药学学报

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基于计算机辅助药物设计的慈菇消脂方调控HIF-1α信号通路干预HSC-T6细胞活化的作用及机制研究

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任真 , 尹硕 , 王爱娣 , 王莉 , 赵秀萍 , 马燕花 ^*

药学学报 | 研究论文 2023,58(10): 3049-3058

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药学学报 |研究论文 2023 , 58 (10) : 3049 -3058

基于计算机辅助药物设计的慈菇消脂方调控HIF-1α信号通路干预HSC-T6细胞活化的作用及机制研究

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任真, 尹硕, 王爱娣, 王莉, 赵秀萍, 马燕花^*

作者信息

甘肃中医药大学, 甘肃兰州 730000

通讯作者:

*马燕花, Tel: 13893411954, E-mail: 617747928@qq.com

Molecular mechanism of Cigu Xiaozhi formula interfering with HSC-T6 cell activation by regulating HIF-1α signaling pathway based on computer aided drug design

Zhen REN, Shuo YIN, Ai-di WANG, Li WANG, Xiu-ping ZHAO, Yan-hua MA^*

Affiliations

Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China

出版时间: 2023-10-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1206

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摘要

收起

基于网络药理学及计算机辅助药物设计探讨慈菇消脂方(Cigu Xiaozhi Formula) 对缺氧微环境下肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs) HSC-T6活性的影响, 预测并验证其可能作用的靶点及相关信号通路。通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)、中医药百科全书在线数据库(Encyclopaedia of Traditional Chinese Medicine, ETCM) 及中药分子机制的生物信息学分析工具(Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine, BATMAN-TCM) 数据库检索筛选出慈菇消脂方的潜在活性成分及作用靶点, 并借助Gene Cards和Pharm GK数据库检索到的肝纤维化相关靶点进行交集整合, 获得慈菇消脂方治疗肝纤维化的潜在作用靶点。在Omic Share平台进行GO (gene ontology) 富集分析和KEGG (kyoto encyclopedia of genes and genomes) 信号通路富集分析, 利用Cytoscape软件构建出“潜在活性成分-关键靶点-通路”网络。利用Auto Dock软件对活性成分和靶点蛋白进行分子对接分析, 根据分子动力学模拟和结合自由能计算结果, 将degree值排名前5的活性成分进行对接打分, 对君药山慈菇活性成分豆甾醇和β-谷甾醇进行分子对接。体外实验应用氯化钴(CoCl₂) 诱导HSC-T6细胞构建缺氧模型, 通过CCK-8实验检测细胞活力, 确定100 µmol·L^-1 CoCl₂作用24 h为构建HSC-T6细胞缺氧模型的最佳作用时间和浓度。细胞划痕愈合实验和免疫荧光检测发现, 在缺氧状态下HSC-T6细胞被活化, 划痕愈合率显著升高, 活化标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA) 荧光信号显著增强, 而6%含药血清能抑制HSC-T6细胞活化, 细胞划痕愈合率显著降低, α-SMA荧光信号显著减弱。进一步研究发现, 在缺氧状态下HSC-T6细胞中缺氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)、α-SMA和刺猬信号通路(hedgehog, Hh) 关键蛋白Patched-1 (Ptch-1)、脑胶质瘤相关癌基因1 (glioma related oncogene homology-1, Gli-1) 表达上调, 而6%含药血清可下调HIF-1α、α-SMA、Ptch-1和Gli-1蛋白表达; HIF-1α特异性阻断剂YC-1组和Hh信号通路特异性阻断剂环巴胺组HIF-1α、α-SMA、Ptch-1和Gli-1蛋白表达均显著下调。以上研究结果表明, HIF-1α和Hh信号通路参与HSC-T6细胞活化, 中药慈菇消脂方可抑制HSC-T6细胞活化, 其机制可能与抑制HIF-1α表达和阻断Hh信号通路有关。综上所述, 中药慈菇消脂方通过直接作用于HIF-1α和Hh信号通路抑制HSC-T6细胞活化, 从而发挥抗肝纤维化作用。实验方案经甘肃中医药大学动物实验伦理委员会批准, 所有程序均严格按照动物使用和护理的伦理原则进行。

关键词

计算机辅助药物设计 / 慈菇消脂方 / 缺氧诱导因子-1α / 大鼠肝星状细胞 / 刺猬信号通路 / 肝纤维化

Abstract

收起

In this study, we investigated the effect of Cigu Xiaozhi formula on HSC-T6 activity in hypoxic microenvironment based on network pharmacology and computer-aided drug design, and predicted and verified its possible targets and related signaling pathways. The potential active components and targets of Cigu Xiaozhi formula were screened by searching Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), Encyclopaedia of Traditional Chinese Medicine (ETCM) and Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine (BATMAN-TCM) databases, and the liver fibrosis related targets retrieved from Gene Cards and Pharm GK database were integrated to obtain the potential targets of Cigu Xiaozhi formula in the treatment of liver fibrosis. GO enrichment analysis and KEGG signaling pathway enrichment analysis were performed on Omic Share platform, and Cytoscape software was used to construct the "potential active ingredient-key target-pathway" network. The active components and target proteins were subjected to molecular docking analysis by Auto Dock software. According to the results of molecular dynamics simulation and binding free energy calculation, the top 5 active components with degree were scored. The active components stigmasterol and β-sitosterol were subjected to molecular docking. CoCl₂ was used to induce HSC-T6 cells to construct hypoxia model in vitro. The cell viability was detected by CCK-8 assay, and the optimal time and concentration of hypoxia model of HSC-T6 cells was determined to be 100 µmol·L^-1 CoCl₂ for 24 h. Under hypoxia condition, HSC-T6 cells were activated, the wound healing rate was significantly increased, and the fluorescence signal of activation marker protein α-smooth muscle actin (α-SMA) was significantly enhanced. However, 6% drug-containing serum could inhibit the activation of HSC-T6 cells, and the wound healing rate was significantly decreased, and the fluorescence signal of α-SMA was significantly weakened. Further studies showed that the expressions of hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α), α-SMA and key proteins of Hedgehog (Hh) signaling pathway in HSC-T6 cells were up-regulated under hypoxia, while the expressions of HIF-1α, α-SMA, Patched-1 (Ptch-1) and glioma related oncogene homology-1 (Gli-1) were down-regulated in 6% drug-containing serum group, the YC-1 group and the cyclopamine group. These results indicated that HIF-1α and Hh signaling pathways were involved in the activation of HSC-T6 cells, and the traditional Chinese medicine Cigu Xiaozhi formula could inhibit the activation of HSC-T6 cells, and the mechanism may be related to the inhibition of HIF-1α expression and the blocking of Hh signaling pathway. In conclusion, Cigu Xiaozhi formula can inhibit the activation of HSC-T6 cells by directly acting on HIF-1α and Hh signaling pathway, and exert an anti-hepatic fibrosis effect. The animal experimental protocol has been reviewed and approved by Laboratory Animal Ethics Committee of Gansu University of Chinese Medicine, in compliance with the Institutional Animal Care Guidelines.

Key words

computer aided drug design / Cigu Xiaozhi formula / hypoxia-inducible factor-1α / rat hepatic stellate cell / Hedgehog signaling pathway / hepatic fibrosis

引用本文

任真, 尹硕, 王爱娣, 王莉, 赵秀萍, 马燕花. 基于计算机辅助药物设计的慈菇消脂方调控HIF-1α信号通路干预HSC-T6细胞活化的作用及机制研究. 药学学报, 2023 , 58 (10) : 3049 -3058 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1206

Zhen REN, Shuo YIN, Ai-di WANG, Li WANG, Xiu-ping ZHAO, Yan-hua MA. Molecular mechanism of Cigu Xiaozhi formula interfering with HSC-T6 cell activation by regulating HIF-1α signaling pathway based on computer aided drug design[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (10) : 3049 -3058 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1206

正文

收起

肝纤维化(liver fibrosis, LF) 是由各种慢性肝损伤引起的病理改变, 慢性肝病向肝硬化发展的必然中间环节, 是一种以细胞外基质(extra cellular matrix, ECM) 过度积累为特征的病理过程^[1], 细胞学基础是静止状态的肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs) 转化为活化表型的肌成纤维细胞, 活化的肌成纤维样细胞增多, ECM大量沉积, 导致肝纤维化的发生^[2]。多种因素可引起HSC发生异常活化, 其中HIF-1α发挥着重要作用^[3], HSC中ECM的代谢能力与缺氧诱导因子-1α (hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α) 的升高直接相关。刺猬信号通路(Hedgehog, Hh) 信号通路参与肝脏、肺脏、肾脏等多种脏器纤维化过程^[4], 当Hh信号通路被药物或基因阻断时, 可阻止HSC向成肌纤维母细胞过程中的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT), 使细胞保持静止状态或转向上皮细胞表型^[5]。研究发现, HIF-1α的增加可以促进声波刺猬(Sonic Hedgehog, Shh) 的自分泌, 进而激活缺氧微环境中的Hh信号通路^[6]。课题组前期研究发现, 慈菇消脂方可显著改善非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD) 大鼠肝脏脂肪变性; 体外实验表明, 慈菇消脂方含药血清具有降脂、抗炎、抗凋亡等作用^{[7, 8]}, 但其作用靶点和作用机制还有待进一步研究。本研究采用CoCl₂化学诱导缺氧法干预HSC-T6细胞, 制备缺氧模型, 慈菇消脂方含药血清进行干预, 利用计算机辅助药物设计(computer aided drug design, CADD) 分析慈菇消脂方主要活性成分, 分子对接预测其可能作用靶点, 并通过细胞实验进行验证, 从而阐述慈菇消脂方抑制HSC活化的作用机制, 为中药治疗肝纤维化提供理论依据。

材料与方法

收起

动物 SPF级健康SD大鼠20只, 雌雄各半, 体质量(200 ± 20) g, 由甘肃中医药大学动物实验中心提供, 实验动物生产许可证号SCXK (甘) 2020-0001。饲养于温度(24 ± 2) ℃左右、湿度40%~70%条件下, 明暗交替照明12 h。本动物实验遵循甘肃中医药大学实验动物中心实验动物使用管理规定, 且通过甘肃中医药大学动物伦理委员会批准(批准号: 2021-258)。

细胞大鼠肝星状细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司(HSC-T6, CL-0116)。细胞培养条件: 将细胞培养于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素双抗的DMEM培养基中, 2~3天换液1次, 细胞80%融合度时传代, 按照1∶3传代比例进行, 于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。

药品与试剂 慈菇消脂方由山慈菇(10 g)、法半夏(15 g)、茯苓(20 g)、柴胡(12 g)、丹参(20 g)、土鳖虫(20 g)、薏苡仁(30 g)、黄芩(10 g)、泽泻(15 g)、枸杞(20 g)、生山楂(20 g)、生首乌(30 g)、决明子(20 g) 和炙甘草(10 g) 共14味中药组成, 购自甘肃中医药大学附属医院并通过药剂室鉴定。环巴胺(批号: HY-17024) 购自MCE公司, 取5 mg环靶胺用1.214 7 mL DMSO配制成10 mmol·L^-1母液, -20 ℃保存, 使用时用细胞生长培养液配制成10 µmol·L^-1。YC-1 (HY-14927, MCE公司), 取5 mg YC-1用1.642 9 mL DMSO配制成10 mmol·L^-1的母液, -20 ℃保存, 使用时用细胞生长培养液配制成10 µmol·L^-1。CoCl₂ (批号: 20201225) 购自美国Sigma公司, 用天平称量0.238 g CoCl₂, 用10 mL超纯水充分溶解, 混合后用0.22 µm滤器缓慢过滤, 制得浓度为100 mmol·L^-1 CoCl₂母液。将CoCl₂母液用DMEM高糖培养基分别配置成100、200、400、600和800 µmol·L^-1 CoCl₂培养液。CCK-8试剂盒(批号: 40203) 购自上海翊圣生物科技有限公司; BCA蛋白定量试剂盒(批号: PC0020)、SDS-PAGE凝胶试剂盒(批号: P1200)、BSA (批号: 20210920)、抗荧光衰减封片剂(批号: S2110) 购自北京索莱宝科技有限公司; HIF-1α抗体(批号: GTX127309, 1∶1 000)、脑胶质瘤相关癌基因1 (glioma related oncogene homology-1, Gli-1) 抗体(批号: GTX106207, 1∶1 000)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA) 抗体(批号: GTX100034, 1∶1 000) 购自Gene Tex公司; 山羊抗兔IgG (批号: RS0002, 1∶10 000)、山羊抗鼠IgG (批号: RS0001, 1∶10 000)、β-actin单克隆抗体(批号: YM3028, 1∶10 000)、抗GAPDH抗体(批号: YM3215, 1∶10 000) 购自Immunoway公司; 抗Patched-1 (Ptch1) 抗体(批号: Ab53715, 1∶1 000) 购自Abcam公司。

仪器酶标仪(iMark, 美国BioRad公司); Western blot转膜仪(DYCZ-40G)、Western blot电泳仪(DYCZ-25D)、Western blot电源(DYY-6D) (北京六一生物科技公司); 摇床(SK-O180-E, SCILOGEX公司); 倒置荧光显微镜(IX53, Olympus公司); 化学发光成像仪(MiniChemi 610, 北京赛智科技有限公司); 高速冷冻离心机(5424R)、高速低温台式离心机(TGL-16) (Eppendorf公司)。

数据库与软件 TCMS数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php), ETCM数据库(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/), BATMAN-TCM数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/), Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/), Cytoscape3.7.2软件, Gene Cards数据库(https://www.genecards.org/) 和PharmGK数据库(https://www.pharmgkb.org/), String数据库(https://cn.string-db.org/), DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)。

慈菇消脂方中化学成分的收集和筛选 通过TCMSP、ETCM及BATMAN-TCM数据库分别以“山慈菇”、“半夏”、“茯苓”、“柴胡”、“党参”、“薏苡仁”、“黄芩”、“泽泻”、“枸杞子”、“山楂”、“何首乌”、“决明子”、“甘草”、“土鳖虫”为关键词检索药物含有的化学成分。以口服生物利用度(oral bioavailability, OB) ≥ 30%且类药性(drug-likeness, DL) ≥ 0.18为标准, 借助TCMSP数据库, 筛选出山慈菇、半夏、茯苓、柴胡、党参、土鳖虫、薏苡仁、黄芩、泽泻、枸杞子、山楂、何首乌、决明子和甘草中的活性成分。

靶标蛋白的筛选及药物-成分-靶点网络的构建 借助TCMSP数据库, 将慈菇消脂丸中的活性成分进行检索, 查找出其对应的靶点, 运用Uniprot数据库查询靶点对应的基因名, 并进行去重。用Cytoscape 3.7.2软件构建、分析成分和靶点网络。

慈菇消脂方治疗肝纤维化潜在作用靶点的预测 在Gene Cards和Pharm GK数据库中以“hepatic fibrosis”为关键词检索肝纤维化相关的基因。将筛选得到的药物靶点与疾病靶点进行映射, 即获得慈菇消脂方治疗肝纤维化的潜在作用靶点。

蛋白互作网络(protein-protein interactions, PPI) 网络构建与分析 将筛选得到的慈菇消脂方治疗肝纤维化的潜在作用靶点导入String数据库, 将物种限定为“homo sapiens”, 获得蛋白相互作用关系。将文件保存为TSV格式, 导入到Cytoscape3.7.2软件中, 利用Cytoscape3.7.2软件的“network analyzer”功能进行网络拓扑属性分析, 筛选高于平均值的degree与betweenness centrality值, 即得到关键靶点。

靶点的通路分析 将关键靶点导入DAVID数据库, 把物种定义为“homo sapiens”, 将所有靶基因名称校正为官方名称, 在Omic Share平台进行GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。GO富集分析选取生物过程(biological processes, BP)、细胞功能(molecular function, MF) 和细胞组分(cell composition, CC)。KEGG通路分析将靶基因官方名称输入KOBAS平台, 导出文件, 按照P-value值进行升序, 选择前20个数据, 绘制气泡图进行可视化。

分子对接评价药物分子与HIF-1α蛋白结合程度 利用Auto Dock软件分别对靶蛋白进行去水、加氢、设置为受体, 中药小分子进行加氢、设置为配体等操作, 并将中药小分子及靶蛋白格式转换为pdbqt格式。利用Auto Dock Tools对预先转化为pdbqt格式的小分子和靶点蛋白进行对接模拟计算, 结合能小于0说明配体与受体可以在自然状态下结合, 结合能小于-5.0 kJ·mol^-1证明分子与靶点对接较好, 可作为药物治疗肝纤维化作用靶点的筛选依据。

含药血清制备 熬制中药, 按成人与大鼠体表面积换算法, 最终制备慈菇消脂方药液浓度为2.268 g·mL^-1。20只雌雄各半的SD大鼠, 随机分为两组, 空白组和中药组, 大鼠灌胃体积为1 mL/100 g。空白组给予等剂量生理盐水灌胃, 中药组给予中药灌胃, 每日早晚各一次, 连续给药1周, 最后一次给药1 h后, 无菌操作下, 于心脏处采用一次性抗凝真空采血管取全血。全血于4 ℃冰箱静置2 h, 以3 500 r·min^-1离心15 min后移液枪小心分离血清。同组混合分离的血清, 56 ℃水浴灭活30 min, 超净台上用0.22 μm微孔滤膜过滤, 保存备用于-20 ℃冰箱。课题组前期实验中, 通过CCK-8法筛选出中药慈菇消脂方对HSC-T6的最佳作用浓度为6%含药血清, 因此, 本实验中将上述除菌后的血清配制成10 mL含药血清浓度为6%的培养液备用(0.6 mL含药血清+ 0.4 mL胎牛血清+ 9 mL基础培养液)。

CoCl₂作用浓度与作用时间筛选 HSC-T6细胞悬液接种于96孔板中, 在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h, 待细胞完全贴壁后, 实验孔加入含不同浓度CoCl₂ (0、100、200、400、600、800 µmol·L^-1) 的完全培养基100 μL, 空白孔只加100 μL不含细胞的完全培养基, 每组3个复孔。培养板置于培养箱中分别孵育24和48 h后, 把10 μL WST-8试剂加入每孔, 再继续孵育2.5 h, 使用酶标仪在450 nm处测定吸光度(A) 值, 计算细胞活力。

细胞分组与模型制备 HSC-T6细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养液, 放置于37 ℃、5% CO₂、95% O₂、100%湿度的培养箱中培养, 在25.0 cm² (50 mL) 细胞培养瓶瓶底生长至90%时, 用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化做传代处理, 取5~8代对数期的细胞用于实验。细胞分为5组: 对照组、缺氧组、环巴胺组、YC-1组、6%含药血清组。对照组用正常培养基培养, 缺氧组依据参考文献^[9], 采用CoCl₂化学诱导缺氧法干预HSC-T6细胞, 依据CCK-8结果用100 µmol·L^-1 CoCl₂诱导缺氧24 h。各给药组(环巴胺组: 10 µmol·L^-1 Hh通路抑制剂环巴胺; YC-1组: 10 µmol·L^-1 HIF-1α特异性抑制剂YC-1; 含药血清组: 含6%慈菇消脂方血清) 预处理24 h后, 立即给予100 µmol·L^-1 CoCl₂进行缺氧处理24 h。

细胞划痕愈合率测定 用记号笔画“丰”字在6孔板的背面, 按2.5×10⁵个/孔接种HSC-T6细胞, 各组细胞在培养箱中培养24 h后, 用200 μL黄色枪头靠在尺子上, 垂直于培养板划痕, 保持同一强度, 划痕方向一致。PBS洗细胞3次, 去除划下的细胞, 加入无血清培养基, 放入37 ℃、5% CO₂培养箱培养, 分别在24和48 h取样, 拍照记录划伤区域, 观察细胞迁移, 并计算细胞划痕愈合百分比。

免疫荧光检测HSC-T6细胞中α-SMA的表达 将各组HSC-T6细胞接种于6孔板, 培养24 h后吸弃培养基, PBS洗3次, 每次5 min, 用4%多聚甲醛(PBS配制) 常温固定15 min, PBS洗爬片3次, 每次5 min。滴加3% BSA均匀覆盖细胞, 室温封闭30 min, 弃封闭液, 玻片上滴加200 μL稀释后的一抗(anti α-SMA兔来源, 1∶100), 置于湿盒中4 ℃冰箱孵育过夜。取出湿盒置于室温复温30 min。PBS洗3次, 加入适量稀释好的二抗放于湿盒中37 ℃孵育60 min。PBS洗3次, 每次5 min, 滴加DAPI孵育5 min, 对标本进行染核, 洗去多余的DAPI。最后在倒置荧光显微镜下观察并采集图像。

Western blot检测HSC-T6细胞中HIF-1α、α-SMA、Ptch-1和Gli-1的表达 收集各实验组细胞, 每孔加入0.5 mL RIPA组织裂解液, 提取各组细胞内总蛋白。根据蛋白定量试剂盒(BCA法) 说明书进行操作, 测定蛋白质浓度。取120 μg蛋白质样本加入30 μL 5× SDS加样缓冲液, 煮沸5 min上样。蛋白样品进行10% SDS-PAGE胶电泳2 h分离蛋白, 电泳电流恒为100 V。SDS-PAGE蛋白胶湿转2 h至PVDF膜; 用5%脱脂奶粉进行常温封闭3 h, 加入β-actin单克隆抗体、GAPDH抗体、Ptch1抗体、HIF-1α抗体、Gli1抗体、α-SMA抗体, 4 ℃过夜; TBST洗膜3次, 每次10 min, 分别加入HRP标记的二抗, 室温孵育1 h; TBST洗膜3次, 每次10 min, 加入ECL发光液显色, 压片显影。扫描摄取图像, 并采用Image J软件分析条带的灰度值, 以α-SMA与GAPDH灰度值的比值, HIF-1α、Ptch-1、Gli-1与β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量。

统计学分析 应用SPSS22.0统计软件, 组间采用单因素方差分析(one-way ANOVA), 多重比较采用最小二乘法(LSD检验), 统计结果以均数±标准差(x ± s) 表示, P < 0.05有统计学意义。

结果

收起

1 慈菇消脂方活性成分、靶点筛选及疾病靶点的收集

根据OB ≥ 30%且DL ≥ 0.18的标准, 从TCMSP数据库中检索得出慈菇消脂丸的活性成分共290个, 其中山慈菇3个, 茯苓15个, 柴胡17个, 党参21个, 薏苡仁9个, 黄芩36个, 枸杞子45个, 山楂9个, 何首乌4个, 甘草92个, 决明子14个, 半夏13个, 泽泻10个, 土鳖虫2个。去掉重复后, 共获得279个活性成分。利用TCMSP数据库查询活性成分靶点信息, 筛选出对应靶点275个。最后利用Uniprot数据库对靶点基因进行标准化, 获得靶点基因273个。表 1为慈菇消脂方中部分活性成分的基本信息。借助GeneCards及PharmGK数据库检索肝纤维化的靶点, 共得到5 259个靶点。运用Omicshare平台绘制韦恩图, 将慈菇消脂方活性成分对应的靶点与肝纤维化的靶点进行映射取交集, 共得到214个交叉靶点, 即为慈菇消脂方治疗肝纤维化的潜在作用靶点。

2 PPI网络构建与分析

将慈菇消脂方治疗肝纤维化的42个关键靶点导入到Cytoscape3.7.2软件中, 得到蛋白质相互作用网络(图 1)。通过网络拓扑分析发现HIF-1α、TP53、SERPINE1、CCND1、EGFR等靶点是慈菇消脂丸治疗肝纤维化的关键靶点。HIF-1α可刺激纤维化基因与炎症基因表达, 启动脂肪组织纤维化进程。

3 药物-成分-靶点网络的构建与分析

借助Cytoscape3.7.2软件构建药物-成分-靶点相互作用网络。根据节点度值等特性对核心节点进行筛选, 结果呈现出槲皮素、山柰酚、木犀草素、豆甾醇、汉黄芩素、柚皮素等活性成分在整个网络中发挥着关键作用, 可能是慈菇消脂丸治疗肝纤维化的核心成分。

4 GO富集分析和KEGG信号通路富集分析

将慈菇消脂方治疗肝纤维化的42个关键靶点基因官方名称输入到OmicShare平台中, 共得到GO富集条目4 848个, 其中包括4 124个BP、392个MF和332个CC, GO条目排名前10的数据进行柱状图的绘制(图 2)。慈菇消脂方主要参与对含氧化合物的反应、对含氧化合物的细胞反应、对脂质的反应、管发育、对化学刺激的细胞反应、对无机物的反应、对有机物质的细胞反应、分子功能的正向调节等生物学过程; 涉及细胞器内腔、胞内细胞器腔、泡腔、细胞质囊泡腔、分泌颗粒、分泌颗粒腔、胞质部分、内膜系统、细胞质囊泡部分等细胞组分; 参与酶结合、信号受体结合、同蛋白结合、转录因子结合、蛋白质二聚体活性、分子功能调节剂、蛋白激酶结合、磷酸酶结合、蛋白质异二聚体活性、生长因子受体结合等细胞功能。

KEGG筛选得到19条信号通路进行分析(图 3)。晚期糖基化产物-晚期糖基化终末产物受体(advanced glycosylation end products-receptor for advanced glycation end products, AGEs-RAGE) 信号通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt) 信号通路、HIF-1信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated prorein kinase, MAPK) 信号通路等在慈菇消脂方治疗肝纤维化中可能发挥重要作用。AGE-RAGE信号通路是一个和糖尿病及其并发症联系相当密切的通路, 可以激活并促进炎性反应、氧化应激, 最终导致胰岛素抵抗及糖尿病其他并发症的发生。PI3K-AKT信号通路广泛存在于各种生物细胞中, 介导包括细胞生长、存活和迁移、肿瘤形成和血管生成等多种过程。MAPK信号通路能够促进细胞增殖, 抗凋亡。HIF-1信号通路在缺氧条件下参与调节血管的生成、葡萄糖代谢及细胞的凋亡和自噬, 并参与调节多条信号通路。本研究主要探讨缺氧状态下中药慈菇消脂方对活化HSC-T6的抑制作用及其机制是否通过调控HIF-1α/Hh信号通路实现。

5 山慈菇活性成分与HIF-1α蛋白的分子对接与可视化

将degree值排名前5的活性成分进行对接打分(表 2)。对君药山慈菇活性成分豆甾醇和β-谷甾醇使用AutoDock软件进行分子对接。实验研究结果显示, 豆甾醇和β-谷甾醇均结合于原活性位点处, 并且2个配体小分子的对接构象与原晶体构象叠合时, 均方根偏差(RMSD) (通过pymol软件) 计算均小于2, 说明对接结果是相对可靠的。将以上对接结果利用pymol软件绘图(图 4)。

6 CoCl₂对HSC-T6细胞活力的影响

利用CCK-8试剂盒检测各组细胞增殖活力。与对照组比较, 100 µmol·L^-1 CoCl₂作用24 h细胞活力无显著变化, 200、400、600和800 µmol·L^-1 CoCl₂作用24 h细胞活力均显著下降(P < 0.05), 且具有浓度依赖性。不同浓度CoCl₂作用48 h后细胞活力均较正常对照组显著下降(P < 0.05)。根据CCK-8实验结果, 选择100 µmol·L^-1 CoCl₂作用24 h建立HSC-T6细胞缺氧模型(图 5)。

7 CoCl₂对HSC-T6细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验发现, 与对照组[(17.7 ± 1.2)%] 比较, 缺氧组[(31.7 ± 0.5)%] 细胞划痕治愈率明显增加, 差异具有统计学意义(P < 0.01)。与缺氧组比较, YC-1组[(23.6 ± 0.6)%]、环巴胺组[(28.3 ± 1.0)%]、6%含药血清组[(20.1 ± 0.9)%] 细胞划痕治愈率明显降低(P < 0.01)。与6%含药血清组比较, YC-1组、环巴胺组细胞划痕治愈率明显增加(P < 0.01), 表明慈菇消脂方能显著降低缺氧状态下HSC-T6细胞的划痕治愈率, 且作用优于Hh通路阻断剂和HIF-1α特异性拮抗剂(图 6)。

8 慈菇消脂方对HSC-T6细胞中α-SMA表达的影响

免疫荧光结果显示, 与正常对照组相比, 缺氧组α-SMA荧光表达上调(P < 0.01)。慈菇消脂方含药血清干预后, α-SMA荧光值显著下调(P < 0.01), YC-1和环巴胺干预后α-SMA荧光值则无明显差异, 表明缺氧能够活化HSC-T6细胞表达特异性标志物α-SMA, 而6%慈菇消脂方含药血清能抑制活化的HSC-T6细胞表达α-SMA (图 7)。

9 慈菇消脂方对HSC-T6细胞中HIF-1α、α-SMA、Ptch-1和Gli-1蛋白表达的影响

与对照组比较, 缺氧组HIF-1α、α-SMA、Ptch-1和Gli-1蛋白表达上调(P < 0.05); 与缺氧组比较, YC-1组、环巴胺组、6%含药血清组HIF-1α、α-SMA、Ptch-1和Gli-1蛋白表达均显著下调(P < 0.01); 与6%含药血清组比较, 缺氧+YC-1组Ptch-1蛋白表达上调(P < 0.05), 表明缺氧能诱导活化HSC-T6表达α-SMA和HIF-1α, 缺氧能激活HSC-T6中HIF-1α/Hh信号通路, HIF-1α抑制剂YC-1能下调Hh信号通路相关蛋白表达, 抑制HSC-T6细胞活化, 经6%慈菇消脂方含药血清干预后, HIF-1α、α-SMA、Ptch-1和Gli-1蛋白表达均显著下调, 提示含药血清可能通过调控HIF-1α/Hh信号通路抑制HSC-T6细胞活化, 从而发挥抗肝纤维化作用(图 8)。

讨论

收起

慈菇消脂方属于院内制剂, 整体组方以解毒化痰、消脂降浊为主。君药山慈菇, 具有清热解毒、化痰祛瘀的功效, 主治痈肿疔毒、瘰历结核等症。在我国, 山慈菇常与其他中药配伍治疗恶性肿瘤以及抗痛风治疗^{[10, 11]}。肝纤维化属中医“胁痛”、“黄疽”、“积聚”等范畴。目前普遍认为肝纤维化生成的主要病因病机为湿热瘀毒。课题组前期的临床研究和基础研究^{[12, 13]}均表明该方具有一定降脂、抗肝纤维作用, 但其主要活性成分和作用靶点及具体机制尚不完全清楚。

CADD是以计算机为工具的一种研究中药复方的重要手段, 其根据配体-受体相互作用的原理, 通过各种理论计算方法以及分子构象模拟技术, 再根据数据库中收录的大量活性化合物构效关系的数据, 预测出具有药效的先导化合物。运用分子对接技术快速预测出中药有效成分的作用靶点, 有助于科学合理地解释传统中药的作用机制。本研究参考李梢《网络药理学评价方法指南》^[14], 对慈菇消脂方进行网络药理学分析。研究结果表明, 慈菇消脂方包含活性成分279个、成分靶点275个及关键靶点42个; GO功能富集分析获得4 848个条目, KEGG通路富集分析筛选得到19条信号通路。慈菇消脂方治疗肝纤维化具有多成分、多靶点、多途径相互作用的特点。分析药物-成分-靶点网络, 显示槲皮素、山柰酚、柚皮素、木犀草素、豆甾醇、汉黄芩素等活性成分在整个网络中发挥着关键作用。通过网络拓扑分析发现HIF-1α、TP53、SERPINE1、CCND1、EGFR等靶点是慈菇消脂丸治疗肝纤维化的关键靶点。HIF-1α可刺激纤维化基因与炎症基因表达, 启动脂肪组织纤维化进程^[15]; TP53能调节细胞周期和避免细胞癌变发生; EGFR可调节细胞的增殖、分化、迁移与存活等多种生物学过程^[16]。君药山慈菇主要活性成分为豆甾醇和β-谷甾醇, 通过分子对接技术预测, 均可与HIF-1α结合。

研究表明, HIF-1α在HSC活化中发挥着重要作用^[17]。体外实验研究发现, 低氧分压、CoCl₂和脂多糖等因素能通过诱导HIF-1α合成促进HSC的活化^[18]。但是随着缺氧时间的延长, HIF-1α的表达水平不断提高, HSC的凋亡水平也不断提高^[19]。HIF-1α亦能通过激活MAPK-mTOR信号通路, 诱导HSC发生自噬现象^[20]。Hh信号通路是胚胎期肝脏形成与形态发生有关的一个重要路径, 在各种类型的肝脏损伤中也扮演重要的角色^{[21, 22]}。Hh信号通路通过促进EMT参与肝脏、肺脏、肾脏等多种脏器纤维化进展^[23]。Grenz等^[24]在小鼠缺氧模型中发现Hh信号通路在缺氧条件下可被激活, 并证实Hh为HIF-1α的下游基因。在人的小肠上皮细胞中, 在缺氧情况下Hh信号通路中Gli1表达增加^[25]。本研究发现, 在CoCl₂诱导的HSC-T6缺氧模型中, HIF-1α表达水平明显升高, HSC-T6活性增加, 慈菇消脂方处理后, HIF-1α表达水平明显下降, HSC-T6活性减低。HIF-1α抑制剂YC-1干预后, HSC-T6活性减低, Hh信号转导通路相关蛋白表达下调。

综上所述, 本研究证实慈菇消脂方含药血清可抑制缺氧状态下HSC的活性, 从而减少细胞外基质的生成和纤维化。利用计算机预测并验证HIF-1α为慈菇消脂方的主要作用靶点, 其机制可能通过HIF-1α参与抑制Hh信号通路相关蛋白表达而发挥作用, 研究结果初步阐述慈菇消脂方抗肝纤维化的作用机制, 为其开发应用及NAFLD的防治提供了一定的思路。

作者贡献: 马燕花负责实验设计、指导, 论文修改; 任真负责论文的生物信息学分析、数据分析和撰写论文; 尹硕负责论文的整体实验; 王爱娣、王莉、赵秀萍参与实验实施。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

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国家自然科学基金资助项目(81860821)

参考文献

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文献

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2023年第58卷第10期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1206

接收时间：2022-11-10
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-10-12

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收稿日期：2022-11-10
修回日期：2023-04-10

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国家自然科学基金资助项目(81860821)

作者信息

甘肃中医药大学, 甘肃兰州 730000

通讯作者:

*马燕花, Tel: 13893411954, E-mail: 617747928@qq.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Mol ID	Compound	OB/%	DL	Drug
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