药学学报

Compd.	Chain length	R	Inhibition rate/%^a
5a	1	4-H	41.68 ± 0.90	29.27 ± 1.10
6a	2		98.47 ± 1.22	45.59 ± 2.35
5b	1	4-CH₃	49.44 ± 2.03	5.85 ± 0.24
6b	2	93.36 ± 0.71	< 5
5c	1	4-C(CH₃)₃	12.49 ± 1.04	23.28 ± 1.65
6c	2		32.40 ± 1.65	29.01 ± 2.08
5d	1	4-CN	19.37 ± 1.45	10.58 ± 0.53
6d	2		51.63 ± 0.65	< 5
5e	1	4-NO₂	41.07 ± 0.90	13.27 ± 1.24
6e	2		54.01 ± 1.16	11.88 ± 0.49
6f	2	4-Cl	74.79 ± 2.84	< 5
6g	2	4-F	97.57 ± 0.48	51.21 ± 1.11
6h	2	4-OCH₃	57.85 ± 2.35	< 5
6i	2	3-F	98.67 ± 0.62	42.49 ± 0.45
6j	2	3-OCH₃	89.18 ± 1.02	21.60 ± 0.41
6k	2	2-F	98.78 ± 1.44	40.85 ± 1.66
6l	2	2-OCH₃	93.02 ± 0.46	14.51 ± 1.34
DPZ	-	-	99.23 ± 0.15	64.22 ± 0.89
TAC	-	-	95.04 ± 2.41	99.18 ± 1.47
GTA	-	-	88.72 ± 0.86	55.65 ± 1.22

Compd.

Chain length

Inhibition rate/%^a

AChE^b

BuChE^c

4-H

41.68 ± 0.90

29.27 ± 1.10

98.47 ± 1.22

45.59 ± 2.35

4-CH₃

49.44 ± 2.03

5.85 ± 0.24

93.36 ± 0.71

< 5

4-C(CH₃)₃

12.49 ± 1.04

23.28 ± 1.65

32.40 ± 1.65

29.01 ± 2.08

4-CN

19.37 ± 1.45

10.58 ± 0.53

51.63 ± 0.65

< 5

4-NO₂

41.07 ± 0.90

13.27 ± 1.24

54.01 ± 1.16

11.88 ± 0.49

4-Cl

74.79 ± 2.84

< 5

4-F

97.57 ± 0.48

51.21 ± 1.11

4-OCH₃

57.85 ± 2.35

< 5

3-F

98.67 ± 0.62

42.49 ± 0.45

3-OCH₃

89.18 ± 1.02

21.60 ± 0.41

2-F

98.78 ± 1.44

40.85 ± 1.66

2-OCH₃

93.02 ± 0.46

14.51 ± 1.34

DPZ

99.23 ± 0.15

64.22 ± 0.89

TAC

95.04 ± 2.41

99.18 ± 1.47

GTA

88.72 ± 0.86

55.65 ± 1.22

Compd.	Chain length	R	Inhibition rate/%^a
5a	1	4-H	41.68 ± 0.90	29.27 ± 1.10
6a	2		98.47 ± 1.22	45.59 ± 2.35
5b	1	4-CH₃	49.44 ± 2.03	5.85 ± 0.24
6b	2	93.36 ± 0.71	< 5
5c	1	4-C(CH₃)₃	12.49 ± 1.04	23.28 ± 1.65
6c	2		32.40 ± 1.65	29.01 ± 2.08
5d	1	4-CN	19.37 ± 1.45	10.58 ± 0.53
6d	2		51.63 ± 0.65	< 5
5e	1	4-NO₂	41.07 ± 0.90	13.27 ± 1.24
6e	2		54.01 ± 1.16	11.88 ± 0.49
6f	2	4-Cl	74.79 ± 2.84	< 5
6g	2	4-F	97.57 ± 0.48	51.21 ± 1.11
6h	2	4-OCH₃	57.85 ± 2.35	< 5
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6k	2	2-F	98.78 ± 1.44	40.85 ± 1.66
6l	2	2-OCH₃	93.02 ± 0.46	14.51 ± 1.34
DPZ	-	-	99.23 ± 0.15	64.22 ± 0.89
TAC	-	-	95.04 ± 2.41	99.18 ± 1.47
GTA	-	-	88.72 ± 0.86	55.65 ± 1.22

Compd.

Chain length

Inhibition rate/%^a

AChE^b

BuChE^c

4-H

41.68 ± 0.90

29.27 ± 1.10

98.47 ± 1.22

45.59 ± 2.35

4-CH₃

49.44 ± 2.03

5.85 ± 0.24

93.36 ± 0.71

< 5

4-C(CH₃)₃

12.49 ± 1.04

23.28 ± 1.65

32.40 ± 1.65

29.01 ± 2.08

4-CN

19.37 ± 1.45

10.58 ± 0.53

51.63 ± 0.65

< 5

4-NO₂

41.07 ± 0.90

13.27 ± 1.24

54.01 ± 1.16

11.88 ± 0.49

4-Cl

74.79 ± 2.84

< 5

4-F

97.57 ± 0.48

51.21 ± 1.11

4-OCH₃

57.85 ± 2.35

< 5

3-F

98.67 ± 0.62

42.49 ± 0.45

3-OCH₃

89.18 ± 1.02

21.60 ± 0.41

2-F

98.78 ± 1.44

40.85 ± 1.66

2-OCH₃

93.02 ± 0.46

14.51 ± 1.34

DPZ

99.23 ± 0.15

64.22 ± 0.89

TAC

95.04 ± 2.41

99.18 ± 1.47

GTA

88.72 ± 0.86

55.65 ± 1.22

Compd.	Chain length	R	IC₅₀/μmol·L^-1	SI
6a	2	4-H	0.16 ± 0.02	31.03 ± 1.16	0.005
6b	2	4-CH₃	1.25 ± 0.10	> 100	< 0.013
6g	2	4-F	0.57 ± 0.03	24.76 ± 0.18	0.023
6i	2	3-F	0.14 ± 0.01	36.32 ± 1.37	0.004
6j	2	3-OCH₃	3.02 ± 0.01	87.58 ± 0.44	0.034
6k	2	2-F	0.13 ± 0.01	46.31 ± 0.80	0.003
6l	2	2-OCH₃	1.78 ± 0.08	> 100	< 0.018
DPZ	-	-	0.05 ± 0.01	7.46 ± 0.32	0.007
TAC	-	-	0.18 ± 0.02	0.03 ± 0.004	6.0
GTA	-	-	3.42 ± 0.23	13.23 ± 1.55	0.26

Compd.

Chain length

IC₅₀/μmol·L^-1

AChE

BuChE

4-H

0.16 ± 0.02

31.03 ± 1.16

0.005

4-CH₃

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> 100

< 0.013

4-F

0.57 ± 0.03

24.76 ± 0.18

0.023

3-F

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0.004

3-OCH₃

3.02 ± 0.01

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0.034

2-F

0.13 ± 0.01

46.31 ± 0.80

0.003

2-OCH₃

1.78 ± 0.08

> 100

< 0.018

DPZ

0.05 ± 0.01

7.46 ± 0.32

0.007

TAC

0.18 ± 0.02

0.03 ± 0.004

6.0

GTA

3.42 ± 0.23

13.23 ± 1.55

0.26

Compd.	Chain length	R	IC₅₀/μmol·L^-1	SI
6a	2	4-H	0.16 ± 0.02	31.03 ± 1.16	0.005
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DPZ	-	-	0.05 ± 0.01	7.46 ± 0.32	0.007
TAC	-	-	0.18 ± 0.02	0.03 ± 0.004	6.0
GTA	-	-	3.42 ± 0.23	13.23 ± 1.55	0.26

Compd.

Chain length

IC₅₀/μmol·L^-1

AChE

BuChE

4-H

0.16 ± 0.02

31.03 ± 1.16

0.005

4-CH₃

1.25 ± 0.10

> 100

< 0.013

4-F

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3-OCH₃

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2-F

0.13 ± 0.01

46.31 ± 0.80

0.003

2-OCH₃

1.78 ± 0.08

> 100

< 0.018

DPZ

0.05 ± 0.01

7.46 ± 0.32

0.007

TAC

0.18 ± 0.02

0.03 ± 0.004

6.0

GTA

3.42 ± 0.23

13.23 ± 1.55

0.26

Compd.	Parameter of Lipinski's rule of five
6a	3.46	40.62	348.44	3	5	Yes
6i	3.62	40.62	366.43	4	5	Yes
6k	3.54	40.62	366.43	4	5	Yes
DPZ	3.92	38.77	379.49	4	6	Yes

Compd.

Parameter of Lipinski's rule of five

Log P^a

TPSA^b

MW^c

nHBA^d

nHBD^e

nRB^f

nVs^g

Drug-likeness

3.46

40.62

348.44

Yes

3.62

40.62

366.43

Yes

3.54

40.62

366.43

Yes

DPZ

3.92

38.77

379.49

Yes

Compd.	Parameter of Lipinski's rule of five
6a	3.46	40.62	348.44	3	5	Yes
6i	3.62	40.62	366.43	4	5	Yes
6k	3.54	40.62	366.43	4	5	Yes
DPZ	3.92	38.77	379.49	4	6	Yes

Compd.

Parameter of Lipinski's rule of five

Log P^a

TPSA^b

MW^c

nHBA^d

nHBD^e

nRB^f

nVs^g

Drug-likeness

3.46

40.62

348.44

Yes

3.62

40.62

366.43

Yes

3.54

40.62

366.43

Yes

DPZ

3.92

38.77

379.49

Yes

邻苯二甲酰亚胺-多奈哌齐杂合物的合成及活性评价

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王军杰 ¹^,² , 穆叶舒 ²^,³ , 洪琛 ¹^,^* , 罗稳 ²^,^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(3): 651-660

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药学学报 | 研究论文 2024, 59(3): 651-660

邻苯二甲酰亚胺-多奈哌齐杂合物的合成及活性评价

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王军杰¹^,², 穆叶舒²^,³, 洪琛¹^,^*, 罗稳²^,^*

作者信息

1.河南大学淮河医院, 河南开封 475004

2.河南大学天然药物与免疫工程重点实验室, 河南开封 475004

3.河南大学药学院, 河南开封 475004

通讯作者:

^*洪琛, Tel: 13783788708, E-mail: hongchenbest@163.com;

罗稳, Tel: 15225477220, E-mail: luowen83@henu.edu.cn

Synthesis and biological activity evaluation of phthalimide-donepezil hybrids

Jun-jie WANG¹^,², Ye-shu MU²^,³, Chen HONG¹^,^*, Wen LUO²^,^*

Affiliations

1. Huaihe Hospital, Henan University, Kaifeng 475004, China

2. Key Laboratory of Natural Medicine and Immuno-Engineering, Henan University, Kaifeng 475004, China

3. School of Pharmacy, Henan University, Kaifeng 475004, China

出版时间: 2024-03-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0863

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摘要

收起

本文设计合成了一系列邻苯二甲酰亚胺-多奈哌齐杂合物(5a~e, 6a~l) 作为选择性的乙酰胆碱酯酶(AChE) 抑制剂。结果表明, 部分化合物具有较强的AChE抑制活性, 半数抑制浓度(IC₅₀) 达到纳摩尔范围, 优于对照药物加兰他敏和他克林, 与多奈哌齐相近。其中6k对AChE的抑制活性最强, IC₅₀值为0.13 μmol·L^-1。酶动力学及分子对接结果表明化合物6k能够同时作用于AChE的催化活性位点和外周结合位点。部分化合物能够抑制AChE诱导的β-淀粉样蛋白聚集。另外, 吸收、分布、代谢和排泄预测结果显示化合物6k符合Lipinski类药五规则且具有较高的油水分配系数。这些化合物特别是6k可以作为双功能的先导物进行更加深入的活性研究。

关键词

邻苯二甲酰亚胺 / 多奈哌齐 / 胆碱酯酶 / β-淀粉样蛋白 / 阿尔茨海默症

Abstract

收起

A series of phthalimide-donepezil (PTA-DPZ) hybrids (5a-e, 6a-l) were designed, synthesized and evaluated as selective inhibitors of acetylcholinesterase (AChE). The results showed that some hybrids had strong AChE inhibitory activity with half maximal inhibitory concentration (IC₅₀) at nanomolar range, which was better than the control drugs galanthamine and tacrine, and equivalent to DPZ. Compound 6k exhibited the strongest inhibition to AChE with an IC₅₀ value of 0.13 μmol·L^-1. Kinetic and molecular modeling studies showed that 6k targeted both catalytic active site and peripheral anionic site of AChE. Moreover, some compounds could inhibit AChE-induced β-amyloid (Aβ) aggregation. In addition, absorption, distribution, metabolism and excretion prediction results showed 6k conforms to the Lipinski's rule of five and had high partition coefficient P value. These compounds, especially 6k, may be considered as a dual-functional lead compound for in-depth research.

Key words

phthalimide / donepezil / cholinesterase / β-amyloid / Alzheimer's disease

引用本文

王军杰, 穆叶舒, 洪琛, 罗稳. 邻苯二甲酰亚胺-多奈哌齐杂合物的合成及活性评价. 药学学报, 2024 , 59 (3) : 651 -660 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0863

Jun-jie WANG, Ye-shu MU, Chen HONG, Wen LUO. Synthesis and biological activity evaluation of phthalimide-donepezil hybrids[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (3) : 651 -660 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0863

正文

收起

阿尔茨海默症(Alzheimer's disease, AD) 是一种严重且不可逆、进行性的神经系统退行性脑疾病, AD随着年龄的增加发病率显著增高, 因此在老年人群中十分常见^[1]。AD的临床表现为记忆认知功能障碍、失语失用、视空间技能损害和人格行为改变等^{[2, 3]}。目前, 低水平的乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)、β-淀粉样蛋白(β-amyloid, Aβ) 沉积、τ-蛋白聚集、氧化应激、炎症和生物金属稳态失调等因素, 在AD发病机制中起着重要作用^[4-7]。迄今为止, 有五种胆碱酯酶抑制剂在临床上用于治疗AD患者, 分别是他克林(tacrine, TAC)、多奈哌齐(donepezil, DPZ)、利凡斯的明、加兰他敏(galanthamine, GTA) 和石杉碱甲^[8] (图 1), 它们通过抑制乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE) 的活性, 提高患者脑内ACh水平从而缓解患者的症状^{[9, 10]}。然而这些药物只能在一定时期内提高患者生存质量, 却无法逆转病情。并且最早获批的TAC, 由于肝毒性, 会导致30%~50%的患者转氨酶升高^{[11, 12]}, 已经退出临床使用。其他抑制剂如GTA和石杉碱甲会产生胃肠道等不良反应, 因此在临床使用中受到一定的限制^{[13, 14]}。

DPZ作为第二代混合型可逆AChE抑制剂, 对AChE具有高亲和力^[15], 在AD患者中耐受性良好, 并且可用于肝肾损伤的患者^{[16, 17]}。由于其安全系数高, 不良反应小, 是治疗轻中度AD的一线用药^[18]。从AChE和DPZ的共晶结构中可以发现, DPZ的茚酮结构结合在AChE的外周结合位点(peripheral anionic site, PAS), N-苄基哌啶结构结合催化活性位点(catalytic active site, CAS) ^[19], 是临床上唯一的双位点AChE抑制剂。并且DPZ的化学结构简单, 易于修饰, 可以与其他活性片段链接构建出丰富的多功能AChE抑制剂, 引起了药物化学家的浓厚兴趣和广泛研究^[20-25]。

邻苯二甲酰亚胺(phthalimide, PTA) 具有平面芳环和疏水性, 其衍生物表现出广泛的生物活性^[26], 如抗炎^[27]、镇痛^[28]、抗肿瘤^{[29, 30]}、单胺氧化酶B抑制活性^[31]等。除此之外, 也有一些文献报道了PTA衍生物的胆碱酯酶抑制活性。例如, 2022年, Yiğit等^[32]设想以PTA为PAS结合单元, 咪唑鎓盐为CAS结合单元, 合成了一些AChE抑制剂, 部分化合物的半数抑制浓度(IC₅₀) 达到了纳摩尔级(图 2A, 1h)。Si等^[33]根据AChE的双位点结构, 将PTA和苄基哌嗪通过脂肪烷相连, 得到一系列新的AChE抑制剂, 显示出了较强的抑制作用(图 2B, 7aⅢ)。Saeedi等^[34]合成了一系列含有PTA的N-苄基吡啶类化合物, 其中(图 2C, 7d) 对AChE抑制显示出良好的选择性。Guzior等^[35]通过脂肪烷基连接PTA和含不同取代基的苄胺, 得到了一些具有AChE和Aβ自聚集抑制活性的化合物(图 2D, 13b)。以上研究结果表明, PTA能够作用于AChE的PAS位点, 并实现AChE的选择性抑制。

本课题组多年以来一直从事抗AD药物研发, 前期作者合成了一系列以DPZ结构为基础的萘内酰胺与萘酰亚胺衍生物作为AChE抑制剂^{[36, 37]}。这些化合物在抑制AChE活性方面表现出良好的潜力, 部分化合物对AChE的IC₅₀值达到了纳摩尔范围。PTA与DPZ中的茚酮具有结构相似性, 因此, 本文设计合成了一系列PTA-DPZ衍生物, 并评价了其生物活性, 包括AChE和丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase, BuChE) 的抑制活性、酶动力学、分子对接和AChE诱导的Aβ聚集抑制活性。

结果与讨论

收起

1 目标化合物的合成

PTA-DPZ衍生物5a~e和6a~l的合成路线如路线1所示。中间体2a、2b以N-Boc-4-哌啶甲醇或N-Boc-4-哌啶乙醇、三苯基膦和四溴化碳为起始原料, 三苯基膦和四溴化碳反应被活化, 醇的氧原子进攻卤代三苯基膦得到氧膦鎓盐中间体, 卤离子进行SN2反应, 三苯氧磷基团离去, 从而得到中间体2a、2b, 此步反应条件温和, 并且由于P=O双键的形成利于反应进行, 产率较高^[38]。PTA经氢化钠(60%) 拔氢后, 在无水N, N-二甲基甲酰胺体系中与中间体2a、2b发生取代反应得到中间体3a、3b, 中间体3a、3b在4 mol·L^-1氯化氢1, 4-二氧六环溶液中脱Boc, 生成对应的盐酸盐4a、4b。4a、4b与带有不同取代基的醛缩合生成席夫碱, 再经过三乙酰氧基硼氢化钠还原得到目标产物5a~e和6a~l, 为室温连续反应, 条件温和且操作简单。其中5b~e、6b~l为新化合物, 未见文献报道。所有目标产物的结构均通过¹H NMR、¹³C NMR和HRMS确证。

2 胆碱酯酶抑制活性

采用Ellman法^[39]测试了目标化合物5a~e、6a~l的胆碱酯酶抑制活性, DPZ、TAC和GTA作为阳性对照药物。首先进行了活性初筛, 化合物终浓度为20 μmol·L^-1, 结果见表 1。所有化合物(除了5c) 对AChE的抑制活性均强于BuChE, 显示出了选择性抑制作用, 与DPZ相同。由于AChE主要存在于中枢神经系统, 而BuChE主要存在于外周系统, 如肝脏、肾脏、肌肉和肠道等, 因此, AChE的选择性抑制剂不良反应更小。此外, 由于AChE在AD患者前中期的调控中起主导作用^[40], 其选择性抑制剂在治疗轻中度患者中可能更具有优势^[41]。

通过构效关系分析, 可得出以下结论: ①当取代基相同时, 链长(n) 为2的化合物对AChE的抑制作用明显强于链长(n) 为1的化合物。例如, 6a (98.47%) > 5a (41.68%), 6b~e > 5b~e。②当链长和取代基相同, 但取代位置不同时, 对AChE的抑制活性顺序为, 邻位(6k、6l) > 间位(6i、6j) > 对位(6g、6h)。③当链长与取代基位置相同时, 取代基不同时, 苯环上体积小的基团对活性更为有利, 例如4-位取代活性顺序为, H和F (6a、6g) > CH₃ (6b) > CN, NO₃, Cl和OCH₃ (6d~f和6h) > C(CH₃)₃ (6c)。

由于链长(n) 为2的化合物, 6a、6b、6g、6i~l对AChE抑制率大于80%, 进一步测试了这些化合物对胆碱酯酶的IC₅₀值(表 2)。由表 2可看出, 这7个化合物对AChE抑制活性较强, 其中6a、6g、6i、6k的IC₅₀值均在纳摩尔范围, 优于TAC和GTA, 略弱于DPZ。其中2-位F取代的化合物6k对AChE抑制活性最强, IC₅₀值为0.13 μmol·L^-1。值得注意的是, F原子取代时, 对AChE的IC₅₀值均保持在纳摩尔范围。因此, 今后的结构修饰可以围绕增加分子长度和F取代数量进行。

3 酶动力学研究

为研究化合物对AChE的作用模式, 选择活性最好的化合物6k对AChE抑制动力学进行了研究。图 3A中所有直线交于坐标轴的第二象限, 这是典型的混合型抑制作用类型, 表明6k可能同时作用于AChE的CAS和PAS双位点。以图 3A中直线斜率-化合物浓度作图, 得到图 3B, 直线与X轴交点的绝对值为K_i值, 为0.13 μmol·L^-1。

4 分子对接研究

运用Autodock对接程序^[42]与PyMol软件对活性最强的化合物6k与AChE (PDB code: 1EVE) 进行了分子对接, 结果见图 4。由图 4A可以看到, 酶的表面有一个阴离子洞口, 6k中的PTA部分位于其入口处, 苄基深入洞口并向谷底方向延伸(图 4A)。细节图(图 4B) 可以看出, 6k结构中氟取代的苄基和PTA分别占据了AChE的CAS和PAS位点。在CAS处, 苄基与Trp84通过经典的π-π相互作用, 苄基与Trp84的吲哚环中心的距离分别为3.8 Å和4.1 Å。哌啶环上的氮原子与Phe330形成阳离子-π相互作用, 距离为4.0 Å。在PAS处, PTA羰基上的氧原子与Tyr121具有氢键作用, 氢键的长度为3.0 Å。PTA的苯环与Trp279形成π-π堆叠作用, 可能通过疏水作用与PAS部位结合。6k的双位点作用模式与阳性药物DPZ十分相似(图 4C)。不同的是, DPZ的羰基与Phe288形成了氢键。以上结果表明, 化合物6k与AChE是双位点结合模式, 与酶动力学研究结果一致。

5 Aβ聚集抑制活性

有文献^[43]报道PTA衍生物能够抑制Aβ聚集^[35], 且AChE的PAS位点能够与Aβ结合并促进其聚集。因此, 采用硫磺素T (thioflavin T, ThT) 法测试了表 2中化合物对AChE诱导的Aβ_1-42聚集抑制活性, 以姜黄素(curcumin, Cur)、DPZ和TAC为对照, 结果见图 5。由图 5可以看出, 测试化合物、Cur和DPZ在10 μmol·L^-1浓度下对AChE诱导的Aβ_1-42聚集均有较强的抑制活性, 抑制率从14.7%到31.3%, 其中化合物6a、6i和6k的活性最强, 抑制率分别为25.3%、27.1%和24.8%, 与DPZ相近(26.4%), 略低于Cur (31.3%)。而作用于CAS位点的抑制剂TAC抑制率很弱(4.2%)。因此, 这些双位点抑制剂可能通过占据PAS位点从而抑制了AChE诱导的Aβ聚集。

6 ADME预测

药物能够穿过血脑屏障(BBB) 对于靶向中枢神经系统的药物十分必要, 亲脂性也是穿过BBB的关键因素。使用预测系统对活性较好的化合物6a、6i、6k进行BBB渗透预测^[44]。同时使用吸收、分布、代谢和排泄(ADME) 预测网站进行脂水分配系数(Log P) 及其他物理化学性质的预测^[45]。Log P等值预测结果见表 3。结果显示, 化合物6a、6i、6k透过分数分别为0.140、0.117、0.117, DPZ得分为0.135, 数值高于0.02表示该化合物具有BBB透过能力, 并且6a、6i、6k符合类药五规则, 具有作为口服药物的潜力。

结论

收起

综上所述, 本文合成了一系列新的PTA-DPZ杂合物作为双位点AChE抑制剂。结果表明这些化合物均表现出了AChE选择性抑制, 其中链长为2的系列化合物对AChE抑制作用更强。活性最好的是6k, IC₅₀值为0.13 μmol·L^-1。酶动力学和分子对接研究表明化合物6k能够同时作用于AChE的CAS和PAS双位点。AChE抑制活性较强的化合物在10 μmol·L^-1浓度下对AChE诱导的Aβ_1-42聚集均有较强的抑制活性。代表化合物6a、6i和6k的ADME预测结果表明它们具有良好的亲脂性和BBB透过性, 符合类药五规则。以上结果为进一步设计新型双位点AChE抑制剂提供重要依据。

实验部分

收起

1 仪器与试剂

Bruker AV-300型超导核磁共振仪, TMS为内标、Esquire3000型LC-MS质谱仪(德国Bruker公司); X-4显微熔点仪(上海康华生化公司); WFH-204B型手提式紫外灯(上海精科实业公司); PowerWave XS全波长酶标仪(美国伯腾公司); 薄层层析板和硅胶(200~300目, 青岛海洋硅胶厂); AChE (E.C. 3.1.1.7, 来源于电鳗)、BuChE (E.C. 3.1.1.8, 来源于马血清)、硫代乙酰胆碱(acetylthiocholine, ATC)、硫代丁酰胆碱(butylthiocholine, BTC)、5, 5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸) [5, 5′-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid), DTNB]、TAC、DPZ和GTA购于Sigma-Aldrich公司; 其他试剂均为市售分析纯, 未作进一步处理。

2 化学合成

2.1 中间体2a、2b

称取三苯基膦(3.93 g, 15 mmol) 溶于30 mL二氯甲烷中, 0 ℃下, 将其滴加到N-Boc-4-哌啶甲醇或N-Boc-4-哌啶乙醇(10 mmol) 和四溴化碳(4.97 g, 15 mmol) 的二氯甲烷溶液中。滴加完毕, 升至室温, 搅拌24 h。反应停止, 抽滤, 蒸除溶剂, 柱色谱(石油醚-乙酸乙酯50∶1), 得中间体2a、2b。

2.1.1 4-(溴甲基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2a)

无色油状液, 产率80%。¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.13 (dt, J = 12.0, 3.0 Hz, 2H), 3.28 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 2.68 (t, J = 12.0 Hz, 2H), 1.83~1.78 (m, 2H), 1.78~1.69 (m, 1H), 1.45 (s, 9H), 1.27~1.05 (m, 2H); ESI-MS m/z: 278.1 [M+H]⁺。

2.1.2 4-(2-溴乙基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(2b)

无色油状液, 产率83%。¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 4.03 (dt, J = 15.0, 3.0 Hz, 2H), 3.38 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.64 (t, J = 12.9. Hz, 2H), 1.79~1.69 (m, 2H), 1.66~1.56 (m, 3H), 1.39 (s, 9H), 1.13~0.98 (m, 2H); ESI-MS m/z: 292.1 [M+H]⁺。

2.2 中间体3a、3b

称取60%的氢化钠(0.60 g, 15 mmol) 于250 mL圆底烧瓶中, 称取邻苯二甲酰亚胺(1.76 g, 12 mmol) 溶于30 mL无水N, N-二甲基甲酰胺中, 在0 ℃滴加到烧瓶内, 并搅拌30 min。搅拌停止后, 升至室温, 将中间体2a或2b (10 mmol) 加入到烧瓶中, 升温至90 ℃, 反应4 h。反应停止, 用水淬灭, 蒸除溶剂, 加水, 乙酸乙酯萃取3次, 收集有机层, 无水Na₂SO₄干燥后蒸除溶剂, 得白色糊状固体, 即中间体3a、3b, 无需提纯直接进行下一步反应。

2.3 中间体4a、4b

将上述中间体3a或3b用10 mL二氯甲烷溶解, 加入10 mL 4 mol·L^-1氯化氢的1, 4-二氧六环溶液, 室温搅拌过夜, 反应完毕, 过滤, 滤饼用二氯甲烷洗涤并干燥, 得中间体4a、4b。

2.3.1 2-(哌啶-4-基甲基)异吲哚啉-1, 3-二酮盐酸盐(4a)

白色固体, 产率86%。¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ 7.60 (s, 4H), 3.39 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 3.27 (dt, J = 12.0, 3.0 Hz, 2H), 2.79 (t, J = 11.7 Hz, 2H), 1.95~1.85 (m, 1H), 1.82~1.72 (m, 2H), 1.39~1.24 (m, 2H); ESI-MS m/z: 245.1 [M+H]⁺。

2.3.2 2-(2-(哌啶-3-基)乙基)异吲哚啉-1, 3-二酮盐酸盐(4b)

白色固体, 产率88%。¹H NMR (300 MHz, D₂O) δ 7.72 (s, 4H), 3.62 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 3.40 (d, J = 12.6 Hz, 2H), 2.93 (t, J = 12.6 Hz, 2H), 2.00 (d, J = 13.6 Hz, 2H), 1.65~1.53 (m, 3H), 1.47~1.34 (m, 2H); ESI-MS m/z: 259.1 [M+H]⁺。

2.4 目标化合物的合成通法

在100 mL的圆底烧瓶中加入中间体4a或4b (0.8 mmol)、相应的醛(1 mmol) 和15 mL甲醇, 室温搅拌8 h。反应停止, 蒸干溶剂后, 残余物中加入15 mL甲醇, 分批加入三乙酰氧基硼氢化钠(0.85 g, 4 mmol), 室温搅拌过夜。反应完毕, 蒸除溶剂, 加水, 乙酸乙酯水萃取3次, 合并有机层, 无水Na₂SO₄干燥, 蒸除溶剂, 柱色谱(二氯甲烷-甲醇50∶1), 得目标化合物。

2.4.1 2-((1-苄基哌啶-4-基)甲基)异吲哚啉-1, 3-二酮(5a)

白色固体, 产率80%; 熔点118.4~120.1 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.89 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.79 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.45~7.30 (m, 5H), 3.66 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 3.61 (s, 2H), 2.99 (dt, J = 9.0, 3.0 Hz, 2H), 2.05 (t, J = 11.4 Hz, 2H), 1.93~1.81 (m, 1H), 1.76~1.64 (m, 2H), 1.57~1.43 (m, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.6, 137.9, 134.0, 132.0, 129.3, 128.2, 127.1, 123.2, 63.0, 53.0, 43.3, 35.4, 29.8; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺(C₂₁H₂₃N₂O₂⁺) 计算值335.175 4; 测量值335.176 4。

2.4.2 2-((1-(4-甲基苄基)哌啶-4-基)甲基)异吲哚啉-1, 3-二酮(5b)

白色固体, 产率82%; 熔点65.7~67.6 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.83 (t, J = 3.0 Hz, 2H), 7.71 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 7.19 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.11 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 3.59 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 3.50 (s, 2H), 2.91 (dt, J = 12.0, 3.0 Hz, 2H), 2.32 (s, 3H), 1.97 (t, J = 11.1 Hz, 2H), 1.85~1.73 (m, 1H), 1.68~1.62 (m, 2H), 1.50~1.36 (m, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.6, 136.8, 134.0, 132.0, 129.3, 128.9, 123.2, 62.7, 52.9, 43.3, 35.3, 29.7, 21.1; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺(C₂₂H₂₅N₂O₂⁺) 计算值349.191 1; 测量值349.191 7。

2.4.3 2-((1-(4-(叔丁基)苄基)哌啶-4-基)甲基)异吲哚啉-1, 3-二酮(5c)

白色固体, 产率85%; 熔点98.7~100.2 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.82 (dd, J = 5.4, 3.0 Hz, 2H), 7.68 (dd, J = 5.4, 3.0 Hz, 2H), 7.32 (dt, J = 9.0, 3.0 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 3.60 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 3.47 (s, 2H), 2.89 (dt, J = 9.0, 3.0 Hz, 2H), 1.94 (t, J = 9.0 Hz, 2H), 1.83~1.77 (m, 1H), 1.67~1.60 (m, 2H), 1.47~1.40 (m, 2H), 1.32 (s, 9H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.5, 149.7, 135.2, 133.9, 132.0, 128.9, 125.0, 123.2, 62.8, 53.1, 43.3, 35.5, 34.4, 31.5, 30.0; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺(C₂₅H₃₁N₂O₂⁺) 计算值391.238 0; 测量值391.239 0。

2.4.4 4-((4-((1, 3-二氧代异吲哚啉-2-基)甲基)哌啶-1-基)甲基)苯腈(5d)

白色固体, 产率68%; 熔点142.3~143.7 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.85 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.60 (dt, J = 6.0, 3.0 Hz, 2H), 7.47 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 3.60 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.59 (s, 2H), 2.87 (dt, J = 9.0, 3.0 Hz, 2H), 2.04 (t, J = 9.0 Hz, 2H), 1.88~1.78 (m, 1H), 1.71~1.65 (m, 2H), 1.52~1.38 (m, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.6, 134.1, 132.2, 132.0, 129.7, 123.3, 119.0, 62.3, 53.1, 43.1, 35.1, 29.6; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺(C₂₂H₂₂N₃O₂⁺)计算值360.170 7; 测量值360.171 6。

2.4.5 2-((1-(4-硝基苄基)哌啶-4-基)甲基)异吲哚啉-1, 3-二酮(5e)

白色固体, 产率63%; 熔点179.8~180.4 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.15 (dt, J = 9.0, 3.0 Hz, 2H), 7.84 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.61 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.59 (s, 2H), 2.85 (dt, J = 12.0, 3.0 Hz, 2H), 2.02 (t, J = 10.5 Hz, 2H), 1.88~1.76 (m, 1H), 1.70~1.64 (m, 2H), 1.50~1.37 (m, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.7, 147.1, 146.5, 134.0, 132.0, 129.5, 123.5, 123.3, 62.2, 53.3, 43.2, 35.2, 29.8; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺(C₂₁H₂₂N₃O₄⁺) 计算值380.160 5; 测量值380.161 3。

2.4.6 2-(2-(1-苄基哌啶-4-基)乙基)异吲哚啉-1, 3-二酮(6a)

白色固体, 产率88%; 熔点79.5~81.2 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.82 (dd, J = 4.8, 3.3 Hz, 2H), 7.76~7.62 (m, 2H), 7.37~7.29 (m, 3H), 7.27 (d, J = 3.9 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.55 (s, 2H), 2.93 (d, J = 11.4 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 10.5 Hz, 2H), 1.77 (d, J = 11.7 Hz, 2H), 1.62 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.45~1.29 (m, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 133.9, 132.2, 129.5, 128.3, 127.3, 123.2, 63.1, 53.4, 35.8, 35.0, 33.2, 31.6; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺(C₂₂H₂₅N₂O₂⁺) 计算值349.191 1; 测量值349.191 1。

2.4.7 2-(2-(1-(4-甲基苄基)哌啶-4-基)乙基)异吲哚啉-1, 3-二酮(6b)

白色固体, 产率81%; 熔点62.7~64.1 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.87~7.77 (m, 2H), 7.77~7.63 (m, 2H), 7.21 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.12 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.54 (s, 2H), 2.94 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.06~1.95 (m, 2H), 1.77 (d, J = 12.0 Hz, 2H), 1.62 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.46~1.34 (m, 2H), 1.33~1.28 (m, 1H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 136.9, 133.9, 132.2, 129.5, 129.0, 123.2, 62.8, 53.3, 35.8, 35.0, 33.2, 31.6, 21.2; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺ (C₂₃H₂₇N₂O₂⁺) 计算值363.206 7; 测量值363.207 2。

2.4.8 2-(2-(1-(4-(叔丁基)苄基)哌啶-4-基)乙基)异吲哚啉-1, 3-二酮(6c)

白色固体, 产率70%; 熔点83.2~84.1 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.83 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.71 (t, J = 4.5 Hz, 2H), 7.33 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.24 (d, J = 9.0 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.50 (s, 2H), 2.92 (dt, J = 12.0, 3.0 Hz, 2H), 1.97 (t, J = 10.8 Hz, 2H), 1.77 (d, J = 11.2 Hz, 2H), 1.67~1.58 (m, 2H), 1.31 (s, 9H), 1.29~1.22 (m, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 150.0, 134.6, 133.9, 132.2, 129.2, 125.1, 123.2, 62.9, 53.6, 35.8, 35.1, 34.5, 33.3, 31.8, 31.4, 29.7; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺ (C₂₆H₃₃N₂O₂⁺) 计算值405.253 7; 测量值405.252 7。

2.4.9 4-((4-(2-(1, 3-二氧代异吲哚啉-2-基)乙基)哌啶-1-基)甲基)苯腈(6d)

白色固体, 产率63%; 熔点142.7~143.8 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.81 (d, J = 3.0 Hz, 2H), 7.69 (t, J = 3.0 Hz, 2H), 7.57 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 3.69 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.49 (s, 2H), 2.79 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 1.94 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 1.78~1.68 (m, 2H), 1.64~1.52 (m, 2H), 1.36~1.24 (m, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 144.7, 133.9, 132.1, 129.5, 123.2, 119.0, 110.7, 62.8, 53.8, 35.8, 35.1, 33.2, 32.0; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺(C₂₃H₂₄N₃O₂⁺) 计算值374.186 3; 测量值374.187 0。

2.4.10 2-(2-(1-(4-硝基苄基)哌啶-4-基)乙基)异吲哚啉-1, 3-二酮(6e)

白色固体, 产率62%; 熔点141.9~142.6 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 8.16 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.83 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.71 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 7.51 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 3.71 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.58 (s, 2H), 2.85 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 2.01 (t, J = 10.5 Hz, 2H), 1.78 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 1.69~1.54 (m, 2H), 1.43~1.26 (m, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 147.1, 146.6, 132.1, 129.5, 123.5, 123.2, 62.4, 53.8, 35.8, 35.1, 33.2, 32.0; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺(C₂₂H₂₄N₃O₄⁺) 计算值394.176 1; 测量值394.176 5。

2.4.11 2-(2-(1-(4-氯苄基)哌啶-4-基)乙基)异吲哚啉-1, 3-二酮(6f)

白色固体, 产率61%; 熔点107.6~108.2 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.87 (s, 2H), 7.82~7.63 (m, 2H), 7.30 (s, 4H), 3.75 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.50 (s, 2H), 2.90 (d, J = 10.5 Hz, 2H), 1.99 (t, J = 10.2 Hz, 2H), 1.80 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 1.72~1.60 (m, 2H), 1.45~1.32 (m, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 136.6, 133.9, 132.8, 132.2, 130.6, 128.3, 123.2, 62.5, 53.5, 35.8, 35.1, 33.3, 31.8; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺ (C₂₂H₂₄ClN₂O₂⁺) 计算值383.152 1; 测量值383.152 6。

2.4.12 2-(2-(1-(4-氟苄基)哌啶-4-基)乙基)异吲哚啉-1, 3-二酮(6g)

白色固体, 产率85%; 熔点76.1~77.4 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.82 (dd, J = 5.1, 2.7 Hz, 2H), 7.77~7.58 (m, 2H), 7.29 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 6.98 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 3.70 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.49 (s, 2H), 2.89 (d, J = 11.1 Hz, 2H), 1.97 (t, J = 10.8 Hz, 2H), 1.77 (d, J = 10.8 Hz, 2H), 1.61 (q, J = 6.6 Hz, 2H), 1.42~1.27 (m, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 133.9, 132.1, 130.9, 123.2, 115.2, 114.9, 62.3, 53.4, 35.7, 35.0, 33.2, 31.7, 29.7; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺ (C₂₂H₂₄FN₂O₂⁺) 计算值367.181 6; 测量值367.181 8。

2.4.13 2-(2-(1-(4-甲氧基苄基)哌啶-4-基)乙基)异吲哚啉-1, 3-二酮(6h)

米色油状液, 产率80%; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.85~7.76 (m, 2H), 7.69 (dd, J = 5.1, 3.0 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 6.84 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.69 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.58 (s, 2H), 3.00 (d, J = 11.4 Hz, 2H), 2.04 (d, J = 13.2 Hz, 2H), 1.79 (d, J = 12.6 Hz, 2H), 1.62 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 1.52~1.38 (m, 2H), 1.35~1.27 (m, 1H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 159.2, 133.9, 132.1, 131.2, 123.2, 113.8, 61.9, 55.3, 52.9, 35.7, 34.9, 32.9, 31.0; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺ (C₂₃H₂₇N₂O₃⁺) 计算值379.201 6; 测量值379.201 8。

2.4.14 2-(2-(1-(3-氟苄基)哌啶-4-基)乙基)异吲哚啉-1, 3-二酮(6i)

米色油状液, 产率86%; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.94~7.77 (m, 2H), 7.76~7.60 (m, 2H), 7.23 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.07 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 6.92 (t, J = 6.9 Hz, 1H), 3.71 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.48 (s, 2H), 2.87 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 1.96 (t, J = 10.5 Hz, 2H), 1.76 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 1.67~1.53 (m, 2H), 1.46~1.28 (m, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 133.9, 132.2, 129.5, 124.7, 123.2, 116.0, 115.7, 114.0, 113.8, 62.7, 53.6, 35.8, 35.1, 33.3, 31.9; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺ (C₂₂H₂₄FN₂O₂⁺) 计算值367.181 6; 测量值367.182 1。

2.4.15 2-(2-(1-(3-甲氧基苄基)哌啶-4-基)乙基)异吲哚啉-1, 3-二酮(6j)

白色固体, 产率81%; 熔点71.2~72.4 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.81 (t, J = 3.0 Hz, 2H), 7.69 (t, J = 3.0 Hz, 2H), 7.21 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 7.01~6.84 (m, 2H), 6.79 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 3.79 (s, 3H), 3.69 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 3.54 (s, 2H), 2.95 (d, J = 11.1 Hz, 2H), 2.02 (t, J = 10.8 Hz, 2H), 1.77 (d, J = 11.7 Hz, 2H), 1.62 (q, J = 6.3 Hz, 2H), 1.49~1.26 (m, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 159.6, 133.9, 132.1, 129.2, 123.2, 121.8, 114.9, 113.0, 62.9, 55.3, 53.4, 35.7, 35.0, 33.1, 31.4; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺ (C₂₃H₂₇N₂O₃⁺) 计算值379.201 6; 测量值379.200 9。

2.4.16 2-(2-(1-(2-氟苄基)哌啶-4-基)乙基)异吲哚啉- 1, 3-二酮(6k)

白色固体, 产率82%; 熔点74.3~76.2 ℃; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.82 (s, 2H), 7.70 (s, 2H), 7.36 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.09 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.00 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 3.70 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.56 (s, 2H), 2.89 (d, J = 10.2 Hz, 2H), 2.00 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 1.76 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 1.68~1.53 (m, 2H), 1.42~1.25 (m, 3H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 133.9, 132.2, 131.7, 131.6, 128.7, 128.6, 123.2, 115.3, 115.0, 55.5, 53.4, 35.8, 35.1, 33.2, 32.0, 29.7; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺ (C₂₂H₂₄FN₂O₂⁺) 计算值367.181 6; 测量值367.182 4。

2.4.17 2-(2-(1-(2-甲氧基苄基)哌啶-4-基)乙基)异吲哚啉-1, 3-二酮(6l)

米色油状液, 产率86%; ¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 7.89~7.82 (m, 2H), 7.81~7.70 (m, 2H), 7.47 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.32 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 6.99 (t, J = 7.5 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.85 (s, 5H), 3.74 (t, J = 6.9 Hz, 2H), 3.16 (d, J = 11.1 Hz, 2H), 2.28 (t, J = 11.4 Hz, 2H), 2.06 (s, 1H), 1.86 (d, J = 12.6 Hz, 2H), 1.68 (q, J = 6.3 Hz, 2H), 1.61~1.48 (m, 2H); ¹³C NMR (75 MHz, CDCl₃) δ 168.4, 158.0, 134.0, 132.1, 129.4, 123.2, 120.6, 110.6, 55.5, 54.9, 52.5, 35.6, 34.8, 32.4, 30.5; HRMS (ESI): m/z [M+H]⁺ (C₂₃H₂₇N₂O₃⁺) 计算值379.201 6; 测量值379.201 9。

3 胆碱酯酶抑制活性

在96孔板中选取6个孔, 每孔加入10 μL胆碱酯酶溶液, 以及0、5、10、20、35、50 μL待测化合物溶液, 加入0.1 mol·L^-1 pH = 8.0磷酸缓冲溶液使总体积为100 μL, 37 ℃孵育15 min, 加入ATC (10 μL)、DTNB (10 μL) 及缓冲液(80 μL) 的混合液共计100 μL, 混匀后测其在λ = 412 nm处的A值(A_样本), 参比用磷酸缓冲溶液。ATC的自发水解为A_自发, 以未加样品所测得的A_control作为100个活力单位。相对酶活力= (A_样本 - A_自发) / (A_control - A_自发) × 100, 然后以酶的相对活力对抑制剂浓度作图, 根据抑制曲线求得化合物的IC₅₀值。实验重复3次, 取平均值。

4 酶动力学研究

酶的动力学研究使用Ellman方法进行, 用PBS将底物ATC稀释备用。对于每种浓度的待测化合物, 使用五种不同浓度的ATC测定。平行对照实验组在不含抑制剂的情况下进行。动力学利用AChE催化ATC水解来进行, 记录412 nm处的紫外吸收。抑制类型通过Lineweaver-Burk图进行判定。

5 分子对接

采用Autodock 4.2软件进行分子对接, 选取对AChE抑制活性最好的化合物6k为代表化合物, AChE晶体结构文件从PDB中下载, 编码为1EVE。对接之前首先对蛋白质和化合物进行预处理: 将蛋白质中的抑制剂和水分子删除, 将氨基酸残基加氢, 赋予Gasteiger电荷等; 对化合物进行电荷计算, 设定可旋转键。得到的蛋白质结构是由AUOTOGRID为配体上的每个原子类型进行原子亲和性的格点计算, 每个网格点相距0.375 Å, 网格盒子分别置于酶活性的底部, 中心坐标为[2.781 64.383 67.971], 格子的大小设定为50×46×46 Å, 包含了活性口袋中的所有残基。对接计算使用拉马克遗传算法(LGA), 随机个体群为150, 能量评估系数为2 500 000, 其他参数为软件默认参数。

6 AChE诱导的Aβ_1-42聚集抑制活性

采用硫磺素T法对化合物进行Aβ_1-42聚集抑制测定^[46]。化合物用二甲基亚砜溶解为10 mmol·L^-1的母液, 使用前用PBS稀释。AChE用超纯水溶解为母液并用PBS稀释。取Aβ_1-42蛋白10 μL与化合物10 μL于离心管中, 加入AChE溶液或PBS, 使化合物、Aβ_1-42和AChE的终浓度分别为10 μmol·L^-1、20 μmol·L^-1和0.06 U, 混匀在37 ℃孵育48 h。空白对照为Aβ_1-42与AChE, 阳性对照为Aβ_1-42与DPZ、TAC或Cur。孵育后将其转移至5 mL离心管中, 加入10 μmol·L^-1 ThT溶液480 μL, 混匀并避光反应10 min。最后加入2 mL的50 mmol·L^-1甘氨酸-NaOH缓冲液, 混匀后测量荧光吸收值(λ_ex = 450 nm, λ_em = 482 nm)。

作者贡献: 王军杰完成了大部分目标化合物的合成、结构鉴定和活性评价; 穆叶舒完成小部分化合物合成和结构鉴定; 洪琛完成了细胞实验, 撰写活性部分内容并提供经费支持; 罗稳负责化合物的设计、指导实验和审校稿件等工作。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

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河南省医学科技攻关计划项目(LHGJ20230429)
河南省重点研发与推广专项(212102311030)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2024年第59卷第3期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0863

接收时间：2023-07-13
首发时间：2025-11-28
出版时间：2024-03-12

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出版历史

收稿日期：2023-07-13
修回日期：2023-09-26

基金

河南省医学科技攻关计划项目(LHGJ20230429)

河南省重点研发与推广专项(212102311030)

作者信息

1.河南大学淮河医院, 河南开封 475004

2.河南大学天然药物与免疫工程重点实验室, 河南开封 475004

3.河南大学药学院, 河南开封 475004

通讯作者:

^*洪琛, Tel: 13783788708, E-mail: hongchenbest@163.com;

罗稳, Tel: 15225477220, E-mail: luowen83@henu.edu.cn

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2023-0863

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Compd.	Chain length	R	Inhibition rate/%^a
5a	1	4-H	41.68 ± 0.90	29.27 ± 1.10
6a	2		98.47 ± 1.22	45.59 ± 2.35
5b	1	4-CH₃	49.44 ± 2.03	5.85 ± 0.24
6b	2	93.36 ± 0.71	< 5
5c	1	4-C(CH₃)₃	12.49 ± 1.04	23.28 ± 1.65
6c	2		32.40 ± 1.65	29.01 ± 2.08
5d	1	4-CN	19.37 ± 1.45	10.58 ± 0.53
6d	2		51.63 ± 0.65	< 5
5e	1	4-NO₂	41.07 ± 0.90	13.27 ± 1.24
6e	2		54.01 ± 1.16	11.88 ± 0.49
6f	2	4-Cl	74.79 ± 2.84	< 5
6g	2	4-F	97.57 ± 0.48	51.21 ± 1.11
6h	2	4-OCH₃	57.85 ± 2.35	< 5
6i	2	3-F	98.67 ± 0.62	42.49 ± 0.45
6j	2	3-OCH₃	89.18 ± 1.02	21.60 ± 0.41
6k	2	2-F	98.78 ± 1.44	40.85 ± 1.66
6l	2	2-OCH₃	93.02 ± 0.46	14.51 ± 1.34
DPZ	-	-	99.23 ± 0.15	64.22 ± 0.89
TAC	-	-	95.04 ± 2.41	99.18 ± 1.47
GTA	-	-	88.72 ± 0.86	55.65 ± 1.22

Compd.

Chain length

Inhibition rate/%^a

AChE^b

BuChE^c

4-H

41.68 ± 0.90

29.27 ± 1.10

98.47 ± 1.22

45.59 ± 2.35

4-CH₃

49.44 ± 2.03

5.85 ± 0.24

93.36 ± 0.71

< 5

4-C(CH₃)₃

12.49 ± 1.04

23.28 ± 1.65

32.40 ± 1.65

29.01 ± 2.08

4-CN

19.37 ± 1.45

10.58 ± 0.53

51.63 ± 0.65

< 5

4-NO₂

41.07 ± 0.90

13.27 ± 1.24

54.01 ± 1.16

11.88 ± 0.49

4-Cl

74.79 ± 2.84

< 5

4-F

97.57 ± 0.48

51.21 ± 1.11

4-OCH₃

57.85 ± 2.35

< 5

3-F

98.67 ± 0.62

42.49 ± 0.45

3-OCH₃

89.18 ± 1.02

21.60 ± 0.41

2-F

98.78 ± 1.44

40.85 ± 1.66

2-OCH₃

93.02 ± 0.46

14.51 ± 1.34

DPZ

99.23 ± 0.15

64.22 ± 0.89

TAC

95.04 ± 2.41

99.18 ± 1.47

GTA

88.72 ± 0.86

55.65 ± 1.22

Compd.	Chain length	R	IC₅₀/μmol·L^-1	SI
6a	2	4-H	0.16 ± 0.02	31.03 ± 1.16	0.005
6b	2	4-CH₃	1.25 ± 0.10	> 100	< 0.013
6g	2	4-F	0.57 ± 0.03	24.76 ± 0.18	0.023
6i	2	3-F	0.14 ± 0.01	36.32 ± 1.37	0.004
6j	2	3-OCH₃	3.02 ± 0.01	87.58 ± 0.44	0.034
6k	2	2-F	0.13 ± 0.01	46.31 ± 0.80	0.003
6l	2	2-OCH₃	1.78 ± 0.08	> 100	< 0.018
DPZ	-	-	0.05 ± 0.01	7.46 ± 0.32	0.007
TAC	-	-	0.18 ± 0.02	0.03 ± 0.004	6.0
GTA	-	-	3.42 ± 0.23	13.23 ± 1.55	0.26

Compd.

Chain length

IC₅₀/μmol·L^-1

AChE

BuChE

4-H

0.16 ± 0.02

31.03 ± 1.16

0.005

4-CH₃

1.25 ± 0.10

> 100

< 0.013

4-F

0.57 ± 0.03

24.76 ± 0.18

0.023

3-F

0.14 ± 0.01

36.32 ± 1.37

0.004

3-OCH₃

3.02 ± 0.01

87.58 ± 0.44

0.034

2-F

0.13 ± 0.01

46.31 ± 0.80

0.003

2-OCH₃

1.78 ± 0.08

> 100

< 0.018

DPZ

0.05 ± 0.01

7.46 ± 0.32

0.007

TAC

0.18 ± 0.02

0.03 ± 0.004

6.0

GTA

3.42 ± 0.23

13.23 ± 1.55

0.26

Compd.	Parameter of Lipinski's rule of five
6a	3.46	40.62	348.44	3	5	Yes
6i	3.62	40.62	366.43	4	5	Yes
6k	3.54	40.62	366.43	4	5	Yes
DPZ	3.92	38.77	379.49	4	6	Yes

Compd.

Parameter of Lipinski's rule of five

Log P^a

TPSA^b

MW^c

nHBA^d

nHBD^e

nRB^f

nVs^g

Drug-likeness

3.46

40.62

348.44

Yes

3.62

40.62

366.43

Yes

3.54

40.62

366.43

Yes

DPZ

3.92

38.77

379.49

Yes