药学学报

No.	Formula	Measured [M-H]^-	Predicted [M-H]^-	Error (ppm)	Identification	Major fragment ion	Source
^*M0	C₂₆H₂₈O₁₄	563.143 1	563.140 1	-5.33	Schaftoside	401, 269, 151, 117	F, U, P
^*M1	C₁₅H₁₀O₅	269.046 5	269.045 0	-5.58	Apigenin	241, 151, 117, 107	F, U, P, B
M2	C₁₅H₁₂O₅	271.061 5	271.060 6	-3.32	Dihydroapigenin	255, 163, 151, 119	F, B
M3	C₁₅H₁₄O₄	257.082 7	257.081 4	-5.06	2ʹ, 4ʹ, 4-Trihydroxydihydrochalcone	163, 147, 135, 121	B
M4	C₁₅H₁₀O₄	253.051 8	253.050 1	-6.72	5, 7-Dihydroxyflavone	151, 123, 107	U
M5	C₁₆H₁₂O₄	267.066 2	267.065 7	-1.87	Tectochrysin	253, 165, 151	P, B
M6	C₂₁H₂₀O₁₀	431.098 1	431.097 8	-0.70	Apigenin-7-O-glucoside	269, 151, 135	U
M7	C₁₅H₁₀O₈S	349.001 2	349.001 8	1.72	Apigenin-7-sulfate	269, 225, 151, 117	F
M8	C₁₆H₁₂O₅	283.061 5	283.060 6	-3.18	Apigenin-4ʹ-methyl ether	269, 151, 131	F, U
M9	C₂₂H₂₀O₁₁	459.093 5	459.092 7	-1.74	Apigenin-4ʹ-methyl ether-7-O-glucuronide	283, 269, 151, 131	U
M10	C₁₆H₁₄O₄	269.082 0	269.081 4	-2.23	5-Hydroxy-7-methoxyflavone	165, 151	F
M11	C₂₂H₂₂O₁₀	445.113 8	445.113 5	-0.67	Apigenin-4ʹ-methyl ether-7-glucoside	283, 269, 151, 131	U
M12	C₂₂H₂₄O₁₀	447.127 9	447.129 1	2.68	Dihydroapigenin-4ʹ-methyl ether-7-glucoside (isosakuranin)	269, 149, 147	U
M13	C₁₈H₁₈O₅	313.106 8	313.107 6	2.56	Dihydroapigenin-4ʹ, 5, 7-trimethyl ether	271, 269, 179, 117	F
M14	C₂₁H₁₆O₈	395.076 6	395.076 7	0.25	Apigenin-4ʹ, 5, 7- triacetyl ether	353, 311, 269, 151	U
^*M15	C₁₅H₁₀O₆	285.040 1	285.039 9	-0.70	Luteolin	177, 151, 133, 107	F, U, P
M16	C₂₁H₂₂O₁₁	449.106 9	449.108 4	3.34	Dihydroxyluteolin-7-O-glucoside	287, 179, 151, 135	F, U
M17	C₁₆H₁₂O₆	299.055 8	299.055 6	-0.67	Luteolin-3ʹ-methyl ether	283, 151, 147, 133, 107	F, U
M18	C₁₆H₁₄O₆	301.072 9	301.071 2	-5.65	Dihydroxyluteolin-3ʹ-methyl ether	287, 271, 151, 149	F, U
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M21	C₁₈H₁₈O₆	329.102 6	329.102 5	-0.30	Dihydroxyluteolin-3ʹ, 4ʹ, 7-trimethyl ether	315, 287, 135, 125	F, U
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^*M25	C₁₆H₁₂O₇	315.051 0	315.050 5	-1.59	Quercetin-3ʹ-methyl ether (isorhamnetin)	301, 177, 151, 125, 107	F
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M28	C₁₆H₁₂O₁₁S	411.000 9	411.002 2	3.16	Gossypetin-3ʹ-methyl ether-4ʹ-sulfate	331, 167, 131	F
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No.	Formula	Measured [M-H]^-	Predicted [M-H]^-	Error (ppm)	Identification	Major fragment ion	Source
^*M0	C₂₆H₂₈O₁₄	563.143 1	563.140 1	-5.33	Schaftoside	401, 269, 151, 117	F, U, P
^*M1	C₁₅H₁₀O₅	269.046 5	269.045 0	-5.58	Apigenin	241, 151, 117, 107	F, U, P, B
M2	C₁₅H₁₂O₅	271.061 5	271.060 6	-3.32	Dihydroapigenin	255, 163, 151, 119	F, B
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UPLC-Q/TOF-MS/MS法分析鉴定夏佛塔苷在小鼠体内的代谢产物

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魏雅芹 ¹ , 王天云 ² , 李雅婷 ¹ , 陈雨浪 ¹^,² , 廖文星 ¹ , 杜岩 ¹ , 汤道权 ¹^,^*

药学学报 | 研究论文 2022,57(9): 2811-2820

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药学学报 | 研究论文 2022, 57(9): 2811-2820

UPLC-Q/TOF-MS/MS法分析鉴定夏佛塔苷在小鼠体内的代谢产物

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魏雅芹¹, 王天云², 李雅婷¹, 陈雨浪¹^,², 廖文星¹, 杜岩¹, 汤道权¹^,^*

作者信息

1.徐州医科大学, 江苏省新药研究与临床药学重点实验室, 江苏徐州 221004

2.淮安市淮安医院, 江苏淮安 223200

通讯作者:

*汤道权, Tel: 86-516-83263313, E-mail: tangdq@xzhmu.edu.cn

Metabolites of schaftoside in mouse plasma, bile, urine and feces after oral administration by UPLC-Q/TOF-MS/MS

Ya-qin WEI¹, Tian-yun WANG², Ya-ting LI¹, Yu-lang CHEN¹^,², Wen-xing LIAO¹, Yan DU¹, Dao-quan TANG¹^,^*

Affiliations

1. Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, Xuzhou Medical University, Xuzhou 221004, China

2. Huai'an Hosipital of Huai'an City, Huai'an 223200, China

出版时间: 2022-09-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-0436

文章导航

摘要

收起

采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography coupled with quadrupole/ time-of-flight tandem mass spectrometry, UPLC-Q/TOF-MS/MS) 技术, 对夏佛塔苷口服给药后在小鼠体内的原形成分及其代谢产物进行定性分析。动物福利和实验过程获得徐州医科大学伦理委员会的批准(批准号: XZMULL201612024)。通过分析各成分的精确分子质量、一级、二级质谱信息, 并与相应的对照品及文献比对, 从小鼠血浆、胆汁、尿液和粪便中共鉴定出1个原形成分和29个代谢产物。这些成分在小鼠体内代谢的主要途径有去羟基化、羟基化、脱糖化、糖化、氢化、甲基化、乙酰化、硫酸化、葡糖醛酸化等。研究结果可为进一步阐明夏佛塔苷的药效物质基础提供有价值的依据。

关键词

夏佛塔苷 / 小鼠 / 原形成分 / 代谢产物 / 超高效液相色谱-飞行时间串联质谱联用

Abstract

收起

Ultra-high performance liquid chromatography coupled with quadrupole/time-of-flight tandem mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS/MS) has been used to detect the metabolites of schaftoside in plasma, bile, urine and feces of mice after oral administration. The study was approved by the Experimental Animal Ethics Committee from Xuzhou Medical University (No. XZMULL201612024). Compounds were identified by analyzing their high-resolution mass spectrometry data, mass spectra, and comparison with reference substances and the literatures. The parent compound and 29 metabolites were detected in the plasma, bile, urine and feces samples of mice. The main metabolic pathways of schaftoside in mice include deglycosylation/glycosylation, hydroxylation/dehydroxylation, hydrogenation, methylation, acetylation, sulfation, and glucuronidation. This study provides references for the material basis of schaftoside in vivo.

Key words

schaftoside / mouse / parent compound / metabolite / UPLC-Q/TOF-MS/MS

引用本文

魏雅芹, 王天云, 李雅婷, 陈雨浪, 廖文星, 杜岩, 汤道权. UPLC-Q/TOF-MS/MS法分析鉴定夏佛塔苷在小鼠体内的代谢产物. 药学学报, 2022 , 57 (9) : 2811 -2820 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-0436

Ya-qin WEI, Tian-yun WANG, Ya-ting LI, Yu-lang CHEN, Wen-xing LIAO, Yan DU, Dao-quan TANG. Metabolites of schaftoside in mouse plasma, bile, urine and feces after oral administration by UPLC-Q/TOF-MS/MS[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2022 , 57 (9) : 2811 -2820 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-0436

正文

收起

夏佛塔苷(芹菜素-6-葡萄糖-7-阿拉伯糖) 为一种黄酮碳苷类化合物, 主要存在于广金钱草中, 并被中国药典收录为广金钱草质量控制的指标性成分^[1]。研究表明, 夏佛塔苷尚存在于甘草、甘蔗、溪黄草、艾叶、天南星等植物中。现代药理学研究证实, 夏佛塔苷具有抗炎^{[2, 3]}、抗黑色素瘤^[4]、抑制胆囊、膀胱及肾脏结石形成^[5]、保护对乙酰氨基酚引起的肝脏损伤^[6]、抗癫痫^[7]、抑制肝脏脂质堆积^{[8, 9]}等药理活性, 但其在体内的代谢产物目前尚不完全清晰。

中药有效成分在体内的代谢产物对阐明其体内药效物质基础和作用机制发挥着重要作用, 但中药有效成分在生物体内通常发生广泛代谢, 且由于其代谢途径的多样性和复杂性, 以及内源性物质的干扰, 使得其代谢物鉴定仍然存在很大的技术挑战。液相色谱-高分辨串联质谱具有分离能力强、扫描质量范围宽、速度快、灵敏度高等优点, 可提供母离子及子离子的精确分子质量和元素组成结构信息, 能较为可靠地快速鉴定复杂生物基质中的代谢产物, 已广泛应用于中药及其有效成分体内代谢产物的鉴定^[10-14]。

本文采用液相色谱-飞行时间/四级杆串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography coupled with quadrupole/time-of-flight tandem mass spectrometry, UPLC-Q/TOF-MS/MS) 技术对小鼠灌胃给予夏佛塔苷后血浆、胆汁、尿液及粪便中主要代谢产物进行鉴定, 共鉴定30种化学成分, 包括1个原形成分及29个代谢物, 为深入探讨夏佛塔苷药效物质基础及作用机制提供了实验基础。

材料与方法

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仪器 Agilent 1290-6550四级杆-飞行时间质谱仪(美国安捷伦科技有限公司); AB265-S梅特勒电子分析天平(瑞士梅特勒公司); Hettich MIKRO 200/200R台式高速冷冻离心机(德国Hettich公司); LNG-T98真空冷冻浓缩干燥仪(太仓市科教器材厂); EYEL4 N-1100旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司); XW-80A微型涡旋仪(上海沪西分析仪器厂有限公司); 超纯水机(德国赛得利斯公司); SB-5200D超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司); 手持组织匀浆器(美国Biospec公司)。

试药与试剂 甲醇(色谱级, 批号: 0000164930) 及乙腈(色谱级, 批号: 0000166712) 购自美国J.T.Baker公司; 甲酸(LC-MS级, 色谱纯) 购自美国MREDA公司; 乙酸乙酯(分析纯) 购自国药集团化学试剂有限公司; 娃哈哈纯净水购自杭州娃哈哈集团有限公司; 屈臣氏纯净水购自广州屈臣氏食品饮料有限公司; 对照品芹菜素(≥ 98%, TB20180302)、木犀草素(≥ 98%, TB20180301) 购自西安天宝生物科技有限公司; 槲皮素(≥ 98%, RP180413) 购自四川维克奇生物科技有限公司; 夏佛托苷(≥ 98%, RP170621)、异鼠李素(≥ 98%, RP170815) 购自成都麦德生生物科技有限公司。

动物实验 C57BL/6J小鼠12只, 体重25~30 g, 雌雄各半, 徐州医科大学实验动物中心提供[生产许可证: SYXK (苏) 2015-0009, 饲养许可证: SYXK (苏) 2015-0030]。随机分为给药组(6只) 和空白组(6只), 于温度22~25 ℃、湿度50%~70%、12 h/12 h日夜循环的环境下适应5天后。进食12 h, 给药组按100 mg·kg^-1·d^-1剂量口服给予夏佛塔苷的0.5%羧甲基纤维素钠悬浮液^[15], 空白组给予相应体积的0.5%羧甲基纤维素钠溶液。给药周期内小鼠自由进食饮水。给药一周后, 分别收集血液、尿液、胆汁、粪便。实验方案经徐州医科大学实验动物中心伦理委员会批准(批准号: XZMULL201612024)。

样品收集 各组动物连续给药4天后, 置代谢笼, 继续给药3天, 最后一天(第7天) 给药后, 收集24 h的粪便、尿液, 置-80 ℃冰箱冻存, 备用。将各组小鼠从代谢笼取出, 置常规饲养笼中, 继续给药1天(第8天), 末次给药后1 h, 眼眶采血, 将收集的血液迅速置肝素化管中, 4 ℃下4 000 r·min^-1离心10 min。收集血浆并储存在-80 ℃冰箱。采血后的各组小鼠脱颈处死, 迅速打开腹腔, 取肝内侧的胆囊于-80 ℃冰箱保存。

样品处理

血浆取血浆200 μL, 加入乙酸乙酯200 μL, 涡旋5 min, 4 000 r·min^-1离心10 min, 重复该步骤3次。收集乙酸乙酯层, 合并后真空冷冻至干, 残余物加入95%乙腈100 μL, 涡旋5 min, 超声3 min, 4 ℃下13 000 r·min^-1离心10 min, 取上清液, 作为脂溶性样品待分析; 取水下层, 加入乙腈400 μL, 4 ℃下13 000 r·min^-1离心10 min, 收集上清液于真空冷冻至干, 残余物加入95%甲醇100 μL, 涡旋5 min, 超声3 min, 4 ℃下13 000 r·min^-1离心10 min, 取上清液, 作为水溶性样品待分析。

胆汁取胆囊置离心管中, 挤破, 吸取胆汁, 加入6倍量的乙酸乙酯, 涡旋5 min, 4 000 r·min^-1离心10 min。取上层真空冷冻至干, 残余物加入6倍胆汁体积的95%乙腈, 涡旋5 min, 超声3 min, 4 ℃下13 000 r·min^-1离心10 min, 取上清液, 作为脂溶性样品待分析; 取乙酸乙酯提取后的下层, 加入6倍胆汁体积的甲醇, 涡旋5 min, 4 ℃下13 000 r·min^-1离心10 min, 取上清液, 作为水溶性样品待分析。

尿液取尿液500 μL, 加入乙酸乙酯500 μL, 涡旋5 min, 4 000 r·min^-1离心10 min, 重复3次。收集乙酸乙酯层, 真空冷冻至干, 残余物加入95%乙腈100 μL, 涡旋5 min, 超声3 min, 4 ℃下13 000 r·min^-1离心10 min, 取上清液, 作为脂溶性样品待分析; 另取尿液500 μL, 加入乙腈1 mL, 涡旋5 min, 4 ℃下13 000 r·min^-1离心10 min, 收集上清液于真空冷冻至干, 残余物加入95%甲醇100 μL, 涡旋5 min, 超声3 min, 4 ℃下13 000 r·min^-1离心10 min, 取上清液, 作为水溶性样品待分析。

粪便取2.5 mg粪便两份, 分别溶于800 μL生理盐水, 搅匀。一份加入乙酸乙酯800 μL, 涡旋5 min, 4 000 r·min^-1离心10 min, 重复萃取3次, 乙酸乙酯层真空冷冻至干, 残余物加入95%乙腈100 μL, 涡旋5 min, 超声3 min, 4 ℃下13 000 r·min^-1离心10 min, 取上清液, 作为脂溶性样品待分析; 另一份加入乙腈2 mL, 涡旋5 min, 4 ℃下13 000 r·min^-1离心10 min, 上清液于真空冷冻至干, 残余物加入95%甲醇100 μL, 涡旋5 min, 超声3 min, 4 ℃下13 000 r·min^-1离心10 min, 取上清液, 作为水溶性样品待分析。

色谱条件

参照本课题组以前的分析方法^[16], 血浆及胆汁样品采用Xbridge C18柱(150 mm × 2.1 mm, 3.5 μm, Waters), 而尿液及粪便样品分别采用Fortis C18柱(100 mm × 2.1 mm, 1.7 µm) 和Zorbax SB-C18柱(100 mm × 2.1 mm, 3.5 μm) 进行分离; 柱温及自动进样器的温度分别为30 ℃和4 ℃; 流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B), 流速、梯度及进样量分设如下:

血浆水溶性提取物: 0 min, 15% B; 3 min, 20% B; 5 min, 30% B; 8 min, 65% B; 20~24 min, 100% B; 脂溶性提取物: 0 min, 30% B; 3 min, 60% B; 5 min, 75% B; 8 min, 80% B; 22 min, 90% B; 26 min, 95% B; 28~30 min, 100% B; 流速0.3 mL·min^-1; 进样量2 μL。

胆汁水溶性提取物: 0 min, 5% B; 3 min, 20% B; 17 min, 20% B; 20 min, 65% B; 23~26 min, 100% B; 脂溶性提取物: 0~3 min, 30% B; 8 min, 80% B; 14 min, 80% B; 16 min, 90% B; 18~22 min, 100% B; 流速0.3 mL·min^-1; 进样量2 μL。

尿液水溶性提取物: 0~10 min, 5% B; 15 min, 15% B; 30 min, 40% B; 32 min, 70% B; 40 min, 100% B; 脂溶性提取物: 0~6 min, 5% B; 10 min, 10% B; 14 min, 20% B; 18 min, 20% B; 19~24 min, 30% B; 28 min, 60% B; 30 min, 90% B; 45 min, 100% B; 流速0.3 mL·min^-1; 进样量1.5 μL。

粪便水溶性提取物: 0~6 min, 5% B; 28 min, 40% B; 40 min, 60% B; 52 min, 100% B; 脂溶性提取物: 0 min, 5% B; 2 min, 10% B; 16 min, 40% B; 22 min, 60% B; 32 min, 60% B; 40 min, 70% B; 48 min, 100% B; 流速0.4 mL·min^-1; 进样量1.5 μL。

质谱条件 电离模式: Dual AJS ESI (-); 参比离子: m/z 121.050 8和922.009 7; 毛细管电压: 3 500 V; 干燥气温度: 225 ℃; 干燥气流量: 12 L·min^-1; 雾化器压力: 28 psig; 鞘气温度: 275 ℃; 鞘气流量: 12 L·min^-1; 扫描范围: m/z 50~1 700。碎裂电压: 175 V; 碰撞能量: 15 eV。

数据处理 根据测得的精确相对分子质量, 在规定误差范围内(±10.0 ppm) 计算可能的元素组成, 并结合对照品及各个成分的二级质谱碎片信息和文献报道的数据, 对各色谱峰进行定性分析。

结果

收起

1 夏佛塔苷口服给予小鼠后的体内代谢分析

夏佛托苷经口服给予小鼠之后, 经初步结构推测, 在小鼠体内共可检测到1个原形成分和29个代谢产物。它们的总离子流色谱图和可能的化学结构分别见图 1和表 1。根据代谢产物的结构, 推测出它们的可能代谢途径见图 2。

由表 1和图 2可知, 夏佛托苷经口服给予小鼠后, 小鼠粪便、尿液、胆汁和血液中均可检测到去糖化、羟基化、甲基化、双键加氢的代谢产物; 尿液、胆汁和血液中均可发现去羟基化的代谢产物; 粪便、尿液和血液中均可检测到葡萄糖化的代谢产物; 粪便、胆汁和血液均可发生去氧还原代谢反应; 粪便和尿液均可检测到硫酸酯化的代谢产物; 而尿液中尚可检测到葡萄糖醛酸化及乙酰化的代谢产物。

由表 1可知, 夏佛托苷经口服给予小鼠后, 在小鼠的粪便、尿液和血液中均可测到原形和其苷元芹菜素的羟基化产物—木犀草素; 另外, 在粪便、尿液、胆汁和血液中均可检测苷元芹菜素。推测可能是由于夏佛托苷是C糖苷, 不容易被糖苷酶水解, 从而以一部分原形吸收入血。

2 原形成分及代谢产物的结构鉴定及裂解规律分析

负离子模式下, 黄酮苷元主要发生以C环为中心的断裂、丢失重排反应, 其中最具有结构特征的是^{i, j}[A-H]^-与^{i, j}[B-H]^-系列离子。黄酮(醇)、查尔酮及二氢黄酮类化合物C环1/3、1/4、0/2、0/4等位上C-C键均能断裂, 其中1/3与0/4断裂为逆狄尔斯-阿德尔(Retro Diels Alder, RDA) 裂解^{[17, 18]}, 是该类化合物的优势裂解, 它们骨架的C环裂解示意图及形成的碎片离子见图 3。负离子下, 黄酮苷元还时常发生相继丢失CO、CO₂、H₂O、C₂H₂O、C₂O₃等中性碎片的系列裂解^[16]。本研究即是参照这些信息进行黄酮类化合物裂解规律的推测。

M0的准分子离子峰产生在m/z 563.143 1 ([M-H]^-), 特征碎片离子分别为m/z 401 ([M-H-葡萄糖基]^-)、269 ([M-H-葡萄糖基-阿拉伯糖基]^-)、151 (^{1, 3}[A-H]^-)、117 (^{1, 3}[B-H]^-), 经与对照品对照、文献^[16]比对, 确定为夏佛塔苷。

M1的准分子离子峰为m/z 269.046 5 ([M-H]^-), 比M0低294 Da (葡萄糖基+阿拉伯糖基), 结合其特征碎片m/z 241 ([M-H-CO]^-)、151 (^{1, 3}[A-H]^-)、117 (^{1, 3}[B-H]^-) 及107 (^{0, 4}[A-H]^-), 并通过对照品及文献比对^[19], 确定为芹菜素。M2的准分子离子峰为m/z 271.061 5 ([M-H]^-), 比M1 (芹菜素) 高2 Da, 结合其碎片离子m/z 255 ([M-OH]^-)、163 (^{0, 4}[B-H]^-)、151 (^{1, 3}[A-H]^-) 及119 (^{1, 3}[B-H]^-), 结合文献^[20], 推测为二氢芹菜素。M4的准分子离子峰为m/z 253.051 8 ([M-H]^-), 比M2低16 Da, 结合其碎片离子m/z 151 (^{1, 3}[A-H]^-)、123 (^{1, 4}[A-H]^-) 及107 (^{0, 4}[A-H]^-), 并经文献^[16]比对, 推测其为5, 7-二羟基黄烷(4-去羟基芹菜素)。M5的准分子离子峰为m/z 267.066 2 ([M-H]^-), 比M4高14 Da, 其碎片离子分别为m/z 253 ([M-H-CH₂]^-)、165 (^{1, 3}[A-H]^-) 及151 (^{1, 3}[A-H-CH₂]^-), 推测为5-羟基-7-甲氧基黄烷(白杨素)^[21]。M6所产生的准分子离子峰在m/z 431.098 1 ([M-H]^-), 比M1高162 Da, 结合其主要碎片离子m/z 269 ([M-H-葡萄糖基]^-)、151(^{1, 3}[A-H-葡萄糖基]^-)、135(^{1, 3}[A-H-O-葡萄糖基]^-), 推测其为芹菜素-7-葡萄糖苷。M7的准分子离子峰为m/z 349.001 2 ([M-H]^-), 比M1高80 Da, 结合其主要产物离子m/z 269 ([M-H-SO₃]^-)、225 ([M-H-SO₃-CO₂]^-)、151 (^{1, 3}[A-H-SO₃]^-) 及117 (^{1, 3}[B-H]^-), 推测其为芹菜素-7-硫酸酯。M8产生的准分子离子峰在m/z 283.061 5 ([M-H]^-), 比M1高14 Da, 结合其碎片离子m/z 269 ([M-H-CH₂]^-)、151 (^{1, 3}[A-H]^-) 及131 (^{1, 3}[B-H]^-), 推测其为芹菜素-4ʹ-甲基醚。M9的准分子离子峰为m/z 459.093 5 ([M-H]^-), 比M8高176 Da, 结合其产物离子m/z 283 ([M-H-葡萄糖醛酸基]^-)、269 ([M-H-CH₂-葡萄糖醛酸基]^-)、151 (^{1, 3}[A-H-葡萄糖醛酸基]^-) 及131 (^{1, 3}[B-H]^-), 推测其为芹菜素-4ʹ-甲基醚-7-O-葡萄糖醛酸苷。M10产生m/z 269.082 0 ([M-H]^-) 的准分子离子峰, 比M4高16 Da, 结合其产物离子m/z 165 (^{1, 3}[A-H]^-) 及151 (^{1, 3}[A-H-CH₂]^-), 推测其为5-羟基-7-甲氧基黄烷。M11产生m/z 445.113 8 ([M-H]^-) 的准分子离子峰, 比M8高162 Da, 其主要碎片离子为m/z 283 ([M-H-葡萄糖基]^-)、269 ([M-H-CH₂-葡萄糖基]^-)、151 (^{1, 3}[A-H-葡萄糖基]^-) 及131 (^{1, 3}[B-H]^-), 因此推测其为芹菜素-4ʹ-甲基醚-7-O-葡萄糖苷。M12的准分子离子峰为m/z 447.127 9 ([M-H]^-), 比M11高2 Da; 结合产物离子m/z 269 ([M-H-O-葡萄糖基]^-)、149 (^{0, 2}[A-H-葡萄糖基]^-) 及147 (^{0, 2}[B-H-CH₂]^-), 推测其为二氢芹菜素-4ʹ-甲基醚-7-O-葡萄糖苷。M13的准分子离子峰为m/z 313.106 8 ([M-H]^-), 比M2高42 Da, 结合其产物离子m/z 271 ([M-H-3CH₂]^-)、269 ([M-H-CO₂]^-)、179 (^{1, 3}[A-H]^-) 及117 (^{1, 3}[B-H-2H-CH₂]^-), 推测其为二氢芹菜素-4ʹ, 5, 7-三甲基醚。M14的准分子离子峰为m/z 395.076 6 ([M-H]^-), 比M1高126 Da, 结合其主要产物离子m/z 353 ([M-H-COCH₂]^-)、311 ([M-H-2COCH₂]^-)、269 ([M-H-3COCH₂]^-) 及151 (^{1, 3}[A-H-2COCH₂]^-), 推测其为芹菜素-4ʹ, 5, 7-三乙酰酯。

M3的准分子离子峰为m/z 257.082 7 ([M-H]^-), 推测为2ʹ, 4ʹ, 4-三羟基查尔酮, 其羰基的α裂解产生碎片离子m/z 135及m/z 121; 也可脱氢后异构化为其相应的黄烷(4ʹ, 7-二羟基黄烷), 进而发生C环裂解, 分别产生碎片离子m/z 163 (^{0, 4}[B-H]^-) 及m/z 147 (^{1, 4}[B-H]^-)^[20]。

M15的准分子离子峰为m/z 285.040 1 ([M-H]^-), 其特征碎片离子分别为m/z 177 (^{0, 4}[B-H]^-)、151 (^{1, 3}[A-H]^-)、133 (^{1, 3}[B-H]^-) 及107 (^{0, 4}[A-H]^-), 结合对照品及文献^[22]比对, 确定其为木犀草素。M16产生准分子离子峰m/z 449.106 9 ([M-H]^-), 比M15高164 Da, 比二氢木犀草素(分子量为287 Da) 高162 Da, 结合其碎片离子m/z 287 ([M-H-葡萄糖基]^-)、179 (^{0, 4}[B-H]^-)、151 (^{1, 3}[A-H-葡萄糖基]^-) 及135 (^{1, 3}[B-H]^-), 推测其为二氢木犀草素-7-O-葡萄糖苷。M17的准分子离子峰为m/z 299.055 8 ([M-H]^-), 比M15高14 Da, 结合其碎片离子m/z 283 ([M-H-CH₂]^-)、151 (^{1, 3}[A-H]^-)、147 (^{1, 3}[B-H]^-)、133 (^{1, 3}[B-H-CH₂]^-) 及107 (^{0, 4}[A-H]^-), 推测其为木犀草素-3ʹ-甲基醚。M18产生m/z为301.072 9 ([M-H]^-) 的准分子离子峰, 比M17高2 Da, 比二氢木犀草素高14 Da, 结合其碎片离子m/z 287 ([M-H-CH₂]^-)、271 ([M-OCH₃]^-)、151 (^{1, 3}[A-H]^-) 及149 (^{1, 3}[B-H]^-), 推测其为二氢木犀草素-3ʹ-甲基醚。M19的准分子离子峰为m/z 381.026 9 ([M-H]^-), 比M18高80 Da, 结合其碎片离子m/z 301 ([M-H-SO₃]^-)、287 ([M-H-SO₃-CH₂]^-)、151 (^{1, 3}[A-H]^-) 及149 (^{1, 3}[B-H]^-), 推测其为二氢木犀草素-3ʹ-甲基醚-7-硫酸酯。M20的准分子离子峰为m/z 327.088 8 ([M-H]^-), 比M17高28 Da, 结合其产物离子m/z 299 ([M-H-2CH₂]^-)、283 ([M-H-3CH₂]^-) 及165 (^{1, 3}[A-H]^-), 推测其为木犀草素-3ʹ, 4ʹ, 7-三甲基醚。M21产生m/z为329.102 6的准分子离子峰, 比M20高2 Da, 结合其产物离子m/z 315 ([M-H-CH₂]^-)、287 ([M-H-3CH₂]^-)、135 (^{0, 4}[A-H]^-或^{1, 3}[A-CH₂-OCH₃]^-) 及125 (^{1, 4}[A-H-2CH₂]^-), 推测其为二氢木犀草素-3ʹ, 4ʹ, 7-三甲基醚。M22的准分子离子峰为m/z 343.118 8 ([M-H]^-), 比M21高14 Da, 结合其产物离子m/z 329 ([M-H-2CH₂]^-)、287 ([M-H-4CH₂]^-)、151 (^{1, 3}[A-H-2CH₂]^-) 及135 (^{1, 3}[A-H]^-), 推测其为二氢木犀草素-3ʹ, 4ʹ, 4, 7-四甲基醚。

M23的准分子离子峰为m/z 301.035 6 ([M-H]^-), 结合特征碎片离子m/z 257 ([M-H-CO₂]^-)、193 (^{0, 4}[B-H]^-)、151 (^{1, 3}[A-H]^-)、149 (^{1, 3}[B-H]^-) 及107 (^{0, 4}[A-H]^-), 并经对照品对照和文献^[23]比对, 鉴定其为槲皮素。M24产生准分子离子峰m/z 303.051 3 ([M-H]^-), 比M23高2 Da, 结合碎片离子m/z 259 ([M-H-CO₂]^-)、167 (^{0, 2}[A-H]^-)、151 (^{1, 3}[A-H]^-或^{1, 3}[B-H]^-) 及107 (^{0, 4}[A-H]^-), 推测其为二氢槲皮素。M25的准分子离子峰为m/z 315.051 0 ([M-H]^-), 比M23高14 Da, 结合其特征碎片离子m/z 301 ([M-H-CH₂]^-)、177 (^{1, 4}[B-H-CH₂]^-)、151 (^{1, 3}[A-H]^-)、125 (^{1, 4}[B-H-CH₂]^-) 及107 (^{0, 4}[A-H]^-), 并经对照品对照及文献^[24]比对, 鉴定其为异鼠李素(槲皮素-3ʹ-甲基醚)。M26产生m/z为329.066 7 ([M-H]^-) 的准分子离子峰, 比M25高14 Da, 结合其碎片离子m/z 315 ([M-H-CH₂]^-)、301 ([M-H-2CH₂]^-)、165 (^{1, 3}[A-H]^-)、163 (^{1, 3}[B-H-CH₂]^-) 及107 (^{0, 4}[A-H-CH₂]^-), 推测其为槲皮素-3ʹ, 7-二甲基醚。M27的准分子离子峰为m/z 357.097 6 ([M-H]^-), 比M26高28 Da, 结合碎片离子m/z 343 ([M-H-CH₂]^-)、313 ([M-H-CH₂-OCH₂]^-) 及151 (^{1, 3}[A-H-2CH₂]^-), 推测其为槲皮素-3, 3ʹ, 4ʹ, 7-四甲基醚。M28产生准分子离子峰m/z 411.000 9 ([M-H]^-), 比M23高96 Da、M25高80 Da, 结合其碎片离子m/z 331 ([M-H-SO₃]^-)、167 (^{1, 3}[A-H]^-) 及131 (^{1, 4}[A-H]^-), 推测其为棉黄素-3-甲基醚-4ʹ-硫酸酯。M29的准分子离子峰为m/z 653.101 4 ([M-H]^-), 比M23高352 Da, 结合其产物离子m/z 477 ([M-H-葡萄糖醛酸基]^-)、301 ([M-H-2葡萄糖醛酸基]^-) 及149 (^{1, 3}[B-H-葡萄糖醛酸基]^-), 再通过文献^[25]比对, 推测其为槲皮素-3ʹ, 7-O-二葡萄糖醛酸苷。

讨论

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近年来, 作为广金钱草的主要活性成分, 夏佛塔苷的药理学活性已引起广泛关注, 但有关其体内代谢的研究尚为有限。Liu等^[15]对其在正常大鼠及结石大鼠体内的代谢产物进行了比较研究, 为广金钱草及其活性成分夏佛塔苷的利尿排石作用提供了坚实的实验依据, 但其在其他生物体内的代谢行为尚未见报道, 这在一定程度上限制了人们对夏佛塔苷体内代谢的全面认识。据此, 本研究利用UPLC-Q/TOF-MS/MS技术, 对小鼠口服给予夏佛塔苷后的血浆、尿液、胆汁及粪便中代谢产物进行了全面的研究。本研究根据参照文献中给药方法及夏佛塔苷的代谢参数, 将给药剂量设定为100 mg·kg^-1·d^{-1 [15]}, 采血时间设定为给药后1 h^{[26, 27]}, 并根据仪器的灵敏度和预实验的结果, 采取多剂量给药的方式, 以增加代谢产物在小鼠生物基质中的累积, 从而尽可能地获取夏佛塔苷代谢产物的全貌。本研究所检测到的体内代谢产物, 除芹菜素、二氢芹菜素及木犀草素3个代谢产物外^[15], 其他均未见报道。与已有结果相比, 本研究所检测到的代谢产物大多数为黄酮苷元的Ⅰ相和Ⅱ相代谢产物, 推测可能与给药方式不同有关。本研究所检测到的代谢产物芹菜素、木犀草素、槲皮素及异鼠李素, 其药理活性均已被广泛证实, 这一方面提示黄酮类化合物在体内可能存在相互转化, 另一方面提示上述代谢产物可能为夏佛塔苷的体内活性成分。

黄酮类化合物在体内可发生多种代谢反应, 主要包括去羟基化、去甲基化、羟基化、甲基化、葡萄糖化、葡萄糖醛酸化、硫酸酯化、乙酰化等, 根据这些代谢反应在质谱中形成的特征性中性损失, 可鉴定代谢反应类型。与母体化合物或其他代谢物相比, 代谢物形成的具有±16 Da (O)、±14 Da (CH₂)、±2.0 Da (H₂)、±18 Da (H₂O)、+80 Da (SO₃)、±162 Da (C₆H₁₀O₅) 和+176 Da (C₆H₈O₆) 等特征丢失, 可能分别意味着羟基化/脱羟基化、甲基化/去甲基化、脱氢/氢化、脱水/水合、硫酸化、脱葡萄糖/葡萄糖化和葡糖醛酸化等代谢反应的发生^[28]。

甲基化反应形成的代谢产物极性较弱, 是阻碍药物清除的代谢反应。体内儿茶酚O-甲基转移酶(catechol-O-methyltransferase, COMT) 存在倾向于B环的C3ʹ或C4ʹ位羟基的甲基取代^[23], 且以2:1的比例形成C3ʹ和C4ʹ位的甲基化反应^[29]。据此, 本研究将M8、M17、M25分别推测为芹菜素-4ʹ-甲基醚、木犀草素-3ʹ-甲基醚、槲皮素-3ʹ-甲基醚(异鼠李素)。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferas, UGTs) 与黄酮(醇) 类化合物不同位置羟基的表观亲和力顺序为C-3ʹ ≥ C-4ʹ > C-7 > C-3, 其中C-3位葡萄糖醛酸化发生率很低, 若5-OH是唯一游离的羟基, 也有可能结合葡萄糖醛酸基团^[30]。由于C3ʹ和C4ʹ位同时又是甲基化优势位点, 当甲基化发生在C3ʹ时, 葡萄糖醛酸则位于C4ʹ或者C7位; 当甲基化发生在C4ʹ时, 葡萄糖醛酸则位于C3ʹ或者C7位, 因此, 本研究将M9及M29分别推测为芹菜素-4ʹ-甲基醚-7-O-葡萄糖醛酸苷及槲皮素-3ʹ, 7-O-二葡萄糖醛酸苷。黄酮(醇) 类化合物的硫酸化呈现出更强的位置选择性, 以C-3ʹ、C-7位为主, 当C-3ʹ位有甲基取代时, C-4ʹ位也可能发生硫酸结合反应^{[23, 29, 31, 32]}, 据此, 本研究结合碎片离子信息将M7、M19、M28分别推测为芹菜素-7-硫酸酯、二氢木犀草素-3ʹ-甲基醚-7-硫酸酯、棉黄素-3-甲基醚-4ʹ-硫酸酯。另外, 羟基化、乙酰化、葡萄糖化的优势位点尚未见相关报道, 本研究参照甲基化、葡萄糖醛化及硫酸化的优势结合位点进行了相关推测。

一般来说, 黄酮类化合物更适应于负离子模式检测。另外, 实验中发现正离子模式下发现的代谢产物远少于负离子模式检测, 且正离子模式下检测到的代谢产物几乎均可以在负离子模式下检测到, 综合以上因素, 本研究最终选择了负离子模式检测。

黄酮及其苷类化合物通常吸收入血困难, 肝脏和肠道中均高度表达的各种药物代谢酶, 如细胞色素P450、UGTs、磺基转移酶和COMTs等, 可促进黄酮体内吸收与代谢; 可通过外排转运蛋白又可将黄酮的代谢物泵入肠腔或胆汁, 参与肠肝、肠道和局部再循环的三重回收。UGTs、外排转运蛋白和肠道微生物菌群/肠细胞衍生的β-葡萄糖醛酸酶的联合作用, 使得这些再循环成为可能, 增加了黄酮类化合物在肠道中的停留时间^[33], 从而使代谢产物在血液、胆汁、尿液及粪便等不同基质中被检测到并得到合理的解释。本研究也发现, 尿液和粪便中的代谢产物较多, 说明尿液和粪便是黄酮类化合物的活性代谢物的主要排泄场所, 而血液和胆汁内被检测的较少, 进一步提示黄酮类化合物及其代谢产物主要经尿液和粪便排泄。另外, 小鼠血液量和胆汁量少, 在生物基质的干扰下, 能被分离分析的化合物也较少, 这在一定程度上影响了本研究的代谢物的发现。

黄酮化合物通常含有多羟基, 羟基位点是其在体内发生代谢转变的关键点。黄酮醇在4种基质中均能发生羟基化或者去羟基化, 但黄酮类含有两个羟基或一个羟基、一个甲基时, 较难发生去羟基化, 一般是先去甲基化。甲基化在黄酮醇、黄酮、二氢黄酮和查尔酮的4种基质中均可发生, 甲基化是延缓药物清除和提高药物脂溶性的反应。在4种基质中, 黄酮母环均能发生羟基化、去羟基化, C环是双键时易被加成。但粪便内共有代谢产物包括葡萄糖化及甲基化产物; 尿液内主要包括极性较大的II相代谢产物, 如葡萄糖醛酸化和硫酸酯化的代谢产物等; 胆汁内不仅包括I相代谢产物, 也包括II相代谢的葡萄糖化、甲基化代谢产物^{[23, 30, 32]}。

作者贡献: 汤道权、魏雅芹和王天云构思并设计了实验; 魏雅芹、王天云和李雅婷进行论文的整体实验和数据分析; 魏雅芹、王天云和杜岩参与体内动物实验; 李雅婷、陈雨浪和廖文星参与数据分析工作; 魏雅芹、杜岩和汤道权撰写并修改了论文。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

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江苏省高校自然科学研究重大项目(16KJA350001)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2022年第57卷第9期

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199

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-0436

接收时间：2022-04-14
首发时间：2025-12-24
出版时间：2022-09-12

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出版历史

收稿日期：2022-04-14
修回日期：2022-06-27

基金

江苏省高校自然科学研究重大项目(16KJA350001)

作者信息

1.徐州医科大学, 江苏省新药研究与临床药学重点实验室, 江苏徐州 221004

2.淮安市淮安医院, 江苏淮安 223200

通讯作者:

*汤道权, Tel: 86-516-83263313, E-mail: tangdq@xzhmu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

No.	Formula	Measured [M-H]^-	Predicted [M-H]^-	Error (ppm)	Identification	Major fragment ion	Source
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M2	C₁₅H₁₂O₅	271.061 5	271.060 6	-3.32	Dihydroapigenin	255, 163, 151, 119	F, B
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No.

Formula

Measured
[M-H]^-

Predicted
[M-H]^-

Error (ppm)

Identification

Major fragment ion

Source

^*M0

C₂₆H₂₈O₁₄

563.143 1

563.140 1

-5.33

Schaftoside

401, 269, 151, 117

F, U, P

^*M1

C₁₅H₁₀O₅

269.046 5

269.045 0

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Apigenin

241, 151, 117, 107

F, U, P, B

C₁₅H₁₂O₅

271.061 5

271.060 6

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Dihydroapigenin

255, 163, 151, 119

F, B

C₁₅H₁₄O₄

257.082 7

257.081 4

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2ʹ, 4ʹ, 4-Trihydroxydihydrochalcone

163, 147, 135, 121

C₁₅H₁₀O₄

253.051 8

253.050 1

-6.72

5, 7-Dihydroxyflavone

151, 123, 107

C₁₆H₁₂O₄

267.066 2

267.065 7

-1.87

Tectochrysin

253, 165, 151

P, B

C₂₁H₂₀O₁₀

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431.097 8

-0.70

Apigenin-7-O-glucoside

269, 151, 135

C₁₅H₁₀O₈S

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349.001 8

1.72

Apigenin-7-sulfate

269, 225, 151, 117

C₁₆H₁₂O₅

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283.060 6

-3.18

Apigenin-4ʹ-methyl ether

269, 151, 131

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C₂₂H₂₀O₁₁

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C₁₆H₁₄O₄

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C₂₂H₂₄O₁₀

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Dihydroapigenin-4ʹ-methyl ether-7-glucoside (isosakuranin)

269, 149, 147

M13

C₁₈H₁₈O₅

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313.107 6

2.56

Dihydroapigenin-4ʹ, 5, 7-trimethyl ether

271, 269, 179, 117

M14

C₂₁H₁₆O₈

395.076 6

395.076 7

0.25

Apigenin-4ʹ, 5, 7- triacetyl ether

353, 311, 269, 151

^*M15

C₁₅H₁₀O₆

285.040 1

285.039 9

-0.70

Luteolin

177, 151, 133, 107

F, U, P

M16

C₂₁H₂₂O₁₁

449.106 9

449.108 4

3.34

Dihydroxyluteolin-7-O-glucoside

287, 179, 151, 135

F, U

M17

C₁₆H₁₂O₆

299.055 8

299.055 6

-0.67

Luteolin-3ʹ-methyl ether

283, 151, 147, 133, 107

F, U

M18

C₁₆H₁₄O₆

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301.071 2

-5.65

Dihydroxyluteolin-3ʹ-methyl ether

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F, U

M19

C₁₆H₁₄O₉S

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Dihydroluteolin-3ʹ-methyl ether 7-sulfate

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M20

C₁₈H₁₆O₆

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Luteolin-3ʹ, 4ʹ, 7-trimethyl ether

299, 283, 165

M21

C₁₈H₁₈O₆

329.102 6

329.102 5

-0.30

Dihydroxyluteolin-3ʹ, 4ʹ, 7-trimethyl ether

315, 287, 135, 125

F, U

M22

C₁₉H₂₀O₆

343.118 8

343.118 2

-1.75

Dihydroluteolin-3ʹ, 4ʹ, 5, 7- tetramethyl ether

329, 287, 151, 135

^*M23

C₁₅H₁₀O₇

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Quercetin

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M24

C₁₅H₁₂O₇

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Dihydroquercetin

259, 167, 151, 107

^*M25

C₁₆H₁₂O₇

315.051 0

315.050 5

-1.59

Quercetin-3ʹ-methyl ether (isorhamnetin)

301, 177, 151, 125, 107

M26

C₁₇H₁₄O₇

329.066 7

329.066 1

-1.82

Quercetin-3ʹ, 7-dimethyl ether

315, 301, 165, 163, 107

F, U

M27

C₁₉H₁₈O₇

357.097 6

357.097 4

-0.56

Quercetin-3, 3ʹ, 4ʹ, 7-tetramethyl ether

343, 313, 151

M28

C₁₆H₁₂O₁₁S

411.000 9

411.002 2

3.16

Gossypetin-3ʹ-methyl ether-4ʹ-sulfate

331, 167, 131

M29

C₂₇H₂₆O₁₉

653.101 4

653.099 0

-3.67

Quercetin-3ʹ, 7-O-diglucuronide

477, 301, 149