药学学报

Gene		Primer sequence
IL-1β	F	AACAGCGAGGGAGAAACTGG
	R	GGTCGGAGATTCGTAGCTGG
IL-18	F	GCTTGAATCTAAATTATCAGTC
	R	GAAGATTCAAATTGCATCTTAT
TNF-α	F	CTACGTTTGCTTTGCTCTGGTGA
	R	CCGGTCTGAATTCCTTTGCTC
GAPDH	F	TCCAAAATCAAGTGGGGCGA
	R	TGATGACCCTTTTGGCTCCC

Gene		Primer sequence
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IL-18	F	GCTTGAATCTAAATTATCAGTC
	R	GAAGATTCAAATTGCATCTTAT
TNF-α	F	CTACGTTTGCTTTGCTCTGGTGA
	R	CCGGTCTGAATTCCTTTGCTC
GAPDH	F	TCCAAAATCAAGTGGGGCGA
	R	TGATGACCCTTTTGGCTCCC

葛根素通过改善线粒体呼吸功能减轻血管内皮细胞氧化损伤

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孙姝婵 , 龚迪菲 , 袁天翊 , 王守宝 , 方莲花 ^* , 杜冠华 ^*

药学学报 | 研究论文 2022,57(5): 1352-1360

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药学学报 | 研究论文 2022, 57(5): 1352-1360

葛根素通过改善线粒体呼吸功能减轻血管内皮细胞氧化损伤

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孙姝婵, 龚迪菲, 袁天翊, 王守宝, 方莲花^*, 杜冠华^*

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

*方莲花, Tel: 86-10-63165313, E-mail: fanglh@imm.ac.cn;

杜冠华, Tel: 86-10-63165184, E-mail: dugh@imm.ac.cn

Puerarin reduces oxidative damage to vascular endothelial cells by improving mitochondrial respiratory function

Shu-chan SUN, Di-fei GONG, Tian-yi YUAN, Shou-bao WANG, Lian-hua FANG^*, Guan-hua DU^*

Affiliations

Beijing Key Laboratory of Drug Targets Identiﬁcation and Drug Screening, State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

出版时间: 2022-05-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2021-1590

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摘要

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本研究旨在探究黄酮类化合物葛根素对过氧化氢(H₂O₂) 诱导损伤的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC) 的影响及其机制。采用体外培养HUVEC细胞, 设立空白组、模型组(H₂O₂ 400 μmol·L^-1)、不同浓度葛根素组(3、10、30、100 μmol·L^-1)。采用葛根素预孵育2 h, H₂O₂损伤HUVEC细胞24 h。CCK-8法检测细胞活力, Transwell小室观察细胞迁移能力, 以JC-1为荧光探针检测线粒体膜电位。O2k线粒体功能检测系统测定线粒体呼吸功能。RT-PCR实验技术分析细胞中肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β) 和白细胞介素-18 (interleukin-18, IL-18) 的mRNA表达水平; Western blot检测细胞焦亡相关蛋白氮端gasdermin D (N-GSDMD)、裂解天冬氨酸特异蛋白酶-1 (cleaved-cysteinyl aspartate specific proteinase-1, cleaved-caspase-1)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (NOD-like receptor protein 3, NLRP3) 和嘌呤能离子通道型受体7 (purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor, P2X7R) 的表达水平。结果显示, 400 μmol·L^-1 H₂O₂处理24 h对HUVEC细胞有明显的损伤作用, 与模型组比较, 葛根素能够浓度依赖性地提高细胞活力, 其中30和100 μmol·L^-1效果最为显著; 葛根素能够显著降低线粒体膜电位, 改善线粒体呼吸功能, 抑制H₂O₂诱导的细胞迁移, 降低炎性因子的表达, 下调焦亡相关蛋白的表达。上述研究结果表明, 葛根素能够抑制HUVEC细胞的迁移, 减轻H₂O₂诱导的HUVEC氧化损伤, 其机制可能与改善线粒体呼吸功能、抑制细胞焦亡有关。

关键词

葛根素 / 人脐静脉内皮细胞 / 作用机制 / 线粒体 / 细胞焦亡

Abstract

收起

This study investigated the effect of puerarin on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) injured with hydrogen peroxide (H₂O₂). HUVEC were divided into three groups: a control group, a model group (H₂O₂ 400 μmol·L^-1) and a puerarin-treated group (3, 10, 30 and 100 μmol·L^-1). HUVEC were cultured with varied concentration of puerarin for 2 h and treated with H₂O₂ for another 24 h. Cell proliferation was detected by a CCK-8 assay. The mitochondrial membrane potential was measured by a JC-1 fluorescent probe. A transwell chamber assay was adopted to observe cell migration ability. Mitochondrial respiratory function was measured in a two-chamber titration injection respirometer (Oxygraph-2k). The expression of interleukin-1β (IL-1β), interleukin-18 (IL-18) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) was detected by quantitative real-time PCR. The expression of pyroptosis-mediated proteins, including cleaved-cysteinyl aspartate-specific proteinase-1 (caspase-1), N-gasdermin D (N-GSDMD), NOD-like receptor protein 3 (NLRP3) and purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor (P2X7R) was detected by Western blot. The results show that 400 μmol·L^-1 H₂O₂ treatment for 24 h causes obvious damage to HUVEC. Compared with the model group, puerarin protected against cellular injury in a dose-dependent manner, with the greatest effect at a dose of 30 and 100 μmol·L^-1. Puerarin significantly decreased the mitochondrial membrane potential and improved mitochondrial function. Puerarin inhibited cell migration induced by H₂O₂, suppressed the expression of IL-1β, IL-18 and TNF-α, and down-regulated the pyroptosis-mediated protein. These changes are statistically significant (P < 0.05). These findings demonstrate that puerarin has a protective effect against H₂O₂-induced oxidative damage of HUVEC by inhibiting the migration of HUVEC cells. The mechanism may be related to improved mitochondrial respiratory function and inhibition of pyroptosis.

Key words

puerarin / human umbilical vein endothelial cell / mechanism / mitochondria / pyroptosis

引用本文

孙姝婵, 龚迪菲, 袁天翊, 王守宝, 方莲花, 杜冠华. 葛根素通过改善线粒体呼吸功能减轻血管内皮细胞氧化损伤. 药学学报, 2022 , 57 (5) : 1352 -1360 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-1590

Shu-chan SUN, Di-fei GONG, Tian-yi YUAN, Shou-bao WANG, Lian-hua FANG, Guan-hua DU. Puerarin reduces oxidative damage to vascular endothelial cells by improving mitochondrial respiratory function[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2022 , 57 (5) : 1352 -1360 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-1590

正文

收起

血管内皮功能障碍是心血管疾病发展的主要危险因素^[1], 人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 是内皮细胞的主要类型, HUVEC细胞膜含有β受体和血管紧张素1型受体(angiotensin type 1 receptor, AT1 receptor) 等, 具有多种生理功能, 是研究心血管疾病的重要工具^[2]。虽然内皮细胞大部分ATP是由无氧糖酵解提供的^[3], 但是内皮细胞线粒体在能量储备、感测血氧水平等过程中仍起到不可忽视的作用^[4]。因此探究内皮细胞与线粒体的关系对心血管疾病的预防与治疗具有重要意义。过氧化氢(H₂O₂) 刺激HUVEC细胞是体外氧化损伤的经典模型, 被广泛用于研究心血管疾病的分子机制^[5]。

细胞焦亡(pyroptosis) 又称细胞炎性坏死, 是一种程序性细胞坏死, 表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂, 导致内容物的释放进而激活强烈的炎症反应^{[6, 7]}, 在形态学上同时具有坏死和凋亡的部分特点^{[8, 9]}。细胞焦亡不仅在感染性疾病中起重要作用, 而且与心血管疾病、肿瘤和中枢神经系统疾病等也密切相关^[10], 有报道称细胞焦亡作为一种高度促炎性的细胞死亡方式可导致内皮细胞的功能障碍^[11], 但具体机制尚未阐明。

葛根素(puerarin) 是从葛根中分离出的一种异黄酮类化合物, 被誉为“植物雌激素”^[12], 具有扩张血管、抗氧化和抗炎等药理作用^{[13, 14]}, 对帕金森病、糖尿病和心血管疾病有很好的疗效, 并可通过细胞焦亡信号通路保护人视网膜内皮细胞的氧化损伤^[15], 但葛根素能否通过该通路保护HUVEC细胞氧化损伤尚不明确。葛根素注射液已广泛应用于中国临床^{[16, 17]}, 但由于临床试验的可用性有限, 其对人体的有益结果仍不清楚。葛根素对细胞的许多保护作用不能完全转化为疗效, 如何正确评价葛根素对细胞的保护作用仍需深入研究。本研究拟采用H₂O₂诱导损伤的HUVEC细胞模型, 以探讨葛根素在保护血管内皮损伤方面的作用及其机制, 为临床应用提供参考。

材料与方法

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主要试剂 葛根素(纯度 > 99%) 由中国医学科学院药物研究所晶型中心提供; 细胞计数试剂盒-8 (CCK-8) 细胞增殖-毒性检测试剂盒购自Dojindo化学研究所; DMEM细胞培养基和胎牛血清均购自Gibco公司; 线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) 购自上海碧云天生物技术有限公司; 地高辛、谷氨酸、苹果酸、ADP、琥珀酸、寡霉素、三氟甲氧基苯腙羰基氰化物(carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone, FCCP)、鱼藤酮和抗霉素A购自Sigma-Aldrich公司; 试剂MiR05购自北京华威中仪科技有限公司; Trizol RNA提取试剂、2× Taq PCR Master Mix试剂购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司; 5× RTIII All-in-One Mix反转录试剂购自莫纳生物; BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE分离胶和浓缩胶、辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP) 标记山羊抗兔lgG、HRP标记山羊抗小鼠lgG、HRP标记兔抗山羊lgG购自北京普利来基因技术有限公司; 0.1%结晶紫染色液、4%组织细胞固定液购自北京索莱宝科技有限公司; 白细胞介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、白细胞介素-18 (interleukin-18, IL-18)、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α) 引物序列由PubMed网站设计(表 1), 合成并购自北京奥科鼎盛生物科技有限公司; 嘌呤能离子通道型受体7 (purinergic ligand-gated ion channel 7 receptor, P2X7R) 抗体(Santa Cruz biotechnology公司)、核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3 (NOD-like receptor protein 3, NLRP3) 及cleaved C-terminal gasdermin D (GSDMD) 抗体(美国Abcam公司)、cleaved-caspase-1及β-actin抗体(Cell Signaling Technology公司); ECL化学发光检测试剂盒(北京康为试剂生物科技有限公司)。其他试剂均为国产分析纯。

细胞培养 HUVEC细胞在含10%胎牛血清、100 u·mL^-1青霉素和100 μg·mL^-1链霉素的DMEM培养液中培养, 37 ℃、5% CO₂饱和湿度培养, 每隔两天传代, 待细胞处于对数生长期时用于实验。

细胞模型及分组 选对数生长期、状态良好的HUVEC细胞, 依据实验选择接种于96孔板、培养皿或6孔板中。建立H₂O₂诱导损伤HUVEC内皮细胞模型, H₂O₂终浓度为400 μmol·L^-1。实验分组: 空白组(不加药、同等体积培养基); 模型组(400 μmol·L^-1 H₂O₂); 给药组: 以终浓度3、10、30、100 μmol·L^-1葛根素预孵育2 h, 之后与400 μmol·L^-1 H₂O₂共培养24 h。

CCK-8法检测细胞存活率 取对数生长期的HUVEC内皮细胞(9~12代), 0.25%胰蛋白酶消化后, 计数, 调整细胞密度, 以5 000个/孔接种于96孔板中。采用CCK-8测定法测定葛根素和/或H₂O₂对HUVEC细胞的毒性。实验终点, 移去上清液, 每个孔中加入80 μL CCK-8 (1∶10稀释) 溶液, 然后在37 ℃下继续培养0.5~1 h。使用Molecular Devices SpectraMax M5酶标仪在450 nm下测定吸光度, 计算各孔细胞活力。

细胞迁移率测定 将对数生长期的HUVEC细胞消化, 用不含血清的DMEM培养基重悬细胞, 调整细胞密度为每毫升5×10⁵个, 取300 µL细胞悬液接种到Transwell小室内, 每组设置3个复孔, 并在24孔板内(下室) 加入600 µL含20% FBS的DMEM培养基作为趋化因子。分别在细胞培养24及48 h后取出小室, 用棉签擦去上层细胞, 将滤膜下表面的细胞用4%多聚甲醛固定, 用0.1%结晶紫染色, 用纯水洗去残余染料, 于倒置显微镜(200×) 下观察并拍照。每组至少随机选取5个视野计数。

JC-1荧光探针检测线粒体膜电位 取对数生长期的HUVEC内皮细胞(9~12代), 0.25%胰蛋白酶消化后, 计数, 调整细胞密度, 以5 000个/孔接种于96孔板中。采用JC-1荧光探针测定线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)。实验终点, 移去上清液, 每孔加入100 μL JC-1染色工作液(1×), 充分混匀, 在细胞培养箱中37 ℃孵育20 min, 孵育结束后吸除上清, 用JC-1染色缓冲液(1×) 洗涤2次, 最后每孔加100 μL细胞培养液, 荧光显微镜下观察。使用Molecular Devices Spectra Max M5酶标仪检测JC-1单体(激发光设置为490 nm, 发射光设置为530 nm) 和JC-1聚合物(激发光设置为525 nm, 发射光设置为590 nm)。

Oxygraph-2k (O2k) 线粒体功能测定系统检测线粒体呼吸功能 对舱内的氧气浓度进行校准。取对数生长期的HUVEC内皮细胞(9~12代), 0.25%胰蛋白酶消化后, 计数, 调整细胞密度, 以每毫升2×10⁵个接种于细胞皿中。实验终点时, 通过胰蛋白酶消化, 在室温下800 r·min^-1离心3 min, 然后用细胞培养基或MiR05将细胞重悬。将重悬细胞加入线粒体呼吸功能测定系统(O2k; Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria)。检测室内细胞最终浓度约为每毫升1×10⁶个细胞。稳定5 min后, 关闭舱室。数据通过DatLab软件5.2 (Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria) 记录。为了检测HUVEC内皮细胞线粒体呼吸功能, 在渗透性细胞中采用底物-解偶联-抑制剂滴定方法, 方案如下: 细胞在舱室呼吸稳定一段时间后, 测量常规呼吸。用洋地黄素(Dig, 每10⁶个细胞150 µg Dig) 进行质膜透化。在没有ADP滴定的情况下, 采用谷氨酸(G, 5 mmol·L^-1) 和苹果酸(M, 2 mmol·L^-1) 用于诱导复合物Ⅰ的呼吸泄漏状态(CI leak)。然后, 加入5 mmol·L^-1 ADP检测复合物Ⅰ的氧化磷酸化(OXPHOS) 能力(CI P)。之后, 加入琥珀酸(100 mmol·L^-1) 诱导最大氧化磷酸化, 包括复合物Ⅰ和复合物Ⅱ (CI + II P)。然后, 使用寡霉素和FCCP滴定法测定电子转移系统(ETS) 的最大解偶呼吸容量(CI + II ETS)。加入鱼藤酮(Rot, 0.5 µmol·L^-1) 后检测复合物Ⅱ的非偶联呼吸功能(CII ETS)。最后, 使用抗霉素A (2.5 µmol·L^-1) 评价残余耗氧量。

qRT-PCR检测HUVEC细胞IL-1β、IL-18、TNF-α的表达 各组细胞分别处理24 h后, Trizol法提取细胞中总RNA。根据Takara逆转录试剂盒进行逆转录反应生成cDNA, 步骤严格按照试剂盒的说明进行。各基因对应上下游引物各0.4 μL, 2× AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL, cDNA模板1.6 μL, 灭菌双蒸水8 μL。PCR反应程序: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s, 95 ℃ 15 s, 35个循环; 60 ℃ 60 s; 95 ℃ 15 s; 选取GAPDH为内参基因。采用2^－△△Ct表示各基因的相对表达量。

蛋白收集与Western blot检测焦亡相关蛋白的表达水平 实验终点, 迅速弃去培养基, 用4 ℃预冷的PBS清洗2次, 加入适量含蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液, 冰上裂解30 min, 用洁净的细胞刮将细胞刮下, 吸入1.5 mL EP管中。高速离心机4 ℃、12 000 r·min^-1离心15 min, BCA法测定蛋白浓度。RIPA调整蛋白浓度后, 加入5×上样缓冲液, 金属浴100 ℃加热10 min。蛋白分装并存储于-80 ℃保存备用。Western blot实验: 每孔上样50 μg蛋白样品, 进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 电转移至PVDF膜, 5%脱脂奶粉封闭2 h, 漂洗之后与焦亡相关的一抗4 ℃下孵育过夜, 经TBST洗膜后, 加入相应二抗25 ℃孵育2 h, 洗膜, ECL显色、曝光、分析条带。

统计学分析 采用GraphPad Prism 7.0软件进行分析, 结果均以$ \stackrel{-}{x} $ ± s表示, 两组间比较用t检验, 多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)。P < 0.05认为具有统计学意义。

结果

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1 不同浓度H₂O₂对HUVEC内皮细胞活力的影响

将H₂O₂设置浓度梯度分别诱导HUVEC细胞24 h, 通过CCK-8法检测H₂O₂对HUVEC细胞活力的影响, 确认模型条件。结果显示(图 1), 随着H₂O₂浓度的升高, 细胞活力越来越低。其中400 μmol·L^-1 H₂O₂孵育HUVEC细胞24 h后, 细胞活力变化明显, 综合考虑, 将选用400 μmol·L^-1 H₂O₂进行诱导损伤。

2 葛根素对正常及H₂O₂条件下HUVEC细胞活力的影响

通过CCK-8法检测葛根素潜在细胞毒性, 探究正常条件下葛根素对HUVEC细胞活力的影响。结果显示(图 2A) 葛根素(3~100 μmol·L^-1) 单独孵育HUVEC细胞24 h后, 与对照组相比, 细胞活力无统计学差异, 表明此浓度下葛根素对HUVEC无明显毒性。接下来(图 2B), 400 μmol·L^-1 H₂O₂作用于HUVEC细胞24 h后, 与正常对照组相比, 细胞存活率明显降低(P < 0.01), 说明400 μmol·L^-1 H₂O₂对HUVEC细胞产生了明显的内皮细胞损伤并导致细胞死亡。葛根素(3~100 μmol·L^-1) 预孵育2 h后, 可以保护细胞免受损伤, 且具有浓度依赖性, 其中以30和100 μmol·L^-1葛根素药物作用效果最好(P < 0.05)。

3 葛根素抑制H₂O₂诱导HUVEC内皮细胞迁移

采用Transwell小室对细胞迁移情况进行评价, 小室上层为无血清DMEM培养基, 下层溶液加入含20% FBS的DMEM培养基, 诱导细胞迁移。结果显示(图 3), 诱导迁移24和48 h后, 模型组下表面细胞数量较对照组明显增多, 葛根素各给药组浓度依赖性地减少细胞迁移数量, 以高浓度葛根素效果最为显著。

4 葛根素对HUEVC内皮细胞线粒体膜电位的影响

激光共聚焦显微观察及JC-1探针染色法检测各组线粒体膜电位变化。结果显示(图 4), 与对照组相比, 模型组的JC-1探针绿色荧光强度明显增强, 红色荧光强度明显减弱(P < 0.05), 表示线粒体膜电位下降; 与模型组相比, 葛根素可以剂量依赖性地减弱JC-1探针的绿色荧光, 红色荧光强度增加, 线粒体膜电位升高(P < 0.05), 其中以100 μmol·L^-1葛根素效果最为显著。

5 葛根素对HUVEC细胞线粒体呼吸功能的影响

细胞预孵育100 μmol·L^-1葛根素2 h, 再经400 μmol·L^-1 H₂O₂处理24 h。通过O2k线粒体呼吸功能仪, 采用底物-解偶联-抑制剂滴定方法, 研究HUVEC内皮细胞中与复合物Ⅰ和Ⅱ相关的线粒体呼吸, HUVEC细胞在不同条件下实时的呼吸状态如图 5A所示; 舱室氧含量的变化情况如图 5B所示; HUVEC细胞在不同条件下的呼吸速率如图 5C所示。结果显示(图 5D), HUVEC细胞经H₂O₂诱导损伤后, 线粒体呼吸速率降低, CI和CI + CII氧化磷酸化(CI P和CI + II P) 能力以及CI + CII电子传递(CI + II ETS) 能力降低最为显著(P < 0.01), 舱室氧量变化不明显。而预孵育葛根素能改善细胞呼吸功能, 其中以CI + CII电子转移系统(CI + II ETS) 最为显著(P < 0.05)。

6 葛根素对H₂O₂诱导损伤HUVEC炎症因子转录水平的影响

通过qRT-PCR在转录水平探究葛根素对H₂O₂诱导损伤HUVEC细胞炎症因子的影响。如图 6所示, 与对照组相比, H₂O₂刺激能够显著增加内皮细胞中TNF-α的mRNA转录水平, 以及细胞焦亡相关的炎症因子IL-1β和IL-18的mRNA转录水平也显著增加, 而葛根素可以浓度依赖地降低TNF-α、IL-1β和IL-18 mRNA的转录水平。

7 葛根素对H₂O₂诱导损伤HUVEC焦亡通路的影响

葛根素对H₂O₂诱导损伤HUVEC细胞焦亡通路的影响, 实验结果显示(图 7), 与对照组相比, 模型组中N-GSDMD、cleaved-caspase-1、NLRP3、P2X7R蛋白表达水平明显升高(P < 0.05); 与模型组相比, 葛根素可以剂量依赖性地降低N-GSDMD、cleaved-caspase-1、NLRP3、P2X7R蛋白的表达水平, 说明葛根素可能通过调节细胞焦亡改善H₂O₂引起的内皮细胞损伤。

讨论

收起

内皮细胞是血管生成所必需的, 是调控炎症、维持血管张力和调节血压的重要通道^{[18, 19]}, 血管内皮细胞损伤是导致多种心血管疾病发生的关键因素。H₂O₂作为一种机体产生的活性氧(reactive oxygen species, ROS), 低浓度时可作为信号分子传导信号, 高浓度则引起氧化应激^[20], 氧化应激会导致血管内皮细胞的功能紊乱, 从而导致心脑血管疾病的发生。

内皮细胞的增殖能力对于修复血管内皮、维持血管壁的完整性至关重要^{[21, 22]}。H₂O₂刺激导致内皮细胞损伤和死亡, 而葛根素可以温和保护内皮细胞, 提高细胞活力。血管内皮细胞迁移是血管生成的关键步骤, 也是新生血管形成的基础。但内皮细胞在氧化应激条件下, 会失去正常的细胞-基质相互作用, 获得了氧化应激下的迁移能力, 伴随着细胞迁移和侵袭能力的改变而导致细胞屏障功能障碍^[23]。本研究中Transwell实验显示, 葛根素明显降低HUVEC细胞的迁移活性, 抑制H₂O₂诱导的细胞迁移, 改善H₂O₂引起的细胞损伤, 以维持血管内平衡。

线粒体维持较高的膜电位对细胞存活起至关重要的作用, 当内皮细胞受氧化应激损伤后, ROS可以引起线粒体渗透性转换孔的开放引起线粒体膜电位降低^[24], 说明H₂O₂可以诱导HUVEC细胞发生凋亡, 破坏线粒体结构; 而葛根素可以升高在H₂O₂条件下HUVEC细胞的线粒体膜电位, 保护内皮细胞免受损伤。有研究发现, 平滑肌细胞受到氧化损伤后, 线粒体复合物Ⅰ活性下降^[25], 而内皮细胞发生氧化损伤后, 细胞内线粒体基础呼吸及复合物Ⅰ、Ⅱ的改变研究较少。本研究通过O2k线粒体呼吸功能仪, 采用底物-解偶联-抑制剂滴定方法, 发现HUVEC细胞经H₂O₂诱导损伤后, 线粒体呼吸速率降低, 舱室氧量变化不明显。而预孵育葛根素能改善细胞呼吸功能, 提高线粒体复合物Ⅰ和Ⅱ的活性, 升高细胞耗氧速率, 其中改善线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ电子转移系统效果最为显著。以上结果提示, 葛根素可以抑制细胞凋亡并对氧化损伤后的内皮细胞线粒体功能有一定的保护作用。

在细胞焦亡过程中, 线粒体作为细胞的供能器官起到了至关重要的作用, 线粒体功能的失衡可导致细胞焦亡的发生^[26]。细胞焦亡是由caspase-1或caspase-11/4/5介导的伴随炎症反应的程序性死亡模式^[27]。氧化应激不仅损伤血管内皮细胞, 而且还能增加炎性细胞因子的产生。本研究发现, H₂O₂处理HUVEC细胞发生氧化应激后, 能使细胞内炎性细胞因子IL-1β、IL-18和TNF-α的表达显著增加, 并且H₂O₂干预, 导致细胞焦亡的关键性蛋白N-GSDMD和cleaved-caspase-1表达显著升高, 与此同时NLRP3和P2X7R表达也明显同步升高, 提示NLRP3/caspase-1介导的细胞焦亡的激活与P2X7R的激活同步。而预孵育葛根素显著减少炎性因子的表达, 降低N-GSDMD、cleaved-caspase-1、NLRP3、P2X7R蛋白的表达水平, 因此葛根素在改善线粒体呼吸功能的同时, 通过调节细胞焦亡改善H₂O₂引起的内皮细胞损伤, 并且此保护作用可能与P2X7R密切相关。

本研究采用H₂O₂诱导的HUVEC细胞损伤模型, 探索了葛根素对HUVEC细胞的保护作用及其机制。结果表明, H₂O₂刺激内皮细胞后, 线粒体呼吸功能受损, 线粒体膜电位改变, 导致caspase信号通路的激活, 而葛根素可以通过改善线粒体呼吸, 维持线粒体功能稳定, 调节NLRP3-caspase-1-GSDMD介导的细胞焦亡通路, 本文为进一步开展葛根素治疗心血管疾病的研究奠定实验基础。

作者贡献: 孙姝婵负责实验研究和文章撰写; 龚迪菲参与部分实验研究; 袁天翊参与论文修改; 王守宝和方莲花负责实验设计、论文修改和基金获得; 杜冠华负责实验监督及论文审阅。

利益冲突: 所有作者均声明不存在利益冲突。

基金

收起

国家自然科学基金资助项目(81773935)
国家自然科学基金资助项目(82073853)
中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-005)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2022年第57卷第5期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2021-1590

接收时间：2021-11-05
首发时间：2025-12-23
出版时间：2022-05-12

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收稿日期：2021-11-05
修回日期：2021-12-17

基金

国家自然科学基金资助项目(81773935)

国家自然科学基金资助项目(82073853)

中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2021-I2M-1-005)

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 药物靶点研究与新药筛选北京市重点实验室, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 北京 100050

通讯作者:

*方莲花, Tel: 86-10-63165313, E-mail: fanglh@imm.ac.cn;

杜冠华, Tel: 86-10-63165184, E-mail: dugh@imm.ac.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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