药学学报

淫羊藿素抑制外泌体介导的黑色素瘤肺转移及机制初探

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屠书梅 ¹^,²^,³ , 刘玉萍 ²^,³ , 陈彦 ²^,³^,^*

药学学报 | 研究论文 2021,56(3): 778-785

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药学学报 | 研究论文 2021, 56(3): 778-785

淫羊藿素抑制外泌体介导的黑色素瘤肺转移及机制初探

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屠书梅¹^,²^,³, 刘玉萍²^,³, 陈彦²^,³^,^*

作者信息

1.江苏大学, 江苏镇江 212013

2.南京中医药大学附属中西医结合医院, 江苏南京 210028

3.江苏省中医药研究院, 中药组分与微生态研究中心, 江苏南京 210028

通讯作者:

*陈彦, Tel: 86-25-85608672, E-mail: ychen202@hotmail.com

Inhibition of exosomes-mediated melanoma metastasis by icaritin

Shu-mei TU¹^,²^,³, Yu-ping LIU²^,³, Yan CHEN²^,³^,^*

Affiliations

1. Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China

2. Affiliated Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China

3. Multi-component of Traditional Chinese Medicine and Microecology Research Center, Jiangsu Provincial Academy of Chinese Medicine, Nanjing 210028, China

出版时间: 2021-03-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2020-1317

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摘要

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本研究从体内外考察淫羊藿素（icaritin，ICT）对外泌体（exosomes，Exo）诱导的小鼠黑色素瘤B16BL6细胞肺转移的影响，并探讨其潜在分子机制。收集B16BL6细胞培养上清液，超速离心法提取Exo，使用透射电镜和Western blotting对Exo进行表征，BCA法对Exo总蛋白进行定量分析。细胞划痕实验考察ICT对Exo诱导的B16BL6细胞迁移能力的影响。建立C57BL/6小鼠黑色素瘤实验性转移模型，动物实验获得南京中医药大学伦理委员会的同意，H&E染色考察ICT体内抑制Exo介导的黑色素瘤转移作用。ELISA及免疫荧光检测转移组织中促炎因子白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、S100钙结合蛋白A8/A9复合物（S100 calcium-binding protein A8/A9 complex，S100A8/A9）、血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A，SAA）及纤连蛋白（fibronectin）的表达。免疫组化及Western blotting检测ICT对Exo诱导的转移组织相关蛋白干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon gene，STING）、磷酸化STING（p-STING）、TANK结合激酶1（TANK-binding kinase 1，TBK1）和磷酸化的TBK1（p-TBK1）的表达情况。结果表明，所提取的外泌体粒径为（149.33±2.68）nm、多分散系数为（0.192±0.02）、zeta电位为（-32.22±0.50）mV，电镜下呈现茶托样双层膜结构，测得蛋白浓度为（838.66±62.14）μg·mL^-1。ICT浓度为5、10和20 μmol·L^-1时，能够抑制Exo诱导的B16BL6细胞迁移。ICT能够抑制Exo介导的黑色素瘤肺转移，抑制肺组织中促炎因子S100A8/A9、SAA和IL-6的表达，能够抑制转移肺组织的p-STING和p-TBK1的表达。本研究结果表明，ICT能够明显抑制Exo诱导的肿瘤转移，且与STING通路的失活有关。

关键词

淫羊藿素 / 外泌体 / 黑色素瘤 / 肿瘤转移 / STING

Abstract

收起

This study investigated the mechanism by which icaritin (ICT) inhibits exosomes-induced lung metastasis of B16BL6 mouse melanoma cells. The culture supernatant of B16BL6 cells was collected for extraction of exosomes by ultracentrifugation and their characterization by transmission electron microscopy and Western blotting. Exosomal protein was quantified by BCA. A wound-healing assay was used to determine the effect of ICT on the migratory ability of B16BL6 cells induced by exosomes. After establishing an experimental melanoma lung metastasis model in C57BL/6 mice, we used H & E staining to study the ability of ICT to inhibit exosomes-induced melanoma metastasis. Animal experiments were approved by the Ethics Committee of Nanjing University of Chinese Medicine. ELISA and immunofluorescence were used to detect pro-inflammatory factors interleukin 6 (IL-6), S100 calcium-binding protein A8/A9 complex (S100A8/A9), serum amyloid A (SAA) and fibronectin in metastatic tumors. The expression of metastatic tissue-related proteins stimulator of interferon gene (STING), phospho-STING (p-STING), TANK-binding kinase 1 (TBK1) and phospho-TBK1 (p-TBK1) was detected by immunohistochemistry or Western blotting. The results showed that the particle size of exosomes was 149.33±2.68 nm, the polydispersity index (PDI) was 0.192±0.02, the zeta potential was -32.22±0.50 mV, and the particles had classic tea tray-like membrane structure under TEM. The protein concentration of exosomes was measured to be 838.66±62.14 μg·mL^-1. The results of the cell scratch test showed that ICT can inhibit exosomes-induced migration of B16BL6 cells at a concentration of 5, 10, and 20 μmol·L^-1. In vivo experimental results also showed that ICT can inhibit exosomes-induced metastasis of melanoma to the lungs and can significantly inhibit the expression of pro-inflammatory factors S100A8/A9, SAA and IL-6 in lung tissue, and inhibit the expression of p-STING and p-TBK1 in metastatic lung tissue. Taken together, these results indicated that ICT can significantly inhibit exosomes-induced tumor metastasis, and the inhibition is related to the inactivation of STING in metastatic foci.

Key words

icaritin / exosome / melanoma / tumor metastasis / STING

引用本文

屠书梅, 刘玉萍, 陈彦. 淫羊藿素抑制外泌体介导的黑色素瘤肺转移及机制初探. 药学学报, 2021 , 56 (3) : 778 -785 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-1317

Shu-mei TU, Yu-ping LIU, Yan CHEN. Inhibition of exosomes-mediated melanoma metastasis by icaritin[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2021 , 56 (3) : 778 -785 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2020-1317

正文

收起

肿瘤转移是肿瘤患者预后不良最终导致死亡的重要原因^[1], 其中肺转移是多种恶性肿瘤最常见以及患者死亡率较高的器官转移^[2], 且目前缺少有效的治疗手段。近年来的研究发现, 肿瘤在发生转移时, 会分泌一种微小囊泡——外泌体(exosomes, Exo), 促进肿瘤的转移^[3]。Exo的直径在30~150 nm, 内含蛋白质、脂质和核酸等不同成分, 可作为细胞间通讯的关键参与者, 从而传递信息^{[4, 5]}。Exo促进肿瘤转移的机制可能与炎症因子的浸润密切相关。Peinado等^[6]发现小鼠尾静脉注射黑色素瘤细胞系B16-F10细胞分泌的Exo后, 肺组织中相关因子热休克蛋白、S100钙结合蛋白A8 (S100 calcium-binding protein A8, S100A8) 和S100钙结合蛋白A9 (s100 calcium-binding protein A9, S100A9) 蛋白表达升高。有学者表明, 肿瘤细胞分泌的Exo, 含有双链DNA, 可以激活细胞内DNA传感器黑素瘤缺乏因子2 (absent in melanoma 2, AIM2), 触发炎症反应^[7]。环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase, cGAS) 作为DNA感受器, 同样可以识别Exo中双链DNA^[8], 进而产生2'-3' cGAMP。2'-3' cGAMP可激活干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon gene, STING), 使STING构象改变进而招募TANK结合激酶1 (TANK-binding kinase 1, TBK1) 使其磷酸化, 接着磷酸化干扰素调节因子3 (interferon regulatory factor 3, IRF3) 并移位至细胞核中, 产生Ⅰ型干扰素(interferon, IFN) 和趋化因子, 触发炎症反应。因此, 针对炎症的研究是治疗肿瘤转移的新策略和方法。

淫羊藿(Epimedii Folium) 作为传统的补肾补虚中药, 在民间沿用已有千年历史, 具有补肾阳、强筋骨和祛风湿等传统功效, 在治疗肺部肿瘤中应用频率较高。而淫羊藿素(icaritin, ICT, 图 1) 是淫羊藿中的有效活性成分, 属异戊烯基黄酮类化合物, 也是淫羊藿活性成分淫羊藿苷体内代谢的主要产物, 具有抗炎和抗肿瘤转移的作用, 但其抗肿瘤转移的机制尚不明确。

本研究通过构建Exo诱导的黑色素瘤体内外转移模型, 考察了ICT对肿瘤肺转移的作用, 旨在证明ICT能够抑制Exo介导的肿瘤转移。通过ELISA检测转移肺组织中炎症因子S100A8/A9、血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A, SAA)和白细胞介素6 (interleukin-6, IL-6) 的表达, 计算机模拟ICT与STING结合, 并用Western blotting和免疫组化实验考察了cGAS/STING通路中关键蛋白的表达, 初步探索了ICT抑制Exo介导的黑色素瘤肺转移的机制, 为中药淫羊藿用于临床防治肿瘤转移提供重要指导。

材料与方法

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细胞株 小鼠恶性黑色素瘤B16BL6细胞, 购于和园生物有限公司。B16BL6细胞培养于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS) 和1%的青-链霉素的DMEM完全培养基, 37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。

实验动物 SPF级C57BL/6雄性小鼠, 由南京中医药大学动物实验中心提供, 合格证号: SCXK (苏) 2018-0007。鼠龄为4~5周, 体重为18~22 g, 动物实验获得南京中医药大学伦理委员会的同意。

药物与试剂 ICT (纯度≥ 98%, 批号: 118525-40-9, 上海源叶生物科技有限公司); 高糖DMEM培养基、胰蛋白酶(上海源培生物科技股份有限公司); FBS (以色列BI公司); 二甲亚砜(DMSO, 美国Sigma公司); BCA检测试剂盒、蛋白Marker (Thermo Fisher Scientific公司); 蛋白酶抑制剂(北京鼎国昌盛生物技术有限公司); 磷酸酶抑制剂(江苏凯基生物科技发展有限公司); 肿瘤易感基因101 (tumor susceptibility gene 101, TSG101) (14497-1-AP, Proteintech公司); phospho-STING (p-STING, Ser366) (Ab-AF7416, Affinity公司); STING (D2P2F, Cell Signaling Technology); CD9 (ab92726)、p-NAK/TBK1 (phospho S172, ab109272)、NAK/TBK1 (ab40676) (Abcam公司); Goat anti-rabbit IgG (H & L)-HRP (BS13278, Bioworld technology公司)。

仪器超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司); TDZ5-WS台式低速离心机(湖南星科科技有限公司); TOMY-SX500高压蒸汽灭菌器(日本TOMY公司); HERA Cell 150i CO₂培养箱(美国Thermo Fisher Scientific公司); Thermo MULTISKAN GO酶标仪(赛默飞科技有限公司); 凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

Exo的提取、表征及蛋白浓度测定

Exo的提取收集处于对数生长期的B16BL6细胞上清液, 采用梯度-超速离心的方法提取Exo, 4 ℃条件下300 ×g离心10 min, 2 000 ×g离心15 min和12 000 ×g离心30 min, 去除细胞及细胞碎片, 上清用0.22 μm的无菌过滤膜过滤除菌, 4 ℃下100 000 ×g离心70 min, 收集沉淀, PBS洗涤, 最后用200 μL PBS重悬。

Exo的表征取Exo 10 μL, 加入纯水稀释至1 mL, 用马尔文激光粒径仪测定Exo的平均粒径、多分散系数(PDI) 及zeta电位。将载有Formvar支持膜的铜网置于蜡板上, 在膜上滴加1滴Exo的PBS重悬液。红外灯下照射5 min, 滴加1滴1%磷钨酸, 室温下风干10 min, 置于透射电镜下观察Exo的外观形态。

Western blotting检测外泌体特异性蛋白 取Exo样品, 加入5×蛋白样品上样缓冲液, 于100 ℃干式混匀器中加热10 min变性。取蛋白样品(20 μg总蛋白量) 进行电泳、转膜、洗涤封闭, 分别结合一抗(CD9和TSG101稀释倍数均为1∶1 000) 于4 ℃过夜, 洗涤, 室温下结合二抗(二抗的稀释倍数为1∶20 000) 孵育2 h后, 洗涤, ECL发光法检测蛋白条带。

Exo的总蛋白浓度测定 采用BCA法测定Exo的总蛋白浓度。取10 μL Exo, 加入高效RIPA裂解液15 μL, 共计25 μL, 涡旋混匀, 作为待测样品。取BCA试剂盒, 按试剂A∶试剂B = 50∶1, 制备工作液。在96孔板中分别加入各个稀释浓度的蛋白质标准品(25~2 000 μg·mL^-1) 和待测样品各25 μL, 然后每孔加入200 μL工作液, 振荡器上震荡1 min, 37 ℃孵育30 min, 采用全波长酶标仪测定各孔562 nm处吸光度值。根据标准曲线计算Exo的总蛋白浓度。

划痕实验考察ICT对Exo诱导的B16BL6细胞迁移的影响 当B16BL6细胞融合度为80%~90%时, 用胰蛋白酶消化并重悬至单个细胞, 以每孔3×10⁵个细胞接种于6孔板, 于37 ℃、5%的CO₂环境下培养至细胞贴壁长成单层细胞。10 μL枪头沿着6孔板直径在细胞培养板上垂直划痕, PBS轻轻冲洗3次后, 拍照记录(0 h)。实验组设置空白对照组、Exo组、ICT剂量组(5、10和20 μmol·L^-1), Exo组与ICT组均给予10 μg·mL^-1 Exo。继续培养24 h后, 于倒置显微镜下拍照, 并计算划痕愈合度, 分析细胞迁移情况。

$ 迁移率\left( \% \right)=\frac{初始划痕面积-24\text{ h}后划痕面积}{初始划痕面积} \ \times 100 \% $

ICT对Exo诱导的B16BL6细胞小鼠体内实验性转移的影响 建立小鼠黑色素瘤肺转移实验性模型。取对数生长期的B16BL6, 消化后离心, 重悬于PBS中, 调整细胞密度为每毫升5×10⁵个, 每只C57BL/6小鼠尾静脉接种200 μL细胞悬液。小鼠接种肿瘤细胞后, 按体重随机分为模型组、Exo组、Exo + ICT (10 mg·kg^-1)组、Exo + ICT (20 mg·kg^-1) 组。隔天Exo组和Exo + ICT组小鼠尾静脉Exo处理, 每只鼠20 μg, 隔天1次, 一共进行10次。同时给药组腹腔注射给予ICT (10和20 mg·kg^-1), 隔天给药。21天后小鼠摘眼球取血, 处死小鼠, 剥离小鼠肺组织, 拍照并称重, 记录转移肺结节数目并对肺组织进行H & E染色来分析肺转移。

ICT对Exo诱导的体内转移肺组织炎症因子的影响 取出肺组织, 加入蛋白裂解液匀浆, 反复冻融4~5次, 12 000 r·min^-1离心10 min, 取上清, BCA测定蛋白浓度。按照ELISA试剂盒的操作方法(标准品的稀释、加样温育、加检测抗体、洗板、加酶温育、洗板、显色、终止及测定) 检测肺组织中炎症因子S100A8/A9、SAA和IL-6因子的释放。采用免疫荧光法考察纤连蛋白fibronectin的表达, 取4%多聚甲醛固定的肺组织, 蔗糖脱水、OCT包埋、冰冻切片、封闭、孵一抗、二抗、DAPI复染、荧光淬灭封片液封片, 荧光显微镜观察拍摄。

分子对接 下载化合物的*mol格式文件, 用Chem Office软件将化合物结构保存为*mol2格式, 经加氢、赋予力场后, 保存为SD格式, 备用。STING蛋白结构下载于PDB数据库, PDB ID为4F5FD。蛋白经加氢、准备、赋予力场后, 定义其原配体的位置为活性位点, 球状半径设为9。采用Discovery studio 3.5平台的Cdocker模块进行对接。

免疫组化检测p-STING、fibronectin在肺组织中的表达 肺组织浸入4%多聚甲醛溶液中固定, 固定的肺组织经脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡, 将切片浸入0.01 mol·L^-1柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0), 微波炉加热修复抗原; PBS清洗, 3% BSA的PBS溶液封闭, 然后滴加一抗, 4 ℃过夜; PBS清洗, 滴加二抗, 室温孵育1.5 h; DAB室温显色; 蒸馏水洗涤; 苏木素轻度复染、脱水、透明、封片; 最后镜检并采集图像。

Western blotting检测p-STING、STING、p-TBK1和TBK1在肺组织中的表达 取50 mg的肺组织, 加预冷的蛋白裂解液冰上研磨, -80 ℃冻融过夜, 然后4 ℃条件下, 12 000 r·min^-1离心10 min, 收集上清。利用BCA法测定样品蛋白浓度。取适量肺上清, 加入5×蛋白样品上样缓冲液, 于干式混匀器中100 ℃蛋白加热变性10 min。配胶、上样、SDS-PAGE电泳后转膜, TBST缓冲液配制的5%脱脂奶粉封闭, 一抗孵育, 4 ℃过夜, 加入二抗, 室温孵育2 h, 最后化学发光曝光显影。

统计学分析 应用GraphPad 8.0软件进行统计分析。所有实验均独立重复3次, 计量资料以x ± s表示, 各组分别与对照组进行单因素方差分析。

结果

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1 Exo的表征

从对数生长期的小鼠黑色素瘤B16BL6细胞上清液中提取Exo, 马尔文粒径仪检测粒径和电位, 结果表明, 所提取的Exo平均粒径约为(149.33 ± 2.68) nm, 分散均匀, 多分散系数为(0.192 ± 0.02), zeta电位为(-32.22 ± 0.50) mV, 呈负电荷。电镜下显示: Exo形态均匀, 具有茶托样的双层膜结构, 大小约在100 nm左右(图 2A)。BCA法检测Exo的蛋白含量, 标准曲线为y = 0.796 5x + 0.009 4, 计算含量为(838.66 ± 62.14)μg·mL^-1。Western blotting实验结果表明, 所提取的外泌体能够表达TSG101和CD9外泌体标记性蛋白(图 2B), 以B16BL6细胞的裂解物及B16BL6细胞衍生的微囊泡作为对照。

2 ICT对Exo诱导的B16BL6细胞迁移的影响

通过划痕法考察不同浓度的ICT (5、10和20 μmol·L^-1) 抑制Exo (10 μg·mL^-1) 诱导的黑色素瘤B16BL6水平迁移能力(图 3)。结果发现, Exo (10 μg·mL^-1)刺激24 h后, 能够明显诱导细胞迁移; 而给予ICT后, 随着ICT浓度的提高, 细胞划痕的愈合程度呈递减趋势。图 3是以0和24 h两个时间点为例, 发现24 h时, 对照组的划痕区域的黑色素瘤细胞发生明显迁移, 而Exo组较对照组发生更明显的迁移(P < 0.01); 而随着ICT药物浓度的增加, 划痕区域细胞迁移的数目呈降低趋势, ICT浓度为20 μmol·L^-1时, 对B16BL6细胞的迁移抑制率高达90%以上(P < 0.001), 几乎完全抑制B16BL6细胞的水平迁移。

3 ICT对Exo诱导的B16BL6体内转移的影响

为了考察ICT对Exo诱导的B16BL6黑色素瘤体内转移情况, 本研究构建了黑色素瘤实验性肺转移模型。尾静脉接种B16BL6细胞, 同时给予Exo以及10和20 mg·kg^-1 ICT, 21天后将小鼠处死, 取出肺脏, 进行拍照、称量肺重以及H & E染色。图 4结果显示, Exo组与模型组相比, 肺部肿瘤转移结节数明显增多(图 4A、B、D), 肺质量异常增加(图 4C), 体重异常降低(图 4E), 表明Exo能够促进B16BL6的肺转移; 而腹腔注射给予ICT能有效减少肺转移结节数目, 并降低肺重, 逆转体重异常降低, 抑制肿瘤的肺转移。ELISA实验结果如图 5所示, ICT抗小鼠黑色素瘤肺转移的作用可能与抑制炎症因子的表达有关。肺组织中, Exo组的IL-6、SAA和S100A8/9的含量与模型组相比较存在显著性差异, 而ICT (20 mg·kg^-1) 组明显抑制了促炎细胞因子SAA、S100A8/A9和IL-6的释放(图 5A~C)。同时免疫荧光结果显示, Exo组的纤连蛋白(fibronectin) 的表达增多, ICT能够抑制fibronectin的表达(图 5D)。

4 ICT与STING的分子对接

由于STING通路的激活与炎症因子的释放相关, 故运用分子模拟CDocker对ICT与STING的对接能力进行分析。研究报道C-178是STING小分子抑制剂^[9], 因此将C-178作为阳性参照。分子对接结果表明: C-178分子能够与STING蛋白的氨基酸残基238位精氨酸(Arg238) 和253位苏氨酸(Thr263) 分别形成分子间氢键, 还与氨基酸残基167位酪氨酸(Tyr167)、Thr263和264位脯氨酸(Pro264) 分别形成共轭作用力。ICT能够与STING蛋白的氨基酸残基Arg238、241位丝氨酸(Ser241)、260位谷氨酸(Glu260) 形成分子间氢键, 还与Tyr167形成共轭作用力, 与氨基酸残基159位亮氨酸(Leu159)、Pro264形成疏水作用力(图 6)。

ICT和C-178与STING的对接有共同的氨基酸残基Arg238、Tyr167和Pro264, 且结合模式有一定的相近性。ICT和C-178与STING的相互作用的能量打分接近, 分别为32.57和30.123。综合对接能量打分和对接模式分析, 淫羊藿素结构稳定, 能够与STING-CTD活性位点相结合。

5 ICT抑制Exo诱导的B16BL6体内转移的机制初探

为了进一步考察ICT抑制Exo诱导的B16BL6体内转移的机制, 基于分子对接结果的同时, 本研究通过免疫组化考察ICT对Exo介导的转移肺组织中p-STING和fibronectin的表达, Western blotting实验考察了ICT对Exo介导的转移肺组织中p-STING、STING、p-TBK1和TBK1的表达影响。结果如图 7所示, Exo组小鼠肺组织中, fibronectin和p-STING的表达较模型组增多; 与Exo组相比, ICT组小鼠肺组织中fibronectin和p-STING的表达下降(图 7A); 由图 7B可知, Western blotting实验表明, Exo组小鼠肺组织中p-STING、STING、p-TBK1和TBK1蛋白表达升高; 而ICT组, 尤其是高剂量组, 蛋白表达下降。

讨论

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原位肿瘤与转移灶之间的对话是促进肿瘤发生转移的重要因素。原位肿瘤持续释放趋化因子和胞外囊泡等加剧肿瘤转移的发生, 其中外泌体被发现是原位肿瘤和继发转移灶之间的桥梁, 在肿瘤细胞转移过程中起了决定性的作用。因此, 本研究采用Exo作为诱导剂, 建立体内外转移模型。研究认为, 肿瘤细胞衍生的Exo加剧肿瘤细胞和局部组织的炎症是其促进肿瘤转移的重要机制。结果发现, 通过ELISA检测转移组织中炎症因子的表达, Exo的诱导可促使S100A8/S100A9、IL-6和SAA炎症相关因子的表达升高, 加重B16BL6的肺转移。IL-6是调节细胞增殖与分化的一种多效细胞因子, 具有多种控制稳态功能如免疫应答、急性期反应及造血功能。有研究表明, IL-6能够通过激活STAT3的激活, 从而促进SAA的释放^[10]。而SAA是一种主要由肝脏合成的高度保守的急性期蛋白, 能够刺激自身的转录以及促炎性S100A8和S100A9蛋白的转录, 增强了肿瘤细胞对纤连蛋白的黏附, 并促进肿瘤细胞的迁移和侵袭^[11]。免疫荧光实验证明, Exo组纤连蛋白表达同样增多。炎症相关的S100A8和S100A9是S100家族的钙结合蛋白, 研究表明高表达S100A8/A9能诱导黑色素瘤细胞发生转移^[12]。综上所述, 研究Exo介导的肿瘤转移能够探寻有效的治疗转移的药物。

文献^[13]报道, ICT对多种肿瘤如前列腺癌、肾癌、胃癌、肺癌及骨肉瘤等均有不同程度的抑制作用, 但其具体的机制尚不明确。B16BL6黑色素瘤实验性转移模型是目前常用的转移动物模型, 本研究发现, ICT可以显著抑制Exo诱导的B16BL6细胞水平迁移, 并可以显著抑制由Exo诱导的肿瘤肺转移。另外, ICT能够降低S100A8/A9和IL-6等炎症因子的表达。

研究表明, DNA是肿瘤细胞衍生的Exo荷载并传递的重要内容物, 恶性肿瘤细胞的染色体不稳定, 易产生断裂的双链DNA, 可由Exo携带进入受体细胞。而这种遗传不稳定性可激活模式识别受体信号cGAS-STING信号, 促进肿瘤的发生发展和转移^[14]。此外, IL-6的表达与STING通路的激活也有关, 在STING缺失的小鼠中, IL-6表达受到抑制^[15]。那么, ICT抑制炎症因子的表达是否与STING相关呢？本研究首先利用分子模拟CDocker对ICT与STING的对接能力进行分析, 发现ICT与STING蛋白的活性位点CTD结合。然后, 对小鼠体内实验性转移模型中转移肺进行免疫组化和Western blotting实验, 发现ICT能够抑制p-STING、STING、TBK1和p-TBK1的表达。

STING通路在肿瘤转移中扮演了重要的角色。STING的高表达, 一方面可以招募免疫抑制细胞如Treg细胞, 帮助肿瘤细胞逃避免疫; 另一方面可激活吲哚胺2, 3-双加氧酶(indoleamine 2, 3-dioxygenase, IDO), 促进肿瘤的增长转移。因而, STING的抑制剂的开发得到了广泛关注, 然而目前针对STING的报道较少, 主要有C-178、C-176、H-151和astin C^[14]。ICT能够抑制STING的表达, 有作为STING的抑制剂开发的前景, 但是具体机制和应用有待于进一步研究。

作者贡献: 陈彦负责实验设计和文章审核等工作; 屠书梅和刘玉萍参与实验并进行数据分析, 负责完成文章撰写及文章修改等工作。

利益冲突: 所有作者声明不存在利益冲突。

基金

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国家自然科学基金资助项目(81903858)
国家自然科学基金资助项目(81873016)
江苏省科教强卫医学重点人才项目(ZDRCA2016036)
江苏省卫生健康委科研项目面上项目(H2019097)

参考文献

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文献

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排序方式：

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2021年第56卷第3期

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文章信息

doi: 10.16438/j.0513-4870.2020-1317

接收时间：2020-08-11
首发时间：2025-12-18
出版时间：2021-03-12

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作者

出版历史

收稿日期：2020-08-11
修回日期：2020-10-01

基金

国家自然科学基金资助项目(81903858)

国家自然科学基金资助项目(81873016)

江苏省科教强卫医学重点人才项目(ZDRCA2016036)

江苏省卫生健康委科研项目面上项目(H2019097)

作者信息

1.江苏大学, 江苏镇江 212013

2.南京中医药大学附属中西医结合医院, 江苏南京 210028

3.江苏省中医药研究院, 中药组分与微生态研究中心, 江苏南京 210028

通讯作者:

*陈彦, Tel: 86-25-85608672, E-mail: ychen202@hotmail.com

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2020-1317

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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