药学学报

丝素蛋白自组装纳米粒的制备、理化表征及细胞相容性研究

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闫羽 ¹^,² , 程佳玲 ² , 刘子晗 ² , 王洪亮 ² , 杨艳芳 ² , 叶军 ² , 蒋伟哲 ¹^,^* , 刘玉玲 ²^,^*

药学学报 | 研究论文 2023,58(12): 3715-3721

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药学学报 | 研究论文 2023, 58(12): 3715-3721

丝素蛋白自组装纳米粒的制备、理化表征及细胞相容性研究

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闫羽¹^,², 程佳玲², 刘子晗², 王洪亮², 杨艳芳², 叶军², 蒋伟哲¹^,^*, 刘玉玲²^,^*

作者信息

1.广西医科大学药学院, 广西南宁 530021

2.中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

*蒋伟哲, Tel: 13607713097, E-mail: jiangweizhe6812@163.com;

刘玉玲, Tel: 86-10-89285191, E-mail: ylliu@imm.ac.cn

Preparation, physicochemical characterization and cytocompatibility study of self-assembled silk fibroin nanoparticles

Yu YAN¹^,², Jia-ling CHENG², Zi-han LIU², Hong-liang WANG², Yan-fang YANG², Jun YE², Wei-zhe JIANG¹^,^*, Yu-ling LIU²^,^*

Affiliations

1. College of Pharmacy, Guangxi Medical University, Nanning 530021, China

2. Beijing Key Laboratory of Drug Delivery Technology and Novel Formulation, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

出版时间: 2023-12-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1273

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摘要

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本研究旨在制备丝素蛋白纳米粒(SF-NPs), 并对制备得到的纳米粒的理化性质及细胞相容性进行评价。采用优化简易的去溶剂化法制备SF-NPs。通过单因素的处方筛选, 如丝素蛋白(SF) 溶液的浓度、SF溶液和有机溶剂的比例、超声功率及时间、不同有机相的种类, 优化了制剂处方, 并对最优处方的粒径分布、多分散性指数(PDI)、zeta电位、形态及稳定性进行了表征。通过CCK-8及细胞活/死染色Calcein-AM/PI评估了SF-NPs的体外细胞相容性。实验结果表明, 当SF浓度为20 mg·mL^-1、水相和丙酮的体积比为1∶6、超声功率为80 W、超声时间为3 min时, 制备得到的SF-NPs最优。本研究制备得到的SF-NPs为类球形, 粒径分布狭窄, 平均粒径为144.8 nm, PDI为0.174, zeta电位为-27.35 mV。细胞相容性实验结果表明, SF-NPs具有优异的细胞相容性, 可促进细胞的增殖。综上表明, 通过去溶剂法制备得到SF-NPs具有均一的粒径及良好的生物相容性, 在药物递送领域具有较大的应用前景。

关键词

丝素蛋白 / 纳米粒 / 去溶剂法 / 处方筛选 / 细胞相容性

Abstract

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This study aimed to prepare silk fibroin nanoparticles (SF-NPs) and assess the physicochemical properties and biocompatibility of the formulation. An optimized and simplified solvent displacement method was employed to obtain SF-NPs. Single-factor prescription screening, such as silk fibroin (SF) solution concentration, the ratio of SF solution to organic solvent, ultrasonication power and time, and different types of organic phases, was used to optimize the formulation. The characterization of the optimal formulation included particle size, polydispersity index (PDI), zeta potential, morphology, and stability. The in vitro cell compatibility of the nanoparticles was evaluated using CCK-8 and Calcein-AM/PI cell viability staining. The results showed that when SF concentration was 20 mg·mL^-1, volume ratio of aqueous phase to acetone was 1∶6, ultrasonic power was 80 W and ultrasonic time was 3 min, the best SF-NPs was obtained. The nanoparticles prepared in this study exhibit a near-spherical shape, with a uniform size distribution, having an average size of 144.8 nm, a PDI of 0.174, and a zeta potential of -27.35 mV. Results from in vitro cell experiments demonstrate excellent cell compatibility of SF-NPs, showing the ability to promote cell proliferation. The SF-NPs which were successfully prepared in this study exhibit uniform particle size and excellent biocompatibility.

Key words

silk fibroin / nanoparticles / solvent displacement method / prescription screening / cell compatibility

引用本文

闫羽, 程佳玲, 刘子晗, 王洪亮, 杨艳芳, 叶军, 蒋伟哲, 刘玉玲. 丝素蛋白自组装纳米粒的制备、理化表征及细胞相容性研究. 药学学报, 2023 , 58 (12) : 3715 -3721 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1273

Yu YAN, Jia-ling CHENG, Zi-han LIU, Hong-liang WANG, Yan-fang YANG, Jun YE, Wei-zhe JIANG, Yu-ling LIU. Preparation, physicochemical characterization and cytocompatibility study of self-assembled silk fibroin nanoparticles[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (12) : 3715 -3721 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1273

正文

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丝素蛋白(silk fibroin, SF) 是从天然蚕丝中提取出来的一种结构性蛋白质, 由18种氨基酸组成^[1]。它在生物医学和材料科学领域中备受瞩目, 已经成为美国食品和药品监督管理局(FDA) 批准用于药物递送系统的载体材料^[2]。SF作为一种天然的高分子材料, 具有优异的生物相容性、可生物降解性和刺激响应性^[3-5], 这些特性也使其成为药物递送领域的研究热点。

SF是由重链、轻链和P25编码的糖蛋白组成, 其中重链是主要的结构支架, 具有多个不同的区段, 这些区段包括亲水嵌段和疏水嵌段, 它们以交替的方式排列^{[6, 7]}。这一排列形成了SF独特的分子结构, 为其性质和功能提供了基础。SF作为一种载体材料, 可根据需要制备成支架^{[8, 9]}、薄膜^{[10, 11]}、纳米粒(nanoparticles, NPs)、纤维和凝胶^[12]等各种体系^[13], 这种机械性能的可调控性有助于精准控制药物的释放速率和靶向输送。SF的天然可降解特性和优异的机械性能使其在药物递送载体的设计中具有显著优势, 应用场景十分广泛^[14]。这些优势包括SF的高水溶性、生物可降解性、易于制造和冷冻干燥、较高的药物包封率和载药量、可控的纳米粒大小及缓控释特性^[15-17]。它可用于小分子药物、蛋白质药物和基因药物的递送。SF纳米颗粒可以提高药物的吸收和生物利用度, 其降解速率可以通过改变结晶度、分子量或交联度来调节^[18]。由于SF具有活性氨基和酪氨酸残基, 也可对其进行表面功能化修饰^[19], 包括电荷反转和特定的靶向配体修饰等^[20]。SF纳米粒的制备方法主要包括自上而下法和自下而上法, 前者是将SF通过研磨的方法磨碎, 然后喷雾干燥制备而得, 制备方法简单且无须引入有机溶剂, 但制备得到的纳米粒粒径分布宽, 易引入杂质, 载药纳米粒的制备通常不适用于此种方法^[21]; 后者是利用疏水作用, 促使溶液中的SF形成更多反平行β-折叠结构, 从而实现纳米粒的自组装和相分离过程^[7]。与前者相比, 自下而上的方法应用更为广泛, 制备得到的纳米粒粒径可控且分布狭窄, 药物的包封率高。Sharma等^[22]将SF加入到丙酮溶液中, 在有机溶剂的诱导下SF可迅速自组装成为纳米颗粒。随后, 将制备得到的SF-NPs与庆大霉素溶液共混搅拌12 h, 可获得载庆大霉素的丝素蛋白纳米粒, 制备得到的纳米粒具有良好的抗菌性能。Wu等^[23]通过去溶剂法成功制备了载紫杉醇(paclitaxel, PTX) 的SF纳米粒, 该纳米粒具有较小的粒径, 可降低PTX的全身毒性。

基于SF-NPs在药物递送领域的应用前景, 本研究采用去溶剂法对SF-NPs的制备工艺进行系统考察, 旨在得到一种具有普适性的SF-NPs制备方法, 为SF-NPs用于药物递送奠定研究基础。作者以平均粒径和多分散性指数(polydispersity index, PDI) 为主要指标, 通过处方工艺筛选, 制备得到了可稳定制备的SF-NPs, 并对最优处方制备的SF-NPs的粒径、PDI、zeta电位、纳米粒的形态及稳定性进行了表征。为考察SF-NPs的细胞相容性, 以L929和4T1细胞为典型代表, 通过CCK-8及细胞活/死染色Calcein-AM/PI方法评估了SF-NPs对细胞增殖能力的影响, 发现SF-NPs具有优异的细胞相容性, 可促进细胞增殖。本研究结果表明, 采用去溶剂制备方法可以制备得到粒径可控且重现性良好的SF-NPs, 其良好的细胞生物相容性也为其用于药物递送奠定良好的基础。

材料与方法

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材料 SF (批号: 22102801) 购自中芯创惟生物科技(杭州) 有限公司; CCK-8试剂盒(批号: 20231114) 购自索莱宝; 小鼠成纤维细胞L929和小鼠乳腺癌细胞4T1由中国医学科学院药物研究所提供。

仪器激光粒度分析仪(Zeta Potential/Particle Sizer NICOMP^TM380ZLS, 美国); 透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM) (JEM-1400Plus, 日本); 扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM) (Thermoscientific ApreoS, FEI); 微粒递送系统稳定性分析仪(Tower, 法国)。

SF-NPs的制备 在去离子水中完全溶解一定浓度的SF, 然后充分水化, 以获得SF溶液(5~40 mg·mL^-1)。随后, 在缓慢搅拌的同时, 将SF溶液滴入不同体积的丙酮溶液中, 混合后观察到混合物迅速转变为白色乳浊液。将取得的乳液继续涡旋30 s, 然后置于冰浴中, 以80 W的功率进行3 min的超声振荡, 随后以500 r·min^-1的速度搅拌2 h。接下来, 通过在10 000 r·min^-1的转速下离心10 min, 收集SF-NPs, 并进行3次水洗, 最后冻干保存。

SF-NPs影响因素的考察

SF浓度的考察按照SF-NPs的制备方法, 考察不同浓度的SF (5、10、15、20、30、40 mg·mL^-1) 对形成SF-NPs粒径及PDI的影响, 其中SF溶液和丙酮的比例为1∶6。

水相与有机相比例的考察按照SF-NPs的制备方法, 考察不同体积的丙酮(2、4、6、8、10、20 mL) 对形成SF-NPs粒径及PDI的影响, 其中SF的浓度为20 mg·mL^-1。

超声功率及时间考察按照SF-NPs的制备方法, 保持SF浓度为20 mg·mL^-1, 水相与丙酮的体积比为1∶6, 考察不同的超声功率(60、80、120 W) 及超声时间(3和6 min) 对形成SF-NPs粒径及PDI的影响。

不同有机相种类考察在实验中, SF溶液与有机溶剂的体积比通常会对SF-NPs的形成过程产生影响。因此, 以甲醇、丙酮、无水乙醇、异丙醇为有机溶剂, 探讨不同种类的有机溶剂对SF-NPs粒径及PDI的影响。

SF-NPs制剂的表征

形态、粒径的考察根据SF-NPs影响因素的考察筛选出的最佳条件, 取SF-NPs适量, 用水稀释后, 采用激光粒度仪测定其粒径、zeta电位和PDI; 另外, 将已经稀释好的SF-NPs混悬液滴于铜网上, 通过醋酸铀染色, 并用滤纸将多余的染色液吸除, 在室温状态下自然干燥后, 采用TEM进行观察; 此外, 取已经冻干好的SF-NPs颗粒, 在15 kV的二次电子模式下获得图像。将分散体沉积在铜片上, 通过SEM观察其表面形貌。

稳定性考察采用法国的微粒递送系统稳定性分析仪测定SF-NPs的稳定性; 将样品置于样品瓶中, 4 ℃下测定, 每30 min扫描1次, 连续测定5天; 测定完成后, 观察样品状态, 并恢复温度至25 ℃, 继续扫描并连续测定5天, 分析数据。

SF-NPs体外细胞实验

L929细胞培养小鼠成纤维细胞L929使用含有10%马血清、1%的链霉素和青霉素的高糖DMEM培养基, 置于37 ℃、含5% CO₂的细胞培养箱中培养, 定期换液、传代, 取对数生长期细胞进行实验。

4T1细胞培养小鼠乳腺癌4T1细胞使用含有10%胎牛血清、1%的链霉素和青霉素的高糖DMEM培养基, 置于37 ℃、含5% CO₂的细胞培养箱中培养, 定期换液、传代, 取对数生长期细胞进行实验。

CCK-8法测定L929和4T1细胞的增殖能力 96孔细胞培养板铺板, 每组设6个复孔, 调整L929细胞密度为2×10³个, 调整4T1细胞密度为3×10³个, SF-NPs混悬液浓度设为0.1、1、5、10、50、100 μg·mL^-1, 当L929细胞或4T1细胞与SF-NPs共培养72 h后, 通过CCK-8法测定并通过细胞活/死染色Calcein-AM/PI定性分析SF-NPs对两种细胞增殖能力的影响。

结果

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1 SF-NPs影响因素的考察

SF在与水互溶的有机溶剂、不同pH值和超声等外界条件下能够通过诱导分子间自组装形成稳定的、不溶于水的沉淀^[24]。本实验中, 通过改变SF浓度、有机相种类、水相与有机相的体积比以及超声功率及时间, 来考察对SF-NPs理化性质的影响。

1.1 SF浓度的考察

如图 1所示, 随着SF浓度的增大(5~40 mg·mL^-1), SF-NPs粒径有增大的趋势, 但低浓度的SF相比较于高浓度的SF, PDI更大。考虑原因可能是因为粒子越小, 越容易聚集, 从而导致PDI越大。为了确保纳米粒具有合适的粒径与较小的PDI, 故选择20 mg·mL^-1 SF作为SF-NPs的制备条件。

1.2 水相与有机相比例的考察

实验中, SF与有机溶剂的体积比通常会影响SF-NPs的形成过程。为此, 以丙酮为有机溶剂, 探讨了不同体积的丙酮对形成SF-NPs的影响。如图 2所示, 当SF与丙酮的体积比较小时(1∶2), 形成的SF-NPs粒径较大, PDI也较大, 考虑原因可能是因为当把SF溶液加入到有机溶剂丙酮中, 在有机溶剂的诱导下, SF可马上分散脱水并自组装形成SF-NPs。当有机溶剂比例过低时, 不足以将SF完全诱导形成纳米粒; 当增大SF与丙酮的体积比到1∶4时, 得到的SF-NPs粒径减小, PDI也有所降低; 当继续增大二者的比例, 发现当SF与丙酮的体积比为1∶6或1∶10时, 得到的纳米粒粒径与PDI均较小, 虽然1∶8的体积比形成的SF-NPs粒径更小, 但PDI略大; 为了确保SF能被充分地诱导, 且无需引入过多的有机溶剂, 故选择1∶6的水相与有机相比例作为SF-NPs的制备条件。

1.3 超声功率及时间的考察

制备方法中超声功率及时间对形成SF-NPs的影响, 如图 3所示, 控制超声时间不变(3 min), 当超声功率为80 W时, 形成的SF-NPs粒径和PDI相比于低功率(60 W) 而言, 均有降低的趋势, 当增大超声功率到120 W时, 对SF-NPs的粒径并没有很好的改善作用, PDI变化也并不显著; 当延长超声时间到6 min时, 随着功率的增大, 形成的SF-NPs粒径有增大的趋势, 而80 W制备得到的纳米粒PDI更小。为了确保制备得到的纳米粒具有较小的粒径和PDI, 故选择超声功率80 W作为SF-NPs的制备条件; 当延长超声时间时, 制备得到的纳米粒PDI虽然有降低的趋势, 但粒径反而增大。表明当超声诱导SF的二级结构从silk 1向silk 2转变时, 不宜使用过高的超声功率和超声时间。因此, 选择超声功率80 W、超声时间3 min作为SF-NPs的制备条件。

1.4 有机相种类的考察

SF在与水互溶的有机溶剂中可自组装形成SF-NPs, 因此探讨了甲醇、丙酮、乙醇、异丙醇对形成SF-NPs的影响。当以异丙醇作为有机溶剂时, 形成的SF-NPs粒径较大; 当以甲醇作为有机溶剂时, 形成的SF-NPs PDI较大, 粒子分散性较差; 当以丙酮作为有机溶剂时, 形成的SF-NPs粒径较小, 粒子更稳定、不容易聚集(图 4)。因此, 选择丙酮作为后续SF-NPs的制备条件。

2 SF-NPs制剂的表征

2.1 形态、粒径的考察

SF的分子结构具有高度有序性, 它由重链(390 kDa)、轻链(25 kDa) 和一个由P25基因编码的糖蛋白(27 kDa) 所组成。其重链由非重复序列组成, 包括亲水嵌段和具有六肽单元(GAGAGS、GAGAGY) 的疏水嵌段, 它们交替排列, 决定了SF的性质。在本研究中, 以SF为载体材料, 通过温和的去溶剂法以自组装的方式制备了SF-NPs。结果显示, 制备得到的SF-NPs呈乳白色混悬液, 表现为单分散状态, 并且没有明显可见的沉淀产生。DLS结果表明(图 5a), 制备得到的SF-NPs分布均一, 平均粒径为144.8 nm, PDI为0.174, zeta电位为-27.35 mV。此外应用透射电镜和扫描电镜来观察SF-NPs的形貌(图 5b、c), SF-NPs明显显示出了粒径小于100 nm的类球形状态。通过动态光散射(dynamic light scattering, DLS) 和TEM/SEM测量得到的SF-NPs粒径有明显差别, 这是因为纳米粒子在水中会遇水膨胀, 所以通过DLS测量得到的粒径会偏大, 而在TEM/SEM制样过程中纳米粒会失水收缩, 所以测量得到的粒径会变小。

2.2 稳定性考察

采用法国的微粒递送系统稳定性分析仪测定SF-NPs的稳定性, 结果如图 6所示, 测定前观察样品状态(图 6a), 纳米混悬液呈单分散状态, 无明显沉淀产生; 在4 ℃条件下连续测定5天的稳定性(图 6b、c), 动力学不稳定指数(Turbiscan stability index, TSI) 较低, 表明SF-NPs较为稳定, 测定结束后取出样品观察(图 6d), 未观察到明显的沉淀沉积现象。此外, 升高温度, 继续测定了SF-NPs在25 ℃下的稳定性(图 6e、f), TSI有缓慢升高的趋势, 表明SF-NPs的稳定性逐渐减弱, 低温更适合SF-NPs的保存。

3 SF-NPs体外细胞实验

使用CCK-8试剂盒测定了SF-NPs对L929和4T1细胞活力的作用效果, 各组加入纳米粒的浓度分别为0.1、1、5、10、50、100 μg·mL^-1, 在与细胞作用72 h后, 检测该浓度范围内SF-NPs对细胞存活的影响。L929细胞结果如图 7a所示, 在SF-NPs与L929细胞共培养72 h后, 所有实验组的细胞存活率均在90%以上, 且表现出一定程度的促增殖作用。此外, 还通过细胞活/死染色Calcein-AM/PI试剂盒定性观察了在50 μg·mL^-1下, SF-NPs对细胞增殖的影响, 在该浓度下, L929细胞生长状态较好, 细胞增殖没有受到抑制(图 7b); 4T1细胞结果如图 7c所示, 当SF-NPs与4T1细胞共培养72 h后, 各实验组的细胞生长状态较好, 尤其是高浓度的SF-NPs更能促进4T1细胞的增殖。通过细胞活/死染色Calcein-AM/PI试剂盒定性观察了SF-NPs对细胞增殖的影响(图 7d), 在50 μg·mL^-1浓度下, SF-NPs对4T1细胞起到促增殖作用, 细胞增殖没有受到抑制。总体而言, SF在生物相容性方面表现出优越的特性, 使其成为潜在的药物递送载体。

讨论

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随着药物递送系统的迅速发展, 对药物的有效性评价除了考虑其治疗效果之外, 还需要考虑药物带来的不良反应^{[25, 26]}。SF来源于蚕丝, 经过适当的处理后, 通常不含有害物质。因此, 它对细胞和组织具有低毒性, 这也使其成为理想的药物递送系统材料^[27]。广泛的研究显示, SF适用于输送小分子、多肽、蛋白质和核酸类药物, 有效提高了药物的包封效率和稳定性、调控药物释放以及降低不良反应。总体而言, 基于SF的纳米药物设计在药物递送方面有着广阔的发展前景。

在本项研究中, 以SF为载体材料, 通过去溶剂法成功制备了SF-NPs, 该制备方法快速简单、重现性好。在处方筛选过程中, 发现高浓度的SF制备得到的SF-NPs粒径较大, 较低浓度的SF制备得到的SF-NPs虽粒径较小, 但PDI较大, 因此选择了20 mg·mL^-1的SF作为后续的处方筛选。在比较不同比例的丙酮对SF-NPs形成的影响中, 发现SF只有在过量丙酮诱导的条件下才能形成纳米沉淀, 但较高体积的丙酮对SF-NPs的粒径和PDI无明显影响。为了减少有机相的比例, 故选择1∶6的比例作为后续的处方筛选。作者还考察了超声功率和超声时间对形成SF-NPs的影响, 结果表明超声功率和时间不宜过大, 适中的超声功率和时间可形成粒径较小且更均一的SF-NPs。此外, 由于SF在与水互溶的有机溶剂中可自组装形成SF-NPs, 也考察了不同有机相的种类对形成SF-NPs的影响, 发现以丙酮作为有机溶剂可形成粒径较小且更均一的SF-NPs。对制备得到SF-NPs进行表征, 该纳米粒粒径分布均匀, 平均粒径为144.8 nm, PDI为0.174, zeta电位为-27.35 mV。TEM/SEM结果表明SF-NPs形貌呈类球形状态, 由于制样过程中纳米粒会失水收缩, 所以测量得到的粒径会变小。稳定性结果表明, 制备得到的SF-NPs前期较为稳定, 后期会有少量沉淀蓄积。

经生物安全性评价发现, 本研究制备得到的SF-NPs与L929和4T1细胞具有较好的相容性, 即使是纳米粒子与细胞共培养72 h后, 也未表现出明显的细胞毒性, 且具有一定的促增殖作用, 表明了SF生物相容性良好, 可作为潜在的药物递送载体。

综上所述, 本研究采用去溶剂制备方法可以制备得到粒径可控且重现性良好的SF-NPs, 其良好的细胞生物相容性也为其用于药物递送奠定良好的基础。但本研究是从空白SF-NPs的角度出发, 未来还需从载药水平深入探讨载药SF-NPs的药物递送优势。

作者贡献: 闫羽负责完成空白纳米粒处方筛选及表征; 程佳玲负责完成细胞实验; 刘子晗负责协助完成空白纳米粒的表征; 王洪亮、杨艳芳、叶军参与文章修改; 蒋伟哲和刘玉玲提出研究方案并指导完成实验和文章撰写。

利益冲突: 本文所有作者声明不存在利益冲突关系。

基金

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国家自然科学基金资助项目(82304393)
北京市科技新星计划(Z211100002121127)
北京市科技新星计划(20220484219)
中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2021-I2M-1-026)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2023年第58卷第12期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1273

接收时间：2023-11-10
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-12-12

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出版历史

收稿日期：2023-11-10
修回日期：2023-11-17

基金

国家自然科学基金资助项目(82304393)

北京市科技新星计划(Z211100002121127)

北京市科技新星计划(20220484219)

中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2021-I2M-1-026)

作者信息

1.广西医科大学药学院, 广西南宁 530021

2.中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 药物传输技术及新型制剂北京市重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

*蒋伟哲, Tel: 13607713097, E-mail: jiangweizhe6812@163.com;

刘玉玲, Tel: 86-10-89285191, E-mail: ylliu@imm.ac.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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