所需N/P比例, 然后在室温下静置20 min得到RLS/EGFP mRNA复合物。

RLS/EGFP mRNA复合物的粒径电位测定采用马尔文纳米粒度-电位测试仪对RLS/EGFP mRNA复合物在室温下的粒径和电位进行测定。

RLS/EGFP mRNA复合物基因递送效果评价

体外基因递送效果评价 HEK293细胞在加入10%胎牛血清的MEM培养基中培养。MSC细胞在加入10%澳洲胎牛血清的α-MEM培养基中培养。

当细胞的融合度达到80%~90%时, 将HEK293和MSC细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板中, 细胞贴壁培养24 h, 吸出原培养基, 然后向每孔分别加入含有血清和不含血清的培养基90 μL。随后, 加入不同N/P比的RLS/EGFP mRNA复合物及作为对照的Lipofectamine 2000 (0.5 μg/200 ng mRNA), 与细胞共同培养4 h。之后更换含有血清的新鲜培养基100 μL, 继续培养44 h后使用荧光显微镜评估转染效率, 并使用ImageJ软件进行半定量分析。

体内基因递送效果评价

斑马鱼的饲养在自动水循环系统内饲养野生斑马鱼, 水温维持在28 ℃, 光暗周期为14/10 h, 每日喂食丰年虫2次。雌雄斑马鱼交配周期为15天左右, 受精后的胚胎培养在胚胎培养液中, 温度维持在28 ℃, 定期观察胚胎发育的情况。

RLS/EGFP mRNA复合物的制备以自组装的方式将阳离子脂质RLS在DEPC水中制备成浓度为2 mg·mL^-1的工作液, 将EGFP mRNA用DEPC水稀释成质量浓度为1 mg·mL^-1的工作液。使RLS与EGFP mRNA于无酶条件下以N/P为20的比例孵育制备复合物。作为对照, Lipo 2000按照说明书工作浓度与EGFP mRNA复合。以DEPC水与EGFP mRNA混合制备相同浓度的裸基因阴性对照。

RLS/EGFP mRNA复合物的体内显微注射孵育20 min后, 将注射液装入显微注射针, 参数调节及注射方式同上。

RLS/EGFP mRNA复合物体内转染效果表征于受精后(hours post fertilization, hpf) 24和48 h, 用激光共聚焦显微镜观察斑马鱼胚胎内的EGFP蛋白表达情况。并利用ImageJ软件统计胚胎内的平均荧光强度。

RLS体外安全性评估 为了评估RLS/EGPF mRNA复合物的细胞毒性, 当细胞的融合度达到80%~90%时, 将HEK293和MSC细胞以1×10⁴个细胞/孔的密度接种于96孔板中, 细胞贴壁培养24 h, 吸出原培养基加入含有10% 血清的新鲜完全培养基。随后, 在每孔中加入不同N/P比的RLS/EGFP mRNA复合物, 其中含有200 ng EGFP mRNA, 并以Lipofectamine 2000 (0.5 μg/200 ng mRNA) 作为对照。每组实验设置4个复孔。细胞与复合物在无菌培养箱共培养4 h后, 更换新鲜完全培养基, 继续培养44 h。在培养结束后, 弃去孔中溶液, 并加入含有10% CCK-8的无血清培养基100 μL, 继续培养1 h后, 使用酶标仪在450 nm处检测吸光度(A) 值, 并计算细胞存活率。公式如下:

$ \mathrm{细}\mathrm{胞}\mathrm{存}\mathrm{活}\mathrm{率}\left(\mathrm{\%}\right)=\frac{\left({A}_{\mathrm{s}}-{A}_{\mathrm{b}}\right)}{\left({A}_{\mathrm{c}}-{A}_{\mathrm{b}}\right)}\times 100\mathrm{\%} $

其中, A_s、A_b、A_c分别为实验样品溶液、空白对照、对照样的吸光度值。

RLS体内安全性评估

胚胎形态、生存期和孵化率的检测于24、48、72及96 h观察注射后斑马鱼胚胎形貌, 用体式显微镜进行拍照, 并统计其生存率和孵化率。

致畸率的检测在胚胎完全孵育后(约受精后96 h), 利用体式显微镜对不同组别内斑马鱼幼鱼的尾巴卷曲、脊柱侧凸及心包水肿情况进行观察, 与野生型斑马鱼进行比较, 并统计其百分率。

数据处理 所有实验均进行3次独立平行实验, 采用GraphPad Prism 9.0进行数据分析和作图, 结果均用

$ \overline{x} $

± s表示, 采用单因素方差分析(ANOVA) 进行多组间比较, P < 0.05认为差异有统计学意义。

结果与讨论

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1 阳离子脂质肽RLS的合成与表征

富含支化精氨酸的两亲性阳离子脂质肽(RLS) 合成路线是按照课题组的前期工作所进行^[23]。通过核磁共振氢谱¹H NMR确认RLS化学结构, 结果如图 1A所示: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ 5.35 (s, 4H), 4.61 (s, 2H), 3.71 (s, 4H), 3.05 (s, 2H), 2.95 (s, 6H), 2.76 (s, 4H), 2.02 (s, 12H), 1.74 (s, 8H), 1.63 (s, 12H), 1.23 (s, 44H), 0.85 (s, 6H)。

飞行时间质谱结果图 1B显示RLS形成的离子峰[M+TFA]⁺ = 1 362.953 0。核磁质谱和飞行质谱结果进一步验证了RLS的结构正确。

2 RLS和RLS/EGFP mRNA基因复合物的物理表征

据报道, 具有适当的正电荷及尺寸(50~200 nm) 的纳米粒对于细胞膜黏附和细胞摄取更具有优势^[33]。作者首先使用马尔文纳米粒度-电位测试仪对RLS及不同N/P比的RLS/EGFP mRNA复合物进行粒径和电位测试, 如图 2所示, RLS的粒径约150 nm, 电位约为+26 mV。随着RLS/EGFP mRNA复合物N/P比的增加, 粒径呈现下降趋势, 而电位呈上升趋势, 表明基因能很好地被压缩成小尺寸纳米粒。

3 RLS/EGFP mRNA基因复合物体外基因递送效果评价

在HEK293和MSC细胞中评估了RLS/EGFP mRNA复合物的体外转染效率, 并考察了不同N/P比及有无血清条件下的转染效果, 以Lipo 2000作为阳性对照。随着RLS与EGFP mRNA的N/P比增加, 转染率呈先增高后降低的趋势。当N/P比为20时, HEK293和MSC细胞表现出最佳的转染效果(图 3A、B)。通过ImageJ半定量分析, 发现在含有血清条件下, N/P比为20的RLS在HEK293和MSC细胞中的平均荧光强度分别是阳性对照组的1.2倍和3倍(图 3C、D)。

4 RLS/EGFP mRNA基因复合物在斑马鱼体内的转染效果表征

将2 mg·mL^-1 RLS和1 mg·mL^-1 EGFP mRNA以N/P为20的比例进行孵育, 随后将每个胚胎注射2 nL的体积至斑马鱼胚胎中。在24 hpf时期, 与裸EGFP mRNA组相比, 可明显观察到RLS/EGFP mRNA注射后的斑马鱼胚胎展现出更好的转染效果, 主要分布在躯干区域。而Lipo 2000/EGFP mRNA组仅产生自体荧光信号(图 4A)。在体内基因递送方面, RLS/EGFP mRNA的效果是Lipo 2000/EGFP mRNA和裸EGFP mRNA的1.5倍(图 4B)。在48 hpf时期, 由于生物体自身的代谢的影响, 各组的荧光信号有所减弱, 但在RLS/EGFP mRNA注射的胚胎中可以观察到逐渐向脑部区域的分布。因此, 作者认为RLS在体内具有更好的基因递送效果。

5 RLS/EGFP mRNA基因复合物体外安全性评估

为了评价基因载体系统的生物相容性本研究通过CCK-8实验, 在HEK293细胞中测定了RLS/EGFP mRNA复合物的细胞毒性。如图 5所示, 在有血清条件下, 使用N/P比为10~40范围的RLS时, 它表现出良好的细胞相容性。尤其是在高N/P比下(N/P = 40), HEK293细胞的存活率依然为95%以上。相比之下, 商品化试剂Lipo 2000细胞毒性明显, 其存活率为82%。

6 RLS/EGFP mRNA基因复合物体内安全性评估

确认RLS在体内能够高效地实现基因递送验证其体内生物安全性十分关键。因此, 将基因载体与EGFP mRNA复合后, 通过显微注射方式将其注入斑马鱼胚胎卵黄。以野生型斑马鱼(AB line) 作为对照组, 探究其对生物体生存、生长的影响。通过观察胚胎的明场图片, 在48及72 hpf, 对照组和裸EGFP mRNA组的胚胎具有较好的存活率, RLS/EGFP mRNA组胚胎状况良好, 而Lipo 2000/EGFP mRNA组出现胚胎皱缩和浑浊(图 6A)。生存曲线显示, 在96 hpf, RLS/EGFP mRNA注射后的斑马鱼存活率约为87%, 而Lipo 2000/EGFP mRNA注射后的存活率略微下降至83%左右(图 6B)。此外, RLS/EGFP mRNA组胚胎孵化率达到86%, 而Lipo 2000/EGFP mRNA组约为77% (图 6C)。这些结果表明, 与商品化试剂Lipo 2000相比, RLS在基因递送中展现出更好的生物安全性。

随后, 为了进一步探究基因递送对生物体发育的影响, 观察了96 hpf孵化后的斑马鱼幼虫的躯体, 并评估是否出现畸形情况。将尾巴卷曲、脊柱侧弯和心源性水肿纳入评估范围。与野生型斑马鱼正常幼鱼进行比较(图 7A), RLS/EGFP mRNA组、Lipo 2000/EGFP mRNA和裸EGFP mRNA组的幼虫都出现一定程度的尾巴卷曲现象, 其致畸率分别为2.9%、9.5%和1.9%。脊柱侧弯的发生率分别为3.3%、4.2%和2.2%。此外, RLS/EGFP mRNA组和Lipo 2000/EGFP mRNA组的斑马鱼出现心源性水肿, 致畸率分别为0.8%和1.3%, 而裸EGFP mRNA组几乎没有(图 7B)。对各组统计后发现, 总体而言, 尽管存在引起心源性水肿的风险, 但与商品化试剂Lipo 2000相比, RLS对3种形态畸形的总诱导率最低(图 7C)。这表明RLS具有更高的生物安全性, 与体外实验结果一致。因此, RLS作为基因递送载体有望在基因治疗领域取得更广泛的应用前景。

结论

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本研究基于RLS基因载体, 成功制备了粒径和电位适宜的均一纳米颗粒。通过体外细胞转染及体内斑马鱼转染实验证实了RLS对mRNA稳定性的优势, 确保了有效的基因递送。实验结果显示, RLS在HEK293和MSC的转染效率分别超过商用试剂Lipofectamine 2000的1.2倍和3倍, 突出了其高效递送mRNA基因的能力。随后, 进一步评估了RLS的生物安全性, 包括细胞毒性和体内存活率、孵化率和畸形率实验。研究结果显示, RLS的细胞毒性仅为Lipofectamine 2000的1/3, 从而减少了递送mRNA过程中对细胞的不良影响。在体内研究中, 相比于商用试剂Lipofectamine 2000, RLS对斑马鱼胚胎的存活率、孵化率和畸形率影响最小, 显示出其出色的生物安全性。综上所述, RLS不仅在mRNA基因递送方面具有卓越的效果, 还展现了对mRNA的稳定性的保护作用及良好的生物安全性。这为RLS在mRNA治疗领域的广泛应用提供了基础。

作者贡献: 王一醇: 实验、文章构思、文章撰写; 蒲艺瑶: 动物实验辅助、文章构思; 毕群杰: 部分细胞实验; 宋相容: 提供相关实验材料; 金蓉蓉、聂宇: 写作、审校和提供资金支持。

利益冲突: 本文所有作者声明不存在利益冲突关系。

基金

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四川省科技项目(2023YFH0060)
中德科学基金研究交流中心中德合作小组项目(GZ1512)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2024年第59卷第4期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1443

接收时间：2023-12-25
首发时间：2025-11-28
出版时间：2024-04-12

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出版历史

收稿日期：2023-12-25
修回日期：2024-02-22

基金

四川省科技项目(2023YFH0060)

中德科学基金研究交流中心中德合作小组项目(GZ1512)

作者信息

1.四川大学国家生物医学材料工程技术研究中心/四川大学生物医学工程学院, 四川成都 610064

2.四川大学, 生物治疗全国重点实验室, 四川成都 610041

通讯作者:

^*聂宇, Tel: 13699024669, E-mail: nie_yu@scu.edu.cn

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2023-1443

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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