药学学报

Primer name	Primer sequence (5'-3')	Function
pCold-PvfIDI1-F	GGTACCCTCGAGGGATCCATGTCAACCACAATCCTTTTTC	Cloning and vector construction (pCold-GST-DNA) of PvfIDI1
pCold-PvfIDI1-R	TCTAGACTGCAGGTCGACTCATATCAATTTGTGAATAATTTTC
pCold-PvfIDI2-F	GGTACCCTCGAGGGATCCATGTCAACCACATCCCCTTTTCAAG	Cloning and vector construction (pCold-GST-DNA) of PvfIDI2
pCold-PvfIDI2-R	TCTAGACTGCAGGTCGACTCATGTCAATTTGTGAATAGTTTTC
PvfIDI1-qRT-F	GTGTCGTTGGCCATGATACT	Quantitative analysis of PvfIDI1
PvfIDI1-qRT-R	TGCTGAAGGAGCAACTCATATT
PvfIDI2-qRT-F	CTGCCAAATCCAAGTCCAAATC	Quantitative analysis of PvfIDI2
PvfIDI2-qRT-R	ACACGAGGAGAGAGAAGAGATAG
ACT1-F	GATTCCGTTGCCCAGAAGTA	Quantitative analysis of PvfACT1
ACT1-R	TCCTGATATCAACATCGCACTT
pTrc-PvfIDI1-F	GGGGTACCATGTCAACCACAATCCTTTT	Vector construction (pTrc) of PvfIDI1
pTrc-PvfIDI1-R	CGGGATCCTCATATCAATTTGTGAATAATT
pTrc-PvfIDI2-F	GGGGTACCATGTCAACCACATCCCCTTT	Vector construction (pTrc) of PvfIDI2
pTrc-PvfIDI2-R	CGGGATCCTCATGTCAATTTGTGAATAGTT

Primer name	Primer sequence (5'-3')	Function
pCold-PvfIDI1-F	GGTACCCTCGAGGGATCCATGTCAACCACAATCCTTTTTC	Cloning and vector construction (pCold-GST-DNA) of PvfIDI1
pCold-PvfIDI1-R	TCTAGACTGCAGGTCGACTCATATCAATTTGTGAATAATTTTC
pCold-PvfIDI2-F	GGTACCCTCGAGGGATCCATGTCAACCACATCCCCTTTTCAAG	Cloning and vector construction (pCold-GST-DNA) of PvfIDI2
pCold-PvfIDI2-R	TCTAGACTGCAGGTCGACTCATGTCAATTTGTGAATAGTTTTC
PvfIDI1-qRT-F	GTGTCGTTGGCCATGATACT	Quantitative analysis of PvfIDI1
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PvfIDI2-qRT-R	ACACGAGGAGAGAGAAGAGATAG
ACT1-F	GATTCCGTTGCCCAGAAGTA	Quantitative analysis of PvfACT1
ACT1-R	TCCTGATATCAACATCGCACTT
pTrc-PvfIDI1-F	GGGGTACCATGTCAACCACAATCCTTTT	Vector construction (pTrc) of PvfIDI1
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pTrc-PvfIDI2-R	CGGGATCCTCATGTCAATTTGTGAATAGTT

越南参变种异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆与功能研究

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王一博 , 管丽娜 , 曹小青 , 王雪 , 程景平 , 王宝婕 , 徐福荣 ^* , 马晓惠 ^*

药学学报 | 专题报道Ⅱ：植物天然产物生物合成及合成生物学 2021,56(12): 3362-3369

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药学学报 | 专题报道Ⅱ：植物天然产物生物合成及合成生物学 2021, 56(12): 3362-3369

越南参变种异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆与功能研究

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王一博, 管丽娜, 曹小青, 王雪, 程景平, 王宝婕, 徐福荣^*, 马晓惠^*

作者信息

云南中医药大学中药学院, 云南昆明 650500

通讯作者:

*徐福荣，Tel: 13759178255, E-mail: xfrong99@163.com;

马晓惠，Tel: 13668710904, E-mail: maxiaohui1988@126.com

Cloning and functional characterization of isopentenyl diphosphate isomerase genes from Panax vietnamensis var. fuscidiscus

Yi-bo WANG, Li-na GUAN, Xiao-qing CAO, Xue WANG, Jing-ping CHENG, Bao-jie WANG, Fu-rong XU^*, Xiao-hui MA^*

Affiliations

School of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Chinese Medicine, Kunming 650500, China

出版时间: 2021-12-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2021-0994

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摘要

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异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase, IDI) 是调控萜类生物合成的关键酶, 在人参皂苷生物合成过程中发挥着重要作用。本研究以越南参变种(Panax vietnamensis var. fuscidiscus) 为材料, 基于已构建的转录组数据, 筛选并克隆出2条IDI基因, 分别为PvfIDI1 (GenBank登录号MZ736417) 和PvfIDI2 (GenBank登录号MZ736418)。生物信息学分析表明, PvfIDI1和PvfIDI2的开放阅读框(open reading frame, ORF) 均为924 bp, 编码307个氨基酸, 分子质量分别为34.84 kDa和34.66 kDa, 理论等电点分别为6.01和5.66, 均具有TNTCCSHPL和WGEHELDY两个保守序列。系统进化分析显示, PvfIDI1和PvfIDI2与三七IDI的亲缘关系最近。表达分析表明, PvfIDI1和PvfIDI2基因在越南参变种根、根茎、茎和叶中均有表达, PvfIDI1在根茎中表达量最高, PvfIDI2在茎中表达量最高。在大肠杆菌中成功表达其重组蛋白, 功能显色实验表明, PvfIDI1和PvfIDI2能促进番茄红素的积累, 说明PvfIDI1和PvfIDI2编码有功能的IDI蛋白。PvfIDI1和PvfIDI2的克隆及功能研究为IDI的进一步研究及利用IDI基因调控越南参变种中人参皂苷生物合成奠定了基础。

关键词

越南参变种 / 异戊烯基焦磷酸酶 / 基因克隆 / 生物信息学分析 / 功能显色

Abstract

收起

Isopentenyl diphosphate isomerase (IDI) is a key enzyme in the regulation of triterpenes biosynthesis and plays an important role in ginsenoside biosynthesis. In this study, two IDI genes, PvfIDI1 (GenBank No. MZ736417) and PvfIDI2 (GenBank No. MZ736418) were cloned from Panax vietnamensis var. fuscidiscus. The open reading frame of both PvfIDI1 and PvfIDI2 was 924 bp encoding 307 amino acids. The molecular weights of PvfIDI1 and PvfIDI2 were 34.84 kDa and 34.66 kDa, respectively, with theoretical pIs of 6.01 and 5.66. Bioinformatic analysis indicated that PvfIDI1 and PvfIDI2 contained two conserved sequences: TNTCCSHPL and WGEHELDY. Phylogenetic analysis showed that PvfIDI1 and PvfIDI2 were closely related to Panax notoginseng IDI. Expression analysis showed that both PvfIDI1 and PvfIDI2 genes are expressed in root, rhizome, stem and leaf of P. vietnamensis var. fuscidiscus. However, PvfIDI1 is highly expressed in the rhizome and PvfIDI2 is highly expressed in the stem. PvfIDI1 and PvfIDI2 recombinant proteins were expressed in E. coli; a functional coloration experiment showed that PvfIDI1 and PvfIDI2 could promote the accumulation of lycopene, indicating that both PvfIDI1 and PvfIDI2 encode functional IDI enzymes. The cloning and functional studies on PvfIDI1 and PvfIDI2 provide a foundation for the further study of IDI and the regulation of ginsenoside biosynthesis in P. vietnamensis var. fuscidiscus.

Key words

Panax vietnamensis var. fuscidiscus / isopentenyl diphosphate isomerase / gene cloning / bioinformatic analysis / functional coloration

引用本文

王一博, 管丽娜, 曹小青, 王雪, 程景平, 王宝婕, 徐福荣, 马晓惠. 越南参变种异戊烯基焦磷酸异构酶基因的克隆与功能研究. 药学学报, 2021 , 56 (12) : 3362 -3369 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-0994

Yi-bo WANG, Li-na GUAN, Xiao-qing CAO, Xue WANG, Jing-ping CHENG, Bao-jie WANG, Fu-rong XU, Xiao-hui MA. Cloning and functional characterization of isopentenyl diphosphate isomerase genes from Panax vietnamensis var. fuscidiscus[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2021 , 56 (12) : 3362 -3369 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2021-0994

正文

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越南参变种(Panax vietnamensis var. fuscidiscus), 俗称野三七, 为五加科人参属多年生植物, 发现于云南省红河州金平苗族瑶族傣族自治县, 是我国重要的药用植物资源^[1]。人参皂苷是越南参变种的活性成分, 其在越南参变种的总含量超过10%^[2]。人参皂苷具有抗肿瘤、抗炎、免疫调节等活性^[3], 在疾病治疗过程中发挥着重要作用。人参皂苷为三萜类化合物, 异戊烯基焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate, IPP) 及其异构体二甲基丙烯基焦磷酸(dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP)为其生物合成的重要前体化合物。IPP在生物体内主要经位于细胞质中的甲羟戊酸(mevalonate, MVA) 途径和质体中的2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate, MEP) 途径合成, 其在异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase, IDI/IPI) 的催化作用下和DMAPP进行互相转化。IDI作为重要的调控萜类化合物生成的调节因子, 影响IPP和DMAPP的稳态比例, 进一步影响萜类化合物下游产物的生物合成^[4]。目前已对拟南芥(Arabidopsis thaliana)、丹参(Salvia miltiorrhiza)、雷公藤(Tripterygium wilfordii)、海岛棉(Gossypium barbadense)、茶树(Camellia sinensis) 和烟草(Nicotiana tabacum) 等多种植物的IDI基因进行克隆及相关研究, 在表达了番茄红素生物合成关键酶基因的大肠杆菌中表达植物IDI基因, 番茄红素的积累量明显增加, 说明植物IDI能促进番茄红素的积累^[5-10]。IDI与越南参变种中人参皂苷生物合成密切相关, 然而, 尚未有越南参变种中IDI基因的相关报道。

本研究基于越南参变种转录组数据, 筛选并克隆获得两条IDI基因, 利用生物学信息学软件对其编码蛋白的理化性质、跨膜结构域、蛋白结构、系统进化关系等进行分析, 采用实时荧光定量PCR分析其在越南参变种不同器官的表达情况, 并在大肠杆菌中异源表达验证其功能, 为今后利用IDI基因调控越南参变种中人参三萜皂苷生物合成奠定基础。

材料与方法

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材料实验所用植物材料采自云南省红河州金平苗族瑶族傣族自治县, 经DNA条形码技术检测18S rRNA基因和叶绿体matK基因^[1], 确定其为越南参变种(P. vietnamensis var. fuscidiscus)。样品冲洗干净, 经液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱。

DH5α Chemically Competent Cell购自翌圣生物科技(上海) 有限公司; BL21 (DE3) Chemically Competent Cell和Trans1-Blue Chemically Competent Cell均购自北京全式金生物技术有限公司。pCold GST DNA购自宝生物工程有限公司; pTrc-AtIDI和pAC-LYC由Francis X Cunningham Jr. (Gantt) (美国马里兰州学院马里兰大学) 教授惠赠。

总RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法分别提取越南参变种根、茎、叶和根茎的总RNA, 用超微量紫外可见分光光度计(DS-11, 美国DENOVIXING) 和1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量, 用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (perfect real time) (TaKaRa) 将RNA反转录为cDNA, -20 ℃保存备用。

基因克隆 分析课题组前期测序得到的越南参变种转录组数据, 转录组中共有14条序列注释为IDI基因, 通过NCBI在线序列比对和ORF分析最终获得2条具有完整开放阅读框的IDI候选基因。利用Primer Premier 5.0软件设计IDI基因全长无缝克隆特异性引物(表 1)。以越南参变种根cDNA为模板进行PCR扩增, 反应体系: PrimeSTAR HS (Premix) 25 μL、正向和反向引物(10 μmol·L^-1) 各1 μL、cDNA 1 μL、双蒸水(ddH₂O) 22 μL。反应程序: 94 ℃ 5 min; 98 ℃ 10 s, 55 ℃ 15 s, 72 ℃ 60 s; 34个循环; 72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物, PCR产物纯化后连入原核表达载体pCold GST DNA, 转化DH5α Chemically Competent Cell感受态细胞, 于含氨苄青霉素(ampicillin, Amp) (100 mg·L^-1) 的LB平板上37 ℃培养12~16 h。挑取单克隆进行菌落PCR验证, 阳性结果送至生工生物工程(上海) 股份有限公司测序。将验证正确的重组质粒命名为pCold GST DNA-PvfIDI1和pCold GST DNA-PvfIDI2。

生物信息学分析 利用NCBI (National Center for Biotechnology Information) 在线分析PvfIDIs基因的ORF和同源性; 利用ExPASy-ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/) 分析PvfIDIs蛋白的理化性质; 利用TMHMM 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 分析PvfIDIs蛋白的跨膜区; 利用SignalP 5.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0) 进行信号肽分析; 用WoLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/) 预测亚细胞定位; 使用InterPro (http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search) 分析结构功能域; 使用SOMPA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)预测蛋白的二级结构; 使用SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/)预测蛋白的三级结构; 利用BioEdit软件进行氨基酸多重序列比对; 利用NCBI的蛋白质序列数据库搜索同源序列, 通过MEGA6.0构建系统进化树, bootstrap为1 000。

表达分析 根据克隆得到的PvfIDI1和PvfIDI2序列设计实时荧光定量PCR引物(表 1), 以越南参变种根、茎、叶和根茎的cDNA作为模板。以ACT1^[11]作为内参基因, 采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) 进行实时荧光定量PCR反应, 反应在Roche LightCycler^® 96实时荧光PCR仪上进行。反应体系20 μL, 包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (Tli RNaseH Plus) (2×) 10 μL、cDNA 2 μL、正向反向引物(10 μmol·L^-1) 各1 μL以及ddH₂O 6 μL。反应程序: 95 ℃ 30 s, 95 ℃ 5 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 10 s, 40个循环; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 30 s, 95 ℃ 1 s。共设3个生物学重复, 每个样品设3个技术重复。用LightCycler® 96 SW软件分析结果。PvfIDI1和PvfIDI2的相对表达量用2^-ΔΔCt法进行计算, 在SPSS软件中使用Duncan's multiple range test (P < 0.05) 分析4个部位中表达差异的显著性。

PvfIDIs重组蛋白表达 将pCold GST DNA-PvfIDI1和pCold GST DNA-PvfIDI2转化至大肠杆菌BL21 (DE3) Chemically Competent Cell, 挑取单克隆于含Amp (100 mg·L^-1) 的LB液体培养基中, 37 ℃、250 r·min^-1培养至吸光度A₆₀₀为0.6~1.0, 加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG) 至终浓度1 mmol·L^-1, 15 ℃诱导培养15 h。4 ℃离心收集菌体, 加入PBS缓冲液进行复溶, 在功率为120 W, 5 s超声/8 s停歇的超声条件下低温超声破碎至液体澄清, 4 ℃离心分别收集上清和沉淀进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE) 凝胶电泳分析。转化pCold GST DNA的BL21 (DE3) 进行随行实验作为对照。

功能显色 用Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ酶切表达载体pTrc-AtIDI, 切胶回收获得链状pTrc载体; 以重组质粒pCold GST DNA-PvfIDI1和pCold GST DNA-PvfIDI2为模板, 用pTrc-PvfIDI1-F/R和pTrc-PvfIDI2-F/R为引物(表 1) 进行PCR扩增, 纯化后用Kpn Ⅰ和BamH Ⅰ进行酶切, 纯化后与链状pTrc载体进行连接, 连接产物转化感受态细胞Trans1-Blue Chemically Competent Cell, 于含Amp (100 mg·L^-1) 的LB平板37 ℃培养12~16 h, 菌落PCR验证并送测序, 将测序结果正确的重组质粒命名为pTrc-PvfIDI1和pTrc-PvfIDI2。将质粒pTrc、pTrc-AtIDI、pTrc-PvfIDI1和pTrc-PvfIDI2分别与pAC-LYC共转化Trans1-Blue感受态细胞, 于含Amp (100 mg·L^-1) 和氯霉素(chloramphenicol, Cm) (20 mg·L^-1) 的LB平板37 ℃培养12~16 h。同时将pAC-LYC转化Trans1-Blue感受态细胞, 于含Cm (20 mg·L^-1) 的LB平板上培养。将菌落PCR验证正确的单克隆点于含Amp (100 mg·L^-1)和Cm (20 mg·L^-1)的LB平板上, 28 ℃培养3~4天, 观察菌斑的颜色变化。

结果与分析

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1 PvfIDI1和PvfIDI2基因的克隆

以越南参变种根的cDNA为模板进行PCR扩增, 产物经1%琼脂糖凝胶进行电泳检测, PvfIDI1和PvfIDI2在1 000 bp处均有单一明亮的条带(图 1), 与转录组中IDI大小一致, 将PCR产物连入表达载体pCold GST DNA, 获得重组质粒pCold GST DNA-PvfIDI1和pCold GST DNA-PvfIDI2, 测序结果表明, PvfIDI1和PvfIDI2的ORF均为924 bp, 编码307个氨基酸。

2 PvfIDI1和PvfIDI2蛋白的生物信息学分析

2.1 理化性质分析

PvfIDI1和PvfIDI2蛋白的分子质量分别为34.84 kDa和34.66 kDa, 理论等电点(pI) 分别为6.01和5.66。信号肽分析表明, PvfIDIs蛋白均无信号肽, 为非分泌蛋白。跨膜结构域分析结果表明, PvfIDIs蛋白均无跨膜结构, 为非膜蛋白。亚细胞定位预测结果表明, PvfIDIs蛋白均定位于叶绿体上。结构域分析表明, PvfIDIs均含有异戊烯基焦磷酸异构酶的结构域(isopentenylPP_isomerase_typ1, 95~277 aa) 和NUDIX水解酶域(NUDIX hydrolase_dom, 124~276 aa) (图 2)。蛋白二级结构预测结果显示, PvfIDI1蛋白二级结构中α-螺旋占58.31%, 延伸链占9.45%, β-转角占2.61%, 无规则卷曲占29.64%; PvfIDI2蛋白二级结构中α-螺旋占50.16%, 延伸链占11.07%, β-转角占4.56%, 无规则卷曲占34.2%。α-螺旋和无规则卷曲是PvfIDIs蛋白的主要结构元件。用SWISS-MODEL预测PvfIDI1和PvfIDI2蛋白质的三级结构, 以人类IDI蛋白(2i6k.1.A) 为模板, PvfIDI1和PvfIDI2与模板序列的相似度分别为49.34%和52.23%, 结果如图 3所示。

2.2 序列比对及系统发育树分析

通过NCBI在线Blast比对发现, PvfIDI1和PvfIDI2蛋白与三七IDI蛋白相似度最高, 相似度分别为95.1%和97.39%。利用BioEdit将PvfIDI1和PvfIDI2的氨基酸序列与其他物种的已报道有功能的IDI氨基酸序列进行多重序列比对, PvfIDIs蛋白与其他植物的IDI序列相似性较高, 均具有高度保守的TNTCCSHPL和WGEHELDY序列(图 4)。在NCBI中下载已报道的IDI蛋白序列, 用MEGA6.0构建系统发育树, PvfIDI1和PvfIDI2与植物IDI聚为一支, 与三七的亲缘关系最近(图 5)。

3 PvfIDI1和PvfIDI2在越南参变种不同器官的表达分析

以ACT1为内参基因分析PvfIDIs在越南参变种根、茎、叶和根茎不同器官中的表达, 结果如图 6所示。PvfIDI1和PvfIDI2在越南参变种各个器官中均有表达, PvfIDI1在根茎中表达量最高, 而PvfIDI2在叶中表达量最高。PvfIDI1和PvfIDI2在不同器官的表达量存在差异, 说明二者在越南参变种中的分工有所不同。

4 PvfIDI1和PvfIDI2重组蛋白表达

IPTG诱导转化质粒的大肠杆菌BL21 (DE3), SDS-PAGE电泳结果(图 7) 显示, 含重组质粒pCold GST DNA-PvfIDI1和pCold GST DNA-PvfIDI2的菌株在约61 kDa处均有明显蛋白条带, 与预期融合蛋白大小一致[融合蛋白理论分子质量为PvfIDIs理论分子质量(PvfIDI1 34.84 kDa, PvfIDI2 34.66 kDa) 与GST标签(26 kDa) 之和], 且上清和沉淀中均出现了明显的条带, 表明PvfIDI1和PvfIDI2在大肠杆菌BL21 (DE3) 中成功表达。

5 功能显色验证PvfIDI1和PvfIDI2功能

将pTrc、pTrc-AtIDI、pTrc-PvfIDI1和pTrc-PvfIDI2分别与质粒pAC-LYC [含有3个参与番茄红素合成的基因, 即香叶基香叶基焦磷酸合成酶(crtE)、八氢番茄红素合成酶(crtB) 和八氢番茄红素脱饱和酶(crtI)] 共转化大肠杆菌Trans1-Blue, 通过菌斑颜色判定大肠杆菌中番茄红色的产量, 菌斑的颜色越深, 菌中产生的番茄红素越多。从图 8可知, 仅转化pAC-LYC的菌株(P2) 在同时含有Amp和Cm的LB培养基上无法生长, 含有pTrc和pAC-LYC的菌株(P1) 能正常生长并呈现浅粉色, 说明其能产生少量番茄红素, 含有pAC-LYC和pTrc-AtIDI、pTrc-PvfIDI1和pTrc-PvfIDI2的菌株(分别为At、Pvf1和Pvf2) 均能正常生长且呈现粉红色, 说明其产生的番茄红素较P1多, 可见AtIDI、PvfIDI1和PvfIDI2可以促进番茄红素的生物合成, 表明PvfIDI1和PvfIDI2可编码有功能的IDI蛋白, 在番茄红素生物合成过程中发挥着重要作用。

讨论

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人参皂苷是越南参变种的活性成分, 越南参变种中人参皂苷生物合成途径相关研究报道逐渐增加, Zhang等^[12]构建了越南参变种根的转录组文库, 并从中筛选了大量参与人参皂苷生物合成的候选基因, 目前, 已有4个鲨烯环氧酶基因从越南参变种中克隆获得, 并对其进行了相关生物信息学分析及原核表达^{[13, 14]}。朱灵英等^[11]对越南参变种实时荧光定量PCR内参基因进行筛选和验证, 确定越南参变种不同组织部位适宜的内参基因为ACT1和αTUB, 为越南参变种中基因表达分析奠定了基础。

IPP和DMAPP是萜类生物合成的重要前体, 二者的含量及比例影响萜类化合物的生物合成, IDI调控IPP和DMAPP的相互转化, 在萜类生物合成过程中起着重要的调控作用, 植物中IDI的基因克隆及功能研究对萜类生物合成途径研究具有重要意义。本研究从越南参变种中克隆得到两条IDI基因, 对其进行了相关生物信息学分析, 在大肠杆菌中成功表达其重组蛋白, 功能显色结果表明, PvfIDI1和PvfIDI2均能促进引入番茄红素生物合成途径重组质粒的大肠杆菌中番茄红素的积累, 说明二者编码的蛋白均具有功能。雷公藤、丹参和海岛棉等物种中仅报道了一条IDI基因, 而茶树、烟草和拟南芥等植物中均有两条相似性较高的IDI基因^[7-9], 越南参变种中也存在两条IDI基因, PvfIDI1和PvfIDI2在不同器官的表达量存在差异, 说明它们的功能不完全冗杂, 在植物体内起着不同的作用, 而PvfIDI1和PvfIDI2在植物体内的功能后续可通过RNA干扰(RNA interference, RNAi) 等方法进行研究。

大肠杆菌由于缺乏番茄红素生物合成途径相关基因, 本身不能产生番茄红素, Francis X Cunningham Jr.教授将番茄红素生物合成途径中香叶基香叶基焦磷酸合成酶(crtE)、八氢番茄红素合成酶(crtB) 和八氢番茄红素脱饱和酶(crtI) 3个基因构建至同一质粒, 形成重组质粒pAC-LYC^{[15, 16]}, 将pAC-LYC转化至大肠杆菌, 从而使大肠杆菌生成番茄红素(图 9)。番茄红素本身具有颜色, 通过菌落颜色即可初步判定番茄红素的含量。功能显色实验是验证IDI功能的有效方法, 拟南芥、雷公藤、丹参等多种植物中IDI均采用此方法进行了功能研究^{[5, 6, 9]}。本研究中含有PvfIDI1和PvfIDI2的菌落颜色明显比仅含有空载的菌落深, 表明PvfIDI1和PvfIDI2能促进番茄红素的积累, 从而说明PvfIDI1和PvfIDI2编码的蛋白具有IDI蛋白的功能。PvfIDI1和PvfIDI2的克隆及功能研究为其他物种中IDI的研究提供了参考。

致谢: 感谢美国马里兰州学院马里兰大学Francis X Cunningham Jr. (Gantt) 教授惠赠实验所用载体, 感谢中国中医科学院中药资源中心郭娟研究员对论文撰写提出的宝贵意见, 感谢首都医科大学高伟教授和童宇茹博士对实验的指导。

作者贡献: 马晓惠、徐福荣、王一博设计研究内容; 王一博、管丽娜完成实验; 马晓惠、王一博、管丽娜、曹小青、王雪、程景平和王宝婕完成数据分析; 王一博撰写论文初稿; 马晓惠和徐福荣修改论文。

利益冲突: 本文所有作者之间不存在利益冲突。

基金

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国家自然科学基金资助项目(81760690)
云南省应用基础研究计划项目(2018FB144)
中医联合专项资助项目(2019FF002(-059))
中央本级重大增减支项目(2060302)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2021年第56卷第12期

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198

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文章信息

doi: 10.16438/j.0513-4870.2021-0994

接收时间：2021-07-06
首发时间：2025-12-18
出版时间：2021-12-12

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作者

出版历史

收稿日期：2021-07-06
修回日期：2021-08-12

基金

国家自然科学基金资助项目(81760690)

云南省应用基础研究计划项目(2018FB144)

中医联合专项资助项目(2019FF002(-059))

中央本级重大增减支项目(2060302)

作者信息

云南中医药大学中药学院, 云南昆明 650500

通讯作者:

*徐福荣，Tel: 13759178255, E-mail: xfrong99@163.com;

马晓惠，Tel: 13668710904, E-mail: maxiaohui1988@126.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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