药学学报

三磷酸腺苷脂质体鼻用凝胶制备及其抗缺氧作用

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欧歌 ¹ , 马金秋 ²^,³ , 朱林 ² , 李瑞滕 ²^,³ , 李欣 ¹^,^* , 杜丽娜 ²^,³^,^*

药学学报 | 研究论文 2020,55(6): 1288-1295

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药学学报 | 研究论文 2020, 55(6): 1288-1295

三磷酸腺苷脂质体鼻用凝胶制备及其抗缺氧作用

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欧歌¹, 马金秋²^,³, 朱林², 李瑞滕²^,³, 李欣¹^,^*, 杜丽娜²^,³^,^*

作者信息

1.解放军总医院药学部, 北京 100853

2.军事科学院军事医学研究院, 北京 100850

3.山东中医药大学药学院, 山东济南 250355

通讯作者:

*李欣, Tel:86-10-66937436, E-mail:doublelixin@126.com;

杜丽娜, Tel:86-10-66930216, E-mail:dulina@188.com

Preparation of adenosine triphosphate liposome hydrogel and research of its anti-hypoxia effect

Ge OU¹, Jin-qiu MA²^,³, Lin ZHU², Rui-teng LI²^,³, Xin LI¹^,^*, Li-na DU²^,³^,^*

Affiliations

1. Department of Pharmacy, General Hospital of the Chinese People's Liberation Army, Beijing 100853, China

2. Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, Beijing 100850, China

3. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China

出版时间: 2020-06-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-0808

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摘要

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制备三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)脂质体，评价其对缺氧性脑损伤的治疗作用。采用离子对薄膜分散法制备ATP脂质体，其最优处方：三磷酸腺苷二钠、十六烷基三甲基溴化铵、大豆磷脂、胆固醇的质量比为1:1.98:8:3，此时ATP脂质体包封率为(81.50±0.82)%，载药量为(6.79±0.07)%。通过体外释放实验与流变学测定分别考察ATP脂质体与空白凝胶的理化性质；将ATP脂质体、ATP水溶液分别加入甲基纤维素凝胶中，以甲基纤维素凝胶为阴性对照，进行小鼠鼻腔给药。动物实验获得军事医学研究院伦理委员会批准。连续给药9天后，与空白凝胶或ATP水凝胶相比，ATP脂质体水凝胶显著提高了血中红细胞与血红蛋白数值(P < 0.01)；连续给药13天后，在常压密闭缺氧实验中，与ATP水凝胶或空白凝胶相比，ATP脂质体鼻用凝胶能显著提高小鼠标准缺氧耐受时间(P < 0.05)。小鼠海马促凋亡基因p53免疫组化染色显示，ATP脂质体对脑组织有明显保护作用。结果表明，ATP脂质体鼻用凝胶预防给药能明显提高小鼠耐缺氧能力，是一种前景广阔的抗缺氧制剂。

关键词

三磷酸腺苷 / 脂质体 / 鼻内给药 / 水凝胶 / 缺氧

Abstract

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The adenosine triphosphate (ATP) liposome, prepared with the methods of film dispersion and ion-pairing was evaluated for its therapeutic effect on hypoxic brain damage. The appropriate formulation is adenosine disodium triphosphate, hexadecyl trimethyl ammonium bromide, soybean phospholipid, cholesterol with mass ratio of 1:1.98:8:3. The encapsulation efficiency of ATP liposome was (81.50 ±0.82) % and the loading efficiency was (6.79 ±0.07) %. In vitro release test and rheology test were conducted to investigate the physicochemical properties of ATP liposomes and empty gels respectively. The blank methylcellulose gel, followed with ATP liposome and ATP aqueous solution added to the methycellulose gel, were used for nasal administration in mice respectively. All experiments were approved by the Ethics Committee for Experimental Research in Academy of Military Medical Sciences. After 9 days of continuous administration, ATP liposome hydrogel increased the values of red blood cells and hemoglobin (P < 0.01) compared to ATP hydrogel and blank gel. And the ATP liposome hydrogel significantly increased the standard hypoxia tolerance time in mice compared to ATP hydrogel and blank gel after 13 days of nasal administration (P < 0.05). The immunohistochemical staining of mice hippocampus for the proapoptotic gene p53 showed that ATP liposome hydrogel was capable of protecting brain tissue in hypoxia. It is indicated that the prophylactic administration of ATP liposome nasal gel can significantly improve the hypoxia tolerance of mice, and the ATP liposome nasal gel was proved to be a promising anti-hypoxia preparation.

Key words

adenosine triphosphate / liposome / intranasal administration / hydrogel / hypoxia

引用本文

欧歌, 马金秋, 朱林, 李瑞滕, 李欣, 杜丽娜. 三磷酸腺苷脂质体鼻用凝胶制备及其抗缺氧作用. 药学学报, 2020 , 55 (6) : 1288 -1295 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0808

Ge OU, Jin-qiu MA, Lin ZHU, Rui-teng LI, Xin LI, Li-na DU. Preparation of adenosine triphosphate liposome hydrogel and research of its anti-hypoxia effect[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2020 , 55 (6) : 1288 -1295 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0808

正文

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高原低氧易导致以中枢神经系统反应为主的急性高原反应(acute mountain sickness, AMS), 表现为头晕、头痛和恶心呕吐等症状, 更有可能进展为以躯干共济失调和意识模糊为主的高海拔脑水肿(high-altitude cerebral oedema, HACE), 限制了人们在高原环境下的生活与工作^[1]。因此, 探索预防低氧环境对中枢系统带来不良反应的研究大有裨益。目前非药物性预防方法包括阶梯习服^[2]、低氧预适应和适应性运动锻炼^[3]; 通过增强机体对缺氧的耐受性, 降低高原反应的发生率。但非药物性预防方法训练周期长, 且预防效果有限。药物性预防方法包括非甾体类抗炎药、乙酰唑胺和地塞米松以缓解症状^[4], 以及提高机体抗缺氧能力的中草药人参、丹参和红景天等。但预防作用片面, 用药量过大限制了该方法的应用。因此, 需要探索新的药物类型与新型给药方式。

三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)是一种具有多种生物学功能的分子, 通常被认为是能量代谢过程中的关键物质, 被称为“能量货币”。在人体中, 1分子葡萄糖经过1次三羧酸循环产生30~32个ATP分子, 为体内各大系统供能, 在这个典型的代谢环路中迅速循环与消耗。此外, ATP也是一种具有多种细胞内和细胞外生物功能的分子, 其功能远远超出能量代谢^[5]。ATP的降解产物环磷酸腺苷(cAMP)是细胞内重要的第二信使, 当ATP存在于细胞外空间时, 可以激活不同细胞类型上的多种嘌呤能P2Y和P2X受体, 在生理和病理条件下参与全身协同进行的细胞通讯活动^[6]。

脂质体是指由磷脂和胆固醇等制得的可将药物进行包裹的微型囊泡, 作为细胞内传递药物常用的纳米载体之一, 由于其组成与细胞膜类似, 在机体内可通过被动或主动靶向作用黏附在细胞表面促进药物吸收并降低药物相关毒性的潜力^[7-10]。甲基纤维素是一种水溶性多糖类纤维素衍生物, 在机体37 ℃条件下形成交联状可注射凝胶, 为药物滞留提供了交联支架^[11]。同时, 由于解剖学发现鼻腔内给药, 可经嗅细胞、三叉神经通路直接入脑^[12]。因此, 本实验通过制得ATP脂质体, 加入甲基纤维素水凝胶中, 对小鼠进行鼻腔给药, 以期利用脂质体促黏膜吸收的特性, 解决水溶性药物难以透过血脑屏障(blood brain barrier, BBB)的困境, 通过鼻脑通路实现对中枢神经系统的抗缺氧保护作用。

本文通过考察ATP脂质体相关理化性质, 测定小鼠血常规和标准常压缺氧时间, 脑组织病理切片分析, 验证ATP脂质体水凝胶对大脑抗缺氧的保护性作用。

材料与方法

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仪器 Agilent 1260安捷伦高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司); Zetasizer Nano ZS纳米激光粒度仪(英国马尔文仪器有限公司); HF Super NW纯水仪(上海康雷分析仪器有限公司); MCR 302流变仪(安东帕商贸有限公司); BDS200-FL倒置荧光显微镜(重庆奥普光电技术有限公司); Celltac E全自动血球计数器(日本光电工业株式会社)。

药品与试剂 三磷酸腺苷二钠(adenosine disodium triphosphate, ATP-2Na, Ark Pharma Scientific公司, 纯度 > 99.84%); 胆固醇(北京伊诺凯科技有限公司, 纯度 > 99%); 甲基纤维素(上海阿拉丁生物化学科技有限公司, 相对分子质量: 658.7, 黏度: 400 mPa·s); 十六烷基三甲基溴化铵(hexadecyl trimethyl ammonium bromide, CTAB, 批号: 20160107)、磷酸二氢钾(批号: 20180929)、无水磷酸氢二钠(批号: 20171030)、无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司); 氢氧化钠(西陇化工股份有限公司, 批号: 140117);四丁基溴化铵(北京兴福精细化学研究所, 批号: 20020605);甲醇(赛默飞世尔科技有限公司); 水为超纯水; 其余所用试剂均为分析纯。

实验动物 健康雄性BALB/c小鼠, 体重18~20 g, 购置于北京维通利华实验动物技术有限公司, 许可证号: SCXK (京) 2016-0006。动物分笼饲养于12 h昼夜交替的环境中, 温度为24~25 ℃, 湿度为(50 ± 5) %, 实验进行前适应性饲养1周。动物福利及实验计划由军事医学科学院动物伦理委员会审查批准。

高效液相色谱(HPLC)条件测ATP含量 色谱条件:色谱柱Diamonsil C 18 (2) (250 mm×4.6 mm, 5 μ); 流动相0.2 mol·L^-1磷酸盐缓冲液(pH 7)-甲醇(95:5);柱温35 ℃; 检测波长259 nm; 流速1 mL·min^-1; 进样量10 μL。标准曲线的建立:精密称取ATP-2Na原料药, 配制20、40、100、200和400 μg·mL^-1 ATP-2Na盐溶液, 0.22 μm微孔滤膜过滤, 以质量浓度为横坐标, 峰面积为纵坐标, 建立回归方程。

薄膜分散法制备ATP脂质体

疏水性离子对复合物的制备将CTAB用超纯水溶解, 加入ATP-2Na搅拌形成絮状混悬物, 6 500 r·min^-1, 离心10 min。HPLC测定上清液中ATP浓度(C), 记录离心管中水的体积(V)和加入的ATP-2Na总量(M), 通过公式计算不同摩尔比的ATP-2Na与CTAB在水中形成离子对复合物的收率^[13] (Y): $ Y = \frac{{M - CV}}{M} \times 100\% $, 以选择ATP与CTAB最佳摩尔比。

ATP脂质体的制备称取ATP-2Na 50 mg与CTAB 99 mg (摩尔比1:3), 于30 mL离心管中, 加入超纯水20 mL, 振荡混匀形成絮状沉淀。将离心管置于低温高速离心机中, 1 800 ×g离心15 min, 絮状沉淀离心于管壁, 弃去上清液, 加入无水乙醇10 mL, 充分溶解ATP-CTAB离子对复合物。当胆固醇与磷脂质量比约为1:3时, 脂质体膜硬度与流动性同时较好^[14]; 且药脂比在1:10至1:20内, 对ATP脂质体制备包封率无显著影响^[13]。考虑到鼻腔制剂高浓度、小用量的特点, 按ATP-2Na、大豆磷脂和胆固醇重量比1:8:3处方比例, 将大豆磷脂与胆固醇加入上述离子对复合物溶液中, 加入无水乙醇至30 mL, 超声15 min, 充分搅拌溶解, 置于250 mL茄形瓶中, 于旋蒸仪上, 35 ℃水浴旋蒸成膜, 加入超纯水50 mL振摇后, 用0.22 μm有机微孔滤膜过滤, 形成ATP脂质体混悬液。

ATP脂质体包封率、载药量、粒径与zeta电位测定 精密量取ATP脂质体混悬液0.5 mL, 于1.5 mL 3KD超滤离心管, 10 000 ×g离心15 min, 将滤过液取出, 移至5 mL量瓶中, 向离心管中加入超纯水0.5 mL, 重复离心步骤两次, 3次离心所得滤液, 用超纯水定容至刻度, HPLC法测得游离部分药物浓度(C₁); 精密量取ATP脂质体混悬液0.5 mL, 加入甲醇2 mL, 充分摇匀破乳, 移至5 mL量瓶中, 用超纯水定容至刻度, HPLC法测得总药物浓度(C₂)。通过公式计算ATP脂质体包封率(encapsulation efficiency, EE): $ {\rm{EE}} = \frac{{{C_2} - {C_1}}}{{{C_2}}} \times 100\% $, 并根据包封率与ATP-2Na占原料重量百分比的乘积, 计算药物载药量(loading efficiency, LE)。另精密量取ATP脂质体混悬液2 mL, 加入上样皿与弯曲式毛细管样品池中, 运用马尔文纳米激光粒度仪测量样品粒径和zeta电位。

ATP脂质体体外释药测定 量取相同药物浓度的ATP水溶液与ATP脂质体溶液各2 mL, 放入5 cm长透析袋中, 两端扎牢放入50 mL离心管中, 量取人工鼻液(每升去离子水含氯化钠7.91 g、氯化钾3.68 g、氯化钙0.51 g, 超声1 min, 使其溶解) 40 mL, 在37 ℃、转速100 r·min^-1条件下, 分别于0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、7、8、9、10、11和12 h取透析液2 mL, 测定透析袋外溶液ATP浓度。每次取液后, 及时补充等量人工鼻液。按照公式计算累计释放率(Q_n):$ {Q_n} = \frac{{{C_n}V + {V_0}\sum _{i = 1}^{n - 1} {{C_i}} }}{A} \times 100\% $, 其中V为离心管中人工鼻液的体积, C_n为第n个取样点测得的浓度, C_i为第i个取样点测得的浓度, V₀为取样体积, A为两种溶液中ATP-2Na的质量。

ATP脂质体水凝胶制备与含量测定 甲基纤维素的质量分数在1.7 wt.%~3.5 wt.%内, 交联速度最快^[11], 并综合考虑鼻腔给药时的良好通针性。因此, 选用质量分数为3.3 wt.%甲基纤维素凝胶作为载药基质。精密称量甲基纤维素1 g, 共3份, 各加超纯水10 mL, 充分搅拌, 放置于4 ℃冰箱溶胀过夜。称量ATP-2Na 600 mg, 根据处方比例制备ATP脂质体, 将ATP脂质体与ATP原料药分别加入已充分溶胀的两份甲基纤维素凝胶中, 超纯水分别定容至30 mL。另用超纯水将空白凝胶定容至30 mL, 作为阴性对照组。取ATP脂质体水凝胶0.05 mL移入10 mL量瓶中, 加入甲醇2 mL充分振荡破乳, 超纯水定容至10 mL, 利用HPLC测定制剂中ATP含量, 确保ATP脂质体水凝胶与ATP水凝胶中ATP含量相同。

空白水凝胶、ATP水凝胶、ATP脂质体水凝胶流变学考察 吸取上述3种凝胶(甲基纤维素质量分数均为3.3 wt.%)各3 mL, 加至轴承正下方的支撑板上, 在10~40 ℃内, 以1 ℃·min^-1升温模式进行复合黏度、储能模量(G′)和损耗模量(G")扫描, 并在34 ℃温度下, 模拟鼻腔环境温度, 探究0~100 rad·s^-1角频率变化下, G′和G"的变化。

预防给药小鼠血常规测定 将21只健康雄性BALB/c小鼠随机分为3组:空白水凝胶组、ATP水凝胶组和ATP脂质体水凝胶组。每组7只。各组用微量注射器进行鼻腔给药。空白水凝胶组给予凝胶30 μL, 两给药组分别给予13.4 mg·mL^-1ATP水凝胶与脂质体水凝胶30 μL, 单侧鼻孔给药, 每日1次, 鼻腔进针深度0.5 cm。用药9天后, 于小鼠尾静脉取血10 μL, 通过全自动血球计数器, 测定各组小鼠红细胞计数(red blood cell, RBC)、血红蛋白浓度(hemoglobin, HGB)与红细胞压积(hematocrit, HCT)数值。

预防给药小鼠常压密闭缺氧实验 上述3组小鼠给药后第11天, 分别称重, 一一对应放入21个250 mL广口大瓶中(各瓶底事先放入氢氧化钙5 g, 并用滤纸覆盖, 用于吸收小鼠呼出的二氧化碳), 在瓶口涂抹凡士林同时密闭后, 开始计时。当瓶中小鼠喘息抽搐时所用时间即为小鼠在瓶中的实际耐缺氧时间(t₀), 通过公式计算各组小鼠标准缺氧耐受时间(t): t = t₀ × 100/(V-W/0.94)^[15], 其中V为广口瓶体积(mL), W为小鼠体重。密闭缺氧实验完毕后将各组小鼠迅速断头取脑, 制作促凋亡基因p53免疫组化病理切片。

统计学分析 通过SPSS 25.0软件对各组血常规及标准缺氧耐受时间数据进行One-way ANOVA方差分析, 并用Dunnett-t检验两两比较组间均数。

结果

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1 HPLC标准曲线的建立

在本实验色谱条件下, ATP浓度在20~400 μg·mL^-1内, 峰面积(S)与药物浓度(C)线性关系良好, 回归方程为: S = 13.52 C - 49.483 (r = 0.999 6)。

2 离子对复合物的组成

比较ATP与CTAB摩尔比对两者结合率的影响, ATP与CTAB摩尔比分别为1:1、1:2和1:3时, 结合率分别为41%、63.67%和74.17% (图 1)。增加CTAB比例可以提高ATP与CTAB的结合率, 但由于CTAB除了能与细胞表面产生非特异性静电相互作用外, 还可能具有细胞毒性, 导致不受控制的细胞死亡^[16]。因此, 综合考虑选择ATP与CTAB摩尔比为1:3, 进行ATP脂质体凝胶的制备。

3 ATP脂质体包封率、载药量、粒径与zeta电位测定

按照处方制作3批ATP脂质体。通过HPLC分别测定C₁和C₂, 测得ATP脂质体EE为(81.50 ± 0.82) %, LE为(6.79 ± 0.07) %; 测得ATP脂质体混悬液粒径为(91.49 ± 6.22) nm, zeta电位为(27.43 ± 0.33) mV, 说明薄膜分散法制备得到ATP脂质体的包封率高、粒径均匀且分散程度好。

4 ATP脂质体体外释药测定

由ATP水溶液与ATP脂质体溶液体外释药曲线(图 2)可知, ATP水溶液3 h左右达到平衡, 累计释放率为(77.08 ± 0.42) %, ATP脂质体溶液12 h累计释放率为(53.76 ± 2.44) %, 表明ATP脂质体具有缓释作用, 且包封较稳定。

5 ATP脂质体水凝胶含量测定

利用HPLC测得ATP脂质体水凝胶中ATP含量为13.4 mg·mL^-1。根据该药物浓度制作ATP水凝胶, 确保两种不同剂型中药物含量相等。

6 ATP脂质体水凝胶流变学考察

在相同温度与角频率条件下, ATP脂质体水凝胶的复合黏度、G′和G"较ATP水凝胶或空白水凝胶高, 证明ATP脂质体增加了凝胶黏稠度。在10~40 ℃内, 随温度升高, 3种凝胶复合黏度、G′和G"均呈下降, 3种凝胶均为G" > G′ (图 3a、b); 随角频率增加, 3种凝胶复合黏度下降, G′和G"均升高, 3种凝胶均为G" > G′(图 3c、d)。结果表明, 以甲基纤维素为基质的水凝胶为假塑性流体, 以液体黏性形变为主。

7 ATP脂质体水凝胶提高小鼠耐缺氧能力

通过3组小鼠的血常规分析, 发现ATP水凝胶组与ATP脂质体水凝胶组RBC与HCT平均值均较空白水凝胶组有显著提高(P < 0.05, P < 0.01, 图 4a、b); ATP脂质体水凝胶组与空白水凝胶组相比, HGB平均值有显著提高(P < 0.01, 图 4c), 而ATP水凝胶组与空白水凝胶组相比HGB数值无显著性差异。提示ATP在相同剂量条件下, ATP脂质体水凝胶能有效提高小鼠血液的携氧能力。

通过对3组小鼠常压密闭缺氧实验数据分析, 空白水凝胶组标准缺氧耐受时间为(21.68 ± 0.98) min, ATP水凝胶组为(24.71 ± 3.31) min, ATP脂质体组为(26.86 ± 4.66) min。结果表明, ATP脂质体水凝胶组与空白水凝胶组相比, 标准缺氧耐受时间有显著性延长(P < 0.05, 图 4d), 而ATP水凝胶组与空白水凝胶组相比, 数值无显著性差异。进一步提示预防性给予ATP脂质体水凝胶能提高小鼠耐缺氧能力。

促凋亡基因p53作为转录调控因子在细胞迁移、增殖、分化和凋亡中发挥重要作用^[17]。在100倍镜下观察发现空白凝胶组与ATP水凝胶组小鼠海马齿状回(dentate gyrus, DG)均有固缩深染的细胞核, 提示神经元凋亡; ATP脂质体凝胶组未见明显固缩深染细胞核(图 5a1~c1)。在400倍镜下观察DG区可见固缩深染细胞包膜破裂, 形态不规则(图 5a2~c2)。在400倍镜下观察海马CA3区, 可见p53蛋白阳性染色位于细胞核上, 呈棕黄色或褐色颗粒(图 5a3~c3)。运用Image-Pro Plus软件对免疫组织切片进行分析, 将p53蛋白标记为粉红色, 通过计算3组切片p53蛋白的综合光密度(integrated optical density, IOD), 定量比较3组切片p53蛋白表达程度的高低。可见空白凝胶组p53蛋白表达程度最高, ATP水凝胶组较少, ATP脂质体水凝胶组最少(图 5a4~c4), 且给药组与空白凝胶组相比均有统计学意义(P < 0.05, 图 6)。

讨论

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ATP作为体内直接供能物质与细胞内外生物信号分子, 在机体缺血缺氧时, 维持体内代谢与神经传导方面具有重要的作用。静脉注射ATP可引起短暂房室结阻塞, 用以治疗急性室上性心动过速^[18]。心肌缺血时, 心肌间质内高浓度分泌的ATP对内皮细胞缺氧损伤亦起到保护性作用^[5]。此外, 外源性ATP在体外培养大鼠皮质神经元缺氧模型中有明显保护作用; 体内实验中, ATP在大鼠脊髓压损伤中对神经具有保护作用^[19]。在中枢神经系统中, 脑干中ATP的释放通过局部星形胶质细胞, 帮助维持呼吸和对抗缺氧引起的呼吸网络抑制^[20]。然而ATP注射液与ATP片剂极易被胞外酶降解, 不能在病灶部位维持血药浓度。为提升药效应用大剂量注射液或片剂后, 由于作用受体分布的广泛性, 常发生不良反应, 其中胸部不适、呼吸困难最为常见, 其他症状包括面部潮红、头痛和眩晕等^[21]。

因此, 本研究旨在证明ATP脂质体水凝胶可利用脂质体药物传递优势与鼻腔的便捷给药途径, 实现提高中枢系统的抗缺氧能力的效果。应用相同浓度的ATP作为实验药物, 考察ATP水凝胶与ATP脂质体水凝胶两种剂型对小鼠抗缺氧能力的影响。由于水溶性分子可通过长烷基链的化学修饰, 稳定的结合在脂质体双层膜中^[22], 因此通过ATP-CTAB离子对复合物方法, 使水溶性药物ATP易溶于有机溶剂无水乙醇, 提高了ATP脂质体包封率与载药量; 并通过薄膜分散法得到符合鼻腔给药、剂量小和浓度高特点的鼻用脂质体水凝胶。通过体外释放实验与流变学测定, 评价了ATP脂质体与甲基纤维素的理化性质特点。

神经细胞内ATP耗竭是缺氧环境因素对中枢神经系统产生的最直接结果。通常情况下, 机体应对缺氧条件的主要策略包括细胞外核苷酸代谢的变化和新生嘌呤合成的增强, 这种代偿作用可满足其生物能量和合成代谢的需要。但长期缺氧所导致的线粒体氧化磷酸化供能不足, 将引起细胞内ATP水平降低, 通过诱发不同通路, 导致中枢神经系统的一系列不可逆损伤^[23]。在神经细胞中, ATP的减少导致跨膜离子泵功能障碍, 使细胞内钠离子与钙离子积累。由此产生的膜去极化激活和电压门控钙通道的打开, 使得兴奋性氨基酸过度释放, 活性氧(reactive oxygen species, ROS)释放, 形成破坏性恶性循环^{[24, 25]}。此外, 缺氧状态下, 非受体酪氨酸激酶介导的半胱天冬酶caspase-1, 2, 3, 8, 9表达上调^[26], 钙蛋白酶calpain-1, 2表达上调^[27], 均与ATP消耗有协同作用。此外, 体外细胞及在体实验均证明ATP对缺氧条件下细胞及组织器官存活时间的延长具有积极促进作用。因此, 探索可提高组织内ATP含量的方法具有重要意义。

动物实验显示, ATP对于提高小鼠抗缺氧能力具有保护性作用。由于HGB是决定缺氧条件下机体携氧能力的重要因素^[28], 并且HGB与HCT、RBC具有正相关性^[29], 通过小鼠尾静脉血液测定, 发现ATP脂质体水凝胶组HGB、HCT、RBC平均值与空白凝胶组相比具有显著性提升, 为ATP提高机体抗缺氧能力提供了支持。通常情况下, 机体内HGB、HCT、RBC受促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)调控, 并在离体环境中也可对HGB、HCT、RBC起到保护作用。在血库储存条件下, 加入EPO可延长红细胞半衰期, 并且6周后红细胞中ATP含量大于空白对照组^[30]; 近年来研究指出, 缺氧条件下大脑内可产生EPO, 并作用于神经元, 星形胶质细胞和脑血管内皮细胞中的促红细胞生成素受体发挥保护作用^[31], 提示ATP与EPO具有共同调节的信号通路, 发挥协同抗缺氧的功能。常压密闭缺氧实验是在密闭缺氧环境下, 通过观察药物能否延长动物耐缺氧时间, 评价药物的抗缺氧活性^[32]。本实验中, ATP脂质体水凝胶显著延长了小鼠常压密闭缺氧的耐缺氧时间, 进一步证明了ATP脂质体水凝胶的抗缺氧活性。p53免疫组化切片同样显示, ATP脂质体水凝胶对小鼠海马神经细胞起到明显的保护作用。

近年来, 鼻腔给药以靶向性治疗颅内疾病, 被证实为一种安全有效的给药手段。粉防己碱鼻用温敏凝胶可增加药物在鼻腔内滞留时间, 显著改善创伤后应激障碍小鼠的相关症状^[33]; 在比较酒石酸卡巴拉汀鼻腔内与静脉注射两种给药途径的实验中, 48.79 %药物可从鼻腔通道直接入脑, 且药物在脑内的清除半衰期延长了1.4倍^[34]。在中枢神经系统缺血缺氧相关疾病治疗中, 鼻腔给药途径也是一种具有针对性的给药方法。在生物制剂领域, 通过对缺氧模型新生仔猪鼻腔给予rh-VEGF165, 减少了缺氧导致的脑血管密度下降^[35]; 对于C57BL/6小鼠缺血缺氧模型, 鼻腔给予人类间充质干细胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs), 减少了小鼠脑内损伤体积, 改善了运动行为^[36]; 在针对Wistar大鼠的缺血缺氧模型中, 鼻腔给予间充质干细胞衍生的外泌体, 并通过LI-COR扫描仪检测监控红外标记的外泌体在脑内的分布情况, 证明外泌体鼻腔给药后可保护神经细胞正常髓鞘的形成, 提高神经元细胞计数^[37]。因此, 鼻腔脑靶向给药被认为是一种成熟的治疗脑部缺氧的新方法。

综上所述, ATP脂质体水凝胶通过ATP与脂质体结合后, 加入甲基纤维素作为凝胶基质, 形成鼻用剂型, 发挥抗缺氧作用, 有望成为预防缺氧性脑损伤的新制剂。

基金

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全军医药卫生“十二五”面上项目(CWS11J303)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

Luks

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2020年第55卷第6期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-0808

接收时间：2019-10-12
首发时间：2026-01-21
出版时间：2020-06-12

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出版历史

收稿日期：2019-10-12
修回日期：2019-11-15

基金

全军医药卫生“十二五”面上项目(CWS11J303)

作者信息

1.解放军总医院药学部, 北京 100853

2.军事科学院军事医学研究院, 北京 100850

3.山东中医药大学药学院, 山东济南 250355

通讯作者:

*李欣, Tel:86-10-66937436, E-mail:doublelixin@126.com;

杜丽娜, Tel:86-10-66930216, E-mail:dulina@188.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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