药学学报

Primer name	Forward primer	Reverse primer
CS	5'-TGCTTCCTCCACGAATTTGAAA-3'	5′-CCACCATACATCATGTCCACAG-3′
IDH1	5'-TGTGGTAGAGATGCAAGGAGA-3'	5′-TTGGTGACTTGGTCGTTGGTG-3′
IDH2	5'-CGCCACTATGCCGACAAAAG-3'	5′-ACTGCCAGATAATACGGGTCA-3′
IDH3	5'-TGCTGCCAAAGCACCTATTCA-3'	5′-GTGACCGGCTGCTATTGGG-3′
OGDH	5'-GGCTTCCCAGACTGTTAAGAC-3'	5′-GCAGAATAGCACCGAATCTGTTG-3′
β-Actin	5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3'	5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'

Primer name	Forward primer	Reverse primer
CS	5'-TGCTTCCTCCACGAATTTGAAA-3'	5′-CCACCATACATCATGTCCACAG-3′
IDH1	5'-TGTGGTAGAGATGCAAGGAGA-3'	5′-TTGGTGACTTGGTCGTTGGTG-3′
IDH2	5'-CGCCACTATGCCGACAAAAG-3'	5′-ACTGCCAGATAATACGGGTCA-3′
IDH3	5'-TGCTGCCAAAGCACCTATTCA-3'	5′-GTGACCGGCTGCTATTGGG-3′
OGDH	5'-GGCTTCCCAGACTGTTAAGAC-3'	5′-GCAGAATAGCACCGAATCTGTTG-3′
β-Actin	5'-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3'	5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'

常山酮抑制肝癌HepG2细胞活性及机制初步研究

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陈孟旸 ¹^,² , 淮瑞平 ¹^,² , 杨丹妮 ¹^,² , 雷利杰 ¹^,² , 蒲秋霖 ¹^,² , 熊莉丽 ²^,^*

药学学报 | 研究论文 2024,59(2): 368-373

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常山酮抑制肝癌HepG2细胞活性及机制初步研究

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陈孟旸¹^,², 淮瑞平¹^,², 杨丹妮¹^,², 雷利杰¹^,², 蒲秋霖¹^,², 熊莉丽²^,^*

作者信息

1.西南交通大学生命科学与工程学院, 四川成都 610000

2.西南交通大学化学学院, 四川成都 610000

通讯作者:

^*熊莉丽, Tel: 86-28-66367236, E-mail: lxiong@swjtu.edu.cn

Preliminary study on the mechanism of halofuginone inhibiting the activity of HepG2 cells

Meng-yang CHEN¹^,², Rui-ping HUAI¹^,², Dan-ni YANG¹^,², Li-jie LEI¹^,², Qiu-lin PU¹^,², Li-li XIONG²^,^*

Affiliations

1. School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610000, China

2. School of Chemistry, Southwest Jiaotong University, Chengdu 610000, China

出版时间: 2024-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0216

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摘要

收起

探讨常山酮(halofuginone) 抑制肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC) 细胞活性的作用及机制。以肝癌HepG2细胞为主要研究对象, 使用CCK-8法、Transwell法、流式细胞术检测不同浓度和时间处理下, 常山酮对HepG2细胞活性、细胞迁移、细胞周期和细胞凋亡的影响。通过实时荧光定量PCR (qPCR) 和Western blot检测常山酮处理后细胞中柠檬酸合酶(citrate synthase, CS)、酮戊二酸脱氢酶(ketoglutarate dehydrogenase, OGDH) 和异柠檬酸脱氧酶(isocitrate deoxygenase, IDH) 的表达水平。与空白组相比, 常山酮显著抑制HepG2细胞活性(P < 0.01), 降低HepG2细胞迁移率(P < 0.01), 诱导肝癌HepG2细胞凋亡(P < 0.01), 促使HepG2细胞周期停滞在S期(P < 0.01)。常山酮处理后肝癌HepG2细胞中三羧酸循环关键酶CS、IDH3和OGDH表达量上调, 异柠檬酸脱氢酶同工酶IDH1和IDH2表达量下调。常山酮可抑制肝癌HepG2细胞增殖和迁移, 促进细胞凋亡并存在明显的剂量依赖性效应, 这可能与促进细胞有氧代谢有关。

关键词

常山酮 / 三羧酸循环 / HepG2细胞 / 异柠檬酸脱氢酶 / 有氧代谢

Abstract

收起

This study aimed to investigate halofuginone's inhibitory effect and mechanism on the activity of hepatocellular carcinoma cells. HepG2 cells were used to detect the effects of halofuginone. After treatment, cell activity, cell migration, cell cycle, and cell apoptosis were detected by CCK-8, transwell, and flow cytometry, respectively. The expression levels of growth and metabolism-related factors such as citrate synthase (CS), ketoglutarate dehydrogenase (OGDH), and isocitrate deoxygenase (IDH) were detected by real-time quantitative PCR and Western blot. Compared with the control group, the activity of HepG2 cells was significantly inhibited by halofuginone (P < 0.01), the migration rate of HepG2 cells was decreased (P < 0.01), the apoptosis of HepG2 cells was induced (P < 0.01), and the cell cycle was arrested in S phase (P < 0.01). The expression levels of tricarboxylic acid key enzymes CS, IDH3, and OGDH were up-regulated, the expression level of isocitrate dehydrogenase isoenzymes IDH1 and IDH2 were down-regulation. In conclusion, halofuginone can inhibit the proliferation and migration of HepG2 cells and promote apoptosis in a dose-dependent manner, which may be due to the promotion of the aerobic metabolism of cells.

Key words

halofuginone / tricarboxylic acid / HepG2 cell / isocitrate dehydrogenase / aerobic metabolism

引用本文

陈孟旸, 淮瑞平, 杨丹妮, 雷利杰, 蒲秋霖, 熊莉丽. 常山酮抑制肝癌HepG2细胞活性及机制初步研究. 药学学报, 2024 , 59 (2) : 368 -373 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0216

Meng-yang CHEN, Rui-ping HUAI, Dan-ni YANG, Li-jie LEI, Qiu-lin PU, Li-li XIONG. Preliminary study on the mechanism of halofuginone inhibiting the activity of HepG2 cells[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2024 , 59 (2) : 368 -373 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2023-0216

正文

收起

据Cancer statistics数据显示, 截至2020年已有超过90万患者患有肝癌, 超过83万患者死于肝癌^[1]。世界卫生组织预测2030年将有超过100万患者死于肝癌^[2]。肝癌的5年生存率为18%, 为除胰腺癌外的第二大致命癌症^[3], 因此急需开发有效的肝癌治疗药物以增加肝癌患者的生存率。天然小分子化合物常山酮近年来被发现可抑制胰腺纤维化和肝硬化, 降低细胞外基质的形成, 抑制前列腺癌和肾母细胞瘤生长^[4-6], 减少胰腺癌的发生^{[7, 8]}。已有研究表明, 常山酮可以抑制乳腺癌细胞迁移^[9], 抑制小鼠肝癌细胞生长^[10]。当常山酮联合其他抗癌药物作用时, 可增加癌细胞凋亡, 比单独治疗更有效^{[7, 9]}, 因此可以作为肿瘤联合治疗的候选药物。常山酮对肝癌细胞是否具有有效的抑制作用及作用机制目前鲜有研究。本研究通过常山酮对肝癌HepG2细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡及细胞周期的影响, 初步探究其对肝癌的潜在治疗效果及其机制。

材料与方法

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细胞系及主要试剂

人肝癌细胞系HepG2、HepG2-C3A、Huh-7均购自中国科学院上海细胞库。常山酮氢溴酸盐(halofuginone hydrobromide, HH) 纯度99.7%, 由重庆威鹏(VPON) 药业提供。DMEM培养基、100 u·mL^-1青霉素和100 μg·mL^-1链霉素、0.25% EDTA胰酶和胎牛血清购自美国ThermoFisher公司; CCK-8试剂盒购自美国APExBIO公司; TRIzol@reagent购自美国Invitrogen公司; 逆转录试剂盒购自Promega公司; qPCR试剂盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix与逆转录试剂盒HiScipt Ⅲ 1^st Strand cDNA Sythesis Kit均购买于南京诺唯赞生物科技股份有限公司; 异柠檬酸脱氧酶(isocitrate deoxygenase, IDH) 1、IDH2、GAPDH一抗购自美国Abcam公司, 羊抗兔辣根过氧化物酶标记二抗购自北京博奥森生物技术有限公司, Annexin V-APC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒和细胞周期检测试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司。

细胞培养

将不同细胞株复苏后在添加10%胎牛血清、100 u·mL^-1青霉素和100 μg·mL^-1链霉素的DMEM培养基中培养。所有细胞放置在含5% CO₂的37 ℃培养箱中培养。视细胞生长情况, 每2~4天进行1∶2~1∶3传代。

CCK-8法检测常山酮对肝癌细胞增殖的抑制作用

收集对数期肝癌细胞按2×10³个/孔的数量接种于96孔板中, 培养过夜。参照Wang等^[11]的实验方法, 选取常山酮氢溴酸盐0.5、2.5、6.25、12.5、25、50、100、200和400 μmol·L^-1分别处理6、24和48 h, 每个浓度梯度设置3个复孔, 并设置空白对照组为0.1% DMSO且不含细胞。培养基与CCK-8试剂按9∶1的比例混匀后加入每个孔中, 37 ℃继续孵育1 h。使用酶标仪在450 nm处测量各孔的光密度值, 以反映各组细胞的增殖活力, 常山酮氢溴酸盐的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀) 使用GraphPad Prism 9软件计算。

Transwell法检测细胞迁移率

将含有大约2×10⁵个细胞, 浓度为2.5和12.5 μmol·L^-1常山酮氢溴酸盐和含0.1% DMSO的无血清DMEM接种到Transwell孔板的内室中。将含血清的DMEM添加至外室。继续孵育24 h后染色, 在Nikon Eclipse TE200倒置光学显微镜下对迁移的细胞进行计数。通过使用Image J软件分析并计算细胞迁移率的变化。

流式细胞术检测HepG2细胞的细胞周期分布及凋亡率

细胞周期分布检测收集常山酮氢溴酸盐(0、0.5、2.5、12.5 µmol·L^-1) 处理48 h的HepG2细胞, 并在冰冷的70%乙醇中固定过夜, 然后将细胞在室温下以350 ×g离心5 min。弃乙醇, 用500 μL PBS洗涤两次, 250 ×g离心5 min, 弃上清。500 μL PI/RNase A染色工作液重悬细胞, 室温避光30 min后, 通过流式细胞仪(cytoflex, Beckman, Brea, CA, USA) 检查细胞周期的相位分布, 并通过ModFit LT5.1程序进行分析。

细胞凋亡率检测收集常山酮氢溴酸盐(0、0.5、2.5、12.5 µmol·L^-1) 处理24和48 h的HepG2细胞。然后250 ×g离心5 min, 吸弃上清液, 用PBS洗涤两次, 250 ×g离心5 min, 吸弃上清, 获得细胞沉淀。用500 μL binding buffer重悬细胞后, 加入5 μL Annexin V轻轻吹匀, 再加入5 μL PI混匀; 室温避光反应15 min, 通过流式细胞仪检查细胞分布, 并通过Flowjo软件(Tree-Star, Ashland, OR, USA) 分析数据, 凋亡率计算方法为: 凋亡率=早期凋亡细胞数(LR) + 晚期凋亡细胞数(UR)/总细胞数。

qPCR法检测细胞中mRNA表达量变化

使用Trizol试剂提取处理后肝癌细胞总RNA。使用HiScipt Ⅲ 1^st Strand cDNA Sythesis Kit纯化总RNA并逆转录, 以制备cDNA样品。目的基因及内参基因的引物序列见表 1。每个PCR反应体系为: ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 7.5 μL, 上下引物各0.6 μL, cDNA 1 μL, 双蒸水6.3 μL。PCR反应条件: 95 ℃下预变性10 min, 然后按95 ℃ 15 s, 62 ℃下反应1 min, 共40个循环, 最后95 ℃下反应15 s、60 ℃下反应1 min、95 ℃下反应15 s。

Western blot法检测细胞中IDH1、IDH2蛋白的表达

使用具有1 mmol·L^-1 PMSF的冰冷RIPA缓冲液裂解刮下肝癌细胞并收集。然后在4 ℃以15 000 r·min^-1离心5 min。收集细胞裂解物并确定蛋白质提取物的浓度。蛋白质样品(每个泳道30 µg) 通过10% SDS-PAGE电泳后转移到NC膜上。用含有5%脱脂奶粉的TBST封闭膜1 h, 在4 ℃下分别过夜孵育一抗IDH1 (1∶5 000)、IDH2 (1∶5 000) 与β-actin (1∶8 000), TBST中将膜洗涤3次, 每次10 min。在常温下孵育相应的二抗(1∶8 000)。使用HRP蛋白发光液于iBright蛋白免疫印迹成像系统中显影成像并分析蛋白条带的灰度值, 以β-actin为内参, 计算IDH1、IDH2蛋白的表达量。

统计学分析

CCK-8法、流式细胞术、Western blot、qPCR等实验均重复3次。数据分析通过GraphPad Prism 9软件完成。两组间比较采用student's t test, 多组间比较采用two-way ANOVA用于确定显著性; P < 0.05表示差异具有统计学意义。数据表示为x ± s。

结果

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1 常山酮抑制HepG2细胞活性

使用HH处理肝癌HepG2细胞, 并通过CCK-8法检测HepG2细胞的活性变化。结果表明, 不同浓度的常山酮处理不同时间后, 能有效抑制肝癌HepG2细胞活性。与空白组相比, 6.25 μmol·L^-1 HH处理肝癌HepG2细胞48 h后, HepG2细胞活性降低50.1% (图 1)。HH处理肝癌其他细胞系, 实验结果表明, 常山酮明显抑制了肝癌HepG2-C3A细胞和Huh-7细胞的活性, 且其作用强于常山酮在HepG2细胞中的抑制作用(图 2)。

2 常山酮抑制肝癌HepG2细胞迁移

Transwell法检测结果显示, HH处理肝癌HepG2细胞后, 其迁移率显著下降, 且高浓度HH处理对迁移影响更明显(P < 0.01, 图 3)。与空白组相比, 2.5 μmol·L^-1 HH处理HepG2细胞48 h后, 细胞迁移率降低48.5%。

3 常山酮诱导肝癌HepG2细胞凋亡

通过流式细胞术检测常山酮处理24 h后的肝癌HepG2细胞, 结果与空白组相比, HH处理组中HepG2细胞凋亡率明显增大, 晚期凋亡百分率增加2.38%~13.74%; 同时常山酮处理48 h后的肝癌HepG2细胞, 结果与空白组相比, HH处理组中HepG2细胞凋亡率明显增大, 晚期凋亡百分比率增加5.18%~30.61% (P < 0.05)。两组结果表明, 常山酮能诱导HepG2细胞凋亡, 且呈现浓度依赖性增加(图 4)。

4 常山酮阻滞肝癌HepG2细胞周期

细胞周期检测结果显示, 与空白组相比, HH处理肝癌HepG2细胞48 h后, G0/G1期比例显著下降, G2期比例无明显变化, S期比例显著上调, 表明HH处理均使HepG2细胞周期阻滞在S期(图 5)。

5 常山酮对三羧酸循环关键酶表达的影响

qPCR检测结果(图 6) 显示, 与空白组相比, HH处理肝癌HepG2细胞48 h后, 柠檬酸合酶(CS)、IDH3和酮戊二酸脱氢酶(OGDH) mRNA的表达水平明显上调(P < 0.01), 而异柠檬酸脱氢酶同工酶IDH1与IDH2 mRNA表达量有下调趋势(P > 0.05)。Western blot蛋白检测结果与mRNA表达量变化一致, IDH1和IDH2蛋白表达量下降(P < 0.05, 图 7)。

讨论

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常山酮是从传统中药常山中提取出的喹唑酮类天然生物碱, 常用于家畜类动物抗球虫病^[12]。研究表明, 常山酮有望用于治疗疟疾、纤维化、炎症和调节自身免疫, 并具有抑制癌细胞生长、转移和引发细胞死亡的能力^[13-15]。目前的实验研究表明, 常山酮可抑制乳腺癌^[16]、膀胱癌^[17]、黑色素瘤转移和多发性骨髓瘤^[18]、前列腺移植瘤^[19]、胰腺肿瘤^[7]的生长。

肝细胞癌(HCC) 占原发性肝癌的90%, 目前尚无被纳入临床治疗的药物能够有效提高HCC患者生存率。近年实验室研究表明, 常山酮可能对HCC^[10]具有潜在的治疗效果, 因此本研究通过常山酮处理肝癌HepG2细胞后表型及其基因表达变化探究其对肝癌细胞的抑制作用及其机制。

本研究结果显示, 常山酮处理可以显著抑制HepG2细胞的细胞活性和迁移率, 且具有剂量依赖性效应, 与Gnainsky等^[20]在肝癌中的研究结果一致。流式细胞术结果显示, 常山酮处理HepG2细胞后细胞凋亡率呈现剂量依赖性增加, 同时细胞周期阻滞在S期。这与Xia等^[21]观察到常山酮对细胞周期的阻滞作用一致, 其可能原因为常山酮抑制组蛋白脱乙酰酶HDAC2表达, 进而影响了细胞周期蛋白表达。

CS、IDH3和OGDH是三羧酸循环的3个关键限速酶, 在癌细胞尤其是在肝癌细胞中起着调节生物合成和有氧代谢的功能^[22]。本研究通过qPCR检测常山酮处理后HepG2细胞中CS、IDH和OGDH表达量变化, 探究常山酮对有氧代谢的相关影响。结果显示, 常山酮显著上调了CS、IDH3和OGDH mRNA的表达量, 证实三羧酸循环受到常山酮的促进作用。有意思的是, 与三羧酸循环关键酶IDH3表达量上调不同, qPCR检测发现其同工酶IDH1和IDH2 mRNA表达量受常山酮影响呈现下调趋势。本研究又进一步通过Western blot实验确证IDH1和IDH2蛋白表达量也下调, 与mRNA结果一致。常山酮处理后IDH1和IDH2表达量下降, 避免了肿瘤细胞受到氧化应激损伤。在细胞三羧酸循环调控中, IDH1和IDH2主要通过提高NADPH与NADH的比值, 增加柠檬酸的转移^[23]。而在常山酮作用下, 三羧酸循环中起主要作用的IDH3 mRNA水平上调, 可能导致肝癌HepG2细胞内氧化应激水平激增, ROS水平升高, 进而导致异常的细胞信号转导, 这也可能是常山酮促进HepG2细胞凋亡的原因之一(图 8)。

总之, 本研究以肝癌HepG2细胞为研究对象, 探究了常山酮对肝癌HepG2细胞表型的影响与分子调控机制, 实验结果表明常山酮可能通过增加细胞有氧代谢促进细胞凋亡, 为深入认识天然药物分子治疗肿瘤、提高疗效提供了新的实验数据和研究思路。

作者贡献: 熊莉丽提出研究思路及文章校对; 陈孟旸完成部分实验操作、数据分析及文章撰写; 淮瑞平完成部分实验操作及部分数据分析; 杨丹妮、雷利杰、蒲秋霖提供技术支持。

利益冲突: 所有作者均声明无利益冲突。

基金

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中央高校基本科研业务费专项资金资助(2682020ZT112)
四川省中医药管理局项目(2021XYCZ008)
四川省科技厅重点研发计划项目(2022YFS0437)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2024年第59卷第2期

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186

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2023-0216

接收时间：2023-02-22
首发时间：2025-11-28
出版时间：2024-02-12

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收稿日期：2023-02-22
修回日期：2023-06-13

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四川省中医药管理局项目(2021XYCZ008)

四川省科技厅重点研发计划项目(2022YFS0437)

作者信息

1.西南交通大学生命科学与工程学院, 四川成都 610000

2.西南交通大学化学学院, 四川成都 610000

通讯作者:

^*熊莉丽, Tel: 86-28-66367236, E-mail: lxiong@swjtu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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