药学学报

紫金牛中一个新颖底物杂泛性O-甲基转移酶

PDF下载

刘琦 ¹^,^# , 闫锐琪 ¹^,^# , 谢冰寒 ¹ , 隋颂扬 ² , 解可波 ² , 戴均贵 ²^,^* , 杨林 ¹^,^*

药学学报 | 研究论文 2023,58(5): 1372-1382

收起

药学学报 | 研究论文 2023, 58(5): 1372-1382

紫金牛中一个新颖底物杂泛性O-甲基转移酶

全屏

刘琦¹^,^#, 闫锐琪¹^,^#, 谢冰寒¹, 隋颂扬², 解可波², 戴均贵²^,^*, 杨林¹^,^*

作者信息

1.中央民族大学生命与环境科学学院, 北京 100081

2.中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 中国医学科学院酶与天然药物生物催化重点实验室, 国家卫生健康委员会天然药物生物合成重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

*戴均贵, jgdai@imm.ac.cn;

杨林, E-mail: 15116995486@163.com

A novel O-methyltransferase with substrate promiscuity from Ardisia japonica

Qi LIU¹, Rui-qi YAN¹, Bing-han XIE¹, Song-yang SUI², Ke-bo XIE², Jun-gui DAI²^,^*, Lin YANG¹^,^*

Affiliations

1. College of Life and Environmental Sciences, Minzu University of China, Beijing 100081, China

2. State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, CAMS Key Laboratory of Enzymes and Natural Drug Biocatalysis, NHC Key Laboratory of Natural Drug Biosynthesis, Institute of Materia Medica, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

出版时间: 2023-05-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1102

文章导航

摘要

收起

O-甲基转移酶(O-methyltransferases, OMTs) 是许多天然产物生物合成途径中的关键后修饰酶之一, O-甲基化不仅可降低化合物的化学反应活性, 而且能显著改善其溶解性、稳定性等理化性质和生物活性等。本研究根据紫金牛转录组测序结果, 首次从紫金牛中克隆获得1条OMT基因(命名为AjOMT1), 并成功进行了大肠杆菌异源表达, 体外酶催化活性结果表明重组AjOMT1能高效催化槲皮素发生O-甲基化反应。底物谱考察结果表明, AjOMT1能催化黄酮类、茋类、香豆素类、生物碱类、苯丙素类等不同结构类型的化合物进行甲基化反应, 具有非常宽泛的底物谱; AjOMT1偏好于具邻二酚羟基的化合物, 并表现出位置选择性。本研究结果表明, AjOMT1可用作O-甲基化工具酶实现不同类型化合物的O-甲基化、获取多样化的活性甲基化产物, 可为药物发现提供新方法, 并可为天然产物合成生物学研究提供普适性元件。

关键词

紫金牛 / O-甲基转移酶 / O-甲基化 / 底物杂泛性 / 位置选择性

Abstract

收起

O-methyltransferases (OMTs) are one of the key tailoring enzymes in the biosynthesis of many natural products, O-methylation can not only reduce the reactivity of natural products, but also alter their solubility, stability and biological activities. Based on the transcriptome data of Ardisia japonica, a full-length cDNA sequence of candidate OMT (termed as AjOMT1) was cloned by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and expressed in Escherichia coli (E. coli) for the first time. In vitro enzyme catalytic activity assay showed that the recombinant AjOMT1 could effectively catalyze quercetin to form O-methylated products. Most importantly, AjOMT1 showed unprecedented substrate promiscuity towards structurally various compounds including flavonoids, stilbenes, coumarins, alkaloids and phenylpropanoids, especially preferring to the compounds with adjacent phenolic hydroxyl groups, and showed regio-selectivity. These results suggested that AjOMT1 could be used as the tool enzyme to conduct O-methylation of different types of compounds to produce diverse active methylated products, and provide a new method for drug discovery, even universal part for synthetic biology of natural products.

Key words

Ardisia japonica / O-methyltransferase / O-methylation / substrate promiscuity / regio-selectivity

引用本文

刘琦, 闫锐琪, 谢冰寒, 隋颂扬, 解可波, 戴均贵, 杨林. 紫金牛中一个新颖底物杂泛性O-甲基转移酶. 药学学报, 2023 , 58 (5) : 1372 -1382 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1102

Qi LIU, Rui-qi YAN, Bing-han XIE, Song-yang SUI, Ke-bo XIE, Jun-gui DAI, Lin YANG. A novel O-methyltransferase with substrate promiscuity from Ardisia japonica[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2023 , 58 (5) : 1372 -1382 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-1102

正文

收起

甲基转移酶(methyltransferases, MTs) 是一类广泛分布于生物体中的重要酶, 在基因的表达调控和许多天然产物的生物合成中起着至关重要的作用^[1]。甲基转移酶通常以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosy-L-methionine, SAM) 作为甲基供体, 催化生物体内蛋白质等大分子及小分子化合物的甲基化反应, 形成相应的甲基化产物。甲基化是天然产物最基本、最主要的后修饰反应之一, 在丰富天然产物分子多样性方面起着重要作用。根据甲基受体分子中与甲基直接相连原子的不同, 将MTs分为O、C、N、S-甲基转移酶, 其中O-甲基转移酶(OMTs) 是甲基转移酶家族中数量最多的一类, 约占总数的54%^[1]。O-甲基化修饰可提高天然产物的结构稳定性、在人体内的转运能力、蛋白的亲和力和生物利用度, 降低其水溶性等, 从而增强其药理活性^[2-5]。研究证实, 一些O-甲基化天然产物具有更强的抗癌、抗炎、抗氧化等功能^[6-8]。

紫金牛(Ardisia japonica) 为紫金牛科紫金牛属植物, 分布于陕西及长江流域以南各省区, 是我国民间常用中草药, 具有止咳、祛痰、凝血、抗病毒等药理活性^[9]。迄今为止, 从紫金牛中分离得到多个具有显著药理活性的O-甲基取代化合物, 如岩白菜素、三甲氧基异岩白菜素^[10]、ardimerin^[9]、ardisinanone A、maesanin、ardisinanone B^[11]等均具有1~3个不等的O-甲基基团。此外, 印度学者从同属植物A. floribunda中分离得到5, 6, 2′, 3′, 4′-五甲氧基黄酮和5, 6, 3′, 4′-四甲氧基黄酮^[12]。上述化合物提示紫金牛属植物中可能存在着多个新颖的OMTs, 但至今尚无紫金牛属植物甲基转移酶的报道。因此, 为了寻找新颖催化特点、宽泛底物谱的OMTs, 获得O-甲基化工具酶用于活性化合物的酶-化学法合成与结构优化, 本研究对紫金牛中的甲基转移酶进行挖掘并对其催化特性进行深入研究。通过转录组分析, 从紫金牛中成功克隆并鉴定了1个新颖O-甲基转移酶(命名为AjOMT1), 并对AjOMT1的底物谱进行了系统性研究。

材料与方法

收起

材料实验所用新鲜植物材料采自福建省厦门市, 经本研究作者之一杨林鉴定为紫金牛(A. japonica)。样品冲洗干净, 经液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱。

菌株和质粒 E. coli Trans1-T1感受态细胞、E. coli Transetta (DE3) 感受态细胞、pET-28a (+) 表达载体(Sigma公司)。

试剂底物槲皮素、山柰酚、杨梅素、染料木素、芹菜素、黄芩素、香橙素、圣草酚、根皮素、5, 7-二羟基香豆素、6, 7-二羟基香豆素、咖啡酸、白藜芦醇、白皮杉醇、3, 5, 3′, 4′-四羟基联苄、去甲乌药碱、去亚甲基小檗碱(北京伊诺凯科技有限公司); SAM、色谱甲醇、色谱甲酸、色谱乙腈(Sigma公司); 咪唑、碳酸钠、碳酸氢钠、十二水合磷酸氢二钠、氯化钠(上海生工公司), 其他试剂均为市售分析纯; 镍柱填料Ni Sepharose 6 Fast Flow (GE公司); KOD-Plus-Neo DNA polymerase (Toyobo公司); E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit (Omega Bio-Tek公司); TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Sythesis Super Mix反转录试剂盒(北京全式金生物技术公司); SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit (Clontech公司); 限制性内切酶Sal I、Nde I (Takara公司); ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit (Vazyme公司); 2× Es Taq Master Mix (北京康为世纪生物科技有限公司); 质粒小量制备试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(上海捷瑞生物工程有限公司)。

仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪(Agilent Technologies公司) 用于HPLC (high performance liquid chromatography) 分析; LCQ-Fleet Ion Trap MS (Thermo Scientific公司) 用于LC/MS (liquid chromatograph mass spectrometer) 分析; 分析柱Shiseido CAPCELL PAK ADME column (250 mm × 4.6 mm I.D., 5 μm)、半制备柱Shiseido CAPCELL PAK CR色谱柱(250 mm × 10 mm I.D., 5 μm, 日本Shiseido公司); Mercury-400核磁共振仪(Varian公司)。

测序与生物信息学分析 转录组测序由华大基因公司完成; 基因测序与引物合成分别由上海生工公司、擎科公司完成; 利用NCBI (National Center for Biotechnology Information) 在线分析AjOMT基因的开放阅读框和同源性; 利用ExPASy-ProtParam tool序列信息分析蛋白的理化性质; 利用软件TMHMM 2.0进行蛋白质跨膜结构分析; 系统进化分析通过MEGA 7.0完成; 引物设计通过Primer Design软件完成。

总RNA提取及cDNA合成 以紫金牛植株上新鲜幼叶为总RNA提取的材料。按照E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit操作说明进行总RNA提取, 用1%非变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。使用TransScript Ⅱ First-Strand cDNA Sythesis Super Mix反转录试剂盒进行反转录, 得到cDNA。

候选基因的克隆 分析紫金牛转录组测序数据, 发现了1条具有完整开放阅读框的AjOMT基因, 依据该序列设计带有酶切位点的特异性引物[FP: 5′-GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCAACAAATGGTGAGAAC-3′, RP: 5′-GGCCGCAAGCTTGTCGATTAGCTAACGCGACGGCAGATAG-3′; 下划线的序列是与pET-28a (+) 表达载体重复的序列]。以获得的紫金牛cDNA为模板, 结合所设计合成的引物, 使用KOD-Plus-Neo高保真酶进行目的基因的PCR扩增, 扩增体系为: 10× KOD Plus Buffer 5 μL、dNTPs (2 mmol·L^-1) 5 μL、MgSO₄ (25 mmol·L^-1) 3 μL、正向和反向引物(10 μmol·L^-1) 各1 μL、cDNA 1 μL、KOD-Plus-Neo 1 μL、双蒸水补足至50 μL。反应条件为: 94 ℃预变性2 min; 98 ℃、10 s, 55 ℃、30 s, 68 ℃、50 s进行35个循环, 程序循环结束后68 ℃延伸反应10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, 切胶回收。将回收后的PCR产物连入原核表达载体pET-28a (+), 转化Trans1-T1感受态细胞, 涂布于含卡那霉素的LB固体培养基上于37 ℃过夜培养, 挑选阳性菌落抽提质粒进行测序验证。

AjOMT1的异源表达和蛋白纯化 经测序验证后的pET-28a-AjOMT1质粒转入Transetta (DE3) 表达感受态宿主细胞, 挑选阳性菌落接种到含卡那霉素和氯霉素的新鲜液体LB培养基中, 在37 ℃、200 r·min^-1下过夜活化。将活化后的菌液按1∶100比例加入含卡那霉素和氯霉素的新鲜LB液体培养基中, 在37 ℃、200 r·min^-1下培养至菌液A₆₀₀为0.6, 加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylthio-β-D-galactoside, IPTG) 至终浓度为0.2 mmol·L^-1, 于16 ℃、200 r·min^-1下诱导重组蛋白进行原核表达, 18 h后, 于4 ℃、8 000 ×g下离心收集菌体。于结合缓冲液[20 mmol·L^-1 pH 7.4磷酸缓冲液(PBS)、500 mmol·L^-1 NaCl、25 mmol·L^-1咪唑] 中超声破碎提取, 将细胞破碎后离心得到的上清液用0.45 µm滤膜过滤后, 上样至预先平衡好的镍柱。先用结合缓冲液洗脱除去杂蛋白, 后依次以含50、100、250、500 mmol·L^-1咪唑的洗脱缓冲液(20 mmol·L^-1 pH 7.4 PBS、500 mmol·L^-1 NaCl) 洗脱目的蛋白。目的蛋白经超滤管(30 kDa) 离心浓缩脱盐后, 于脱盐缓冲液(50 mmol·L^-1 Tris-HCl、50 mmol·L^-1 NaCl、1 mmol·L^-1二硫苏糖醇、1%甘油, pH 7.4) 中-80 ℃保存备用。

重组AjOMT1体外催化活性测定 以SAM为甲基供体, 槲皮素(1) 为甲基受体, 考察重组AjOMT1的体外催化活性。反应体系为: 槲皮素(40 mmol·L^-1) 1 μL、SAM (40 mmol·L^-1) 2 μL、MgCl₂ (40 mmol·L^-1) 2.5 μL、纯化蛋白200 µg、Tris-HCl buffer (pH 7.4, 50 mmol·L^-1) 补足至100 μL。在37 ℃下反应6 h, 用100 μL冷甲醇终止反应, 15 000 ×g下离心30 min, 上清液用于HPLC和LC/MS检测。流动相为乙腈(A相) 和含0.1%体积分数甲酸的水(B相), 使用如下梯度洗脱方法: 15%~100% A 30 min梯度洗脱, 流速为1.0 mL·min^-1。进样体积为10 μL, 紫外检测波长为254 nm。质谱分析条件: 电喷雾离子源(ESI), 扫描模式为正、负离子同时扫描并自动触发多级质谱, 参数为: 鞘气流速, 20 (arbitrary units); 辅助气流速, 5 (arbitrary units); 喷雾电压, 5 000 V; 毛细管温度, 350 ℃; 碰撞诱导解离(CID) 电压, 35 V。

重组AjOMT1酶学性质研究 以SAM为甲基供体, 槲皮素(1) 为甲基受体, 考察不同pH缓冲液、反应温度、二价金属离子条件下对AjOMT1纯酶催化甲基化反应活性的影响。除加入纯化蛋白的量为50 µg、反应时间为30 min外, 反应体系和反应条件同上。考察不同pH缓冲液对酶催化反应活性影响时, 将反应体系中的缓冲液置换成相应不同pH的缓冲液[pH 5.0~6.0, 50 mmol·L^-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液; pH 6.0~7.0, 50 mmol·L^-1磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液; pH 7.0~9.0, 50 mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl) 缓冲液; pH 9.0~11.0, 50 mmol·L^-1碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液]; 考察温度对酶催化反应活性影响时, 将反应体系(用pH 8.0的50 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液补足至100 μL) 放入不同温度(20、30、40、50、60 ℃) 下进行反应; 考察不同金属离子对酶催化反应活性影响时, 将反应体系中MgCl₂换成不同的二价金属离子(BaCl₂、SnCl₂、SrCl₂、FeCl₂、CaCl₂、ZnCl₂、CuCl₂、NiSO₄、MnCl₂), 以终浓度为1 mmol·L^-1的金属离子螯合剂EDTA作为对照, 反应体系用pH 8.0的50 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液补足至100 μL, 在40 ℃下反应。分别加入两倍体积的冷甲醇终止反应, 于15 000 ×g离心30 min后取上清液用于HPLC-UV检测。每组反应设置3个平行, 底物的转化率通过HPLC谱图中峰面积的比值来估算, 酶的催化效率以对应条件下底物的转化率表示。

AjOMT1催化槲皮素(1) 生成甲基化产物的表观米氏常数(K_m) 与酶最大反应速率(V_max) 的测定(每组设置3个平行): 酶促反应的总体积为100 μL, 固定SAM终浓度800 μmol·L^-1, Mg²⁺终浓度为1 000 μmol·L^-1, 底物槲皮素浓度梯度分别设置为40、100、200、400、800、1 000、2 000、3 000、4 000 μmol·L^-1, 反应缓冲液为pH 8.0的50 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液, 10 μg AjOMT1, 40 ℃下反应10 min。反应后处理及分析条件同上。

重组AjOMT1催化受体底物谱考察 除槲皮素(1) 外, 同时选取16种不同类型的化合物, 对AjOMT1底物杂泛性进行系统探究。底物分别为: 黄酮类化合物[山柰酚(2)、杨梅素(3)、染料木素(4)、芹菜素(5)、黄芩素(6)、香橙素(7)、圣草酚(8)、根皮素(9)]、香豆素类化合物[5, 7-二羟基香豆素(10)、6, 7-二羟基香豆素(11)]、苯丙素类化合物[咖啡酸(12)]、茋类化合物[白藜芦醇(13)、白皮杉醇(14)、3, 5, 3′, 4′-四羟基联苄(15)]、苄基异喹啉生物碱类[去甲乌药碱(16)、去亚甲基小檗碱(17)]。反应体系为: 底物(40 mmol·L^-1) 1 μL、SAM (40 mmol·L^-1) 2 μL、MgCl₂ (40 mmol·L^-1) 2.5 μL、纯化蛋白150 μg、Tris-HCl缓冲液(pH 7.4, 50 mmol·L^-1) 补足至100 μL。在37 ℃下水浴反应6 h, 反应后处理同上。流动相使用乙腈(A相) 和含0.1%体积分数甲酸的水(B相), 不同底物反应后的分析条件为: 底物1~11和13, 15%~100% A 30 min梯度洗脱; 底物12, 20%~30% A 30 min梯度洗脱; 底物14和15, 5%~100% A 30 min梯度洗脱; 底物16和17, 10%~100% A 30 min梯度洗脱。流速为1.0 mL·min^-1, 进样体积均为10 μL。

产物的酶法合成、分离与结构鉴定 利用AjOMT1的纯酶液进行放大酶促反应并制备代表性底物的甲基化产物。反应体积为150 mL, 包括: 0.5 mmol·L^-1 SAM、0.5 mmol·L^-1 MgCl₂、280 mg纯酶、50 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液(pH 8.0), 底物加入量因底物不同在10~25 mg不等。于40 ℃水浴振荡反应12 h, 后用2倍体积的乙酸乙酯萃取5次, 将有机相减压浓缩至干, 用1~2 mL甲醇溶解, 0.45 µm滤膜过滤, 乙腈/水作为流动相进行反相半制备HPLC分离, 产物经MS、¹H NMR (nuclear magnetic resonance) 和¹³C NMR分析确定结构, 如引入甲基的数目及位置等。

结果与分析

收起

1 AjOMT1的克隆与系统进化树分析

分析挖掘紫金牛转录组测序结果, 获得一条具有完整开放阅读框的OMT基因, 以紫金牛幼叶的cDNA为模板, 利用带有pET-28a (+) 同源臂的PCR引物, 通过RT-PCR扩增目的基因全长并将PCR产物连接到pET-28a (+) 载体上, 测序结果经过NCBI的BLAST比对分析, 确定该扩增产物为具有完整开放阅读框的OMT基因, 命名为AjOMT1 (GenBank accession number OP621325), 其序列长度为735 bp, 编码245个氨基酸。

将紫金牛候选甲基转移酶AjOMT1氨基酸序列与植物中已报道的甲基转移酶的进行OMT系统进化树的构建与聚类分析(图 1)。从图 1可看出, 来源于植物的29个OMT氨基酸序列被划分为2个主支, 从上到下分别为Type Ⅰ OMT (即咖啡酸氧甲基转移酶, caffeic acid O-methyltransferase, COMT)、Type Ⅱ OMT (即咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶, caffeoyl-CoA O-methyltransferase, CCOMT)。AjOMT1与柑橘(Citrus reticulata) 的CrOMT1蛋白系统进化关系非常接近, 氨基酸序列一致性为71%, 同属于Type Ⅱ OMT。CrOMT1具有催化含有邻二酚羟基黄酮形成多O-甲基化产物的特性^[13], 因此, 推测AjOMT1可能具有催化天然产物O-甲基化的活性。

2 AjOMT1的原核表达与重组AjOMT1体外催化活性测定

将成功构建的AjOMT1与pET-28a (+) 重组质粒转化到Transetta (DE3) 表达感受态宿主细胞中, 通过诱导表达及蛋白纯化获得了纯度较高的重组AjOMT1, SDS-PAGE分析显示, 在27 kDa附近出现目标蛋白条带, 提示AjOMT1成功表达(图 2)。

以SAM为甲基供体, Mg²⁺为辅助因子, 以槲皮素(1) 为甲基受体进行体外酶促反应(图 3)。HPLC-UV/MS分析显示, 重组AjOMT1可高效催化槲皮素(1) 产生两个新的产物峰1a (转化率为95.5%)、1b (转化率为2.7%) (图 3A、B), 且较底物的保留时间长。一级质谱显示1a分子质量较底物的分子质量增加14 amu (图 3C), 推测1a为底物1的单甲基化产物。为了进一步确定1a的结构及AjOMT1的催化特点, 通过放大反应制备获得了1a, 并经NMR分析鉴定产物1a结构为槲皮素3′-甲醚。产物1b的分子质量较底物的分子质量增加28 amu (图 3D), 表明1b为底物1的双甲基化产物(因产率低未能制备)。以上结果表明, AjOMT1对槲皮素(1) 具有较强的位置选择性3′-O-甲基化能力。

3 重组AjOMT1酶学性质研究

进一步以槲皮素(1) 作为甲基化受体底物对AjOMT1的酶学性质及酶动力学进行了系统研究(图 4)。AjOMT1在pH 6.0~9.0均具有甲基化活性, pH 8.0时活性最强(图 4A); AjOMT1在反应温度20~40 ℃时随温度的升高活性逐渐增强, 40 ℃时活性最强(图 4B); 在二价金属离子中, Mg²⁺、Ba²⁺、Sn²⁺、Sr²⁺、Fe²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺可促进AjOMT1催化槲皮素(1) 甲基化反应活性, 其中以Mg²⁺最强, 而Cu²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺则完全抑制其活性(图 4C)。酶动力学考察结果显示, AjOMT1对槲皮素(1) 甲基化的K_m值为355.7 μmol·L^-1, V_max值为390.9 nmol·min^-1·mg^-1 (图 4D)。

4 重组AjOMT1酶底物杂泛性研究

为考察AjOMT1体外酶底物杂泛性, 选取了多种不同结构类型的17种化合物(图 5A), 包括黄酮类(1~9)、香豆素类(10、11)、苯丙素类化合物(12)、茋类(13~15)、生物碱类(16、17) 对重组AjOMT1催化底物谱进行系统性的研究和评价。重组AjOMT1在体外底物筛选中表现出很强的甲基化能力, 在本研究筛选范围内, 能对17个化合物中的14个包括5种结构类型的化合物进行O-甲基化反应(图 5B), 具有较强的底物杂泛性。该酶不仅能催化底物产生1~2个不同位点的mono-O-甲基化产物, 甚至能催化有些底物产生di-O-甲基化产物(1、3、6、8、14、17)、tri-O-甲基化产物(3、8)。AjOMT1表现出较高的催化效率, 对8个化合物(1、3、6、11、14~17) 的O-甲基化活性大于50%, 这些化合物的类型包括黄酮类(1、3、6)、香豆素类(11)、茋类(14、15)、生物碱类(16、17)。另外对黄酮类(8) 和苯丙素类(12) 化合物表现出中等强度的催化活性(图 6、7)。

为进一步明确及系统性评价AjOMT1催化功能及催化特点, 通过放大酶促反应对部分甲基化产物进行合成、分离和纯化, 并通过质谱和核磁分析确定了产物的结构, 尤其是甲基化位置。通过比对相同骨架结构化合物的羟基位置和参照制备的甲基化产物的甲基位点, 可看出重组AjOMT1对于含有邻二酚羟基的化合物具有较强的催化活性, 而对具有间位酚羟基的化合物则催化活性较弱(2、4、5和13) 或不具有催化活性(7、9和10)。AjOMT1催化杨梅素(3) 形成tri-O-甲基化的主产物杨梅素3′, 4′, 5′-三甲醚(3c), 进一步证明AjOMT1具有催化含有邻二酚羟基的化合物形成多O-甲基化产物的特性。除化合物16为底物时其甲基化产物仅有1个外, AjOMT1可催化其他含有邻二酚羟基的化合物生成2~4个甲基化产物, 但以一种甲基化产物为主, 表明该酶促反应具有位置选择性。

5 结构鉴定

槲皮素3′-甲醚(isorhamnetin, 1a, 2.0 mg): ESI-MS (m/z) 317.29 [M+H]⁺. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 7.56 (1H, brs, Н-2′), 7.46 (1H, brd, J = 8.4 Hz, Н-6′), 6.91 (1H, d, J = 8.4 Hz, Н-5′), 6.41 (1Н, brs, Н-8), 6.19 (1Н, brs, Н-6), 3.83 (3Н, s, СН₃О); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ 175.8 (C-4), 164.0 (C-7), 160.6 (C-5), 156.3 (C-9), 148.7 (C-2), 147.4 (C-3′), 146.0 (C-4′), 135.5 (C-3), 122.2 (C-1′), 121.4 (C-6′), 115.6 (C-5′), 111.6 (C-2′), 102.3 (С-10), 98.7 (C-6), 93.8 (C-8), 55.7 (СН₃О)^[14]。

杨梅素3′, 4′, 5′-三甲醚(ferrugin, 3c, 2.2 mg): ESI-MS (m/z) 361.49 [M+H]⁺. ¹H NMR (MeOD-d₄, 400 MHz) δ 7.31 (2H, brs, Н-2′, 6′), 6.51 (1Н, brs, Н-8), 6.27 (1Н, brs, Н-6), 3.89 (3Н, s, 4′-СН₃О), 3.86 (6Н, s, 3′-СН₃О, 5′-СН₃О); ¹³C NMR (MeOD-d₄, 100 MHz) δ 177.6 (C-4), 167.2 (C-7), 162.2 (C-5), 158.1 (C-9), 151.7 (C-3′, 5′), 147.4 (C-2), 138.6 (C-4′), 138.3 (C-3), 128.0 (C-1′), 108.8 (C-2′, 6′), 105.1 (С-10), 98.5 (C-6), 94.4 (C-8), 60.8 (4′-СН₃О), 56.4 (3′-СН₃О, 5′-СН₃О)^[15]。

千层纸素A (oroxylin A, 6a, 3.6 mg): ESI-MS (m/z) 285.39 [M+H]⁺. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 8.05 (2H, brd, J = 8.0 Hz, Н-2′, 6′), 6.58 (3H, m, Н-3′, 5′), 6.94 (1Н, s, Н-3), 6.62 (1Н, s, Н-8), 3.75 (3Н, s, СН₃О); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ 182.0 (C-4), 163.4 (C-2), 157.6 (C-7), 152.8 (C-5), 152.7 (C-9), 131.9 (C-4′), 131.7 (C-1′), 130.8 (C-6), 129.1 (C-3′, 5′), 126.4 (C-2′, 6′), 104.6 (C-3), 104.4 (С-10), 94.6 (C-8), 59.8 (СН₃О)^[16]。

异东莨宕亭(isoscopoletin, 11a, 3.7 mg): ESI-MS (m/z) 193.13 [M+H]⁺. ¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 7.60 (1H, d, J = 9.2 Hz, Н-4), 6.97 (1Н, s, Н-5), 6.83 (1Н, s, Н-8), 6.29 (1H, d, J = 9.2 Hz, Н-3), 3.98 (3Н, s, СН₃О); ¹³C NMR (CDCl₃, 100 MHz) δ 161.6 (C-2), 150.2 (C-9), 149.4 (C-7), 143.5 (C-4), 142.8 (C-6), 114.1 (C-3), 112.4 (C-10), 111.2 (C-5), 99.5 (С-8), 56.6 (СН₃О)^[17]。

东莨宕亭(scopoletin, 11b, 11.4 mg): ESI-MS (m/z) 193.12 [M+H]⁺. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 7.91 (1H, d, J = 9.2 Hz, Н-4), 7.21 (1Н, s, Н-5), 6.78 (1Н, s, Н-8), 6.21 (1H, d, J = 9.2 Hz, Н-3), 3.81 (3Н, s, СН₃О); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ 160.7 (C-2), 151.1 (C-9), 149.5 (C-7), 145.2 (C-6), 144.5 (C-4), 111.7 (C-3), 110.5 (C-10), 109.6 (C-5), 102.8 (С-8), 56.0 (СН₃О)^[18]。

丹叶大黄素(rhapontigenin, 14a, 12.4 mg): ESI-MS (m/z) 259.29 [M+H]⁺. ¹H NMR (acetone-d₆, 400 MHz) δ 7.22 (1H, d, J = 2.0 Hz, Н-2′), 7.02 (1H, d, J = 16.2 Hz, Н-α), 7.01 (1H, dd, J = 8.4, 2.0 Hz, Н-6′), 6.92 (1H, d, J = 16.2 Hz, Н-β), 6.82 (1H, d, J = 8.4 Hz, Н-5′), 6.54 (2H, J = 2.0 Hz, Н-2, 6), 6.28 (1Н, t, J = 2.0 Hz, Н-4), 3.89 (3Н, s, СН₃О); ¹³C NMR (Acetone-d₆, 100 MHz) δ 159.6 (C-3, 5), 148.6 (C-3′), 147.5 (C-4′), 140.8 (C-1), 130.4 (C-1′), 129.4 (C-β), 127.0 (C-α), 121.2 (C-6′), 115.9 (C-5′), 110.1 (С-2′), 105.6 (C-2, 6), 102.7 (C-4), 56.2 (СН₃О)^[19]。

3′-甲氧基-3, 5, 4′-三羟基联苄(tristin, 15a, 8.1 mg): ESI-MS (m/z) 261.21 [M+H]⁺. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 6.72 (1H, d, J = 2.0 Hz, Н-2′), 6.65 (1H, d, J = 8.0 Hz, Н-5′), 6.58 (1H, dd, J = 8.0, 2.0 Hz, Н-6′), 6.06 (2H, J = 2.0 Hz, Н-2, 6), 6.02 (1Н, t, J = 2.0 Hz, Н-4), 3.72 (3Н, s, СН₃О), 2.65 (4H, m, Н-α, β); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ 158.2 (C-3, 5), 147.3 (C-3′), 144.5 (C-4′), 143.7 (C-1), 132.5 (C-1′), 120.4 (C-6′), 115.2 (C-5′), 112.6 (С-2′), 106.4 (C-2, 6), 100.1 (C-4), 55.5 (СН₃О), 37.6 (C-α), 36.6 (C-β)^[20]。

乌药碱(coclaurine, 16a, 4.0 mg): ESI-MS (m/z) 286.23 [M+H]⁺. ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 9.47 (1H, s, OH), 8.98 (1H, s, OH), 7.09 (2H, d, J = 8.0 Hz, Н-2′, 6′), 6.73 (2H, d, J = 8.0 Hz, Н-3′, 5′), 6.72 (1H, s, Н-5), 6.54 (1Н, s, Н-8), 4.52 (1Н, m, Н-9), 3.74 (3Н, s, СН₃О), 3.3-2.8 (6H, CH₂×3); ¹³C NMR (DMSO-d₆, 100 MHz) δ 156.5 (C-4′), 147.3 (C-6), 145.0 (C-7), 130.6 (C-2′, 6′), 125.8 (C-1′), 124.5 (C-1a), 119.7 (C-4a), 115.5 (C-3′, 5′), 111.9 (C-5), 113.4 (C-8), 63.1 (С-1), 55.6 (СН₃О), 55.2 (C-3), 44.1 (C-9), 24.5 (C-4)^[21]。

药根碱(jatrorrhizine, 17a, 12.7 mg): ESI-MS (m/z) 338.39 [M+H]⁺. ¹H NMR (CD₃OD, 400 MHz) δ 9.72 (1H, s, H-8), 8.75 (1H, s, H-13), 8.09 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-11), 7.99 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-12), 7.65 (1H, s, H-1), 6.86 (1H, s, H-4), 4.90 (2H, t, J = 6.4 Hz, H-6), 4.20 (3H, s, 9-OCH₃), 4.10 (3H, s, 10-OCH₃), 4.02 (3H, s, 2-OCH₃), 3.20 (2H, t, J = 6.4 Hz, H-5); ¹³C NMR (CD₃OD, 100 MHz) δ 151.8 (C-9), 151.7 (C-2), 149.6 (C-3), 146.1 (C-8), 145.7 (C-10), 140.2 (C-13a), 135.4 (C-4a), 130.3 (C-12a), 128.1(C-12), 124.3 (C-11), 123.2 (C-1a), 120.9 (C-13), 119.4 (C-8a), 115.9 (C-4), 110.0 (C-1), 62.5 (9-OCH₃), 57.6 (10-OCH₃), 57.4 (2-OCH₃), 56.9 (C-6), 27.6 (C-5)^[22]。

讨论

收起

OMTs是含有甲氧基的天然产物生物合成途径中关键的后修饰酶。植物OMTs通常划分为Type Ⅰ OMT、Type Ⅱ OMT两种类型, 目前已报道的植物OMTs大多属于Type Ⅰ OMT。Type Ⅱ OMT具有高效催化含有邻二酚羟基的化合物形成甲基化产物的特性^[23], 系统进化分析表明, AjOMT1属于Type Ⅱ OMT, 体外底物谱的筛选进一步证明AjOMT1具有Type Ⅱ OMT典型的催化功能。另外, AjOMT1能催化底物形成di-O-甲基或tri-O-甲基产物的功能进一步支持与其系统进化关系非常近的CrOMT1在多甲基黄酮类化合物形成过程中具有重要作用^[13]。值得一提的是, 部分Type Ⅰ OMTs同样具有催化含有邻二酚羟基化合物甲基化的功能, 如来源于柑橘(C. reticulata) 的黄酮类OMT (CrOMT2)^[24]、日本黄连(Coptis japonica) 的苄基异喹啉生物碱类OMT (Cja6OMT)^[25]、嘉兰(Gloriosa superba) 的生物碱类OMT (GsOMT1)^[26]等(图 1)。

绝大多数报道的植物OMTs的底物谱较窄, 仅能对一种结构类型的化合物甲基化, 如黄酮类OMTs (研究最为广泛和深入)、苄基异喹啉类OMTs、茋类OMTs等。目前, 仅有少数植物OMTs能催化2~4类不同结构类型的化合物进行甲基化, 如唐松草属Thalictrum tuberosum的OMTs能催化苯丙素类、苄基异喹啉类; 欧洲赤松(Pinus sylvestris) OMT能催化茋类、苯丙素类、黄酮类; 冰叶日中花OMT (Mesembryanthemum crystallinum) 能催化咖啡酸酯类、黄酮类。并且, 大多数底物谱较为宽泛的OMTs受体分子均具有邻二酚羟基(邻苯二酚) 的结构^[27]。AjOMT1具有比所有已报道植物OMTs更为宽泛的底物谱, 可催化黄酮类、香豆素类、苯丙素类化合物、茋类、苄基异喹啉生物碱类共5种结构类型的化合物进行甲基化。尽管AjOMT1与苄基异喹啉类OMTs如Cja6OMT、GsOMT1在系统进化上差异较大, 但三者均能催化去甲乌药碱甲基化形成乌药碱, 表现出相似的催化活性。目前, 尚未从紫金牛药材中分离得到香豆素类、苯丙素类、茋类、苄基异喹啉生物碱类化合物, 但AjOMT1对上述类型化合物具有高效的甲基化活性。AjOMT1的天然底物目前还难以确认, 由于其具有较强的底物杂泛性, 可开发为O-甲基化的工具酶, 为O-甲基化天然产物的合成提供了新颖、绿色、高效的酶催化方法, 亦可为天然产物合成生物学研究提供普适性甲基化元件。

作者贡献: 杨林、戴均贵设计实验; 刘琦、闫锐琪、隋颂扬进行生物信息学分析、蛋白表达纯化、底物杂泛性研究; 闫锐琪、谢冰寒进行酶学性质研究; 刘琦、闫锐琪分析数据; 刘琦、闫锐琪、解可波、杨林、戴均贵撰写文章手稿。

利益冲突: 本文不存在利益冲突。

基金

收起

国家自然科学基金资助项目(81573317)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

[1]

Liscombe DK, Louie GV, Noel JP. Architectures, mechanisms and molecular evolution of natural product methyltransferases[J]. Nat Prod Rep, 2012, 29: 1238-1250.

https://doi.org/10.1039/c2np20029e

[2]

Walle T. Methylation of dietary flavones greatly improves their hepatic metabolic stability and intestinal absorption[J]. Mol Pharmaceut, 2007, 4: 826-832.

https://doi.org/10.1021/mp700071d

[3]

Roberta B, Crisante F, Ginnasi MC. A convenient and safe O-methylation of flavonoids with dimethyl carbonate (DMC)[J]. Molecules, 2011, 16: 1418-1425.

https://doi.org/10.3390/molecules16021418

[4]

Cao H, Jing XH, Wu DH, et al. Methylation of genistein and kaempferol improves their affinities for proteins[J]. Int J Food Sci Nutr, 2013, 64: 437-443.

https://doi.org/10.3109/09637486.2012.759186

[5]

Liu XY, Luo LL, Ma Y, et al. Biopathway construction of plant natural products[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2021, 56: 3285-3299. http://www.yxxb.com.cn/aps/cn/article/doi/10.16438/j.0513-4870.2021-1637

[6]

Kim SY, Jin CY, Kim CH, et al. Isorhamnetin alleviates lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in BV2 microglia by inactivating NF-κB, blocking the TLR4 pathway and reducing ROS generation[J]. Int J Mol Med, 2019, 43: 682-692. http://www.onacademic.com/detail/journal_1000041698348199_342e.html

[7]

Rasquel-Oliveira FS, Manchope MF, Staurengo-Ferrari L, et al. Hesperidin methyl chalcone interacts with NFκB Ser276 and inhibits zymosan-induced joint pain and inflammation, and RAW264.7 macrophage activation[J]. Inflammopharmacology, 2020, 28: 979-992.

https://doi.org/10.1007/s10787-020-00686-7

[8]

Li XP, Yu MX, Kuang TR, et al. Research progress on the antitumor effect of flavonoid derivatives[J]. Acta Pharm Sin (药学学报), 2021, 56: 913-923. http://www.yxxb.com.cn/aps/cn/article/doi/10.16438/j.0513-4870.2020-1296

[9]

Dat NT, Bae K, Wamiru A, et al. A dimeric lactone from Ardisia japonica with inhibitory activity for HIV-1 and HIV-2 ribonuclease H[J]. J Nat Prod, 2007, 70: 839-841.

https://doi.org/10.1021/np060359m

[10]

Piacente S, Pizza C, De Tommasi N. Constituents of Ardisia japonica and their in vitro anti-HIV activity[J]. J Nat Prod, 1996, 59: 565-569.

https://doi.org/10.1021/np960074h

[11]

Fukuyama Y, Kiriyama Y, Okino J, et al. Naturally occurring 5-lipoxygenase inhibitor. Ⅱ. Structures and syntheses of ardisianones A and B, and maesanin, alkenyl-1, 4-benzoquinones from the rhizome of Ardisia japonica[J]. Chem Pharm Bull, 1993, 41: 561-565.

https://doi.org/10.1248/cpb.41.561

[12]

Mei L, Deng Y. Research progress on chemical components of Ardisia plants[J]. Asia-Pacific Trad Med (亚太传统医学), 2015, 11: 54-55.

[13]

Liu XJ, Zhao CN, Gong Q, et al. Characterization of a caffeoyl-CoA O-methyltransferase like enzyme involved in biosynthesis of polymethoxylated flavones in Citrus reticulata[J]. J Exp Bot, 2020, 71: 3066-3079.

https://doi.org/10.1093/jxb/eraa083

[14]

Docampo-Palacios ML, Alvarez-Hernández A, Adiji O, et al. Glucuronidation of methylated quercetin derivatives: chemical and biochemical approaches[J]. J Agric Food Chem, 2020, 68: 14790-14807.

https://doi.org/10.1021/acs.jafc.0c04500

[15]

Cimanga K, Bruyne TD, Apers S, et al. Complement-inhibiting constituents of Bridelia ferruginea stem bark[J]. Plant Med, 1999, 65: 213-217.

https://doi.org/10.1055/s-1999-14059

[16]

Xiao LH, Wang HY, Song SJ, et al. Isolation and identification of the chemical constituents of roots of Scutellaria amoena C. H. Wright[J]. J Shenyang Pharm Univ (沈阳药科大学学报), 2003, 20: 181-183, 193.

[17]

Bendjedou H, Maggi F, Bennaceur M, et al. A new ionone derivative from Lycium intricatum Boiss. (Solanaceae)[J]. Nat Prod Res, 2022, 36: 687-694.

https://doi.org/10.1080/14786419.2020.1797729

[18]

Urbagarova BM, Shults EE, Taraskin VV, et al. Chromones and coumarins from Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk. growing in Buryatia and Mongolia and their cytotoxicity[J]. J Ethnopharmacol, 2020, 261: 112517.

https://doi.org/10.1016/j.jep.2019.112517

[19]

Silayo A, Ngadjui BT, Abegaz BM, et al. Homoisoflavonoids and stilbenes from the bulbs of Scilla nervosa subsp. rigidifolia[J]. Phytochemistry, 1999, 52: 947-955.

https://doi.org/10.1016/S0031-9422(99)00267-8

[20]

Majumder PL, Pal (née Ray) S. Cumulatin and tristin, two bibenzyl derivatives from the orchids Dendrobium cumulatum and Bulbophyllum triste[J]. Phytochemistry, 1993, 32: 1561-1565.

https://doi.org/10.1016/0031-9422(93)85180-Y

[21]

Song FQ, Sun Y, Han LM, et al. Separation of coclaurine from Ziziphi Spinosae Semen and discussion on its antidepressant mechanism by network pharmacology[J]. J Chin Med Mater (中药材), 2019, 42: 636-642.

[22]

Tang Y, Li SL, Li SN, et al. Screening and isolating potential α-glucosidase inhibitors from Rhizoma Coptidis by ultrafiltration LC-PDA-ESI/MS combined with high-speed countercurrent chromatography and reverse phase medium-pressure liquid chromatography[J]. Med Chem Res, 2017, 26: 3384-3394.

https://doi.org/10.1007/s00044-017-2031-6

[23]

Cui MY, Lu AR, Li JX, et al. Two types of O-methyltransferase are involved in biosynthesis of anticancer methoxylated 4′-deoxyflavones in Scutellaria baicalensis Georgi[J]. Plant Biotechnol J, 2022, 20: 129-142.

https://doi.org/10.1111/pbi.13700

[24]

Liu XJ, Wang Y, Chen YZ, et al. Characterization of a flavonoid 3′/5′/7-O-methyltransferase from Citrus reticulata and evaluation of the in vitro cytotoxicity of its methylated products[J]. Molecules, 2020, 25: 858.

https://doi.org/10.3390/molecules25040858

[25]

Inui T, Tamura K, Fujii N, et al. Overexpression of Coptis japonica norcoclaurine 6-O-methyltransferase overcomes the rate-limiting step in benzylisoquinoline alkaloid biosynthesis in cultured Eschscholzia californica[J]. Plant Cell Physiol, 2007, 48: 252-262.

https://doi.org/10.1093/pcp/pcl062

[26]

Nett RS, Lau W, Sattely ES. Discovery and engineering of colchicine alkaloid biosynthesis[J]. Nature, 2020, 584: 148-153.

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2546-8

[27]

Lam KC, Ibrahim RK, Behdad B, et al. Structure, function, and evolution of plant O-methyltransferases[J]. Genome, 2007, 50: 1001-1013.

https://doi.org/10.1139/G07-077

2023年第58卷第5期

PDF下载

150

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-1102

接收时间：2022-10-10
首发时间：2025-11-21
出版时间：2023-05-12

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2022-10-10
修回日期：2022-11-10

基金

国家自然科学基金资助项目(81573317)

作者信息

1.中央民族大学生命与环境科学学院, 北京 100081

通讯作者:

*戴均贵, jgdai@imm.ac.cn;

杨林, E-mail: 15116995486@163.com

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2022-1102

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT