药学学报

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Primer name

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Gene name	Abbreviation	Number of unigenes annotated
Aspartate aminotransferase	AspAT	4
Polyphenol oxidase	PPO	2
Tyrosinase	TYR	3
L-Tryptophan decarboxylase	TDC	3
Primary-amine oxidase	PrAO	1
(S)-Norcoclaurine synthase	NCS	8
Norcoclaurine-6-O-methyltransferase	6OMT	3
(S)-Coclaurine N-methyltransferase	CNMT	1
3′-Hydroxy-N-methylcoclaurine 4′-O- methyltransferase	4′OMT	1
Berberine bridge enzyme	BBE	3
Tetrahydroprotoberberine oxidase	STOX	1
Codeine 3-O-demethylase	CODM	3

Gene name

Abbreviation

Number of
unigenes
annotated

Aspartate aminotransferase

AspAT

Polyphenol oxidase

PPO

Tyrosinase

TYR

L-Tryptophan decarboxylase

TDC

Primary-amine oxidase

PrAO

(S)-Norcoclaurine synthase

NCS

Norcoclaurine-6-O-methyltransferase

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(S)-Coclaurine N-methyltransferase

CNMT

3′-Hydroxy-N-methylcoclaurine 4′-O-
methyltransferase

4′OMT

Berberine bridge enzyme

BBE

Tetrahydroprotoberberine oxidase

STOX

Codeine 3-O-demethylase

CODM

Gene name	Abbreviation	Number of unigenes annotated
Aspartate aminotransferase	AspAT	4
Polyphenol oxidase	PPO	2
Tyrosinase	TYR	3
L-Tryptophan decarboxylase	TDC	3
Primary-amine oxidase	PrAO	1
(S)-Norcoclaurine synthase	NCS	8
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Berberine bridge enzyme	BBE	3
Tetrahydroprotoberberine oxidase	STOX	1
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Gene name

Abbreviation

Number of
unigenes
annotated

Aspartate aminotransferase

AspAT

Polyphenol oxidase

PPO

Tyrosinase

TYR

L-Tryptophan decarboxylase

TDC

Primary-amine oxidase

PrAO

(S)-Norcoclaurine synthase

NCS

Norcoclaurine-6-O-methyltransferase

6OMT

(S)-Coclaurine N-methyltransferase

CNMT

3′-Hydroxy-N-methylcoclaurine 4′-O-
methyltransferase

4′OMT

Berberine bridge enzyme

BBE

Tetrahydroprotoberberine oxidase

STOX

Codeine 3-O-demethylase

CODM

大黄藤中黄藤素生物合成途径关键酶基因的筛选

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周兴乾 , 耿应敏 , 张体操 , 郑兰平 ^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(6): 1873-1882

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(6): 1873-1882

大黄藤中黄藤素生物合成途径关键酶基因的筛选

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周兴乾, 耿应敏, 张体操, 郑兰平^*

作者信息

云南中医药大学中药学院暨云南省南药可持续利用重点实验室, 云南昆明 650500

通讯作者:

^*郑兰平, E-mail: casperlp@126.com

Screening of key enzyme genes on the palmatine biosynthetic pathway in Fibraurea recisa

Xing-qian ZHOU, Ying-min GENG, Ti-cao ZHANG, Lan-ping ZHENG^*

Affiliations

College of Chinese Materia Medica and Yunnan Key Laboratory of Southern Medicinal Utilization, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China

出版时间: 2024-06-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1292

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摘要

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黄藤素是大黄藤的主要功效成分, 是典型的小檗碱类异喹啉类生物碱, 具有广泛的抗炎、抗菌活性。本研究运用代谢组学与转录组学研究, 筛选了与黄藤素合成显著相关的差异表达基因(DEGs), 并对其中8个DEGs进行了实时荧光定量PCR (qRT-PCR) 验证。代谢组学研究共检测到106种生物碱, 其中包含23种异喹啉类生物碱。黄藤素在根与叶的对比组中位居差异代谢物差异倍数前十位, 其在根中的相对含量约是叶中的47.5倍。通过转录组学研究, 共188条基因注释到异喹啉类生物碱的生物合成途径上, 其中36条基因具有显著差异, 根与叶的对比组包含33条DEGs, 30条DEGs在黄藤素的生物合成途径上。最后, 通过代谢组学与转录组学关联分析, 筛选到4条基因序列的表达模式与黄藤素具有显著相关性。qRT-PCR实验结果表明8个DEGs的表达趋势均与转录组结果一致。本研究不仅丰富了大黄藤的组学数据, 也为黄藤素的生物合成研究奠定了基础, 并进一步为其他异喹啉类生物碱生物合成途径上关键酶基因的解析提供了参考。

关键词

大黄藤 / 多组学 / 生物合成途径 / 黄藤素 / 异喹啉类生物碱

Abstract

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Palmatine, the main effective ingredient of Fibraurea recisa, is a typical berberine isoquinoline alkaloid with extensive anti-inflammatory and antibacterial activities. In this work, the studies of metabolomics and transcriptomics were utilized to detect differentially expressed genes (DEGs) that are significantly associated with the synthesis of palmatine. In addition, eight of these DEGs were verified by quantitative real-time PCR (qRT-PCR). A total of 106 alkaloids were detected in the metabolomics study, including 23 isoquinoline alkaloids. Palmatine ranked in the top ten of differential metabolites in the group of root vs leaf, and its relative content in root was about 47.5 times higher than that in leaf. In the transcriptomics study, a total of 188 genes were annotated to the pathway of isoquinoline alkaloid biosynthesis. Among them, there were 36 DEGs were significantly different. In the comparison group of root and leaf, a total of 33 DEGs were significantly different, and 30 DEGs were annotated on the biosynthetic pathway of palmatine. Finally, the results of the correlation analysis between metabolomics and transcriptomics showed that the expression patterns of four gene sequences were screened to be significantly correlated with palmatine. The results of qRT-PCR experiments showed that the expression trends of eight DEGs were consistent with the results of transcriptomic. This study not only enriched the omics data of F. recisa, but also established the foundation for the study of the synthetic biology of palmatine. It further provided a reference for the analysis of the key enzyme genes on the biosynthetic pathway of other isoquinoline alkaloids.

Key words

Fibraurea recisa / multi-omics / biosynthetic pathway / palmatine / isoquinoline alkaloid

引用本文

周兴乾, 耿应敏, 张体操, 郑兰平. 大黄藤中黄藤素生物合成途径关键酶基因的筛选. 药学学报, 2024 , 59 (6) : 1873 -1882 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1292

Xing-qian ZHOU, Ying-min GENG, Ti-cao ZHANG, Lan-ping ZHENG. Screening of key enzyme genes on the palmatine biosynthetic pathway in Fibraurea recisa[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (6) : 1873 -1882 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1292

正文

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大黄藤为防己科植物天仙藤Fibraurea recisa Pierre的干燥藤茎, 又名黄藤、藤黄连、金锁匙、土黄连等^[1], 多生长于海拔180~1 000 m阴湿而肥沃的热带、亚热带密林中, 常攀援高大藤本植物^[2]。其首载于《本草纲目》, 于1974年收载于《云南省药品标准》, 后被1977年版《中华人民共和国药典》收录^[2-4]。现收载于2020版《中华人民共和国药典》, 其味苦, 性寒, 归心、肝经, 具有清热解毒、泻火通便的功效^[5], 对多种感染性疾病具有防治作用^[6]。现代药理学研究认为大黄藤的主要功效成分为异喹啉类生物碱(又称苄基异喹啉类生物碱, benzylisoquinoline alkaloid, BIA), 包括黄藤素(又称巴马汀, palmatine)、药根碱(jatrorhizine)、小檗碱(berberine)、黄藤素甲(fibranine)、黄藤素乙(ibraminine) 等。其中黄藤素是大黄藤中最重要的生物碱, 在大黄藤的根及茎中, 黄藤素含量高达3%, 且黄藤素具有广泛的抗炎、抗菌活性^[7]。以单一黄藤素为原料, 已被开发为黄藤素片, 并被中国药典收录, 用以治疗妇科炎症、菌痢、肠炎、呼吸道及泌尿道感染、外科感染、眼结膜炎等症^[5]。

近年来, 大黄藤野生资源逐渐匮乏, 不得不走向人工种植的方向, 但人工种植通常需要4~5年才可采收^[8], 大黄藤作为黄藤素的主要来源植物, 这严重影响了黄藤素的产量。而黄藤素的化学合成方面, 又存在产率低、使用剧毒试剂、副产物影响产品纯度及对实验设备要求较高等劣势^[9]。

随着现代生物学技术的发展, 通过挖掘中药活性成分生物合成途径中的关键酶, 并利用合成生物学技术来设计构建模式微生物和模式植物中新的代谢途径, 从而达到异源生产重要化合物的目的, 被认为是一种崭新的、极具潜力的药用化合物获取方法^[10]。目前, 虽然黄藤素的生物合成通路已注释, 但其合成途径上的关键酶基因表达调控的分子机制研究还未见报道。本研究通过多组学方法, 筛选了大黄藤中异喹啉类生物碱合成通路上与黄藤素合成相关的关键酶基因, 可为后续关键基因的鉴定及功能验证研究指明方向, 为黄藤素的异源生产研究奠定基础。

材料与方法

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植物样品 大黄藤样品于2021年9月采自云南省屏边苗族自治县玉屏镇卡口村委会附近林下(东经103.75°, 北纬23.03°), 为两年生健康植株。材料经由云南中医药大学李学芳正高级工程师鉴定确认。采摘后, 取其根、茎、叶分为3组, 立即液氮速冻, 而后储存于-80 ℃冰箱备用。

代谢物提取 将9个大黄藤样品分别冷冻干燥, 研磨至粉末状。称取100 mg粉末加入甲醇提取液中, 4 ℃过夜后离心, 吸取上清液并过滤样品, 保存于进样瓶中, 用于UPLC-MS/MS分析^[11]。

UPLC条件 色谱柱: Agilent SB-C18 (100 mm × 2.1 mm, 1.8 µm); 流动相: 水相A为含0.1%甲醇的超纯水, 有机相B为含0.1%甲酸的乙腈; 洗脱梯度: 0~9 min为5%~95% B; 9~10 min为95% B; 10~11.1 min为95%~5% B; 11.1~14 min为5% B; 流速0.35 mL·min^-1; 柱温40 ℃; 进样量4 μL^[11]。

MS/MS条件 涡轮喷雾离子源温度550 ℃; 离子喷雾电压(IS) 正离子模式5 500 V, 负离子模式-4 500 V; 离子源气体I (GSI), 气体II (GSII) 和帘气(CUR) 分别设置为50、60和25.0 psi (1 psi ≈ 6.9 kPa)。QQQ扫描使用MRM模式, 通过进一步的DP和CE优化, 完成各个MRM离子对的DP和CE。根据每个时期内洗脱的代谢物, 在每个时期监测一组特定的MRM离子对^{[11, 12]}。

代谢组学分析 检测完成后, 对代谢物数据运用主成分分析(PCA) 判别组间差异, 运用正交偏最小二乘法-判别分析法(OPLS-DA) 进行代谢物差异分析, 以VIP ≥ 0.9且FC (fold change) ≥ 2 (或FC ≤ 0.5) 为条件筛选差异代谢物, 并对筛选的差异代谢物进行KEGG富集分析。

总RNA提取与转录组测序 用RNA试剂盒(MagZol^TM Reagent Plus Kit) 提取9个样本总RNA, 使用PacBio测序仪进行全长转录组测序, 最终得到一致性转录本序列(consensus transcripts)。得到二代测序数据后去除接头序列、低质量测序序列, 得到clean data后使用二代测序数据对三代转录本进行纠错, 并对纠错后的转录本使用CD-HIT去冗余^[13], 再比对到KEGG、Nr、Swiss-prot、Trembl、KOG、GO和Pfam等数据库, 得到注释结果^[14]。计算FPKM, 得到基因表达定量数据后, 进行基因差异和富集分析。最后将转录组数据与代谢组数据进行KEGG联合分析, 筛选与黄藤素合成相关的显著差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)。最后, 将与黄藤素合成相关的差异代谢物的相对定量数据和DEGs的表达定量数据进行相关性网络分析, Pearson相关系数阈值设置为0.80, 同时设置P < 0.05。

实时荧光定量PCR验证实验及分析 在与黄藤素合成显著相关的DEGs中, 随机挑选了8条序列, 设计了特异性引物, 并以GAPDH为内参基因(表 1), 进行实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR) 验证。每个样品中每个基因的检测设置3个复孔, 共进行了3次生物学重复。将3次生物学重复得到的数据利用公式R = 2^-∆∆Ct计算其相对表达量, 并绘制箱线图。

结果与分析

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1 代谢组结果及主成分分析

在大黄藤的根、茎、叶中一共检测到954种代谢物, 酚酸类物质数量占比最多, 其次是脂质、其他类, 生物碱位居第4位。共有106种生物碱, 包含23种异喹啉类生物碱(图 1A)。主成分分析(PCA) 结果显示代谢物在大黄藤根、茎、叶之间明显分离, 表明在大黄藤的根、茎、叶之间存在显著差异代谢物, 其中第一主成分的贡献率为40.39%, 第二主成分的贡献率为23.13%; Mix质控样本紧密聚集, 且有部分重叠, 表明结果可信且可重复性高(图 1B)。

2 差异代谢物筛选

通过正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA) 进行模拟验证后, 结合以变量重要性投影(VIP ≥ 0.9) 且差异倍数(FC ≥ 2或FC ≤ 0.5) 为条件筛选差异代谢物。在根与叶的对比组有509个差异代谢物, 364个在叶中上调, 145个下调, 差异的异喹啉类生物碱有16个, 11个在叶中上调, 5个下调; 在根与茎的对比组有381个差异代谢物, 261个在茎中上调, 120个下调, 差异的异喹啉类生物碱有9个, 4个在茎中上调, 5个下调; 在茎与叶的对比组有415个差异代谢物, 275个在叶中上调, 140个下调, 差异的异喹啉类生物碱有9个, 均在叶中上调(图 1C、D)。

本研究筛选了大黄藤根、茎、叶两两对比的差异代谢物中分别位于前十的物质。差异代谢物前十结果表明, 叶相较于根, 上调的差异代谢物主要是黄酮, 下调的主要是生物碱; 茎相较于根, 上调的差异代谢物主要是黄酮类, 下调的主要是酚酸类; 叶相较于茎, 上调的差异代谢物主要是生物碱, 下调的主要是黄酮。对于异喹啉类生物碱, 在根与叶的对比组中, 大黄藤的主要功效成分——黄藤素在叶中显著下调, 其在根中的相对含量约为叶中的47.5倍(图 1E); 在茎与叶的对比组中, 原千金藤那布任碱(prostephanaberrine) 在叶中显著上调。在不同组织部位中, 化合物含量的差异往往源于基因表达的差异, 黄藤素作为大黄藤中最重要的生物碱, 在大黄藤的根和叶中具有显著差异, 因此可以进一步进行转录组学分析, 挖掘造成此差异的关键基因。

3 差异代谢物KEGG富集分析

利用KEGG数据库对差异代谢物进行注释, 并筛选显著富集通路。根与叶的对比组中有334种物质被注释到79条代谢通路中, 其中差异代谢物173种, 富集结果表明这些代谢物主要富集在亚油酸代谢(linoleic acid metabolism)、α-亚麻酸代谢(α-linolenic acid metabolism)、苯丙氨酸代谢(phenylalanine metabolism) 等能量代谢途径中, 异喹啉类生物碱的生物合成(isoquinoline alkaloid biosynthesis) 途径也有被富集到。根与茎的对比组中有332种物质被注释到70条代谢通路中, 其中差异代谢物95种, 主要富集到了黄酮和黄酮醇的生物合成(flavone and flavonol biosynthesis) 和精氨酸的生物合成(arginine biosynthesis) 途径中; 茎与叶的对比组中有334种物质被注释到77条代谢通路中, 其中差异代谢物139种, 主要富集到了亚油酸代谢、α-亚麻酸代谢途径中。

大黄藤中最重要的成分—黄藤素在根与叶的对比组具有显著差异, 且在KEGG数据库中被注释到了异喹啉类生物碱的生物合成途径。在根与叶的对比组, 此通路上共有9个显著差异代谢物, 以根为对照, 在叶中上调的有碎叶紫堇碱(cheilanthifoline)、金黄紫堇碱(scoulerine)、四氢巴马汀(tetrahydropalmatine)、四氢小檗碱(canadine)、多巴胺(dopamine) 和木兰花碱(magnoflorine); 在叶中下调的有黄藤素、原儿茶醛(protocatechualdehyde) 和L-酪氨酸(L-tyrosine)。其中, L-酪氨酸、多巴胺、金黄紫堇碱、四氢巴马汀和黄藤素位于黄藤素生物合成途径上。此外, 在根与茎的对比组中, 位于黄藤素生物合成途径上且具有显著差异的还有去甲乌药碱(norcoclaurine)。

4 转录组测序结果及数据统计

经Pacbio测序共得到553 543条polymerase reads, 拆分后得到24 720 823条subread, 经自我纠错后得到800 890条CCS序列, 全长序列(full-length, FL) 652 771条, 全长非嵌合序列(full-length non-concatemer, FLNC) 652 029条, 具有polyA的FLNC序列651 560条, 经聚类后得到consensus transcript序列50 294条。所得数据经二代测序数据校正并去冗余后, 得到33 613条isoforms序列, 数据量大小为69 523 220 bp, 大部分isoforms序列长度大于1 000 bp, 表明其完整性较高, 可对其进行功能注释。

5 转录组功能注释

去冗余后得到的33 613条isoforms序列, 在KEGG、Nr、Swiss-prot、Trembl、KOG、GO和Pfam共7个公共数据库中分别注释27 245、32 707、26 932、32 634、22 471、29 973和29 661条, 其中至少在一个数据库中被注释的序列有32 980条, 占比98.12% (图 2A)。

在KEGG注释结果中, 27 245条序列被注释到了146条pathway, 共188条序列被注释到异喹啉类生物碱的生物合成上。Nr注释表明罂粟科的博落回(Macleaya cordata) 的转录本与大黄藤的转录本相似度最高, 同源序列共7 626条, 占比23.32%; 其次是莲科的莲(Nelumbo nucifera), 4 828条同源序列占比14.76%。GO功能分析显示被注释到的29 973条序列在生物过程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC) 和分子功能(molecular function, MF) 这3类均有富集, 在生物过程功能分类上的基因数目最多, 大部分体现在细胞过程(cellular process)、代谢过程(metabolic process) 及刺激反应(response to stimulus)。

6 差异表达基因筛选及富集分析

通过计算FPKM衡量基因的表达水平后, 依据|log₂Fold Change| ≥ 1且错误发现率FDR < 0.05为标准筛选DEGs。根与叶的对比组中有3 440条DEGs, 其中2 248条DEGs在叶中上调, 1 192条DEGs在叶中下调; 根与茎的对比组中有758条DEGs, 其中383条DEGs在茎中上调, 375条DEGs在茎中下调; 茎与叶的对比组中有1 704条DEGs, 其中1 146条DEGs在叶中上调, 558条DEGs在叶中下调。被注释到异喹啉类生物碱的生物合成途径上的DEGs共36条, 根与叶的对比组有33条DEGs, 20条DEGs在叶中上调, 13条DEGs在叶中下调; 根与茎的对比组有6条DEGs, 4条DEGs在茎中上调, 2条DEGs在茎中下调; 茎与叶的对比组有11条DEGs, 6条DEGs在叶中上调, 5条DEGs在叶中下调(图 2B、C)。

利用KEGG数据库对DEGs进行注释及富集分析的结果表明, 根与叶对照组的DEGs主要富集在代谢途径(metabolic pathways)、次生代谢物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、淀粉和蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism) 及异喹啉类生物碱的生物合成等生物合成途径。根与茎对照组的DEGs主要富集在角质、栓质和蜡质的生物合成(cutin, suberine and wax biosynthesis)、苯噁唑类化合物的生物合成(benzoxazinoid biosynthesis) 及光合作用(photosynthesis) 等生物合成途径; 茎与叶对照组的DEGs主要富集在代谢途径、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation) 及次生代谢物的生物合成等生物合成途径。

7 代谢组与转录组联合分析

根据差异代谢物, 以及差异基因的KEGG富集分析结果, 找到转录组和代谢组共同富集到的KEGG pathway, 并绘制气泡图。富集结果表明, 在根与叶的对比组中, 较为显著富集的通路有亚油酸代谢、苯丙氨酸代谢及异喹啉类生物碱的生物合成; 根与茎的对比组中, 较为显著富集的通路有苯丙酮的生物合成(phenylpropanoid biosynthesis)、次生代谢物的生物合成及α-亚麻酸代谢; 茎与叶的对比组中, 较为显著富集的通路有亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢(图 3)。

在根与叶的对比组中显著富集的异喹啉类生物碱的生物合成途径上共有33条DEGs (表 2)。从KEGG pathway看, 有3条可待因3-O-去甲基酶基因(codeine 3-O-demethylase, CODM) 序列不在黄藤素生物合成途径上, 其他与黄藤素合成相关的酶基因序列包括4条天冬氨酸转氨酶基因(aspartate aminotransferase, AspAT), 2条多酚氧化酶基因(polyphenol oxidase, PPO), 3条酪氨酸酶基因(tyrosinase, TYR), 3条色氨酸脱羧酶基因(L-tryptophan decarboxylase, TDC), 1条伯胺氧化酶基因(primary-amine oxidase, PrAO), 8条(S)-去甲乌药碱合成酶基因((S)-norcoclaurine synthase, NCS), 3条(S)-去甲乌药碱6-O-甲基转移酶基因(norcoclaurine-6-O-methyltransferase, 6OMT), 1条(S)-乌药碱-N-甲基转移酶基因((S)-coclaurine N-methyltransferase, CNMT), 1条3′-羟基-N-甲基乌药碱-4′-O-甲基转移酶基因(3′-hydroxy-N-methylcoclaurine 4′-O-methyltransferase, 4′OMT), 3条小檗碱桥酶基因(berberine bridge enzyme, BBE), 以及1条四氢原小檗碱氧化酶基因(tetrahydroprotoberberine oxidase, STOX)。

根与叶的代谢组学对比组中, 在黄藤素生物合成途径上显著差异代谢物共5个, 包括L-酪氨酸、多巴胺、金黄紫堇碱、四氢巴马汀和黄藤素。将这5个差异代谢物的相对定量数据与上述在黄藤素生物合成途径上30个DEGs的表达定量数据汇总(图 4A), 再进行相关性网络分析。结果显示共有10条DEGs的表达模式与5个差异代谢物具有显著相关性, DEGs包括2条AspAT, 2条TYR, 1条PPO, 3条NCS, 1条6OMT, 1条CNMT。4条DEGs与黄藤素显著相关, 4条DEGs与四氢巴马汀显著相关, 4条DEGs与黄金紫堇碱显著相关, 1条DEGs与多巴胺显著相关, 1条DEGs与L-酪氨酸显著相关(图 4B)。

8 关键基因qRT-PCR验证

qRT-PCR实验结果显示, 基因BBE_27675、TDC_35849、AspAT_21163和6OMT_39928在叶中表达量高, 基因BBE_28224、BBE_30738、6OMT_40488和6OMT_42512在根中表达量高。上述基因表达趋势均与转录组FPKM值结果一致, 说明该转录组学数据基因表达定量较准确, 筛选出的关键基因可供后续实验使用(图 5)。

讨论

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异喹啉类生物碱的生理活性极强, 一直是国内外研究开发利用的热点, 是寻找有开发应用前景的先导化合物和生物活性成分的源泉。其主要药理作用包括抗炎抗菌、镇痛镇咳、抗心律失常、保护心脑血管、调节免疫作用以及抗癌等, 且不良反应较小^[15]。黄藤素作为一种典型的小檗碱类异喹啉类生物碱, 具有广泛的抗炎、抗菌活性, 近年来又发现其具有抗糖尿病和抗氧化等多种功效, 具有较高的临床应用价值^[7]。黄藤素是大黄藤的主要活性成分, 然而近年来, 大黄藤药用资源逐渐匮乏, 化学合成黄藤素又存在得率较低或黄藤素纯度低, 及对实验设备的要求较高等劣势^{[9, 16]}。中药活性成分是植物长期演化过程中特有基因共同调控的产物, 由系列关键酶通过系列催化反应所合成, 并存在特定生物合成途径。通过发掘药用植物基因资源, 解析其生源途径并在微生物中人工创建代谢途径, 进而利用合成生物学策略生产或改造药用活性成分, 将是一种极具潜力的药用活性成分获取方法^[17]。药用活性成分的积累往往与基因表达相关, 通过比较组学分析, 筛选具有显著差异表达的基因, 能有效缩小候选基因范围, 并获得可能对药用活性成分合成具有较强调控作用的候选基因^[18]。

黄藤素属于小檗碱类异喹啉类生物碱, 其生物合成途径与小檗碱的生物合成途径前半段一致。据文献^[19]记载, 二者的生物合成皆始于L-酪氨酸, 经过酪氨酸转氨酶(TyrAT) 催化生成4-羟基苯丙酮酸(4-hydroxyphenylpyruvate), 又经由4-羟基苯丙酮酸脱羧酶(4HPPDC) 催化生成4-羟基苯乙醛(4-hydroxyphenylacetaldehyde), 另一边L-酪氨酸经酪氨酸脱羧酶(TYDC) 生成酪氨(tyramine), 后经多酚氧化酶(PPO) 催化为多巴胺。多巴胺作为异喹啉部分的前体, 而4-羟基苯乙醛作为苄基组成, 二者在(S)-去甲乌药碱合成酶(NCS) 的催化下缩合形成(S)-去甲乌药碱[(S)-norcoclaurine]^[20]。(S)-去甲乌药碱经过(S)-去甲乌药碱6-O-甲基转移酶(6OMT) 可催化为(S)-乌药碱[(S)-coclaurine], 在(S)-乌药碱-N-甲基转移酶(CNMT) 催化下可进一步生成(S)-N-甲基乌药碱[(S)-N-methylcoclaurine], (S)-N-甲基乌药碱经(S)-N-甲基乌药碱-3′-羟化酶(CYP80B1) 催化成(S)-3′-羟基-N-甲基乌药碱[(S)-3′-hydroxy-N-methylcoclaurine], 接着经3′-羟基-N-甲基乌药碱-4′-O-甲基转移酶(4′OMT) 形成(S)-牛心果碱[(S)-reticuline]。(S)-牛心果碱是包括吗啡、血根碱、小檗碱等多种重要异喹啉类生物碱的关键中间产物^[21]。(S)-牛心果碱经小檗碱桥酶(BBE) 催化为金黄紫堇碱[(S)-scoulerine], 接着经(S)-金黄紫堇碱-9-O-甲基转移酶(SMT) 催化为(S)-四氢非洲防己碱[(S)-tetrahydrocolumbamine]^[21]。(S)-四氢非洲防己碱可由两条路径合成黄藤素, 一条为经过四氢非洲防己碱2-O-甲基转移酶(Thc2OMT) 催化生成四氢巴马汀, 再经过四氢小檗碱氧化酶(STOX) 催化生成黄藤素; 另一条途径为(S)-四氢非洲防己碱先由四氢小檗碱氧化酶(STOX) 催化为非洲防己碱(columbamine), 再由非洲防己碱O-甲基转移酶(CoOMT) 催化为黄藤素^[22]。(S)-去甲乌药碱合成酶(NCS)、(S)-去甲乌药碱6-O-甲基转移酶(6OMT) 及小檗碱桥酶(BBE) 被认为是异喹啉类生物碱合成途径上的限速酶^{[23, 24]}。(S)-牛心果碱是多种重要异喹啉类生物碱合成途径上的关键中间体, (S)-牛心果碱通过异构、偶联、重排、甲基化、去甲基化等反应, 几乎可以形成所有骨架类型的异喹啉类生物碱^[25]。因此, 与(S)-牛心果碱合成直接相关的4′OMT也极为重要。综上, 编码NCS、6OMT、BBE和4′OMT的基因均是大黄藤中黄藤素生物合成途径上的重要基因。

除此之外, AspAT、TYR、TDC及PrAO在KEGG pathway中也位于黄藤素生物合成途径上。AspAT是TyrAT的同工酶, 能将L-酪氨酸催化为4-羟基苯丙酮酸; TYR是PPO的同工酶, TDC是TYDC的同工酶, 在TYR和TDC的作用下, 能将L-酪氨酸催化为多巴胺。PrAO则能将多巴胺催化为3, 4-二羟基苯乙醛(3, 4-dihydroxyphenylacetaldehyde), 3, 4-二羟基苯乙醛又能与多巴胺缩合形成(S)-四氢维洛林[(S)-norlaudanosoline], 经系列催化反应后生成关键中间体——(S)-牛心果碱, 是合成(S)-牛心果碱的另一条途径。通过此途径, 多巴胺可经系列催化反应直接合成(S)-牛心果碱, 而不必依赖于同4-羟基苯乙醛结合后再合成(S)-牛心果碱。由于以往对于异喹啉类生物碱生物合成途径的描述较少提及AspAT、TYR、TDC、PrAO等酶, 而本研究发现编码这些酶的基因是黄藤素合成途径上的显著差异表达基因, 因此, 它们应对黄藤素的合成具有一定的调控作用, 有进一步研究的价值。

本研究结果显示, 异喹啉类生物碱合成的源头—L-酪氨酸在根中含量最高, 其次为茎, 叶中含量最低。而后, 去甲乌药碱是异喹啉类生物碱合成途径上的第一个中间体化合物^[24], 其合成对下游生物碱的含量具有一定影响, 去甲乌药碱在根相比于茎中体现显著差异, 而在根相比于叶中差异较小。合成去甲乌药碱的NCS基因在根和叶中都有高表达, 可以推断根和叶可同时合成去甲乌药碱。此外, 合成多巴胺的DEGs主要在叶中高表达, 同时多巴胺也主要在叶中特异性积累, 多巴胺作为合成去甲乌药碱的底物, 其在根中含量较低, 可能会成为根中去甲乌药碱合成的限制因素。合成去甲乌药碱后经过系列催化反应生成的金黄紫堇碱在叶中特异性积累, 继而进入了小檗碱类和原小檗碱类异喹啉类生物碱的合成过程(图 4A)。大黄藤中的原小檗碱类异喹啉类生物碱, 包括四氢巴马汀、四氢小檗碱均在叶中特异性积累, 而属于小檗碱类异喹啉类生物碱的黄藤素和药根碱则均在根中特异性积累, 造成这两类异喹啉类生物碱在不同组织部位特异性积累的具体机制还将有待进一步研究。

本研究运用多组学联合的方法, 初步分析了大黄藤主要功效成分—黄藤素的生物合成途径, 挖掘到了黄藤素生物合成途径中的关键酶, 为黄藤素合成的工程菌株构建提供了可选择的生物元件。由于黄藤素是典型的小檗碱类异喹啉类生物碱, 其上游合成途径为所有异喹啉类生物碱共有, 且黄藤素的化学结构与小檗碱、药根碱、四氢巴马汀等异喹啉类生物碱的化学结构极为相似, 对黄藤素生物合成途径上关键酶的解析, 也为其他异喹啉类生物碱的合成生物学研究提供了参考。

作者贡献: 周兴乾负责样本采集、实验操作、文章撰写和图片绘制; 耿应敏协助样本采集及论文格式修改; 张体操对论文内容给予了指导和修改; 郑兰平负责论文设计、样本采集、指导论文写作并对论文最终审核。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

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云南省应用基础研究中医联合专项(202101AZ070001-056)
云南省基础研究项目(202301AT070254)
云南省南药可持续利用重点实验室开放课题(202005AG070157)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

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[1]

Qi YF, Gao L, Fu DH, et al. Review of Fibraurea recisa [J]. Yunnan J Tradit Chin Med (云南中医中药杂志), 2005, 26: 56-57.

[2]

Lv N, Zhao YW, Ji LW, et al. Review of Fibraurea recisa [J]. Chin J Exp Tradit Med Form (中国实验方剂学杂志), 2016, 22: 199-202.

[3]

Zhu ZY, Zhao Y, Wei QH. The Annals of National Medicine in Yunnan, Vol 4 (云南民族药志第四卷) [M]. Kunming: The Nationalities Publishing House of Yunnan, 2012: 53-54.

[4]

Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China, Vol I (中华人民共和国药典一部) [S]. Beijing: Chinese Medical Science Press, 1977: 545.

[5]

Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China, Vol I (中华人民共和国药典一部) [S]. Beijing: Chinese Medical Science Press, 2020: 320, 1601.

[6]

Liu RM, Zhao SX, Zhu RH. A note on the identification of fibralactone from the root of Fibrauria recisa Pierre [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 1981, 16: 479-480.

[7]

Zhao W, Lu RB, Liu W, et al. Research progress on fibriuretinin [J]. China Anim Husb Veter Med (中国畜牧兽医), 2014, 41: 267-271.

[8]

Yang T, Jin H, Zhang JY, et al. Standardized cultivation techniques of Fibrauria recisa [J]. Yunnan Agric Sci Technol (云南农业科技), 2012, (1): 33-35.

[9]

Yuan MW, Li ZH, Chen YK, et al. Synthetic process optimization of palmatine hydrochloride [J]. J Yunnan Univ Natlities (云南民族大学学报), 2017, 26: 451-454.

[10]

Huang LQ, Gao W, Zhou YJ. Application of synthetic biology to sustainable utilization of Chinese material medica resources [J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2014, 49: 37-43.

[11]

Chen W, Gong L, Guo Z, et al. A novel integrated method for large-scale detection, identification, and quantification of widely targeted metabolites: application in the study of rice metabolomics [J]. Mol Plant, 2013, 6: 1769-1780.

[12]

Dai J, Liu BW, Liu XF, et al. Efficacy research of stems and leaves of Fritillaria cirrhosa based on similarity of chemical components [J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2021, 52: 4942-4953.

[13]

Li W, Godzik A. Cd-hit: a fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences [J]. Bioinformatics, 2006, 22: 1658-1659.

[14]

Buchfink B, Xie C, Huson DH. Fast and sensitive protein alignment using DIAMOND [J]. Nat Methods, 2015, 12: 59-60.

[15]

Deng J, Gao YY. Recent developments in isoquinoline alkaloids isolation and analysis [J]. Chem Ind Times (化工时刊), 2010, 24: 45-50.

[16]

Zhao H, Liu D, Zhu J, et al. Synthesis method of palmatine [J]. J Shenyang Univ Chem Technol (沈阳化工大学学报), 2017, 31: 143-146.

[17]

Tong YR, Zhang YF, Shen SY, et al. "Synthetic biology" innovation of active natural products of traditional Chinese medicine and new drug discovery—Professor Gao Wei [J]. J Capit Med Univ (首都医科大学学报), 2020, 41: 783-787.

[18]

Ma Y, Zhao YJ, Ma XJ, et al. Biosynthetic pathway of active components in traditional Chinese medicine and its application [J]. Sci Sin Vitae (中国科学: 生命科学), 2022, 52: 894-907.

[19]

Sato F, Hashimoto T, Hachiya A, et al. Metabolic engineering of plant alkaloid biosynthesis [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98: 369.

[20]

Ziegler J, Facchini PJ. Alkaloid biosynthesis: metabolism and trafficking [J]. Annu Rev Plant Biol, 2008, 59: 735.

[21]

Zhang Y, Zhang J, Ge HX. Progress in the biosynthetic pathway of benzylisoquinoline alkaloids in Coptis chinensis and the application of synthetic biology [J]. Pharm Biotechnol (药物生物技术), 2019, 26: 165-171.

[22]

Wang AQ, Yuan QJ, Guo N, et al. Research progress on medicinal resources of Coptis and its isoquinoline alkaloids [J]. China J Chin Mater Med (中国中药杂志), 2021, 46: 3504-3513.

[23]

Wang L, Shi LL, Zhang YX, et al. Biosynthesis and regulation of the secondary metabolites in plants [J]. J Wuhan Bot Res (武汉植物学研究), 2007, 25: 500-508.

[24]

Li QS. Screening of Candidate Functional Genes for the Biosynthetic Pathway of Tetrandrine and Functional Study of Norcoclaurine-6-O-Methyltransferase (粉防己碱生物合成途径候选功能基因筛选及去甲乌药碱-6-O-甲基转移酶的功能研究) [D]. Zhenjiang: Jiangsu University, 2020.

[25]

Lin Z, Hu ZW, Qu XD, et al. Advances and challenges in microbial production of benzylisoquinoline alkaloids [J]. Synth Biol J (合成生物学), 2021, 2: 716-733.

2024年第59卷第6期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1292

接收时间：2023-11-15
首发时间：2025-11-26
出版时间：2024-06-12

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收稿日期：2023-11-15
修回日期：2024-01-17

基金

云南省应用基础研究中医联合专项(202101AZ070001-056)

云南省基础研究项目(202301AT070254)

云南省南药可持续利用重点实验室开放课题(202005AG070157)

作者信息

云南中医药大学中药学院暨云南省南药可持续利用重点实验室, 云南昆明 650500

通讯作者:

^*郑兰平, E-mail: casperlp@126.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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