药学学报

No.	1^a		2^b		3^a
1	185.9			204.0			32.8	2.18, t (7.4)
2	147.6		41.8	2.66, dd (17.5, 9.9)	24.0	1.55, m
2.50, dd (17.5, 4.5)
3	141.7		36.0	2.33, m	31.2	2.00, dt (7.5, 6.8)
4	180.0		71.8	4.60, d (3.0)	134.2	5.58, dt (15.2, 6.8)
5	116.2	7.44, d (1.6)	109.0	6.44, d (2.2)	126.2	5.29, dd (15.2, 9.3)
6	152.6		166.9		51.5	3.01, t (9.3)
7	119.5	7.16, d (1.6)	102.7	6.19, d (2.2)	40.6	2.59, m
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9	111.5		109.9
10	131.1		149.6
11	62.1	4.56, s	16.0	1.08, d (6.8)
1′	60.1	3.87, s
8-OH		11.5, s
1-COOH					174.2
6-COOH					174.3
7-COOH					176.2

No.

1^a

2^b

3^a

δ_C

δ_H

δ_C

δ_H

δ_C

δ_H

185.9

204.0

32.8

2.18, t (7.4)

147.6

41.8

2.66, dd (17.5, 9.9)

24.0

1.55, m

2.50, dd (17.5, 4.5)

141.7

36.0

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160.1

166.6

14.7

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111.5

109.9

131.1

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62.1

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16.0

1.08, d (6.8)

1′

60.1

3.87, s

8-OH

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1-COOH

174.2

6-COOH

174.3

7-COOH

176.2

No.	1^a		2^b		3^a
1	185.9			204.0			32.8	2.18, t (7.4)
2	147.6		41.8	2.66, dd (17.5, 9.9)	24.0	1.55, m
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10	131.1		149.6
11	62.1	4.56, s	16.0	1.08, d (6.8)
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1-COOH					174.2
6-COOH					174.3
7-COOH					176.2

No.

1^a

2^b

3^a

δ_C

δ_H

δ_C

δ_H

δ_C

δ_H

185.9

204.0

32.8

2.18, t (7.4)

147.6

41.8

2.66, dd (17.5, 9.9)

24.0

1.55, m

2.50, dd (17.5, 4.5)

141.7

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31.2

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71.8

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152.6

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174.2

6-COOH

174.3

7-COOH

176.2

Compound	Cytotoxicity (IC₅₀/μmol·L^-1)
1	78.93	98.80
Doxorubicin hydrochloride	0.25	0.37

Compound

Cytotoxicity (IC₅₀/μmol·L^-1)

HeLa

p338

78.93

98.80

Doxorubicin hydrochloride

0.25

0.37

Compound	Cytotoxicity (IC₅₀/μmol·L^-1)
1	78.93	98.80
Doxorubicin hydrochloride	0.25	0.37

Compound

Cytotoxicity (IC₅₀/μmol·L^-1)

HeLa

p338

78.93

98.80

Doxorubicin hydrochloride

0.25

0.37

真菌Pleosporales sp.中的萘醌和羧酸类衍生物

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戚思远 ^# , 张丽花 ^# , 郝轶男 , 胡友财 , 柏健 ^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(5): 1327-1333

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(5): 1327-1333

真菌Pleosporales sp.中的萘醌和羧酸类衍生物

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戚思远^#, 张丽花^#, 郝轶男, 胡友财, 柏健^*

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

^*柏健, Tel: 86-10-50927167, E-mail: baijian@imm.ac.cn

Naphthoquinone and carboxylic acid derivatives from the fungus Pleosporales sp.

Si-yuan QI, Li-hua ZHANG, Yi-nan HAO, You-cai HU, Jian BAI^*

Affiliations

Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

出版时间: 2024-05-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1269

文章导航

摘要

收起

运用Sephadex LH-20凝胶柱色谱、硅胶柱色谱、反相HPLC、手性色谱等多种色谱方法, 从真菌Pleosporales sp.大米发酵物的乙酸乙酯提取物中分离得到3个新化合物, 包括1个萘醌类化合物、1个萘醌还原型的萘酮类化合物和1个三羧酸类化合物, 以及5个已知的萘酮类衍生物。利用质谱、核磁共振、比旋光等多种波谱学方法, 以及计算ECD的方法, 确定了这8个化合物的结构。新化合物分别命名为pleospathone A (1)、pleospathone B (2) 和pleosporalic acid A (3)。已知化合物分别鉴定为(3S, 4R)-3,4,8-trihydroxy-6-methyl-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one (4)、(4R)-3,4-dihydro-4,6,8-trihydroxy-1(2H)-naphthalenone (5)、(-)-scytalone (6)、(3S, 4S)-3,4-dihydro-3,4,6,8-tetrahydroxy-1(2H)-naphthalenone (7) 和cis-4-hydroxyscytalone (8)。其中, 化合物4~8均为首次从Pleosporales属真菌中分离得到。化合物1对人宫颈癌细胞HeLa和小鼠白血病细胞P388有弱的细胞毒活性, IC₅₀值分别为78.93和98.80 μmol·L^-1。

关键词

Pleosporales属真菌 / 次级代谢产物 / 萘醌 / 萘酮 / 三羧酸类化合物 / 细胞毒活性

Abstract

收起

Three new compounds, including a naphthoquinone, a reduced naphthoquinone derivative naphthalenone, and a tricarboxylic acid, along with five known naphthalenone derivatives were isolated from ethyl acetate extract of rice fermentation products of the fungus Pleosporales sp. by multiple column chromatographic methods, including Sephadex LH-20 gel column chromatography, silica gel column chromatography, reversed-phase HPLC, and chiral chromatography. Their structures were elucidated by MS, NMR, and specific rotation spectroscopic analyses as well as ECD calculations. Three novel compounds were named as pleospathone A (1), pleospathone B (2), and pleosporalic acid A (3). Five known compounds were separately identified as (3S, 4R)-3,4,8-trihydroxy-6-methyl-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one (4), (4R)-3,4-dihydro-4,6,8-trihydroxy-1(2H)-naphthalenone (5), (-)-scytalone (6), (3S, 4S)-3,4-dihydro-3,4,6,8-tetrahydroxy-1(2H)-naphthalenone (7), and cis-4-hydroxyscytalone (8). Compounds 4-8 were isolated from the Pleosporales fungi for the first time. Compound 1 shows inhibitory activities against human cervical carcinoma cell line HeLa and murine leukemia cell line P388 with the IC₅₀ values of 78.93 and 98.80 μmol·L^-1, respectively.

Key words

Pleosporales fungus / secondary metabolite / naphthoquinone / naphthalenone / tricarboxylic acid / cytotoxic activity

引用本文

戚思远, 张丽花, 郝轶男, 胡友财, 柏健. 真菌Pleosporales sp.中的萘醌和羧酸类衍生物. 药学学报, 2024 , 59 (5) : 1327 -1333 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1269

Si-yuan QI, Li-hua ZHANG, Yi-nan HAO, You-cai HU, Jian BAI. Naphthoquinone and carboxylic acid derivatives from the fungus Pleosporales sp.[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (5) : 1327 -1333 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-1269

正文

收起

萘醌类化合物广泛存在于自然界中的细菌、真菌和高等植物中, 具有广泛的药理活性和丰富的生态特性^{[1, 2]}, 如抗菌^[3]、抗结核^[4]、杀虫^[5]、抗肥胖、抗肿瘤^[6]等作用。这类化合物通常具有鲜艳的颜色, 如黄色、红棕色等。从古代就开始将含有大量萘醌类化合物的植物汁液进行染发以及丝绸和羊毛的染色, 现如今人们也将萘醌类化合物用于化妆品和服装行业^[7]。人体内必不可少的维生素K族化合物, 如维生素K₁和K₂, 就是属于萘醌类化合物。它们具有促进凝血的作用, 可用于多种凝血障碍的疾病治疗^[8]。萘醌具有良好的化学反应特性, 醌环的结构中与羰基共轭的双键使醌环很容易发生还原、氧化和加成反应, 是上市药物分子中重要的骨架片段。目前含有萘醌骨架的上市药物种类繁多, 用途广泛, 如抗凝血药甲萘醌、抗疟药阿托伐醌、抗炎药双醋瑞因, 抗癌药阿霉素、米托蒽醌等^[9]。Pleosporales属真菌可以产生具有抗癌活性的萘酮类衍生物^[10]。本课题组前期从Pleosporales sp.中发现了具有抗癌活性的马来酸酐二聚体类化合物phomoidrides E-G和具有6/6/7/6四环结构的新颖聚酮pleosporalesones A-B^{[11, 12]}。基于此, 本研究继续探索Pleosporales sp.在大米培养基中产生的活性次级代谢产物, 从其乙酸乙酯提取物中分离鉴定了8个化合物(图 1), 包括1个萘醌类化合物(1), 6个萘醌还原型的萘酮类化合物(2、4~8) 和1个三羧酸类化合物(3), 其中化合物1~3为新化合物, 化合物4~8为首次从该菌属中分离得到。对化合物1进行了肿瘤细胞毒活性评价, 发现化合物1对人宫颈癌细胞HeLa和小鼠白血病细胞P388有弱的细胞毒活性。

结果与讨论

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1 结构鉴定

化合物1为橘红色无定型粉末, 易溶于甲醇。高分辨质谱HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 251.054 4 [M+H]⁺ (C₁₂H₉O₆, 计算值251.055 0), 提示其分子式为C₁₂H₁₀O₆, 不饱和度为8。化合物1的¹³C NMR谱(表 1) 显示出10个sp²碳信号(包含2个酮羰基碳信号) 和2个sp³碳信号。结合¹H NMR谱(表 1) 中的两个芳香氢信号δ_H 7.16 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-7)、7.44 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-5), 推测存在一个苯环片段。¹H NMR和 ¹³C NMR谱提示, 还存在一个羟甲基[δ_C 62.1 (C-11), δ_H 4.56 (2H, s, H₂-11)] 和一个甲氧基[δ_C 60.1 (C-1′), δ_H 3.87 (3H, s, H₃-1′)]。HMBC谱(图 2) 中, 羟甲基的氢信号H₂-11与C-5、C-6、C-7和C-10相关, H-7与C-1、C-5、C-11、C-8和C-9相关, 羟基氢信号8-OH与C-7、C-8和C-9相关, H-5与C-11、C-9和C-4相关, 表明存在一个四取代的苯环, 并且C-6位连接羟甲基, C-8位连接羟基, C-9位和C-10位分别连接酮羰基碳C-1和C-4。根据分子式, 分子中还有一个双键片段(2个sp²碳) 未连接。甲氧基氢信号H₃-1′与双键碳δ_C 141.7有HMBC相关, 提示甲氧基连接在该双键碳上。结合分子式、不饱和度以及碳信号的化学位移, 并与文献^[13]报道的3, 5-dihydroxy-2-methoxy-1, 4-naphthalenedione的碳谱数据进行比对, 确定双键的C-2和C-3应分别与两个酮羰基C-1和C-4相连, 并且C-2连接羟基, C-3连接甲氧基, 最终形成萘醌结构(图 1)。综上, 确定化合物1的结构为2, 8-dihydroxy-6-hydroxymethyl-3-methoxy-1, 4-naphthalenedione, 为新化合物, 命名为pleospathone A。

化合物2为淡黄色无定型粉末, 易溶于甲醇。高分辨质谱HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 209.080 8 [M+H]⁺ (C₁₁H₁₃O₄, 计算值209.073 6), 提示其分子式为C₁₁H₁₂O₄, 不饱和度为6。化合物2的¹³C NMR谱(表 1) 显示出7个sp²碳信号(包含1个酮羰基碳信号) 和4个sp³碳信号。结合¹H NMR谱(表 1) 中δ_H 6.44 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-5)、6.19 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-7), 提示存在一个苯环片段; 同时还提示存在一个连氧次甲基[δ_C 71.8 (C-4), δ_H 4.60 (1H, d, J = 3.0 Hz, H-4)]、一个亚甲基[δ_C 41.8 (C-2), δ_H 2.66 (1H, dd, J = 17.5, 9.9 Hz, H-2a)、2.50 (1H, dd, J = 17.5, 4.5 Hz, H-2b)]、一个次甲基[δ_C 36.0 (C-3), δ_H 2.33 (1H, m, H-3)] 和一个甲基[δ_C 16.0 (C-11), δ_H 1.08 (3H, d, J = 6.8 Hz, H₃-11)]。HMBC谱(图 2) 中, H-5与C-4、C-6、C-7和C-9相关, H-7与C-5、C-6、C-8和C-9相关, 连氧次甲基的氢信号H-4与C-10、C-5和C-9相关, 表明存在一个四取代苯环, 并且C-6和C-8位各连接一个羟基, C-10位与C-4位的连氧次甲基相连, C-9位可能连接酮羰基。¹H-¹H COSY谱(图 2) 显示H-3与H-4、H₂-2、甲基氢信号H₃-11相关, 提示C-3位分别连接C-4、C-2和C-11。¹H-¹H COSY谱(图 2) 显示H-3与H-4、H₂-2、甲基氢信号H₃-11相关, 提示C-3位分别连接C-4、C-2和C-11。HMBC谱(图 2) 中, H-4与C-3、C-2和C-11相关, H₂-2与C-1和C-9相关, 证明C-4和C-3相连, C-1分别与C-9和C-2相连, 最终形成萘酮结构, 从而确定了化合物2的平面结构(图 1)。¹H NMR谱(表 1) 显示, H-2a (δ_H 2.66) 与H-3之间的大耦合常数(J = 9.9 Hz) 表明H-2a和H-3均处于直立键; H-3与H-4之间的小耦合常数(J = 3.0 Hz) 则表明H-4处于平伏键。结合ROESY谱显示, H-3和H-4有相关, 从而确定H-3与H-4在环己酮环的同侧。经数据库检索和文献^[14]数据比对, 化合物2与teratosphaerone B平面结构相似, 区别仅在于teratosphaerone B的C-6取代为甲氧基。由于化合物2的相对构型与teratosphaerone B相同, 并且旋光数据([α]

$ {}_{\mathrm{D}}^{25} $

-10.4) 和teratosphaerone B的旋光数据([α]

$ {}_{\mathrm{D}}^{25} $

+16.3) 符号相反, 故确定化合物2的绝对构型为3S, 4S。因此, 确定化合物2的结构为(3S, 4S)-4,6,8-trihydroxy-3-methyl-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one, 为新化合物, 命名为pleospathone B。

化合物3为透明油状物, 易溶于乙腈。高分辨质谱HR-ESI-MS显示准分子离子峰m/z 267.083 9 [M+Na]⁺ (C₁₁H₁₆O₆Na, 计算值267.083 9), 提示其分子式为C₁₁H₁₆O₆, 不饱和度为4。¹³C NMR谱(表 1) 显示出5个sp²信号(包含3个羰基碳信号) 和6个sp³信号。¹H NMR、¹³C NMR (表 1) 和HSQC谱显示, 存在4个次甲基(含2个不饱和碳) [δ_C 134.2 (C-4), δ_H 5.58 (1H, dt, J = 15.2, 6.8 Hz, H-4); δ_C 126.2 (C-5), δ_H 5.29 (1H, dd, J = 15.2, 9.3 Hz, H-5); δ_C 51.5 (C-6), δ_H 3.01 (1H, t, J = 9.3 Hz, H-6); δ_C 40.6 (C-7), δ_H 2.59 (1H, m, H-7)]、3个亚甲基[δ_C 32.8 (C-1), δ_H 2.18 (2H, t, J = 7.4 Hz, H₂-1); δ_C 24.0 (C-2), δ_H 1.55 (2H, m, H₂-2); δ_C 31.2 (C-3), δ_H 2.00 (2H, dt, J = 7.5, 6.8 Hz, H₂-3)] 和1个甲基[δ_C 14.7 (C-8), δ_H 1.02 (3H, d, J = 7.3 Hz, H₃-8)]。¹H-¹H COSY (图 2) 谱显示了H₂-1/H₂-2/H₂-3/H-4/H-5/H-6/H-7/H₃-8相关; 结合HMBC谱(图 2) 中, H-7、H₃-8与羰基碳δ_C 176.2相关, H-5、H-6与羰基碳δ_C 174.3相关, H₂-1、H₂-2与羰基碳δ_C 174.2相关, 表明存在一个1, 6, 7-三取代的辛-4-烯结构片段, 并且C-1、C-6、C-7分别连接一个羰基。结合分子式和羰基的化学位移, 提示δ_C 176.2、174.3和174.2为3个羧酸的羰基碳信号, 因此确定了化合物3的平面结构(图 1)。

¹H NMR谱显示双键上H-4和H-5之间的偶合常数是15.2 Hz, 确定C-4位双键的构型为E型。H-6和H-7之间的大耦合常数(J = 9.3 Hz) 表明两者处于反式构型, 提示它们的相对构型有两种, 其纽曼投影式如图 3所示。NOESY谱(图 3) 显示, H-5和H₃-8有相关, 因此确定C-6和C-7的相对构型为苏式, 即6S*, 7S*。化合物3的绝对构型是通过理论计算的ECD谱与实测CD谱对比来确定的。结果如图 4所示, (6S, 7S)-3的ECD曲线与化合物3的实验测试曲线吻合良好, 从而确定了化合物3的绝对构型。综上所述, 确定化合物3的结构为(6S, 7S, E)-oct-4-ene-1, 6, 7-tricarboxylic acid, 为新化合物, 命名为pleosporalic acid A。

通过波谱数据分析, 结合与文献报道数据比较, 5个已知的萘酮类衍生物分别鉴定为(3S, 4R)-3,4,8-trihydroxy-6-methyl-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one (4)^[15]、(4R)-3,4-dihydro-4,6,8-trihydroxy-1(2H)-naphthalenone (5)^[16]、(-)-scytalone (6)^[17]、(3S, 4S)-3,4-dihydro-3,4,6,8-tetrahydroxy-1(2H)-naphthalenone (7)^[18]和cis-4-hydroxyscytalone (8)^[19]。这5个萘酮类衍生物均为首次从Pleosporales属真菌中分离得到。

2 化合物活性检测

利用MTT法^[20]对化合物1的细胞毒活性进行评价, 测试肿瘤细胞为人宫颈癌细胞HeLa和小鼠白血病细胞P388, 阳性对照药为盐酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride)。结果(表 2) 显示化合物1对人宫颈癌细胞HeLa和小鼠白血病细胞P388均具有弱的细胞毒活性, IC₅₀值分别为78.93和98.80 μmol·L^-1。

实验部分

收起

AUTOPOL IV旋光仪(美国鲁道夫公司); JASCO V-650紫外-可见光谱仪、JASCO J-815圆二色谱仪(日本Jasco分光公司); Bruker AV-Ⅲ-500、Bruker AV-Ⅲ-700 HD型核磁共振光谱仪(德国布鲁克公司); BUCHI中高压Reveleris@Prep纯化系统(瑞士步琦公司); SSI半制备高效液相色谱仪(DAD检测器, 美国科学系统公司); Waters ACQUITY H-Class QDA UPLC-MS (1.7 μm, 50 mm × 2.1 mm, C18 column, 美国沃特世有限公司); Silgreen C18色谱柱(5 μm, 250 mm × 20 mm; 北京绿百草科技发展有限公司); YMC-Pack ODS-A半制备色谱柱(5 μm, 10 mm × 250 mm, 日本YMC公司); CHIRALPAK AD-H手性色谱柱(5 μm, 250 mm × 10 mm; 大赛璐药物手性技术有限公司); 羟丙基葡聚糖Sephadex LH-20 (GE Healthcare Bio-Sciences AB公司); CombiFlash Rf中低压色谱系统(Teledyne Isco, USA); GF₂₅₄硅胶TLC板(青岛海洋化工厂)。水(LC-MS级)、乙腈(LC-MS级、HPLC级和AR级)、甲醇(HPLC级和AR级)、乙酸乙酯(AR级)、正己烷(AR级)、乙醇(AR级), 其中LC-MS级和HPLC级试剂均来源于Fisher公司, AR级试剂均来源于北京化工厂。甲酸(HPLC级, 上海麦克林生化科技股份有限公司)、氘代甲醇和氘代DMSO (美国CIL公司)。马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)、马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB培养基) (美国BD公司), 大米培养基为福临门水晶米(中粮集团有限公司)与水以8∶11的比例混合后在115 ℃下高压蒸汽灭菌20 min而得。生物材料是从美国模式培养物集存库购买的编号为ATCC 74256的真菌, 通过对18S核糖体RNA的核苷酸序列分析鉴定为Pleosporales sp.。

1 真菌培养

将真菌Pleosporales sp. (ATCC 74256) 接种于PDA培养基上, 于28 ℃培养箱中培养8天进行活化。将活化后的菌株接种至900 mL的PDB培养基中, 于28 ℃、180 r·min^-1条件下培养5天, 作为种子液。取10 mL种子液接种于500 mL锥形瓶中的大米培养基(包含80 g大米和110 mL水) 中, 共接种50瓶, 在室温下静置培养25天。

2 提取分离

用8 L乙酸乙酯超声提取大米发酵物3次, 每次1 h。将乙酸乙酯提取液加入等量的蒸馏水, 进行萃取, 乙酸乙酯层减压浓缩得到粗膏(97 g)。将粗膏溶于适量乙腈中进行分散, 加入等量的正己烷萃取(除脂)。得到的乙腈萃取物(76 g) 经Sephadex LH-20柱色谱(90%甲醇-水, v/v) 后, 得到4个组分Fr.1~Fr.4。Fr.1 (21 g) 和Fr.2 (12 g) 分别经Sephadex LH-20柱色谱(95%乙腈-水, v/v) 分离后, 两根色谱柱的所有流分在TLC监测下合并为4个组分F1~F4, TLC监测采用90%硫酸-乙醇试剂显色。之后将F1 (23 g) 经硅胶柱色谱(石油醚-乙酸乙酯, 1∶0~0∶1, v/v, 0.01%甲酸) 后分离, 得到9个组分F1-1~F1-9。F1-9 (3.2 g) 经中压液相色谱(甲醇-水, 20%~80%, v/v) 分离, 得到5个组分F1-9-1~F1-9-5。F1-9-3 (335.2 mg) 经半制备HPLC (45%乙腈-水, v/v, 0.01%三氟乙酸, YMC-C18柱, 10 mm × 250 mm) 分离, 得到化合物1 (4.2 mg, t_R = 30 min) 和3 (2.1 mg, t_R = 64 min)。

将F4和Fr.3合并(共14.0 g) 经Sephadex LH-20柱色谱(95%乙腈-水, v/v) 分离后, 在TLC监测下合并为4个组分F4a~F4d。F4b (1.5 g) 经中压液相色谱(甲醇-水, 20%~100%, v/v) 分离, 得到12个组分F4b-1~F4b-12。F4b-9 (306.2 mg) 经硅胶柱色谱(甲醇-二氯甲烷, 1%~20%, v/v) 分离, 得到5个组分F4b-9a~F4b-9e。F4b-9c (145.0 mg) 经ODS柱色谱(甲醇-水, 30%-40%-50%, v/v) 分离, 得到8个组分F4b-9c-1~F4b-9c-8。F4b-9c-2 (23.9 mg) 经半制备HPLC (甲醇-水, 37∶63, v/v, 0.1%甲酸, Silgreen柱, 10 mm × 250 mm) 纯化, 得到化合物4 (5.0 mg, t_R = 21 min)。

Fr.4 (6.2 g) 经Sephadex LH-20柱色谱(95%乙腈-水, v/v) 分离后, 在TLC监测下合并为3个组分F5~F7。将F5 (2.7 g) 经中压液相色谱(甲醇-水, 10%~99%, v/v) 分离, 得到10个组分F5-1~F5-10。将其中5个组分F5-1~F5-5 (共1.2 g) 合并, 经中压液相色谱(甲醇-水, 20%~40%, v/v) 分离, 得到3个组分F5-1a (115.2 mg)、F5-1b (80.0 mg) 和F5-1c (994.1 mg)。将F5-1c经中压液相色谱(甲醇-水, 4%~20%, v/v) 分离, 得到5个组分F5-1c-1~F5-1c-5。F5-1c-3 (86.2 mg) 经半制备HPLC (甲醇-水, 34∶66, v/v, 0.1%甲酸, Silgreen柱, 10 mm × 250 mm) 分离, 得到化合物2 (2.2 mg, t_R = 34 min)、5 (2.4 mg, t_R = 15 min) 和6 (2.3 mg, t_R = 17 min)。

将F7 (777.2 mg) 经中压液相色谱(甲醇-水, 20%~80%, v/v) 分离, 得到7个组分F7-1~F7-7。F7-3 (43.1 mg) 经ODS柱色谱(12%甲醇-水, v/v) 分离, 得到2个组分F7-3a (30.2 mg) 和F7-3b (10.2 mg)。将F7-3a经半制备HPLC (甲醇-水, 21%~37%, v/v, 0.1%甲酸, Silgreen柱, 10 mm × 250 mm) 分离, 得到4个组分F7-3a-1~F7-3a-4。将F7-3a-2 (5.8 mg) 经手性半制备HPLC (20%正己烷-异丙醇, v/v, 0.1%甲酸, CHIRALPAK AD-H柱, 10 mm × 250 mm) 拆分后, 得化合物7 (3.0 mg, t_R = 12 min) 和8 (1.6 mg, t_R = 17 min)。

3 结构鉴定

化合物1 橘红色无定型粉末; UV (MeOH) λ_max (log ε) 204.8 (4.07), 230.4 (3.84), 280.2 (3.79), 398.4 (3.35) nm; HR-ESI-MS m/z 251.054 4 [M+H]⁺ (C₁₂H₉O₆, 计算值251.055 0); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) 和 ¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) 数据见表 1; ¹H NMR (700 MHz, CD₃OD) δ_H: 7.53 (1H, J = 3.0 Hz, H-5), 7.17 (1H, J = 3.0 Hz, H-7), 4.64 (2H, s, H-11), 4.01 (3H, s, H-1′); ¹³C NMR (175 MHz, CD₃OD) δ_C: 187.6 (C-1), 148.6 (C-2), 143.1 (C-3), 182.1 (C-4), 117.9 (C-5), 153.3 (C-6), 121.3 (C-7), 162.4 (C-8), 112.9 (C-9), 132.8 (C-10), 64.1 (C-11), 61.0 (C-1′)。

化合物2 淡黄色无定型粉末; [α]

$ {}_{\mathrm{D}}^{25} $

-10.4 (c 0.22, MeOH); UV (MeOH): λ_max (log ε) 207.4 (3.97), 281.4 (3.74), 321.4 (3.53) nm; HR-ESI-MS m/z 209.080 8 [M+H]⁺ (C₁₁H₁₃O₄, 计算值209.073 6); ¹H NMR (700 MHz, CD₃OD) 和¹³C NMR (175 MHz, CD₃OD) 数据见表 1。

化合物3 透明油状物; [α]

$ {}_{\mathrm{D}}^{20} $

-59.5 (c 0.21, MeOH); UV (CH₃CN): λ_max (log ε) 203.4 (4.00) nm; HR-ESI-MS m/z 267.083 9 [M+Na]⁺ (C₁₁H₁₆O₆Na, 计算值267.083 9); ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆) 和¹³C NMR (150 MHz, DMSO-d₆) 数据见表 1。

化合物4 棕色无定型粉末; [α]

$ {}_{\mathrm{D}}^{22} $

-18.2 (c 0.28, MeOH); ESI-MS m/z 209.10 [M+H]⁺, 189.15 [M-H-H₂O]^-; ¹H NMR (700 MHz, CD₃OD) δ_H: 6.94 (1H, s, H-5), 6.69 (1H, s, H-7), 4.80 (1H, d, J = 2.8 Hz, H-4), 4.25 (1H, m, H-3), 2.94 (1H, dd, J = 17.3, 7.4 Hz, H-2a), 2.82 (1H, m, H-2b), 2.35 (3H, s, H-9); ¹³C NMR (175 MHz, CD₃OD) δ_C: 204 (C-1), 43.7 (C-2), 70.5 (C-3), 71.3 (C-4), 121.3 (C-5), 149.9 (C-6), 117.9 (C-7), 163.5 (C-8), 114.5 (C-9), 145.4 (C-10), 22.2 (C-11)。以上数据与文献^[15]报道的(3S, 4R)-3,4,8-trihydroxy-6-methyl-3,4-dihydronaphthalen-1(2H)-one的数据基本一致。

化合物5 黄色无定型粉末; [α]

$ {}_{\mathrm{D}}^{22} $

+30.0 (c 0.08, MeOH); ESI-MS m/z 195.01 [M+H]⁺, 193.12 [M-H]^-; ¹H NMR (700 MHz, CD₃OD) δ_H: 12.77 (1H, s, OH-8), 6.54 (1H, dd, J = 2.3, 1.0 Hz, H-5), 6.17 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-7), 4.72 (1H, dd, J = 8.8, 3.9 Hz, H-4), 2.77 (1H, ddd, J = 17.6, 6.7, 4.6 Hz, H-2a), 2.60 (1H, ddd, J = 17.7, 9.9, 4.9 Hz, H-2b), 2.19~2.27 (1H, m, H-3a), 2.02 (1H, ddd, J = 13.1, 9.9, 8.7, 4.6 Hz, H-3b); ¹³C NMR (175 MHz, CD₃OD) δ_C: 203.7 (C-1), 166.8 (C-6), 166.7 (C-8), 151.0 (C-10), 110.1 (C-9), 107.3 (C-5), 102.4 (C-7), 68.5 (C-4), 32.7 (C-3), 35.7 (C-2)。以上数据与文献^[16]报道的(4R)-3,4-dihydro-4,6,8-trihydroxy-1(2H)-naphthalenone的数据基本一致。

化合物6 白色无定型粉末; [α]

$ {}_{\mathrm{D}}^{22} $

-33.3 (c 0.23, MeOH); ESI-MS m/z 195.00 [M+H]⁺, 193.12 [M-H]^-; ¹H NMR (700 MHz, CD₃OD) δ_H: 6.22 (1H, d, J = 1.2 Hz, H-5), 6.10 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-7), 4.25 (1H, tt, J = 7.7, 3.8 Hz, H-3), 3.08 (1H, dd, J = 16.0, 3.8 Hz, H-4a), 2.85 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-4b), 2.83 (1H, d, J = 5.6 Hz, H-2a), 2.61 (1H, dd, J = 16.9, 7.7 Hz, H-2b); ¹³C NMR (175 MHz, CD₃OD) δ_C: 202.5 (C-1), 166.6 (C-8), 166.5 (C-6), 146.0 (C-10), 111.7 (C-9), 109.4 (C-5), 101.6 (C-7), 66.9 (C-3), 47.4 (C-2), 39.1 (C-4)。以上数据与文献^[17]报道的(-)-scytalone的数据基本一致。

化合物7 淡黄色无定型粉末; [α]

$ {}_{\mathrm{D}}^{22} $

+44.0 (c 0.05, MeOH); ESI-MS m/z 211.01 [M+H]⁺, 209.11 [M-H]^-; ¹H NMR (700 MHz, CD₃OD) δ_H: 6.61 (1H, d, J = 2.4 Hz, H-5), 6.18 (1H, d, J = 2.3 Hz, H-7), 4.48 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-4), 3.97 (1H, ddd, J = 8.9, 7.5, 4.3 Hz, H-3), 2.95 (1H, dd, J = 17.1, 4.3 Hz, H-2a), 2.62 (1H, dd, J = 17.1, 8.9 Hz, H-2b); ¹³C NMR (175 MHz, CD₃OD) δ_C: 201.5 (C-1), 167.1 (C-8), 166.4 (C-6), 148.5 (C-10), 110.4 (C-9), 108.3 (C-5), 102.5 (C-7), 71.7 (C-3), 44.3 (C-2), 73.7 (C-4)。以上数据与文献^[18]报道的(3S, 4S)-4-hydroxyscytalone的数据基本一致。

化合物8 淡黄色无定型粉末; [α]

$ {}_{\mathrm{D}}^{22} $

-56.0 (c 0.05, MeOH); ESI-MS m/z 211.02 [M+H]⁺, 209.11 [M-H]^-; ¹H NMR (700 MHz, CD₃OD) δ_H: 6.56 (d, J = 2.4 Hz, H-5), 6.18 (d, J = 2.3 Hz, H-7), 4.73 (d, J = 7.5 Hz, H-4), 4.22 (ddd, J = 8.9, 7.5, 4.3 Hz, H-3), 2.87 (dd, J = 17.1, 4.3 Hz, H-2a), 2.78 (dd, J = 17.1, 8.9 Hz, H-2b); ¹³C NMR (175 MHz, CD₃OD) δ_C: 201.9 (C-1), 166.3 (C-8), 167.0 (C-6), 148.0 (C-10), 110.3 (C-9), 108.9 (C-5), 102.6 (C-7), 70.5 (C-3), 43.5 (C-2), 71.4 (C-4)。以上数据与文献^[19]报道的cis-4-hydroxyscytalone的数据基本一致。

4 ECD计算

化合物3的构象分析是通过殷赋云计算平台(https://cloud.yinfotek.com) 的构象搜索方案来执行的。采用随机算法, 在MMFF94分子力场下使用7 kcal·mol^-1的能量窗进行构象搜索。采用Gaussian 09, 在气相中PM6、HF/6-31G(d) 和B3LYP/6-31G(d) 水平上对构象进行连续的几何优化, 选择优势构象, 共7个。随后, 采用含时密度泛函理论(TD-DFT), 在甲醇相中B3LYP/6-311G(d, p) 水平下对这7种优势构象进行激发态计算。利用殷赋云计算平台上的ECD/UV分析工具拟合ECD图谱, 并与实测CD图谱比较。

5 细胞毒活性测试

采用MTT比色法^[20]对化合物1进行体外细胞毒活性的测试, 以盐酸多柔比星作为阳性对照。在37 ℃、5% CO₂条件下, 以DMEM培养基分别培养人宫颈癌细胞HeLa和小鼠白血病细胞P388, 随后接种在每孔包含200 μL细胞悬浮液(1×10⁴) 的96孔板中。24 h后, 每孔加入2 μL的化合物1不同浓度的样品溶液, 再孵育72 h; 而后每孔加入50 μL MTT溶液, 继续孵育3 h后终止培养, 离心, 弃去上清液; 每孔加入150 μL DMSO, 经酶标仪测试读取各孔吸光值后, 软件计算出IC₅₀值。

致谢: 核磁数据由中国医学科学院药物研究所的核磁测试中心的朱承根老师、王亚男老师、许悦同学和朱浩文同学代测; 细胞毒活性的测试得到了中国中医科学院中药研究所孙奕老师的帮助和支持。

作者贡献: 戚思远、张丽花主要负责化合物的分离纯化和结构鉴定; 张丽花负责菌种发酵; 戚思远负责文献调研、整理及文章撰写和修改; 郝轶男参与部分化合物的分离和结构鉴定; 胡友财负责实验设计及数据分析; 柏健负责文章的选题、思路框架的提出, 全程指导了实验设计、结构解析和论文撰写。

利益冲突: 没有任何利益冲突。

基金

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中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-029)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2024年第59卷第5期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-1269

接收时间：2023-11-10
首发时间：2025-11-27
出版时间：2024-05-12

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收稿日期：2023-11-10
修回日期：2023-12-15

基金

中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-029)

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

^*柏健, Tel: 86-10-50927167, E-mail: baijian@imm.ac.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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