药学学报

Genomic feature	Accession	Overall length/bp	LSC length/bp	SSC length/bp	IR length/bp	Total gene	Protein- coding gene	tRNA		rRNA	GC content /%
Lycopus europaeus	OM617843.1	152 085	83 103	17 734	25 624	132	88	36		8	38.04
L. lucidus Turcz. var. hirtus Regel	MT980792.1	152 096	83 111	17 737	25 624	132	88	36	8	38.04
Dracocephalum taliense	MT473756.1	150 976	82 253	17 365	25 679	132	87	37	8	37.78
Dracocephalum tanguticum	NC_057508.1	150 954	82 221	17 363	25 685	133	88	37	8	37.8
Dracocephalum heterophyllum	MW970109.1	150 860	82 146	17 360	25 673	133	88	37	8	37.76
Dracocephalum moldavica	NC_057509.1	149 868	81 450	17 066	25 676	133	88	37	8	37.83
Glechoma longituba	MK609928.1	153 069	114 878	20 791	8 700	132	87	37	8	37.84
Mentha spicata	NC_037247.1	152 132	83 219	17 663	25 625	132	87	37	8	37.85
Mentha canadensis	NC_044082.1	152 154	83 278	17 676	25 600	132	87	37	8	37.81
Salvia miltiorrhiza	NC_020431.1	151 328	82 695	17 555	25 539	132	87	37	8	38.02
Salvia plebeia	NC_050929.1	151 062	82 454	17 498	25 555	132	87	37	8	38.01
Salvia splendens	NC_050901.1	150 604	82 181	17 857	25 283	130	86	36	8	38.04
Salvia przewalskii	NC_041091.1	151 319	82 732	17 605	25 491	132	87	37	8	37.96
Salvia yunnanensis	NC_050903.1	151 413	82 656	17 577	25 590	132	87	37	8	38.02
Scutellaria baicalensis	NC_027262.1	152 731	83 950	17 475	25 653	132	87	37	8	38.38
Scutellaria rehderiana	MT982397.1	151 827	83 971	17 330	25 263	132	87	37	8	38.33
Scutellaria amoena	NC_057255.1	151 569	83 738	17 325	25 253	131	87	36	8	38.36
Anisomeles indica	NC_046781.1	151 900	83 143	17 555	25 601	132	87	37	8	38.26
Caryopteris mongholica	NC_035729.1	151 707	83 203	17 226	25 639	131	86	37	8	38.24
Galeopsis bifida	MT473759.1	151 890	82 936	17 672	25 641	132	87	37	8	38.47
Leonurus japonicus	NC_038062.1	151 610	82 827	17 515	25 634	132	87	37	8	38.41
Nepeta cataria	NC_051544.1	152 399	83 340	17 605	25 697	132	87	37	8	37.85
Pogostemon cablin	NC_042796.1	152 461	83 553	17 584	25 662	132	87	37	8	38.24
Clerodendrum trichotomum	NC_057680.1	151 549	83 065	17 306	25 589	131	86	37	8	38.2
Rosmarinus officinalis	NC_027259.1	152 462	83 355	17 965	25 571	132	87	37	8	37.99
Stellera chamaejasme	NC_042714.1	173 381	86 769	2 858	41 877	132	87	37	8	36.68
Potentilla chinensis	MN871983.1	157 053	86 174	15 829	27 525	126	81	37	8	36.81
Prunella vulgaris	NC_039654.1	151 342	82 606	17 420	25 613	133	88	37	8	37.92

Genomic feature	Accession	Overall length/bp	LSC length/bp	SSC length/bp	IR length/bp	Total gene	Protein- coding gene	tRNA		rRNA	GC content /%
Lycopus europaeus	OM617843.1	152 085	83 103	17 734	25 624	132	88	36		8	38.04
L. lucidus Turcz. var. hirtus Regel	MT980792.1	152 096	83 111	17 737	25 624	132	88	36	8	38.04
Dracocephalum taliense	MT473756.1	150 976	82 253	17 365	25 679	132	87	37	8	37.78
Dracocephalum tanguticum	NC_057508.1	150 954	82 221	17 363	25 685	133	88	37	8	37.8
Dracocephalum heterophyllum	MW970109.1	150 860	82 146	17 360	25 673	133	88	37	8	37.76
Dracocephalum moldavica	NC_057509.1	149 868	81 450	17 066	25 676	133	88	37	8	37.83
Glechoma longituba	MK609928.1	153 069	114 878	20 791	8 700	132	87	37	8	37.84
Mentha spicata	NC_037247.1	152 132	83 219	17 663	25 625	132	87	37	8	37.85
Mentha canadensis	NC_044082.1	152 154	83 278	17 676	25 600	132	87	37	8	37.81
Salvia miltiorrhiza	NC_020431.1	151 328	82 695	17 555	25 539	132	87	37	8	38.02
Salvia plebeia	NC_050929.1	151 062	82 454	17 498	25 555	132	87	37	8	38.01
Salvia splendens	NC_050901.1	150 604	82 181	17 857	25 283	130	86	36	8	38.04
Salvia przewalskii	NC_041091.1	151 319	82 732	17 605	25 491	132	87	37	8	37.96
Salvia yunnanensis	NC_050903.1	151 413	82 656	17 577	25 590	132	87	37	8	38.02
Scutellaria baicalensis	NC_027262.1	152 731	83 950	17 475	25 653	132	87	37	8	38.38
Scutellaria rehderiana	MT982397.1	151 827	83 971	17 330	25 263	132	87	37	8	38.33
Scutellaria amoena	NC_057255.1	151 569	83 738	17 325	25 253	131	87	36	8	38.36
Anisomeles indica	NC_046781.1	151 900	83 143	17 555	25 601	132	87	37	8	38.26
Caryopteris mongholica	NC_035729.1	151 707	83 203	17 226	25 639	131	86	37	8	38.24
Galeopsis bifida	MT473759.1	151 890	82 936	17 672	25 641	132	87	37	8	38.47
Leonurus japonicus	NC_038062.1	151 610	82 827	17 515	25 634	132	87	37	8	38.41
Nepeta cataria	NC_051544.1	152 399	83 340	17 605	25 697	132	87	37	8	37.85
Pogostemon cablin	NC_042796.1	152 461	83 553	17 584	25 662	132	87	37	8	38.24
Clerodendrum trichotomum	NC_057680.1	151 549	83 065	17 306	25 589	131	86	37	8	38.2
Rosmarinus officinalis	NC_027259.1	152 462	83 355	17 965	25 571	132	87	37	8	37.99
Stellera chamaejasme	NC_042714.1	173 381	86 769	2 858	41 877	132	87	37	8	36.68
Potentilla chinensis	MN871983.1	157 053	86 174	15 829	27 525	126	81	37	8	36.81
Prunella vulgaris	NC_039654.1	151 342	82 606	17 420	25 613	133	88	37	8	37.92

Gene function	Category	Gene name
Self-replication	rRNA genes	rrn16S (×2), rrn23S (×2), rrn5S (×2), rrn*4.5S (×2)
tRNA genes	36 trn genes (8 contain one intron)
Small subunit of ribosome	rps11, rps12 (×2), rps14, rps15, rps16, rps18, rps19 (×2), rps2, rps3, rps4, rps7 (×2), rps8
Large subunit of ribosome	rpl14, rpl16, rpl2 (×2), rpl20, rpl22, rpl23 (×2), rpl32, rpl33, rpl36
DNA-dependent RNA polymerase	rpoA, rpoB, rpoC1, rpoC2
Photosynthesis	Subunits of NADH-dehydrogenase	ndhA, ndhB (×2), ndhC, ndhD, ndhE, ndhF, ndhG, ndhH, ndhI, ndhJ, ndhK
Subunit of rubisco	rbcL
Subunits of photosystem Ⅰ	psaA, psaB, psaC, psal, psaJ
Subunits of photosystem Ⅱ	psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbI, psbJ, psbK, psbL, psbM, psbN, psbT, psbZ, ycf3
Subunits of cytochrome b/f complex	petA, petB, petD, petG, petL, petN
Subunits of ATP synthase	atpA, atpB, atpE, atpF, atpH, atpI
Other genes	c-Type cytochrome synthesis gene	ccsA
Protease	clpP
Envelop membrane protein	cemA
Subunit of acetyl-CoA-carboxylase	accD
Maturase	matK
Translational initiation factor	infA
Unknown function	Supposed chloroplast reading frame	ycf1, ycf15 (×2), ycf2 (×2), ycf4

Gene function	Category	Gene name
Self-replication	rRNA genes	rrn16S (×2), rrn23S (×2), rrn5S (×2), rrn*4.5S (×2)
tRNA genes	36 trn genes (8 contain one intron)
Small subunit of ribosome	rps11, rps12 (×2), rps14, rps15, rps16, rps18, rps19 (×2), rps2, rps3, rps4, rps7 (×2), rps8
Large subunit of ribosome	rpl14, rpl16, rpl2 (×2), rpl20, rpl22, rpl23 (×2), rpl32, rpl33, rpl36
DNA-dependent RNA polymerase	rpoA, rpoB, rpoC1, rpoC2
Photosynthesis	Subunits of NADH-dehydrogenase	ndhA, ndhB (×2), ndhC, ndhD, ndhE, ndhF, ndhG, ndhH, ndhI, ndhJ, ndhK
Subunit of rubisco	rbcL
Subunits of photosystem Ⅰ	psaA, psaB, psaC, psal, psaJ
Subunits of photosystem Ⅱ	psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbI, psbJ, psbK, psbL, psbM, psbN, psbT, psbZ, ycf3
Subunits of cytochrome b/f complex	petA, petB, petD, petG, petL, petN
Subunits of ATP synthase	atpA, atpB, atpE, atpF, atpH, atpI
Other genes	c-Type cytochrome synthesis gene	ccsA
Protease	clpP
Envelop membrane protein	cemA
Subunit of acetyl-CoA-carboxylase	accD
Maturase	matK
Translational initiation factor	infA
Unknown function	Supposed chloroplast reading frame	ycf1, ycf15 (×2), ycf2 (×2), ycf4

Repeat unit type	Repetitive sequence	Number of replication	Total
Mononucleotide	A/T	-	-	-	-	-	13	4	6	2	1	1	1	28
C/G	-	-	-	-	-	1		1					2
Dinucleotide	AG/CT	-	1											1
AT/AT	-	2					1						3

Repeat unit type	Repetitive sequence	Number of replication	Total
Mononucleotide	A/T	-	-	-	-	-	13	4	6	2	1	1	1	28
C/G	-	-	-	-	-	1		1					2
Dinucleotide	AG/CT	-	1											1
AT/AT	-	2					1						3

欧地笋叶绿体全基因组序列特征及其系统发育分析

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杜清 ¹^,²^,³^,^*^,^# , 王立强 ⁴^,^# , 陈卓尔 ²^,⁵ , 姜梅 ⁶ , 陈海梅 ² , 曾晶 ²^,⁵ , 王彬 ⁵^,^* , 刘昶 ²

药学学报 | 研究论文 2022,57(7): 2206-2215

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药学学报 | 研究论文 2022, 57(7): 2206-2215

欧地笋叶绿体全基因组序列特征及其系统发育分析

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杜清¹^,²^,³^,^*^,^#, 王立强⁴^,^#, 陈卓尔²^,⁵, 姜梅⁶, 陈海梅², 曾晶²^,⁵, 王彬⁵^,^*, 刘昶²

作者信息

1.青海民族大学药学院, 青海省青藏高原植物化学重点实验室, 青海西宁 810007

2.中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所生物信息中心, 北京 100193

3.清新天正 (北京) 国际科技有限责任公司, 北京 100097

4.菏泽学院药学院, 山东菏泽 274015

5.湘南学院药学院, 湖南郴州 423099

6.齐鲁工业大学药学院, 山东济南 250200

通讯作者:

*杜清, E-mail: 171765300@qq.com;

王彬, E-mail: beinwang@126.com

Characterization and phylogenetic analysis of the complete chloroplast genome of Lycopus europaeus

Qing DU¹^,²^,³^,^*, Li-qiang WANG⁴, Zhuo-er CHEN²^,⁵, Mei JIANG⁶, Hai-mei CHEN², Jing ZENG²^,⁵, Bin WANG⁵^,^*, Chang LIU²

Affiliations

1. Key Laboratory of Medicinal Plant Resources of Qinghai-Tibetan Plateau in Qinghai Province, College of Pharmacy, Qinghai Minzu University, Xining 810007, China

2. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100193, China

3. Fresh Sky-Right (Beijing) International Science and Technology Co. Ltd., Beijing 100097, China

4. College of Pharmacy, Heze University, Heze 274015, China

5. College of Pharmacy, Xiangnan University, Chenzhou 423099, China

6. School of Pharmaceutical Sciences, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Jinan 250200, China

出版时间: 2022-07-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-0208

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摘要

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研究欧地笋Lycopus europaeus Linn.叶绿体基因组的结构特征, 比较与欧地笋具有相近药理作用和临床功效的唇形科物种的系统进化关系。利用Illumina Hiseq 4000测序平台对欧地笋全基因组DNA进行测序、使用NOVOplasty组装了完整的叶绿体基因组, 然后用CPGAVAS2软件对叶绿体基因组进行注释和特征分析。以瑞香狼毒(Stellera chamaejasme) 和委陵菜(Potentilla chinensis) 为外类群, 构建系统进化树, 分析唇形科中与欧地笋具有相近功效的物种之间的系统发育关系。结果表明, 欧地笋叶绿体基因组全长152 085 bp, 注释得到132个基因, 包括88个蛋白编码基因、8个rRNA基因和36个tRNA基因, 其中8个蛋白质编码基因(ndhB、rps7、rps12、rps19、rpl2、rpl23、ycf2、ycf15)、7种tRNA编码基因(trnM-CAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnE-UUC、trnV-GAC、trnA-UGC、trnR-ACG)、4个rRNA编码基因(rrn16S、rrn23S、rrn4.5S、rrn5S) 位于IR区。其中13个蛋白质编码基因[rps16、rps19 (×2)、atpF、rpoC1、rpl2 (×2)、petB、petD、rpl16、ndhB (×2)、ndhA] 各含有1个内含子(intron), 2个蛋白质编码基因(ycf3、clpP) 各含有2个内含子, 8个tRNA编码基因各含有1个内含子; 共检测到34个SSR序列, 其中A/T、AT/AT为重复单元的占91.18%, 说明SSR偏好使用A和T碱基。系统发育分析显示欧地笋与硬毛地笋、青兰属的四个物种、活血丹、薄荷属的两个物种、夏枯草共计10个植物的亲缘关系最近。由此, 研究中获得并分析了完整欧地笋叶绿体基因组的序列特征, 明确了欧地笋与唇形科物种间的系统发育亲缘关系。

关键词

唇形科 / 欧地笋 / 硬毛地笋 / 叶绿体基因组 / 序列特征 / 重复序列 / 系统发育

Abstract

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We intend to study the structural characteristics of Lycopus europaeus Linn. chloroplast genome and compare the evolutionary relationship of species from Lamiaceae with similar medicinal effects. The total DNA of Lycopus europaeus was sequenced using the Illumina Hiseq 4000 Sequencing platform and was assembled using NOVOplasty software. And then we annotated and analyzed the genome using the CPGAVAS2 online tool. We constructed the phylogenetic tree using the Stellera chamaejasme and Potentilla chinensis as the outgroup. The whole length of Lycopus europaeus chloroplast genome was 152 085 bp. A total of 132 genes were annotated including 88 protein-coding genes, 8 rRNA genes and 36 tRNA genes. Among them, 8 protein-coding genes (ndhB, rps7, rps12, rps19, rpl2, rpl23, ycf2, ycf15), 7 tRNA coding genes (trnM-CAU, trnL CAA, trnN-GUU, trnE-UUC, trnV-GAC, trnA-UGC, trnR-ACG) and 4 rRNA coding genes (rrn16s, rrn23s, rrn4.5s, rrn5s) are located in the IR region. There are 13 protein coding genes [rps16, rps19 (×2), atpF, rpoC1, rpl2 (×2), petB, petD, rpl16, ndhB (×2), ndhA] each contains one intron, two protein-coding genes (ycf3, clpP) each contain two introns, and 8 tRNA coding genes each contain one intron. A total of 34 SSRs were detected in the chloroplast genome of Lycopus europaeus. Phylogenetic analysis revealed that two species in the Lycopus genus, four species in the Dracocephalum genus, Glechoma longituba, two species in the Mentha genus and Prunella vulgari, in total 10 species are most related. The complete genome sequence of Lycopus europaeus was obtained and analyzed, which clarified the evolutional relationship between the species of Lycopus europaeus and in the Lamiaceae family.

Key words

Lamiaceae / Lycopus europaeus / L. lucidus Turcz. var. hirtus Regel / chloroplast genome / sequence characteristics / repeats sequence / phylogenetic evolution

引用本文

杜清, 王立强, 陈卓尔, 姜梅, 陈海梅, 曾晶, 王彬, 刘昶. 欧地笋叶绿体全基因组序列特征及其系统发育分析. 药学学报, 2022 , 57 (7) : 2206 -2215 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-0208

Qing DU, Li-qiang WANG, Zhuo-er CHEN, Mei JIANG, Hai-mei CHEN, Jing ZENG, Bin WANG, Chang LIU. Characterization and phylogenetic analysis of the complete chloroplast genome of Lycopus europaeus[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2022 , 57 (7) : 2206 -2215 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2022-0208

正文

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唇形科在全世界有3 500余种, 我国有99属800余种^[1]。唇形科植物多数富含具有药用的芳香油, 香气浓郁, 且大多数颜色鲜丽, 是有名的油料作物和药用植物, 比如黄芩、丹参、薰衣草、薄荷、益母草等^[2]。

地笋属约14种, 分布于东半球温带及北美, 我国有4种4变种, 4种分别是地笋L. lucidus、小花地笋L. parviflorus、小叶地笋L. coreanus、欧地笋L. europaeus和4变种分别是硬毛地笋L. lucidus Turcz. var. hirtus Regel、异叶地笋L. Turcz. var. maackianus Maxim.、西南小叶地笋L. coreanus Levl. var. Cavaleriei、深裂欧地笋L. europaeus Linn. var.exaltatus Hook^[3]。

国内外研究表明, 地笋属的植物主要含有挥发油、萜类与甾体、酚酸类、黄酮类和微量元素等化学成分^[3]。其中硬毛地笋是地笋的变种, 分布较广, 含有黄酮、挥发油等成分^{[4, 5]}。全草入药, 乃本草经著录的泽兰正品, 为妇科要药, 能通经利尿, 对产前产后诸病有效, 根通称地笋, 可食, 又为金疮肿毒良剂, 并治风湿关节痛^[1]。欧地笋L. europaeus是唇形科地笋属多年生草本植物, 小坚果四边形, 棕褐色。欧地笋分布于河北北部、陕西及新疆等地; 生于田边、沟边、潮湿草地, 海拔700~1 000 m。欧洲至亚洲中部也有, 北美洲也有引进^[1]。研究表明, 欧地笋含有黄酮、有机酸、甾类和脂溶性挥发油等化学成分^[6], 全草入药, 具有活血化瘀, 清热解毒, 通经, 利尿的功效; 对产前产后诸病有效, 根可治金疮肿毒, 并治风湿关节痛^[7]。

叶绿体(chloroplast) 是绿色植物细胞中重要的细胞器, 是植物进行光合作用的场所, 也即“光动力工厂”。研究中发现, 植物细胞内的叶绿体基因组分子长度约为120~160 kb, 多数DNA分子是闭合共价双链形状, 通常叶绿体基因组可编码120个以上的基因, 主要分为三类基因, 分别是遗传系统基因, 即与转录和翻译相关的基因, 与光合作用相关的光合系统基因和与氨基酸、脂肪酸等物质生物合成相关的基因。通过对叶绿体基因组的研究, 发现叶绿体基因组特有的基因序列可用于物种的鉴别^[8]、遗传多样性分析^[9]、物种DNA分子鉴定^[10]、同科属物种分子系统发育、药用植物遗传改良转化、分子育种基因工程^[11]、生物制剂的生产、植物叶绿体基因的适应性进化等方面^[12]。相对于独立的核系统转化, 叶绿体转化系统为植物导入外源基因提供了新的途径, 能够高效地在对应的重复区域内自动调整拷贝数并表达^[13]。

到目前为止, 唇形科地笋属硬毛地笋的叶绿体基因组序列已有研究报道^[14], 而同科属的植物欧地笋的叶绿体基因组还未见报道, 为深入探讨唇形科各个属植物之间的系统发育进化关系, 且为了比较与欧地笋具有相近功效物种间叶绿体全基因组序列的特征, 本研究对欧地笋叶绿体基因组进行了测序并分析了其结构特征, 通过DNA和蛋白质序列构建不同的进化树揭示欧地笋与各个植物的进化关系及其在唇形科系统发育中的地位。

材料与方法

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材料欧地笋新鲜幼嫩的叶片采自广西植物园(22°54′30.34″N, 103°13′16.39″E), 经鉴定为欧地笋, 标本存放于中国医学科学院药用植物研究所(标本号implad201910060)。

基因组DNA提取和检测 取经硅胶干燥的欧地笋叶片100 mg, 用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN生物, 北京) 提取欧地笋总基因组DNA。通过1.0%琼脂糖凝胶电泳, NanoDrop 2000微量分光光度计(Thermo scientific, 美国) 和Qubit3.0检测总DNA的纯度和浓度。

叶绿体基因组的测序、组装、注释与特征分析 将符合测序要求的叶绿体基因组总DNA提取物500 ng DNA构建文库, 在IlluminaSolexa测序平台(Hiseq 4000, 圣地亚哥, CA, 美国) 上测序, 获取2×150 bp的reads^[15]。利用NGS QC ToolKit过滤去除接头及低质量reads, 得到高质量待分析reads (即clean reads)^[16]。以硬毛地笋(NC_036935.1) 叶绿体基因组序列作为参考序列, 采用NOVOplasty (3.7.2) 从原始测序数据中组装欧地笋的叶绿体基因组^[17]。使用Bowtie2 (2.4.4) (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtml)^[18]将原始reads映射到组装好的欧地笋叶绿体基因组上, 检测组装序列的正确性。应用CPGAVAS2在线工具(http://www.herbalgenomics.org/cpgavas2/)^[19]对欧地笋的叶绿体基因组序列进行注释和特征分析, 使用默认参数预测蛋白质编码基因、转移RNA (tRNA) 基因和核糖体RNA (rRNA) 基因, 对注释信息采用Apollo软件进行手工编辑校正^[20]。将注释好的欧地笋叶绿体基因组序列用BankIt向NCBI在线提交, 获得序列登录号为OM617843。

欧地笋叶绿体基因组的特征分析 采用CPGview-RSG在线软件(http://www.herbalgenomics.org/cpgview/) 绘制欧地笋叶绿体基因组图谱, 对顺式剪接基因和反式剪接基因的情况进行了可视化展示^[21]。应用CPGAVAS2在线分析工具(http://www.herbalgenomics.org/cpgavas2/) 获得欧地笋叶绿体基因组的总长度, 大单拷贝区LSC、小单拷贝区SSC和一对反向重复区IR的长度及各个区的GC含量; 并注释出各种编码基因的情况和长度、内含子和外显子的特征及非编码区的长度。然后与同属物种硬毛地笋的叶绿体基因组特征对比分析研究。

重复序列分析 CPGAVAS2在线工具可注释出各种的重复序列, 利用MISA软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/) 鉴定欧地笋和硬毛地笋叶绿体基因组中的简单重复序列(simple sequence repeats, SSR), 也叫微卫星序列^{[22, 23]}, 搜索参数设置为: 重复单元碱基数为1~6, 最小重复单元个数分别为10、5、4、3、3和3, 设置2个SSR之间的最小距离为100 bp, 如果距离小于100 bp, 则2个SSR被当做一个复合微卫星; 使用TRF软件(4.09, Gary Benson, 波士顿大学, https://tandem.bu.edu/trf/trf.html) 预测欧地笋叶绿体基因串联重复序列^[24], 设定重复单元大小为≥ 7; 采用VMATCH软件预测欧地笋叶绿体基因散在重复序列。

LSC、SSC、IR边界与特征基因的比较研究 使用IRscope (https://irscope.shinyapps.io/irapp/) 比较唇形科中与地笋属近缘的共计10种植物的叶绿体基因组LSC、SSC和IR区域边界和大小^[25]。同时对存在于不同区域和连接位点的相同或不同的基因进行比较分析, 探讨与近似药理作用的相关性。

系统发育分析 组装后的欧地笋叶绿体基因组和唇形科同科不同属且具有相近药理作用的物种共计28种(表 1), 以瑞香科的狼毒(S. chamaejasme, NC_042714.1) 和蔷薇科的委陵菜(P. chinensis, MN871983.1) 作为外类群, 从GenBank数据库下载27个物种的叶绿体基因组序列(表 1), 利用系统发育软件Phylosuite (v1.2.2) 软件^[26]提取共有蛋白质和DNA序列, 不同物种按相同排列顺序首尾连接, 采用MAFFT (v7.313)^[27]软件比对。系统发育分析基于TVM+F+I+G4模型下在IQ-TREE (v1.6.8)^[28]中构建蛋白质和DNA序列比对的最大似然法(maximum likelihood, ML)^[29]进化树。此外, 还应用软件Mega^[30]结合邻接NJ法(neighbor joining method)^[31]基于蛋白质和DNA序列构建系统进化树。通过1 000次bootstrap重复分析来评估系统发育树的显著性水平, 使用MEGA-X可视化系统发育树。

结果与分析

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1 叶绿体基因组图谱和顺反式剪切基因情况

欧地笋叶绿体基因组图谱绘制如图 1, 顺式剪切基因和反式剪切基因及其内含子、外显子的情况如图 2和3, 在预测出的基因中, 12个顺式剪接基因的rps16、atpF、rpoC1、petB、petD、rpl2 (×2)、ndhB (×2)、ndhA包含一个内含子, 而ycf3、clpP各包含两个内含子(图 2)。rps12是一种反式剪接基因, 它包含3个外显子。白色区域为IRa的第2外显子, 黑色区域为IRb的第2外显子, 灰色区域为第1外显子。其5′端位于LSC区, 而3′端位于IR区(图 3)。

2 基因组基本特征

欧地笋总DNA测序共获得数据6.0 GB, 对应18 663 661条reads, 其原始数据(raw reads) 已经提交到GenBank, 相应的Bioproject ID为PRJNA726215。测序数据的覆盖度为100%, 其中337 628对reads (1.1%) 被精确地映射到基因组上一次, 全基因组的平均测序深度为337 628 × 151 / 152 085 = 335.2。与绝大多数被子植物叶绿体基因组一样, 欧地笋叶绿体基因组为双链环状分子, 全长152 085 bp, 包括1个大的单拷贝(LSC) 区(83 103 bp), 1个小的单拷贝(SSC) 区(17 734 bp) 和1对反向重复(IR) 区(25 624 bp)。全基因组的GC含量为38.04%, 其中IR区GC含量最高(43.16%), LSC区(36.16%) 和SSC区(32.05%) 均较低, 低于全基因组的GC含量。在欧地笋叶绿体基因组中共注释到132个基因, 包括88个蛋白质编码基因(独特基因80个), 8个rRNA基因[rrn16S (×2)、rrn23S (×2)、rrn4.5S (×2) 和rrn5S (×2)] (独特基因4个) 和36个tRNA基因(独特基因29个) (表 2)。其中8个蛋白质编码基因(ndhB、rps7、rps12、rps19、rpl2、rpl23、ycf2、ycf15)、7种tRNA编码基因(trnM-CAU、trnL-CAA、trnN-GUU、trnE-UUC、trnV-GAC、trnA-UGC、trnR-ACG)、4个rRNA编码基因(rrn16S、rrn23S、rrn4.5S、rrn5S) 位于IR区。欧地笋叶绿体基因组中有23个含内含子的基因, 包括13个蛋白质编码基因[rps16、rps19 (×2)、atpF、rpoC1、rpl2 (×2)、petB、petD、rpl16、ndhB (×2)、ndhA] 各含有1个内含子(intron), 2个蛋白质编码基因(ycf3、clpP) 各含有2个内含子, 8个tRNA编码基因各含有1个内含子。欧地笋叶绿体基因组中蛋白质编码区(coding sequence, CDS) 的长度为80 775 bp, 占整个基因组长度的53.11%。rRNA基因的长度为9 406 bp, 占整个基因组长度的6.18%。而tRNA基因的长度为2 724 bp, 占整个基因组长度的1.79%。叶绿体基因组非编码区主要包括内含子和基因间隔区, 其中基因间隔区的长度占整个基因组长度的38.92%。

3 地笋属叶绿体基因组与边界基因比较分析

对唇形科10种植物的叶绿体基因组进行比较, 包括地笋属的欧地笋和硬毛地笋(表 1)。发现除了活血丹、硬毛地笋植物外的叶绿体基因组LSC/IRa和LSC/IRb边界的侧翼基因相同, LSC/IRb边界均在基因rpl22、rps19和rpl2基因之间, 而LSC/IRb边界位于rps19和psbA基因之间。SSC/IRa边界IRa一侧都存在一个ycf1基因且均跨越SSC/IRa区, 而活血丹叶绿体基因组比较特殊, rpl22、rps19、rpl2和psbA均未在四区出现, 多种tRNA出现, 有trnV、trnR、trnN, 还有rrn5、rrn23等, 硬毛地笋叶绿体基因组未见rpl2, SSC/IRa均位于ycf1基因中。地笋属两个物种间基因组长度有11个碱基的差距, 其中LSC区碱基长度差距为8 bp, SSC区碱基长度差距为3 bp, IR区长度相等。两个物种的叶绿体基因组均包含132个基因, 88个蛋白编码基因, 36个tRNA基因和8个rRNA基因, 且基因组的GC含量均为38.04%, 说明欧地笋与其变种硬毛地笋非常近缘(图 4)。通过比较10个物种的药理作用, 发现它们都主要用于感冒发热、清热解毒、治疗风湿性关节炎和尿路感染等方面, 可能与基因生物合成的化学成分之间的亲缘关系有一定的关联。

4 重复序列分析

重复序列的插入、重排或缺失都会影响叶绿体基因组的长度和顺序, 且对叶绿体基因组进化方面也会有重要的作用。叶绿体基因组中重复序列一般可分为简单重复序列(SSR)、串联重复序列(tandem repeat sequence) 和分散重复序列(dispersed repeat sequence)。欧地笋叶绿体基因组中共检测到34个SSR, 其中单核苷酸重复SSR最多, 共计30个, A、C、G和T分别为14、1、1和14个; 其次是二核苷酸SSR, 共计4个, AT、GA和TA分别为2、1和1个; 三核苷酸和四核苷酸SSR未检测到。在所检测的SSR中以A/T、AT/AT为重复单元的占91.18%, 表明欧地笋叶绿体SSR偏好使用A和T碱基(表 3, 图 5), 其类型分别为P1 (24个)、P2 (4个) 和c (3个), 大部分都位于LSC区(80.65%), 位于SSC和IR区分别为12.9%和6.45%, SSRs的大小在10~22 bp之间(图 5)。以总长度超过20 bp且重复单元之间的相似性≥ 72%筛选后, 发现31个串联重复序列。以e值(e-value) 小于1E-05为阈值, 欧地笋叶绿体基因组散在重复序列包括回文重复序列17条、正向重复序列18条。

5 系统发育分析

叶绿体基因组结构简单, 序列保守且基因大部分同源。研究异同科属植物叶绿体基因组之间的进化关系可提供系统发育和功效同源的有力依据。本研究选择了唇形科中常见具有类似的药理作用, 用于活血化瘀、清热解毒、抗菌消炎、抗风湿关节炎症的物种构建系统发育树。利用系统发育软件Phylosuite (v1.2.2) 软件提取81个共有蛋白质和DNA序列, 其中有26个唇形科的物种, 瑞香科的狼毒(S. chamaejasme, NC_042714.1) 和蔷薇科的委陵菜(P. chinensis, MN871983.1) 作为外类群构建最大似然法系统发育树(表 1)。从DNA和蛋白质序列构建的系统发育树中显示, 唇形科物种聚为一支, 分为4个小分支, 地笋属的两个物种与青兰属的4个物种、活血丹、薄荷属的两个物种、夏枯草聚为一支; 鼠尾草属5个物种和迷迭香聚为一支; 荆芥单独聚为一支; 蒙古莸、海州常山、黄芩属3个物种、广防风、广藿香、鼬瓣花和益母草聚为一支, 两个外类群狼毒和委陵菜单独聚为一支, 24个节点中, 应用CDS蛋白质和DNA构建的进化树bootstrap值^[32]分别在84%~100%、50%~100%之间, 说明经过1 000次运算之后, 拓扑结构^[33]置信度分别在84%和50%以上(图 6, 左右两侧分别为蛋白质和DNA进化树比对图)。应用软件Mega结合邻接NJ法(neighbor joining method) 基于DNA和CDS蛋白质序列构建的系统进化树, 各个物种的聚类结果与Phylosuite (v1.2.2) 结合最大似然法结果一致, 只是进化树的bootstrap值分别在69%~100%、61%~100%之间, 说明经过1 000次运算之后, 拓扑结构置信度分别在69%和61%以上(图 6), 结果表明应用Phylosuite结合最大似然法提取各个物种中的共有CDS蛋白质构建进化树的各个分支的拓扑结构可信度最高, 也说明两种方法构建的进化树都是可用的。

讨论

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应用IlluminaSolexa测序平台首次完成了欧地笋的叶绿体基因组的测序, 使用软件NOVOplasty3.7.2组装原始数据。欧地笋叶绿体基因组中, 具有自我复制且在IR区的蛋白质编码基因有NADH脱氢酶亚单(ndhB)、核糖体小亚单位(rps7、rps12、rps19)、核糖体大亚单位(rpl2、rpl23), 还有两个未知功能具有ORF的基因(ycf2、ycf15)。在研究中比较了地笋属两个物种欧地笋和硬毛地笋的叶绿体基因组的基本特征, 虽然两者全长仅有11个碱基的差别, 经过比对发现两个物种的叶绿体基因组序列有多处的基因缺失和差异, 通过进化树构建中基因和蛋白等信息的提取后, 发现两者的共有基因110个, 其中硬毛地笋特有的tRNA基因有3种, 分别是trnI-CAU、trnI-GAU和trnV-UAC; 蛋白质序列均为80个, 其中有差异的3个, 分别是rps12、rps19和ycf1; 两个物种有68种基因间区, 其中欧地笋特定的基因间区有6个, 分别是ndhC_trnM-CAU、rpl22_ rpl2、rps15_ycf1、trnE-UUC_rrn16S、rrn16S_trnE-UUC和trnN-GUU_ndhF, 硬毛地笋特定的基因间区有5个, 分别是ndhC_trnV-UAC、rrn16S_trnI-GAU、start_rps12、trnI-GAU_rrn16S和trnN-GUU_ycf1。两个物种从进化树分支上看是近缘物种, 仅从原植物的外观性状鉴定, 硬毛地笋不同于欧地笋的地方就在于茎稜上被向上小硬毛, 节上密集硬毛; 叶披针形, 暗绿色, 上面密被细刚毛状硬毛, 叶缘具缘毛, 下面主要在肋及脉上被刚毛状硬毛, 两端渐狭, 边缘具锐齿。故今后需要结合共同基因和特定基因所表达的蛋白差异功能, 不仅从外观性状鉴定和区别, 而且结合异同基因生物化学过程合成功效成分的动态化学成分的差异, 也可从化学亲缘关系方面比较和区分两个物种。

在植物群体遗传学、种群分析、多态性研究和进化系统的研究中, 叶绿体基因组中的SSR基因起着很好的应用价值^[34]。目前应用叶绿体基因组中的SSR研究的药用植物有甘草^[35]、灵芝^[36]、丹参^[37]、明党参和川明参^[38]、文冠果^[39]、藠头^[40]、甘西鼠尾草^[41]、藠头^[42]和旋覆花属等^[43]。本研究结果表明欧地笋叶绿体基因组中的SSR包含高频率的A或T重复, 与很多植物叶绿体基因组SSR序列的组成相似, 比如草果^[44]和丹参^[45]。本研究中26个唇形科叶绿体基因组序列, 以瑞香科狼毒和蔷薇科委陵菜为外类群, 用两种方法构建的系统发育树中看到, 地笋属的两个物种与青兰属的4个物种在唇形科中的亲缘关系较近; 而且地笋属的两个物种在进化树中的节点的最大相似度为100%。从各个药用植物的药理作用分析发现, 与地笋属聚为一支的物种主要有活血化瘀、清热解毒、消炎平喘为主的功效, 当然主要是基于化学物质构效关系的不同引起的; 鼠尾草属5个物种和迷迭香主要以活血化瘀的“心脏动力药”为主聚为一类; 荆芥主要用于解暑、发汗发热、防治感冒, 故单独为一类; 蒙古莸、海州常山、黄芩属3个物种、广防风、广藿香、鼬瓣花和益母草主要以活血补血、解热解毒、止痛驱寒为主要功效, 故聚为一支。同时从分子角度分析物种的叶绿体基因组的聚类分析证实了物种之间的亲缘关系, 从而也可以一定程度说明该物种的药用成分可能具有高度的相似性, 因为植物体内的化学成分都是通过相关基因家族通过特定的生物合成途径生成的, 故相近化学成分和药理作用的物种间可以根据需要互相增补和调换使用。通过本次对欧地笋植物叶绿体基因的研究, 可为唇形科及地笋属的物种鉴定、分子进化和遗传系统发育研究提供重要的参考。

作者贡献: 第一作者杜清、王立强负责论文设计、实验、数据分析及论文撰写; 通讯作者刘昶、王彬负责指导论文的实验和数据分析; 姜梅、陈海梅参与样品采集、保存、数据分析; 陈卓尔、曾晶、刘鑫参与数据分析和文章修改。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

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中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2021-I2M-1-022)
国家科技基础资源调查专项(2018FY100705)
国家自然科学基金项目(81872966)
青海省青藏高原植物化学重点实验室(2020-ZJ-Y20)
湖南省教育厅重点科研项目(20A467)
湖南省技术创新引导计划项目(2018SK52001)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2022年第57卷第7期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2022-0208

接收时间：2022-02-18
首发时间：2025-12-23
出版时间：2022-07-12

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作者

出版历史

收稿日期：2022-02-18
修回日期：2022-03-31

基金

中国医学科学院医学与健康科技创新工程(2021-I2M-1-022)

国家科技基础资源调查专项(2018FY100705)

国家自然科学基金项目(81872966)

青海省青藏高原植物化学重点实验室(2020-ZJ-Y20)

湖南省教育厅重点科研项目(20A467)

湖南省技术创新引导计划项目(2018SK52001)

作者信息

1.青海民族大学药学院, 青海省青藏高原植物化学重点实验室, 青海西宁 810007

2.中国医学科学院、北京协和医学院药用植物研究所生物信息中心, 北京 100193

3.清新天正 (北京) 国际科技有限责任公司, 北京 100097

4.菏泽学院药学院, 山东菏泽 274015

5.湘南学院药学院, 湖南郴州 423099

6.齐鲁工业大学药学院, 山东济南 250200

通讯作者:

*杜清, E-mail: 171765300@qq.com;

王彬, E-mail: beinwang@126.com

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2022-0208

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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RefWorks
TxT

Genomic feature	Accession	Overall length/bp	LSC length/bp	SSC length/bp	IR length/bp	Total gene	Protein- coding gene	tRNA		rRNA	GC content /%
Lycopus europaeus	OM617843.1	152 085	83 103	17 734	25 624	132	88	36		8	38.04
L. lucidus Turcz. var. hirtus Regel	MT980792.1	152 096	83 111	17 737	25 624	132	88	36	8	38.04
Dracocephalum taliense	MT473756.1	150 976	82 253	17 365	25 679	132	87	37	8	37.78
Dracocephalum tanguticum	NC_057508.1	150 954	82 221	17 363	25 685	133	88	37	8	37.8
Dracocephalum heterophyllum	MW970109.1	150 860	82 146	17 360	25 673	133	88	37	8	37.76
Dracocephalum moldavica	NC_057509.1	149 868	81 450	17 066	25 676	133	88	37	8	37.83
Glechoma longituba	MK609928.1	153 069	114 878	20 791	8 700	132	87	37	8	37.84
Mentha spicata	NC_037247.1	152 132	83 219	17 663	25 625	132	87	37	8	37.85
Mentha canadensis	NC_044082.1	152 154	83 278	17 676	25 600	132	87	37	8	37.81
Salvia miltiorrhiza	NC_020431.1	151 328	82 695	17 555	25 539	132	87	37	8	38.02
Salvia plebeia	NC_050929.1	151 062	82 454	17 498	25 555	132	87	37	8	38.01
Salvia splendens	NC_050901.1	150 604	82 181	17 857	25 283	130	86	36	8	38.04
Salvia przewalskii	NC_041091.1	151 319	82 732	17 605	25 491	132	87	37	8	37.96
Salvia yunnanensis	NC_050903.1	151 413	82 656	17 577	25 590	132	87	37	8	38.02
Scutellaria baicalensis	NC_027262.1	152 731	83 950	17 475	25 653	132	87	37	8	38.38
Scutellaria rehderiana	MT982397.1	151 827	83 971	17 330	25 263	132	87	37	8	38.33
Scutellaria amoena	NC_057255.1	151 569	83 738	17 325	25 253	131	87	36	8	38.36
Anisomeles indica	NC_046781.1	151 900	83 143	17 555	25 601	132	87	37	8	38.26
Caryopteris mongholica	NC_035729.1	151 707	83 203	17 226	25 639	131	86	37	8	38.24
Galeopsis bifida	MT473759.1	151 890	82 936	17 672	25 641	132	87	37	8	38.47
Leonurus japonicus	NC_038062.1	151 610	82 827	17 515	25 634	132	87	37	8	38.41
Nepeta cataria	NC_051544.1	152 399	83 340	17 605	25 697	132	87	37	8	37.85
Pogostemon cablin	NC_042796.1	152 461	83 553	17 584	25 662	132	87	37	8	38.24
Clerodendrum trichotomum	NC_057680.1	151 549	83 065	17 306	25 589	131	86	37	8	38.2
Rosmarinus officinalis	NC_027259.1	152 462	83 355	17 965	25 571	132	87	37	8	37.99
Stellera chamaejasme	NC_042714.1	173 381	86 769	2 858	41 877	132	87	37	8	36.68
Potentilla chinensis	MN871983.1	157 053	86 174	15 829	27 525	126	81	37	8	36.81
Prunella vulgaris	NC_039654.1	151 342	82 606	17 420	25 613	133	88	37	8	37.92

Genomic feature

Accession

Overall length/bp

LSC length/bp

SSC length/bp

IR length/bp

Total gene

Protein- coding gene

tRNA

rRNA

GC content /%

gene

Lycopus europaeus

OM617843.1

152 085

83 103

17 734

25 624

132

38.04

L. lucidus Turcz. var. hirtus Regel

MT980792.1

152 096

83 111

17 737

25 624

132

38.04

Dracocephalum taliense

MT473756.1

150 976

82 253

17 365

25 679

132

37.78

Dracocephalum tanguticum

NC_057508.1

150 954

82 221

17 363

25 685

133

37.8

Dracocephalum heterophyllum

MW970109.1

150 860

82 146

17 360

25 673

133

37.76

Dracocephalum moldavica

NC_057509.1

149 868

81 450

17 066

25 676

133

37.83

Glechoma longituba

MK609928.1

153 069

114 878

20 791

8 700

132

37.84

Mentha spicata

NC_037247.1

152 132

83 219

17 663

25 625

132

37.85

Mentha canadensis

NC_044082.1

152 154

83 278

17 676

25 600

132

37.81

Salvia miltiorrhiza

NC_020431.1

151 328

82 695

17 555

25 539

132

38.02

Salvia plebeia

NC_050929.1

151 062

82 454

17 498

25 555

132

38.01

Salvia splendens

NC_050901.1

150 604

82 181

17 857

25 283

130

38.04

Salvia przewalskii

NC_041091.1

151 319

82 732

17 605

25 491

132

37.96

Salvia yunnanensis

NC_050903.1

151 413

82 656

17 577

25 590

132

38.02

Scutellaria baicalensis

NC_027262.1

152 731

83 950

17 475

25 653

132

38.38

Scutellaria rehderiana

MT982397.1

151 827

83 971

17 330

25 263

132

38.33

Scutellaria amoena

NC_057255.1

151 569

83 738

17 325

25 253

131

38.36

Anisomeles indica

NC_046781.1

151 900

83 143

17 555

25 601

132

38.26

Caryopteris mongholica

NC_035729.1

151 707

83 203

17 226

25 639

131

38.24

Galeopsis bifida

MT473759.1

151 890

82 936

17 672

25 641

132

38.47

Leonurus japonicus

NC_038062.1

151 610

82 827

17 515

25 634

132

38.41

Nepeta cataria

NC_051544.1

152 399

83 340

17 605

25 697

132

37.85

Pogostemon cablin

NC_042796.1

152 461

83 553

17 584

25 662

132

38.24

Clerodendrum trichotomum

NC_057680.1

151 549

83 065

17 306

25 589

131

38.2

Rosmarinus officinalis

NC_027259.1

152 462

83 355

17 965

25 571

132

37.99

Stellera chamaejasme

NC_042714.1

173 381

86 769

2 858

41 877

132

36.68

Potentilla chinensis

MN871983.1

157 053

86 174

15 829

27 525

126

36.81

Prunella vulgaris

NC_039654.1

151 342

82 606

17 420

25 613

133

37.92

Gene function	Category	Gene name
Self-replication	rRNA genes	rrn16S (×2), rrn23S (×2), rrn5S (×2), rrn*4.5S (×2)
tRNA genes	36 trn genes (8 contain one intron)
Small subunit of ribosome	rps11, rps12 (×2), rps14, rps15, rps16, rps18, rps19 (×2), rps2, rps3, rps4, rps7 (×2), rps8
Large subunit of ribosome	rpl14, rpl16, rpl2 (×2), rpl20, rpl22, rpl23 (×2), rpl32, rpl33, rpl36
DNA-dependent RNA polymerase	rpoA, rpoB, rpoC1, rpoC2
Photosynthesis	Subunits of NADH-dehydrogenase	ndhA, ndhB (×2), ndhC, ndhD, ndhE, ndhF, ndhG, ndhH, ndhI, ndhJ, ndhK
Subunit of rubisco	rbcL
Subunits of photosystem Ⅰ	psaA, psaB, psaC, psal, psaJ
Subunits of photosystem Ⅱ	psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbI, psbJ, psbK, psbL, psbM, psbN, psbT, psbZ, ycf3
Subunits of cytochrome b/f complex	petA, petB, petD, petG, petL, petN
Subunits of ATP synthase	atpA, atpB, atpE, atpF, atpH, atpI
Other genes	c-Type cytochrome synthesis gene	ccsA
Protease	clpP
Envelop membrane protein	cemA
Subunit of acetyl-CoA-carboxylase	accD
Maturase	matK
Translational initiation factor	infA
Unknown function	Supposed chloroplast reading frame	ycf1, ycf15 (×2), ycf2 (×2), ycf4

Gene function