药学学报

Primer	Primer sequence	Usage
LjANR-F	ATGGCAGCTCAACAACCTACTGCGT	CDS and gDNA amplification
LjANR-R	TCAGTTCTGCAGTAACCCTTTGGCC
PLjANR-F	AGAGAGGGGGAAGGAGGG	Promoter amplification
PLjANR-R	TACTCTCTCTCTATTGGCTTTCTCC
qLjANR-F	ACCTACTGCGTGTGTTGTGGGAG	qRT-PCR
qLjANR-R	TCGTTTCGTCGGTTAAGTCTGCT
LjG6PD-F	GACCCAACAGTTCCTGACAA	Reference gene
LjG6PD-R	GCTTTCCCTGCCTTGAGTATAA
P32LjANR-F	ACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCAGCTCAACAACCTACTGCGT	Prokaryotic expression
P32LjANR-R	CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTTCTGCAGTAACCCTTTGGCC

Primer	Primer sequence	Usage
LjANR-F	ATGGCAGCTCAACAACCTACTGCGT	CDS and gDNA amplification
LjANR-R	TCAGTTCTGCAGTAACCCTTTGGCC
PLjANR-F	AGAGAGGGGGAAGGAGGG	Promoter amplification
PLjANR-R	TACTCTCTCTCTATTGGCTTTCTCC
qLjANR-F	ACCTACTGCGTGTGTTGTGGGAG	qRT-PCR
qLjANR-R	TCGTTTCGTCGGTTAAGTCTGCT
LjG6PD-F	GACCCAACAGTTCCTGACAA	Reference gene
LjG6PD-R	GCTTTCCCTGCCTTGAGTATAA
P32LjANR-F	ACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCAGCTCAACAACCTACTGCGT	Prokaryotic expression
P32LjANR-R	CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTTCTGCAGTAACCCTTTGGCC

Element name	Core sequence	Number	Function
TATA-box	ATATAT; TATATA; TATA; TATACA; TATAAAA; ATTATA; TATAAAT	78	Core promoter element around -30 of transcription start
CAAT-box	CAAAT; CAAT; CCCAATTT; CCAAT	20	Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
GT1-motif	GGTTAA	1	Light responsive element
Box 4	ATTAAT	2	Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
I-box	gGATAAGGTG	1	Part of a light responsive element
Sp 1	GGGCGG	2	Light responsive element
GATA-motif	GATAGGA	1	Part of a light responsive element
G-Box	CACGTG; TACGTG	2	cis-Acting regulatory element involved in light responsiveness
MRE	AACCTAA	1	MYB binding site involved in light responsiveness
GARE-motif	TCTGTTG	1	Gibberellin-responsive element
CGTCA-motif	CGTCA	1	cis-Acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
ABRE	ACGTG; CACGTG	3	cis-Acting element involved in the abscisic acid responsiveness
ERE	ATTTCATA; ATTTTAAA	2	Ethylene responsive element
WRE 3	CCACCT	2	Damage and defense response element
STRE	AGGGG	6	Osmotic stress response element
ARE	AAACCA	2	cis-Acting regulatory element essential for the anaerobic induction
MYB	CAACAG	1	MyB-binding site
MYC	CATTTG/CAATTG	4	MyC-binding site

Element name	Core sequence	Number	Function
TATA-box	ATATAT; TATATA; TATA; TATACA; TATAAAA; ATTATA; TATAAAT	78	Core promoter element around -30 of transcription start
CAAT-box	CAAAT; CAAT; CCCAATTT; CCAAT	20	Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
GT1-motif	GGTTAA	1	Light responsive element
Box 4	ATTAAT	2	Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
I-box	gGATAAGGTG	1	Part of a light responsive element
Sp 1	GGGCGG	2	Light responsive element
GATA-motif	GATAGGA	1	Part of a light responsive element
G-Box	CACGTG; TACGTG	2	cis-Acting regulatory element involved in light responsiveness
MRE	AACCTAA	1	MYB binding site involved in light responsiveness
GARE-motif	TCTGTTG	1	Gibberellin-responsive element
CGTCA-motif	CGTCA	1	cis-Acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
ABRE	ACGTG; CACGTG	3	cis-Acting element involved in the abscisic acid responsiveness
ERE	ATTTCATA; ATTTTAAA	2	Ethylene responsive element
WRE 3	CCACCT	2	Damage and defense response element
STRE	AGGGG	6	Osmotic stress response element
ARE	AAACCA	2	cis-Acting regulatory element essential for the anaerobic induction
MYB	CAACAG	1	MyB-binding site
MYC	CATTTG/CAATTG	4	MyC-binding site

Protein	Physical and chemical property		Secondary structure/%
LjANR	333	5.57	35.9063	0.017	26.46		41.74	36.34	14.41	7.51
rLjANR	333	5.57	35.9184	0.032	26.21		42.64	36.04	13.81	7.51

Protein	Physical and chemical property		Secondary structure/%
LjANR	333	5.57	35.9063	0.017	26.46		41.74	36.34	14.41	7.51
rLjANR	333	5.57	35.9184	0.032	26.21		42.64	36.04	13.81	7.51

不同品种忍冬ANR基因克隆、表达模式及原核表达分析

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余永亮 ¹ , 鲁丹丹 ¹ , 谭政委 ¹ , 杨红旗 ¹ , 李磊 ¹ , 许兰杰 ¹ , 杨青 ¹ , 董薇 ¹ , 安素妨 ¹ , 郭水柱 ² , 高松 ² , 梁慧珍 ¹^,^*

药学学报 | 研究论文 2023,58(11): 3449-3460

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药学学报 | 研究论文 2023, 58(11): 3449-3460

不同品种忍冬ANR基因克隆、表达模式及原核表达分析

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余永亮¹, 鲁丹丹¹, 谭政委¹, 杨红旗¹, 李磊¹, 许兰杰¹, 杨青¹, 董薇¹, 安素妨¹, 郭水柱², 高松², 梁慧珍¹^,^*

作者信息

1.河南省农业科学院芝麻研究中心, 河南郑州 450002

2.仲景宛西制药股份有限公司, 河南南阳 474550

通讯作者:

*梁慧珍, E-mail: lhzh66666@163.com

Cloning and expression analysis of ANR genes from different species of Lonicera japonica Thunb.

Yong-liang YU¹, Dan-dan LU¹, Zheng-wei TAN¹, Hong-qi YANG¹, Lei LI¹, Lan-jie XU¹, Qing YANG¹, Wei DONG¹, Su-fang An¹, Shui-zhu GUO², Song GAO², Hui-zhen LIANG¹^,^*

Affiliations

1. Henan Sesame Research Center, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China

2. Zhongjing Wanxi Pharmaceutical Co., Ltd., Nanyang 474550, China

出版时间: 2023-11-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0608

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摘要

收起

花青素还原酶(anthocyanidin reductase, ANR) 是黄酮合成途径中的关键酶, 该酶的催化活性对花青素含量有重要的调控作用。本研究根据忍冬转录组数据, 设计特异性引物, 克隆忍冬和红白忍冬ANR基因的CDS、gDNA及启动子序列。结果表明, 从忍冬和红白忍冬克隆得LjANR和rLjANR的CDS序列均为1 002 bp, gDNA序列分别为2 017和2 026 bp, 启动子序列分别为1 170和1 164 bp。LjANR和rLjANR均含有6个外显子和5个内含子, 外显子长度一致, 内含子差异较大, 二者启动子序列中均含有大量光响应、激素应答、非生物胁迫应答元件。生物信息学分析发现, LjANR和rLjANR均编码333个氨基酸, 均为稳定的疏水性蛋白, 无跨膜结构, 无信号肽, 二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲组成。序列比对及系统进化分析表明, LjANR和rLjANR蛋白与猕猴桃、茶树、油茶聚为一类, 亲缘关系较近。qRT-PCR分析发现, LjANR和rLjANR均在花蕾中表达量最高, 根中表达量最低, 不同花期的表达量变化模式相似, S1和S2期表达量较高, 然后表达量逐渐下降, 至S4期达到最低, 之后在S5期有一个缓慢的上升后表达量再次下降, 两个品种中ANR基因的表达量在根、S2、S5期差异显著, 茎、花蕾、S1、S3、S6期差异极显著。将LjANR基因构建到原核表达载体pET-32a上进行诱导表达, 在59 kD处成功表达出目的蛋白。该研究为进一步研究ANR基因的功能奠定了基础, 同时也为忍冬新品种的选育提供理论指导。

关键词

忍冬 / 花青素还原酶 / 基因克隆 / 表达模式 / 原核表达

Abstract

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Anthocyanidin reductase (ANR) is one of the key enzyme in the flavonoid biosynthetic pathway, and its catalytic activity is important for the synthesis of plant anthocyanin. In this study, specific primers were designed according to the transcriptome data of Lonicera japonica Thunb., and the CDS, gDNA and promoter sequences of ANR genes from Lonicera japonica Thunb. and Lonicera japonica Thunb. var. chinensis (Wats.) Bak. were cloned. The results showed that the CDS sequences of LjANR and rLjANR were 1 002 bp, the gDNA sequences were 2 017 and 2 026 bp respectively, and the promoter sequences were 1 170 and 1 164 bp respectively. LjANR and rLjANR both contain 6 exons and 5 introns, which have the same length of exons and large differences in introns. The promoter sequences both contain a large number of light response, hormone response and abiotic stress response elements. Bioinformatics analysis showed that both LjANR and rLjANR encoded 333 amino acids and were predicted to be stable hydrophobic proteins without transmembrane segments and signal peptides. The secondary structures of LjANR and rLjANR were predicted to be mainly consisted of α-helix and random coil. Sequence alignment and phylogenetic analysis showed that LjANR and rLjANR had high homology with Actinidia chinensis var. chinensis, Camellia sinensis and Camellia oleifera, and were closely related to them. The expression levels of LjANR and rLjANR were the highest in flower buds and the lowest in roots. The expression patterns at different flowering stages were similar, with higher expression levels in S1 and S2 stages and then gradually decreased until reaching the lowest level in S4 stage, after a slow increase in S5 stage, the expression levels decreased again. The expression levels of ANR genes in the two varieties showed significant differences in roots, S2 and S5 stages, while the differences in stems, flower buds, S1, S3 and S6 stages were extremely significant. The prokaryotic expression vector pET-32a-LjANR was constructed for protein expression. The target protein was successfully expressed of about 59 kD. This study lays a foundation for further study on the function of ANR gene and provides theoretical guidance for breeding new varieties of Lonicera japonica Thunb.

Key words

Lonicera japonica Thunb. / anthocyanidin reductase / gene cloning / expression pattern / prokaryotic expression

引用本文

余永亮, 鲁丹丹, 谭政委, 杨红旗, 李磊, 许兰杰, 杨青, 董薇, 安素妨, 郭水柱, 高松, 梁慧珍. 不同品种忍冬ANR基因克隆、表达模式及原核表达分析. 药学学报, 2023 , 58 (11) : 3449 -3460 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0608

Yong-liang YU, Dan-dan LU, Zheng-wei TAN, Hong-qi YANG, Lei LI, Lan-jie XU, Qing YANG, Wei DONG, Su-fang An, Shui-zhu GUO, Song GAO, Hui-zhen LIANG. Cloning and expression analysis of ANR genes from different species of Lonicera japonica Thunb.[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (11) : 3449 -3460 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0608

正文

收起

金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.) 的干燥花蕾或待开放的花^[1], 是传统的中药材, 具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗内毒素、降血脂、解热等生物活性^{[2, 3]}。药理研究表明, 其主要有效成分是绿原酸、木犀草苷和环烯醚萜类化合物等^[4], 可用于治疗关节炎、糖尿病、发烧、感染、溃疡和肿胀等^[1], 也是SARS冠状病毒, 甲型流感病毒、新型冠状病毒的重要抗病毒药物^[5-7]。红白忍冬[Lonicera japonica var. chinensis (Wats.) Bak.] 是忍冬的自然突变种, 其花蕾、叶、茎均为紫红色, 花红色。和忍冬相比, 红白忍冬中木犀草苷、槲皮素、绿原酸、花色苷含量更高, 挥发油种类更多^{[8, 9]}, 因此比忍冬更香, 且其花期长, 开花时间早, 因此具有较高的观赏价值, 集药用、观赏、绿化于一体。

花青素又称花色素, 是一种重要的水溶性黄酮类化合物, 自然界中已发现的花青素有700多种, 而食物中有6种花青素是比较重要的, 包括天竺葵色素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素^[10]。花青素不仅赋予水果、蔬菜和花卉红色、紫色和蓝色等不同的颜色^[11], 提高植物的观赏性, 还可以促进昆虫授粉和种子传播, 提高植物抵抗病毒、细菌等生物胁迫的能力, 清除非生物胁迫下过量的活性氧, 提高植物的抗性^[12]。此外, 花青素对人体健康也有很大的帮助, 能预防心血管疾病、糖尿病和癌症等^[13]。因此, 花青素已广泛应用于食品、保健品、化妆品、医药等领域, 花青素合成的研究也逐渐受到广大科研者的关注, 如何利用分子生物学技术提高植物花青素的含量, 培育花青素含量高的新品种成为了科研界的热点问题。

花青素还原酶是花青素合成下游的一种关键酶, 它可以在NADPH或NADH存在的条件下将有色的花青素还原合成表没食子儿茶素、表儿茶素等, 进一步聚合形成无色的原花青素, 是一种依赖NADPH-和/或NADH-的酶^{[14, 15]}。Xie等^[16]克隆了第一个花青素还原酶基因, 发现该酶是由BANYULS (BAN) 基因编码的, 并验证了该基因可以抑制类黄酮物质的积累。Lei等^[17]从舒茶早叶片中克隆了两个ANR基因CssANRa和CssANRb, 发现这两个基因在烟草中的过表达可以导致花中原花青素的形成和花青素的减少。Li等^[18]将两个海棠ANR基因导入烟草中过表达, 促进了原花青素的积累, 该研究还发现槲皮素、花青素和原花青素的合成在海棠叶和果皮发育过程中呈负相关且存在竞争关系。以上表明, 花青素还原酶对花青素在植物组织中的积累具有重要调控作用, 因此对花青素还原酶调控机制的研究有利于从基因水平改善植物的品质。

目前已经在艾纳香^[19]、越橘^[20]、银杏^[21]、香椿^[22]、红花^{[23, 24]}等植物中成功克隆了ANR基因, 并进行了生物信息学及表达分析, 忍冬中的研究大多集中在鉴定和定量分析花青素类化合物及上游结构基因, 如Yuan等^[8]分析鉴定了红白忍冬中8种不同的花青素, 并克隆比较了忍冬和红白忍冬中的DFR (dihydroflavanol 4-reductase, 二氢黄酮醇-4-还原酶)、LDOX (leucoanthocyanidin dioxygenase, 无色花青素双加氧酶) 等基因。Xue等^[25]通过转录组学和靶向代谢组学阐明了不同花期忍冬花色变化的机制, 而迄今为止尚未见忍冬ANR基因的报道。本研究首次从忍冬和红白忍冬中成功克隆得到ANR基因的CDS、gDNA及启动子序列, 分析了其结构、启动子中的顺式作用元件, 并对其进行了生物信息学分析、多重比对及系统进化分析, 检测了它们在不同组织及不同花期中的表达量, 构建原核表达载体并诱导表达LjANR重组蛋白, 为研究ANR基因在忍冬花青素代谢途径中的功能奠定基础, 也为忍冬新品种的选育提供理论指导。

材料与方法

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材料供试材料忍冬和红白忍冬于2017年种植于河南省农业科学院现代农业研究开发基地, 经河南科技学院孟丽教授鉴定, 在自然条件下生长。于2021年4∼5月, 在上述开发基地采取忍冬和红白忍冬开头茬花时的根、茎、叶、花蕾, 并选取不同发育时期的花, 每份样品设置3个生物学重复, 液氮中速冻后转移至-80 ℃冰箱中保存备用。

仪器 NanoDrop 2000核酸蛋白分析仪(美国NanoDrop公司); JY300C型水平电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司); 1658001型垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司); QIAquant 96 2plex实时荧光定量PCR仪(德国QIAGEN公司); 5804R高速冷冻离心机和Mastercycler nexus GSX1梯度PCR扩增仪(德国Eppendorf公司); SW-CJ-1D洁净工作台(江苏苏洁净化设备厂); Tanon 2500凝胶成像系统(上海天能公司)。

试剂总RNA提取试剂盒Quick RNA Isolation Kit (Lot: 2020#08)、基因组DNA提取试剂盒Quick DNA Isolation Kit (Lot: 2111#22) 购自北京华越洋生物科技有限公司; 反转录试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Lot: AJ91997A)、荧光定量试剂盒TB Green^® Premix Ex Taq^TMⅡ (Tli RNaseH Plus) (Lot: AL61804A)、胶回收试剂盒MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0 (Lot: ALG2057A)、加A试剂DNA A-Tailing Kit (Lot: AL11579A)、质粒抽提试剂盒MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0 (Lot: AL61448A)、载体pMD19-T (Lot: ALF0445A)、pET-32a (Lot: ALF2037A)、感受态细胞DH5α (Lot: AJ91561A)、BL21(DE3) (Lot: AJ917805A)、内切酶BamH Ⅰ (Lot: AJ91453A) 和Xho Ⅰ (Lot: AJE1013A), DL2000 Maker (Lot: AL61432A) 均购自宝日医生物技术(北京) 有限公司; 高保真酶GenStar 2×SuperStar Plus PCR Mix with Loading Dye (Lot: GB081) 购自河南宝格生物技术有限公司; 无缝拼接试剂盒Clone Express^®Ⅱ One Step Cloning Kit (Lot: 7E490J0) 购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司; 蛋白Marker PM2510 (Lot: PM25112011132-7)、E×Blue蛋白超快染色液(Lot: ZD305A)、新快速SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(Lot: ZD304A-1)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) (Lot: I1020)、10×PBS缓冲液(Lot: GP21030080613) 均购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司; 琼脂糖、琼脂粉、胰蛋白胨、氯化钠等购于上海生工有限公司。所需引物由河南尚亚生物技术公司合成。

基因组DNA和总RNA的提取及cDNA的合成 按照北京华越洋生物公司植物基因组DNA提取试剂盒操作说明提取忍冬和红白忍冬叶片DNA, 忍冬和红白忍冬根、茎、叶、花蕾及不同花期样品总RNA的提取参照该公司RNA提取试剂盒说明书。利用1.1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的质量和完整性, NanoDrop 2000分光光度计测定总RNA的浓度和纯度。选择A260 nm/A280 nm为1.8~2.0, 总量1 μg的总RNA, 按照上述反转录试剂盒的说明书进行反转录合成cDNA。

目的基因CDS、gDNA及启动子的克隆 以河南省农业科学院芝麻研究中心药用植物研究室构建的忍冬转录组数据库获得的Unigene基因序列为参考序列, 使用Primer Premier 5软件设计特异性引物(表 1), 分别以忍冬和红白忍冬花瓣cDNA和叶片DNA为模板, 使用GenStar高保真酶进行PCR扩增。具体如下: CDS扩增体系50 μL, 含2×SuperStar Plus PCR Mix 25 μL、cDNA 4 μL、10 μmol·L^-1正反向引物各3.0 μL、ddH₂O 15 μL, 反应程序为98 ℃预变性30 s; 98 ℃变性10 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min, 35个循环; 72 ℃终延伸8 min; gDNA扩增体系10 μL, 含2×SuperStar Plus PCR Mix 10 μL、DNA 1.5 μL、10 μmol·L^-1正反向引物各1.2 μL、ddH₂O 6.1 μL, 反应程序为98 ℃预变性30 s, 98 ℃变性10 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min, 35个循环; 72 ℃终延伸8 min; 启动子扩增体系10 μL, 含2×SuperStar Plus PCR Mix 10 μL、DNA 1.5 μL、10 μmol·L^-1正反向引物各1.2 μL、ddH₂O 6.1 μL, 反应程序为98 ℃预变性30 s; 98 ℃变性10 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min, 35个循环; 72 ℃终延伸8 min。上述PCR产物分别经1.1%琼脂糖凝胶电泳检测分离, 切下含目的条带的胶块后, 经胶回收试剂盒回收纯化, 连接到pMD19-T载体上, 连接产物按照说明书上的方法转化DH5α感受态细胞, 涂布于含氨苄青霉素(Amp) 的固体LB培养基上, 37 ℃倒置培养15 h左右。从平板中挑选单克隆菌落, 通过菌落PCR筛选阳性克隆, 将阳性菌落重新挑入600 μL含Amp的LB液体培养基中, 37 ℃ 200 r·min^-1摇菌6~8 h后, 将菌液送往河南尚亚生物技术公司测序。

目的基因的生物信息学分析 将目的基因FASTA格式的核苷酸序列导入DNAMAN 6.0软件, 利用软件自带的翻译功能对目的基因编码的氨基酸序列进行预测; 使用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) 分析目的基因编码蛋白的理化性质; 使用Prabi (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html) 预测目的基因编码蛋白的二级结构; 使用NCBI中的CD-Search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi) 对氨基酸序列的保守结构域进行分析; 运用ProtScale (https://web.expasy.org/protscale/)对蛋白的疏水性和亲水性进行预测。TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 进行蛋白序列的跨膜结构分析; 利用SignalP 4.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/) 对蛋白序列的信号肽进行预测; 将目的基因的CDS序列和基因组序列分别提交在线网站GSDS 2.0 (http://gsds.gao-lab.org/) 分析基因的结构; 使用PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 分析启动子中的顺式作用元件。通过NCBI数据库中的BlastP搜索与目的基因编码蛋白同源的其他植物ANR氨基酸序列, 采用DNAMAN 6.0软件进行氨基酸序列的多重比对分析, 并使用MEGA 6.0软件中的Neighbor-joining构建关于ANR蛋白的系统化进化树, 通过Bootstrap方法对进化树进行校验, Bootstrap值设置为1 000。

实时荧光定量PCR及表达量分析 根据测序得到的CDS序列的保守区域, 使用Primer Premier 5软件设计荧光定量引物(表 1), 以金银花LjG6PD作为内参基因^[26]。反应体系为10 μL: 5 μL TB Green Premix Ex TaqⅡ (Tli RNaseH Plus) (2×), 1.5 μL cDNA (10×), 10 μmol·L^-1正反向引物各0.4 μL, 2.7 μL Rnase free ddH₂O。首先将相同组分混匀配成混合液, 之后分别加入不同体系中, 以保证反应条件的一致性, 再加入差异组分。反应程序为95 ℃ 30 s, 随后进行45个循环的95 ℃ 5 s; 55 ℃ 30 s; 72 ℃ 30 s。通过仪器自带的熔解曲线程序分析监测PCR扩增的特异性。每个样品设3个生物学重复, 3个技术重复, 通过2^-ΔΔCT相对定量法计算目的基因的相对表达量^[27], 使用IBM SPSS Statistics 20软件对表达量进行差异显著性分析。

目的基因原核表达载体构建与诱导表达 对目的基因测序后的序列进行分析, 设计带有酶切位点的同源臂正反引物。分别以原核表达载体pET-32a上的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点作为上下游引物的酶切位点, 如表 1所示P32LjANR-F/R。以扩增的CDS重组质粒为模板, 进行PCR扩增。扩增体系为50 μL, 包含2×SuperStar Plus PCR Mix 25 μL、20×质粒模板2.5 μL、10 μmol·L^-1正反向引物各3.0 μL、ddH₂O 16.5 μL。反应程序为98 ℃预变性30 s; 98 ℃变性10 s、61 ℃退火30 s、72 ℃延伸2 min, 35个循环; 72 ℃终延伸8 min。PCR产物经1.1%琼脂糖凝胶电泳检测后, 进行切胶回收。同时用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pET-32a原核表达空载体, 并切胶回收。将切胶回收后的目的片段及表达载体pET-32a用无缝拼接试剂盒在37 ℃连接30 min, 将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中, 挑取单克隆进行菌液PCR检验、提取质粒并测序, 测序正确的重组质粒即为目的基因的原核表达载体。将测序正确的重组质粒转化至BL21 (DE3) 表达感受态中, 挑取单克隆进行PCR验证, 阳性克隆于含有Amp的LB液体培养基37 ℃培养至浑浊, 按1∶100加到含Amp抗性的新LB培养液中, 37 ℃, 200 r·min^-1振荡培养至OD值为0.4~0.8, 然后分别按如下3步操作: ①加入IPTG至终浓度为0.6 mmol·L^-1, 于25 ℃摇床中振荡培养, 分别于诱导后的2、3、4、15 h取1 mL菌液, 收集菌体; ②分别加入IPTG至终浓度为0.2、0.4、0.6、1.0、2.0 mmol·L^-1, 于37 ℃摇床中振荡培养, 6 h后分别取1 mL菌液, 收集菌体; ③加入IPTG至终浓度为0.6 mmol·L^-1, 于37、25、20 ℃摇床中振荡培养, 15 h后取1 mL菌液, 收集菌体, 剩余菌液离心去上清后加入5 mL 1×PBS重悬菌体, 冰浴下以3 s/10 s超声破碎15 min, 离心后获得目的基因的蛋白上清; 将以上收集的菌体重悬后分别进行10% SDS-PAGE电泳。

结果与分析

收起

1 忍冬和红白忍冬ANR基因全长CDS的克隆及序列分析

基于忍冬转录组数据库获得的Unigene基因序列设计引物, 分别以忍冬和红白忍冬花瓣RNA反转录获得的cDNA为模板扩增PCR, 两个品种均得到长度为1 000 bp左右的片段。扩增产物经回收、连接、转化、测序, 确定两个品种ANR基因的全长CDS序列均为1 002 bp (图 1A)。

将获得的忍冬和红白忍冬ANR基因分别命名为LjANR和rLjANR, DNAMAN 6.0预测发现两个基因均编码333个氨基酸。序列比对后发现, LjANR和rLjANR基因的CDS序列在两个品种中有6个碱基的差异, 以LjANR为例, 它们分别为723位A→G、786位C→T、792位T→C、846位C→T、876位T→C及911位C→T, 而只有911位点碱基的差异导致了氨基酸的变异(T→I) (图 2), 这一变异是否导致两个品种中花青素还原酶功能的差异, 进而影响两品种的开花特性, 需要后续进一步的功能验证。

2 LjANR和rLjANR基因gDNA的克隆及基因结构分析

分别以忍冬和红白忍冬基因组DNA为模板, 利用特异性引物LjANR-F/R进行PCR扩增, 扩增后分别得到大约2 000 bp的条带(图 1B)。将扩增产物同样进行回收、连接、转化、测序, 测序后确定两个品种ANR基因的gDNA序列分别为2 017和2 026 bp。将两个品种测序后的CDS和gDNA序列提交GSDS 2.0后发现, LjANR和rLjANR基因都含有6个外显子和5个内含子(图 3), 且序列都符合真核生物典型的GT-AG法则。经分析比较发现, LjANR和rLjANR基因的外显子在基因组序列上的位置不同, 如图 3所示, 但6个外显子的长度是一致的, 均分别为118、167、198、160、214、145 bp, 而内含子的长度存在较大差异, LjANR基因的内含子长度分别为306、83、166、236、224 bp, rLjANR基因的内含子长度分别为312、83、167、239、223 bp (图 3)。

3 LjANR和rLjANR基因启动子的克隆及分析

启动子在基因表达调控中起到了关键作用, 为了明确LjANR和rLjANR基因潜在的调控机理, 分别以忍冬和红白忍冬基因组DNA为模板, 利用特异性引物PLjANR-F/R进行启动子扩增, 扩增后分别得到大约1 200 bp的条带(图 1C)。将扩增产物经上述同样的方法测序后获得两个品种ANR基因的启动子序列分别为1 170和1 164 bp, 序列比对发现两条启动子序列存在多处碱基的置换。利用PlantCARE数据库对启动子的顺式作用元件进行预测, 发现两个基因的启动子中所含的顺式作用元件是相同的, 如表 2所示, 除了TATA-box和CAAT-box等基本元件外, 还含有大量的光响应元件GT1-motif、Box 4、I-box等, 非生物胁迫应答元件WRE 3、STRE、ARE等, 及激素应答元件GARE-motif、CGTCA-motif、ABRE等(表 2)。以上表明, LjANR和rLjANR基因启动子能够响应光调控、植物激素和逆境胁迫等外界环境的变化, 从而调控ANR基因的表达, 在忍冬的生长发育和环境胁迫响应过程中发挥重要作用。

4 LjANR和rLjANR基因编码蛋白的生物信息学分析

通过在线网站分析可知, LjANR和rLjANR基因编码的蛋白很相似, 仅存在很细微的差别。ProtParam在线预测发现, LjANR和rLjANR蛋白的分子量相似, 等电点均为5.57, 且都属于稳定的疏水性蛋白(表 3)。采用SOPMA在线工具分析预测LjANR和rLjANR蛋白的二级结构发现, 2个蛋白质都主要由α-螺旋和无规则卷曲构成, β-折叠所占比例最少(表 3)。

NCBI CD-Search分析发现, LjANR和rLjANR蛋白结构域分析结果相同, 如图 4A所示, 2个蛋白都含有3个功能位点, 即活性位点、NADP结合位点、底物结合位点, 具有类黄酮还原酶共有的保守结构域FR-SDR-e [flavonoid reductase (FR), short-chain dehydrogenases/reductases (SDR), extended (e), 类黄酮还原酶-短链脱氢酶/还原酶] (图 4A)。

利用ExPASy-ProtScale在线工具的Hphob./Kyte&Doolittle算法对LjANR和rLjANR蛋白亲/疏水性分析发现, 2个蛋白亲水(负值) 和疏水(正值) 性氨基酸的分布基本相同, 仅存在一处差异, 如图 4B中的虚线椭圆所示。另外, 2个蛋白的正值数量明显多于负值数量, 结合表 3中2个蛋白总平均亲水性指数为正值, 推测2个蛋白质都是疏水性蛋白, 且都是在第89位氨基酸分值最高为2.178, 疏水性最强, 第40和41位分值最低为-2.633, 亲水性最强(图 4B)。

通过Signal P 4.1 Server对信号肽预测发现, 2个蛋白信号肽预测结果相同, 平均信号肽分值(mean S) 均为0.312, 低于0.5 (图 4C), 表明2个蛋白质都不存在信号肽, 可能在合成处起作用, 不存在运输利用。TMHMM分析跨膜结构发现, LjANR和rLjANR蛋白都不存在跨膜结构(图 4D), 表明它们可能定位于与膜无关的结构。

5 LjANR和rLjANR基因编码氨基酸序列同源性比对与系统进化分析

将LjANR和rLjANR基因编码的氨基酸序列分别在NCBI进行BlastP比对, 两者比对结果相似。以LjANR蛋白为例, 结果发现LjANR与中华猕猴桃、茶树、油茶、高大越橘、兔眼蓝莓中的ANR具有较高的同源性, 同源性分别为83.83%、82.93%、83.23%、80.54%、80.84%。通过DNAMAN 6.0软件将上述氨基酸序列进行多重比对分析, 结果发现这6种植物ANR蛋白的总相似度高达89.66%, 且它们具有高度保守的活性位点A¹⁰²、S¹²⁶、Y¹⁶³、K¹⁶⁷ (图 5), 表明ANR蛋白在进化过程中是高度保守的。此外, 这些氨基酸序列N端含有一个高度保守的NADP(H)结合区(G-G-X-G-X-X-A), 中间部分还有一个亮氨酸拉链区(图 5)。

选取GenBank中注册的19种植物的ANR氨基酸序列, 利用MEGA 6.0软件采用邻接法构建ANR氨基酸序列的系统进化树(图 6)。结果表明, 来源于不同植物的ANR蛋白表现出明显的种属特性, 同科植物大多以较高的置信度各自聚为一支, 此外, 同为无患子目的楝、香椿、荔枝、龙眼, 同为杜鹃花目的中华猕猴桃、油茶、越橘、兔眼蓝莓等各自聚在一个大分支里。LjANR和rLjANR蛋白和山茶目山茶科的茶树, 杜鹃花目山茶科的油茶及杜鹃花目猕猴桃科的猕猴桃ANR蛋白聚为一个大分支, 表明亲缘关系较近, 和豆科的紫苜蓿、百脉根、大豆等亲缘关系较远(图 6)。

6 LjANR和rLjANR基因的表达模式分析

为了解ANR基因在不同组织中的表达模式, 选取忍冬和红白忍冬根、茎、叶、花蕾4个组织的cDNA样品为模板, 进行荧光定量PCR分析。结果表明, 2个品种中的ANR基因都是在花蕾中的表达量最高, 根中的表达量最低, 且忍冬和红白忍冬花蕾中的表达量分别是根中的387和173倍(图 7A)。

为进一步了解ANR基因的表达模式, 本研究还检测了ANR基因在忍冬和红白忍冬不同花期的表达量。金银花的花期大致可以分为幼蕾S1、三青S2、二白S3、大白S4、银花S5、金花S6、凋花S7等七个阶段^[28], 由于凋花期RNA易降解, 本研究选取了S1-S6期cDNA样品进行荧光定量PCR分析(图 7C)。结果如图 7B所示, ANR基因在忍冬和红白忍冬不同花期具有相似的表达模式和变化规律, 都是在S4期表达量最低, S1和S2期表达量相对较高。整体来看, 从S2期开始表达量呈逐渐下降趋势, 直至S4期达到最低, 之后在S5期有一个缓慢的上升后表达量再次下降(图 7B)。

不同品种基因表达量分析发现, ANR基因在忍冬和红白忍冬的根、S2期、S5期差异显著(P < 0.05), 茎、花蕾、S1、S3、S6期差异极显著(P < 0.01), 且ANR基因在红白忍冬根、茎中的表达量明显高于忍冬, 而叶和花蕾中则相反, 忍冬花蕾中ANR基因的表达量是红白忍冬中的2.24倍左右(图 7A和图 7B)。

7 LjANR基因的原核表达分析

LjANR和rLjANR基因编码的蛋白仅有一个氨基酸的差异, 因此仅对LjANR蛋白进行了原核表达分析, 为后续研究ANR蛋白的功能奠定基础。将重组质粒pET-32a-LjANR转入表达宿主菌BL21 (DE3), 在25 ℃下加入IPTG进行诱导。SDS-PAGE显示, 与对照相比, pET-32a-LjANR在60 kD左右有一条明显的外源蛋白条带(图 8A), 除去23 kD左右的融合表达标签, 实际诱导蛋白大概为37 kD, 这和ProtParam在线预测的分子质量35.9 kD基本一致, 表明LjANR融合蛋白表达成功, 且从图 8A可以看出, 随着诱导时间的延长, 融合蛋白表达量逐渐增加。

从图 8B可以看出, 0.2 mmol·L^-1的IPTG浓度即可以诱导大量蛋白表达, 当IPTG浓度达到0.6 mmol·L^-1时, 蛋白诱导量达最高, 继续增加IPTG的浓度, 蛋白表达量变化不大(图 8B)。由图 8C可以看出, 温度对上清中LjANR融合蛋白的表达量影响较大, 在20 ℃时LjANR融合蛋白的表达量在超声破碎后的上清中最高, 表明该温度为LjANR融合蛋白的最佳诱导温度(图 8C)。综上所述, LjANR蛋白的最佳诱导条件可以是0.6 mmol·L^-1 IPTG、20 ℃诱导15 h。

讨论

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忍冬是我国传统药用藤本植物, 已有数千年的历史, 也是国家卫生健康委员会公布的110种药食同源名录品种之一。与此同时, 忍冬也是一种备受追捧的观赏植物, 其花在发育的过程中会从绿色变成白色再变成金色。花青素是自然界存在的天然色素, 在植物的生长发育和胁迫防御中发挥重要作用。花青素还原酶是花青素生物合成及调控途径的重要酶, 对花青素含量的积累有重要影响。因此忍冬花青素还原酶的研究对于从基因水平上改善金银花的品质, 提高金银花的经济价值有重要意义。

本研究成功克隆了忍冬和红白忍冬ANR基因的CDS、gDNA及启动子序列, 分析发现LjANR和rLjANR的CDS序列仅存在6个碱基的差异, 其编码的氨基酸仅有一个差异, gDNA序列长度相差9个碱基, 启动子序列长度相差6个碱基。这和同为忍冬科忍冬属的灰毡毛忍冬中ACS3基因的克隆结果是极其相似的, 不同品种灰毡毛忍冬克隆获得的ACS3基因的cDNA序列有7个位点具碱基差异, 编码氨基酸1个不同^[29]。此外, Yuan等^[8]在红白忍冬中克隆的LjcDFR比忍冬中克隆的LjDFR多了12个碱基的插入, 这和本研究的结果也是相似的。对LjANR和rLjANR基因编码的氨基酸序列进行生物信息学分析发现, 和大多数ANR蛋白一样, 其二级结构主要由α螺旋和无规卷曲组成, β折叠较少^[20-22]。研究发现, 大多数ANR基因含有6个外显子和5个内含子, 如芸薹属7个ANR基因都含有6个外显子和5个内含子^[30], MsBAN^[31]和芒果ANR^[32]也都含有6个外显子, 5个内含子, 但也有少数例外, 像银杏GbANR2^[21]及红花的CtANR2和CtANR3^[24]都含有5个外显子和4个内含子。本研究基因结构分析发现, LjANR/rLjANR和大多数ANR基因一样含有6个外显子和5个内含子。

系统进化分析表明, LjANR和rLjANR蛋白和山茶目山茶科的茶树, 杜鹃花目山茶科的油茶及杜鹃花目猕猴桃科的猕猴桃ANR蛋白聚为一个大分支, 表明亲缘关系较近, 据报道茶树ANR蛋白可以催化矢车菊色素生成儿茶素EC, 催化翠雀素生成EGC^[33], 油茶ANR蛋白能够催化矢车菊色素合成儿茶素和表儿茶素, 催化飞燕草色素合成没食子儿茶素(GC) 和没食子表儿茶素(EGC)^[34]。因此, 推测LjANR和rLjANR蛋白可能含有类似茶树、油茶ANR酶的功能, 但仍需要进一步的功能验证。

表达量分析发现, ANR基因在忍冬和红白忍冬花蕾中表达量最高, 根中表达量最低, 这和红花CtANR1/2在花中表达量最高, 初期果球中表达量最低, CtANR3苞片中最高, 初期果球和根中几乎不表达的结果基本一致^{[23, 24]}。而和MsBAN在花中几乎不表达, 荚果中最高的结果是不同的^[31]。表明植物ANR基因的表达在不同植物、同一植物的不同组织差异性很大。Yuan等^[8]检测了忍冬和红白忍冬花蕾中花青素的含量, 研究结果发现忍冬花蕾中检测不到花青素, 而红白忍冬中检测到了8种不同的花青素, 本研究中忍冬花蕾ANR基因的表达量明显高于红白忍冬花蕾ANR的表达量, 是其2.24倍左右, 两者是一致的, 表明忍冬中的花青素可能被高表达的ANR还原合成了原花青素, 可以通过进一步检测忍冬和红白忍冬中的原花青素的含量加以验证。Xue等^[25]研究发现忍冬S1和S2期可以检测到花青素的含量, 而其他时期检测不到花青素, 本研究中ANR的表达也是在S1、S2期相对较高, 这可能是由于底物对酶的合成有诱导作用。大量研究发现, 受酶催化的底物常常可以诱导该酶的合成, 这是生物界普遍存在的现象, 这种诱导作用对于维持体内代谢物浓度的相对恒定有重要生理意义。如袁景丽等^[35]研究发现棉花GhANR和GhLAR可以促进纤维花青素的合成, 具体表现为GhANR和GhLAR在棕色纤维的表达量极显著高于白色纤维中, 且主要集中在纤维发育的5-15 DPA高表达。以上结果表明花青素还原酶对花青素的含量不仅有负调控作用, 在某些情况下, 为了维持植物体内花青素浓度的相对恒定, 也可以诱导花青素的合成。

综上所述, 本研究成功克隆LjANR和rLjANR全长CDS、gDNA及启动子序列, 对其进行基因结构、顺式作用元件及编码蛋白的生物信息学分析, 并对其在忍冬和红白忍冬不同组织及不同花期的表达量进行分析, 明确了其重组蛋白的最佳诱导表达条件, 为进一步研究ANR基因的功能奠定了基础。ANR基因作为花青素代谢途径的关键基因, 对忍冬和红白忍冬花青素含量的积累有重要调控作用, 关于其催化特性尚有待深入研究。

作者贡献: 余永亮和鲁丹丹负责本实验的设计、数据分析、论文初稿撰写; 谭政委、杨红旗、李磊负责金银花的取样, DNA、RNA的提取; 许兰杰、杨青、董薇负责基因克隆、原核表达分析; 安素妨、郭水柱、高松负责qRT-PCR等相关实验; 梁慧珍负责论文思路设计、指导论文写作与修改。所有作者参与论文修改。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

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河南省重大科技专项(221100310400)
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[1]

Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China (中华人民共和国药典) [S]. 2020 Ed. Vol 1. Beijing: China Medical Science Press, 2020: 173.

[2]

Yu JQ, Wang ZP, Zhu H, et al. Chemical constituents of Lonicera japonica roots and their anti-inflammatory effects[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2016, 51: 1110-1116. http://www.yxxb.com.cn/aps/cn/article/doi/10.16438/j.0513-4870.2016-0208

[3]

Yoo HJ, Kang HJ, Song YS, et al. Anti-angiogenic, antinociceptive and anti-inflammatory activities of Lonicera japonica extract[J]. J Pharm Pharmacol, 2008, 60: 779-786.

[4]

Shang X, Pan H, Li M, et al. Lonicera japonica Thunb. : ethnopharmacology, phytochemistry and pharmacology of an important traditional Chinese medicine[J]. J Ethnopharmacol, 2011, 138: 1-21.

https://doi.org/10.1016/j.jep.2011.08.016

[5]

Liu X, Zhang M, He L, et al. Chinese herbs combined with western medicine for severe acute respiratory syndrome (SARS)[J]. Cochrane Database Syst Rev, 2006, 10: CD004882.

[6]

Zhou Z, Li X, Liu J, et al. Honeysuckle-encoded atypical microRNA2911 directly targets influenza A viruses[J]. Cell Res, 2015, 25: 39-49.

https://doi.org/10.1038/cr.2014.130

[7]

Zheng ZH, Wang K, Wei HL, et al. Antiviral effect of Fufang yinhua jiedu (FFYH) granules against coronavirus and its potential mechanism[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2022, 57: 1808-1815. http://www.yxxb.com.cn/aps/cn/article/doi/10.16438/j.0513-4870.2021-1815

[8]

Yuan Y, Yang J, Yu XD, et al. Anthocyanins from buds of Lonicera japonica Thunb. var. chinensis (Wats.) Bak.[J]. Food Res Int, 2014, 62: 812-818.

https://doi.org/10.1016/j.foodres.2014.03.026

[9]

Li XQ, Sun XH, Cai S, et al. Investigation on the chemical constituents and variation of the flower buds of Lonicera species by UPLC-ESI-MS/MS and principle component analysis[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2009, 44: 895-904. http://www.yxxb.com.cn/aps/cn/article/id/bca4d06f-7453-4b22-9563-9426213e1018

[10]

Jaakola L. New insights into the regulation of anthocyanin biosynthesis in fruits[J]. Trends Plant Sci, 2013, 18: 477-483.

https://doi.org/10.1016/j.tplants.2013.06.003

[11]

Tanaka Y. Flower colour and cytochromes P450[J]. Phytochem Rev, 2006, 5: 283-291.

https://doi.org/10.1007/s11101-006-9003-7

[12]

Liu KY, Wang ML, Xin HB, et al. Anthocyanin biosynthesis and regulate mechanisms in plants: a review[J]. Chin Agric Sci Bull (中国农学通报), 2021, 37: 41-51.

[13]

He J, Giusti MM. Anthocyanins: natural colorants with health-promoting properties[J]. Annu Rev Food Sci Technol, 2010, 1: 163-187.

https://doi.org/10.1146/annurev.food.080708.100754

[14]

Gargouri M, Gallois B, Chaudiere J. Binding-equilibrium and kinetic studies of anthocyanidin reductase from Vitis vinifera[J]. Arch Biochem Biophys, 2009, 491: 61-68.

https://doi.org/10.1016/j.abb.2009.09.010

[15]

Pfeiffer J, Kuhnel C, Brandt J, et al. Biosynthesis of flavan 3-ols by leucoanthocyanidin 4-reductases and anthocyanidin reductases in leaves of grape (Vitis vinifera L.), apple (Malus x domestica Borkh.) and other crops[J]. Plant Physiol Biochem, 2006, 44: 323-334.

https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2006.06.001

[16]

Xie DY, Sharma SB, Paiva NL, et al. Role of anthocyanidin reductase, encoded by BANYULS in plant flavonoid biosynthesis[J]. Science, 2003, 299: 396-399.

https://doi.org/10.1126/science.1078540

[17]

Lei Z, Xiao LJ, Yu MQ, et al. Metabolic characterization of the anthocyanidin reductase pathway involved in the biosynthesis of flavan-3-ols in Elite Shuchazao tea (Camellia sinensis) cultivar in the field[J]. Molecules, 2017, 22: 2241-2261.

https://doi.org/10.3390/molecules22122241

[18]

Li H, Tian J, Yao YY, et al. Identification of leucoanthocyanidin reductase and anthocyanidin reductase genes involved in proanthocyanidin biosynthesis in Malus crabapple plants[J]. Plant Physiol Bioch, 2019, 139: 141-151.

https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2019.03.003

[19]

Ju ZG, Jiang MX, Wang WB, et al. Cloning and bioinformatics analysis of ANR gene in Blumea balsamifera[J]. Mol Plant Breed (分子植物育种), 2018, 16: 7270-7274.

[20]

Song Y, Liu HD, Wang HB, et al. Molecular cloning and functional identification of proanthocyanidin synthesis related genes VcLAR and VcANR of blueberry[J]. Jiangsu J Agric Sci (江苏农业学报), 2019, 35: 682-688.

[21]

Ji YF. Identification of key genes for flavonoid synthesis in Ginkgo Biloba and cloning of GbANR2 gene[J]. Agric Technol Equ (农业技术与装备), 2022, (4): 64-66.

[22]

Sui JJ, Yang JX, Hu X, et al. Cloning and expression analysis of TsANR gene under temperature stress in Toona sinensis[J]. J Fuyang Nor Univ (Nat Sci Ed) (阜阳师范大学学报自然科学版), 2021, 38: 57-61.

[23]

Lu DD, Tan ZW, Li L, et al. Cloning and expression analysis of anthocyanidin reductase gene ANR in Carthamus tinctorius L.[J]. Acta Agric Nucl Sin (核农学报), 2022, 36: 517-526.

[24]

Lu DD, Tan ZW, Yu YL, et al. Cloning, structure and expression profile analysis of CtANR2 and CtANR3 genes from Carthamus tinctorius L.[J]. Acta Agric Boreali Sin (华北农学报), 2023, 38: 84-93.

[25]

Xue Q, Fan H, Yao F, et al. Transcriptomics and targeted metabolomics profilings for elucidation of pigmentation in Lonicera japonica flowers at different developmental stages[J]. Ind Crop Prod, 2020, 145: 111981.

https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2019.111981

[26]

Liu XY, Chen L, Qiao YG, et al. Selection of reference genes by qRT-PCR inflower organ of Lonicera japonica Thunb.[J]. J Shanxi Agri Sci (山西农业科学), 2017, 45: 514-517.

[27]

Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (delta-delta Ct) method[J]. Methods, 2001, 25: 402-408.

[28]

Liu J, Zhang YL, Fu QF, et al. The optimum harvest time of Lonicera japonica[J]. Inf Tradit Chin Med (中医药信息), 2011, 28: 49-50.

[29]

Liu CY, Chen X, Chen Y, et al. Cloning, space-time expression and bioinformatics analysis of ACS3 gene from different species of Lonicera macranthoides[J]. Chin Tradit Herb Drugs (中草药), 2019, 50: 2154-2164.

[30]

Lin BB. Molecular Cloning and Comparative Genomic Analysis of BANYULS (BAN) Gene Family from Brassica napus and its Parental Species (甘蓝型油菜及其亲本物种BAN基因家族的克隆与比较基因组学分析) [D]. Chongqing: Southwest University, 2007.

[31]

Wang XM, Dong J, Jiang JS, et al. Cloning and bioinformatic analysis of MsBAN gene from Medicago sativa[J]. Chin J Grassland (中国草地学报), 2012, 34: 8-15.

[32]

Li XL, Zhao ZC, Gao AP, et al. Cloning and expression analysis of ANR gene from Mango[J]. Jiangsu Agric Sci (江苏农业科学), 2017, 45: 22-25.

[33]

Luo Y, Wang HX, Wang YS, et al. Expression and optimization of anthocyanin reductase gene of tea plant [Camellia sinensis (L.) O. Kuntze] in Escherichia coli[J]. J Tea Sci (茶叶科学), 2011, 31: 326-332.

[34]

Huang B, Li LB, Wu XJ, et al. Cloning and in vitro functional study of anthocyanin reductase gene from Camellia oleifera[J]. J Tea Bus (茶业通报), 2018, 40: 71-76.

[35]

Yuan JL, Zheng HL, Liang XL, et al. Influence of anthocyanin biosynthesis on leaf and fiber color of Gossypium hirsutum L.[J]. Sci Agric Sin (中国农业科学), 2021, 54: 1846-1855.

2023年第58卷第11期

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接收时间：2023-05-10
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-11-12

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收稿日期：2023-05-10
修回日期：2023-08-21

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1.河南省农业科学院芝麻研究中心, 河南郑州 450002

2.仲景宛西制药股份有限公司, 河南南阳 474550

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*梁慧珍, E-mail: lhzh66666@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Primer	Primer sequence	Usage
LjANR-F	ATGGCAGCTCAACAACCTACTGCGT	CDS and gDNA amplification
LjANR-R	TCAGTTCTGCAGTAACCCTTTGGCC
PLjANR-F	AGAGAGGGGGAAGGAGGG	Promoter amplification
PLjANR-R	TACTCTCTCTCTATTGGCTTTCTCC
qLjANR-F	ACCTACTGCGTGTGTTGTGGGAG	qRT-PCR
qLjANR-R	TCGTTTCGTCGGTTAAGTCTGCT
LjG6PD-F	GACCCAACAGTTCCTGACAA	Reference gene
LjG6PD-R	GCTTTCCCTGCCTTGAGTATAA
P32LjANR-F	ACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCAGCTCAACAACCTACTGCGT	Prokaryotic expression
P32LjANR-R	CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTTCTGCAGTAACCCTTTGGCC

Primer

Primer sequence

Usage

LjANR-F

ATGGCAGCTCAACAACCTACTGCGT

CDS and gDNA amplification

LjANR-R

TCAGTTCTGCAGTAACCCTTTGGCC

PLjANR-F

AGAGAGGGGGAAGGAGGG

Promoter amplification

PLjANR-R

TACTCTCTCTCTATTGGCTTTCTCC

qLjANR-F

ACCTACTGCGTGTGTTGTGGGAG

qRT-PCR

qLjANR-R

TCGTTTCGTCGGTTAAGTCTGCT

LjG6PD-F

GACCCAACAGTTCCTGACAA

Reference gene

LjG6PD-R

GCTTTCCCTGCCTTGAGTATAA

P32LjANR-F

ACAAGGCCATGGCTGATATCGGATCCATGGCAGCTCAACAACCTACTGCGT

Prokaryotic expression

P32LjANR-R

CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTTCTGCAGTAACCCTTTGGCC

Element name	Core sequence	Number	Function
TATA-box	ATATAT; TATATA; TATA; TATACA; TATAAAA; ATTATA; TATAAAT	78	Core promoter element around -30 of transcription start
CAAT-box	CAAAT; CAAT; CCCAATTT; CCAAT	20	Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
GT1-motif	GGTTAA	1	Light responsive element
Box 4	ATTAAT	2	Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness
I-box	gGATAAGGTG	1	Part of a light responsive element
Sp 1	GGGCGG	2	Light responsive element
GATA-motif	GATAGGA	1	Part of a light responsive element
G-Box	CACGTG; TACGTG	2	cis-Acting regulatory element involved in light responsiveness
MRE	AACCTAA	1	MYB binding site involved in light responsiveness
GARE-motif	TCTGTTG	1	Gibberellin-responsive element
CGTCA-motif	CGTCA	1	cis-Acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
ABRE	ACGTG; CACGTG	3	cis-Acting element involved in the abscisic acid responsiveness
ERE	ATTTCATA; ATTTTAAA	2	Ethylene responsive element
WRE 3	CCACCT	2	Damage and defense response element
STRE	AGGGG	6	Osmotic stress response element
ARE	AAACCA	2	cis-Acting regulatory element essential for the anaerobic induction
MYB	CAACAG	1	MyB-binding site
MYC	CATTTG/CAATTG	4	MyC-binding site

Element name

Core sequence

Number

Function

TATA-box

ATATAT; TATATA; TATA; TATACA; TATAAAA; ATTATA; TATAAAT

Core promoter element around -30 of transcription start

CAAT-box

CAAAT; CAAT; CCCAATTT; CCAAT

Common cis-acting element in promoter and enhancer regions

GT1-motif

GGTTAA

Light responsive element

Box 4

ATTAAT

Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness

I-box

gGATAAGGTG

Part of a light responsive element

Sp 1

GGGCGG

Light responsive element

GATA-motif

GATAGGA

Part of a light responsive element

G-Box

CACGTG; TACGTG

cis-Acting regulatory element involved in light responsiveness

MRE

AACCTAA

MYB binding site involved in light responsiveness

GARE-motif

TCTGTTG

Gibberellin-responsive element

CGTCA-motif

CGTCA

cis-Acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness

ABRE

ACGTG; CACGTG

cis-Acting element involved in the abscisic acid responsiveness

ERE

ATTTCATA; ATTTTAAA

Ethylene responsive element

WRE 3

CCACCT

Damage and defense response element

STRE

AGGGG

Osmotic stress response element

ARE

AAACCA

cis-Acting regulatory element essential for the anaerobic induction

MYB

CAACAG

MyB-binding site

MYC

CATTTG/CAATTG

MyC-binding site

Protein	Physical and chemical property		Secondary structure/%
LjANR	333	5.57	35.9063	0.017	26.46		41.74	36.34	14.41	7.51
rLjANR	333	5.57	35.9184	0.032	26.21		42.64	36.04	13.81	7.51

Protein

Physical and chemical property

Secondary structure/%

Amino acid number

Molecular weight/kD

GRAVY

Instability index

Alpha helix

Random coil

Extended strand

Beta turn

LjANR

333

5.57

35.9063

0.017

26.46

41.74

36.34

14.41

7.51

rLjANR

333

5.57

35.9184

0.032

26.21

42.64

36.04

13.81

7.51