药学学报

No.	δ_H, Mult. (J in Hz)	δ_{C, type}
1	1.58 m, 1.03 m	39.3, CH₂
2	1.85 m	28.6, CH₂
3	3.47 dd, (11.3, 4.9)	78.6, CH
4	-	39.9, C
5	0.92 dd, (12.8, 5.7)	56.4, CH
6	1.61 m, 1.44 m	19.4, CH₂
7	1.59 m, 1.41 m	34.1, CH₂
8	-	40.4, C
9	1.90 m	48.8, CH
10	-	38.1, C
11	1.91 m, 2.06 m	24.6, CH₂
12	5.64 m	124.3, CH
13	-	144.8, C
14	-	42.8, C
15	2.11 td, (3.9, 3.0), 1.32 m	29.6, CH₂
16	2.96 td, (13, 5, 3.1), 2.52 m	31.7, CH₂
17	-	46.6, C
18	3.82 br s	44.7, CH
19	3.87 dd, (6.6, 2.9)	84.8, CH
20	-	39.9, C
21	4.03 br s	75.8, CH
22	2.64 dd, (14.1, 4.9)	41.5, CH₂
	2.55 dd, (14.3, 3.5)
23	1.26 s	29.3, CH₃
24	1.06 s	17.0, CH₃
25	0.96 s	16.1, CH₃
26	1.11 s	18.0, CH₃
27	1.67 s	24.6, CH₃
28	-	181.0, C
29	1.20 s	26.8, CH₃
30	1.54 s	24.3, CH₃

No.	δ_H, Mult. (J in Hz)	δ_{C, type}
1	1.58 m, 1.03 m	39.3, CH₂
2	1.85 m	28.6, CH₂
3	3.47 dd, (11.3, 4.9)	78.6, CH
4	-	39.9, C
5	0.92 dd, (12.8, 5.7)	56.4, CH
6	1.61 m, 1.44 m	19.4, CH₂
7	1.59 m, 1.41 m	34.1, CH₂
8	-	40.4, C
9	1.90 m	48.8, CH
10	-	38.1, C
11	1.91 m, 2.06 m	24.6, CH₂
12	5.64 m	124.3, CH
13	-	144.8, C
14	-	42.8, C
15	2.11 td, (3.9, 3.0), 1.32 m	29.6, CH₂
16	2.96 td, (13, 5, 3.1), 2.52 m	31.7, CH₂
17	-	46.6, C
18	3.82 br s	44.7, CH
19	3.87 dd, (6.6, 2.9)	84.8, CH
20	-	39.9, C
21	4.03 br s	75.8, CH
22	2.64 dd, (14.1, 4.9)	41.5, CH₂
	2.55 dd, (14.3, 3.5)
23	1.26 s	29.3, CH₃
24	1.06 s	17.0, CH₃
25	0.96 s	16.1, CH₃
26	1.11 s	18.0, CH₃
27	1.67 s	24.6, CH₃
28	-	181.0, C
29	1.20 s	26.8, CH₃
30	1.54 s	24.3, CH₃

Compounds	AchE		BuChE
1	20	15.29 ± 5.61		20	88.25 ± 2.31
2	20	3.34 ± 5.53	20	36.79 ± 1.61
3	20	8.31 ± 5.61	20	72.35 ± 3.12
4	20	45.70 ± 3.22	20	37.07 ± 6.53
5	20	20.10 ± 5.42	20	77.56 ± 3.92
6	20	17.38 ± 7.05	20	37.50 ± 4.12
7	20	17.26 ± 1.13	20	28.70 ± 5.94
8	20	12.52 ± 5.44	20	33.02 ± 3.82
Iso-OMPA	-	-	4	90.00 ± 2.01
Huperzine A	0.8	29.96 ± 5.53	-	-

Compounds	AchE		BuChE
1	20	15.29 ± 5.61		20	88.25 ± 2.31
2	20	3.34 ± 5.53	20	36.79 ± 1.61
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Iso-OMPA	-	-	4	90.00 ± 2.01
Huperzine A	0.8	29.96 ± 5.53	-	-

维药格蓬脂中三萜类化学成分研究及其抗胆碱酯酶活性评价

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王书云 ¹^,²^,³ , 孙富周 ³ , 孙义凡 ⁴ , 黄健 ²^,³ , 王金辉 ²^,³^,^* , 杨宝峰 ²

药学学报 | 研究论文 2020,55(2): 283-288

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药学学报 | 研究论文 2020, 55(2): 283-288

维药格蓬脂中三萜类化学成分研究及其抗胆碱酯酶活性评价

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王书云¹^,²^,³, 孙富周³, 孙义凡⁴, 黄健²^,³, 王金辉²^,³^,^*, 杨宝峰²

作者信息

1.河南大学药学院, 河南开封 475004

2.哈尔滨医科大学药化教研室, 省部共建生物医药工程重点实验室, 黑龙江哈尔滨 150081

3.沈阳药科大学中药学院, 辽宁沈阳 110016

4.深圳弘汇生物医药有限公司, 广东深圳 518118

通讯作者:

*王金辉, Tel/Fax:86-451-86685745, E-mail:wangjinhui@hrbmu.edu.cn

Triterpenoids from Galbanum of uygur medicine and their anticholinesterase activities

Shu-yun WANG¹^,²^,³, Fu-zhou SUN³, Yi-fan SUN⁴, Jian HUANG²^,³, Jin-hui WANG²^,³^,^*, Bao-feng YANG²

Affiliations

1. School of Pharmacy, Henan University, Kaifeng 475004, China

2. Department of Medicinal Chemistry and Natural Medicine Chemistry(State-Province Key Laboratories of Biomedicine-Pharmaceutics of China), Harbin Medical University, Harbin 150081, China

3. School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China

4. Shenzhen Honghui Biopharmaceutical Co., Ltd., Shenzhen 518118, China

出版时间: 2020-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-0484

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摘要

收起

采用反复硅胶柱色谱、开放ODS柱色谱、重结晶和半制备型HPLC等方法，从维药格蓬脂的甲醇超声提取物中共分离得到8个三萜类化合物。根据波谱数据及理化性质鉴定了化合物的结构，分别为：3β，19α，21α-三羟基-12-烯-28-油酸（1）、苏门树脂脑酸（2）、3β，19α-二羟基-12-烯-28-油酸（3）、齐墩果酸（4）、3β，6β，19α-三羟基-12-烯-28-油酸（5）、19α-羟基齐墩果酮酸（6）、6α-羟基齐墩果酮酸（7）和3α，6α-二羟基-11R，12R-环氧齐墩果烷-28，13α-内酯（8），其中化合物1为新化合物，化合物2~8首次从该科植物中分离得到。运用改进Ellman法对化合物1~8进行胆碱酯酶抑制活性筛选，化合物1表现出较强的丁酰胆碱酯酶抑制活性，进一步对其进行了分子对接研究，提示Trp82、His438、Phe329及Ala328四个氨基酸残基是化合物1与丁酰胆碱酯酶结合的关键位点。

关键词

格蓬脂 / 三萜 / 胆碱酯酶抑制活性 / 分子对接

Abstract

收起

Eight triterpenes were isolated from the methanol extract of Galbanum by various chromatographic methods including silica gel, ODS opening column, recrystallization and semi-preparative HPLC. Their structures were determined by spectroscopic methods and physicochemical properties as 3β, 19α, 21α-trihydroxyl-12-en-28-oic acid (1), sumaresinolic acid (2), 3β, 19α-dihydroxyl-12-en-28-oic acid (3), oleanolic acid (4), 3β, 6β, 19α-trihydroxyl-12-en-28-oic acid (5), 19α-hydroxy oleanonic acid (6), 6α-hydroxy oleanonic acid (7), and (11R, 12R)-3α, 6α-dihydroxy-epoxyolean-28α, 13α-olide (8). Among them, compound 1 is a new compound, while compounds 2-8 were newly isolated from the Apiaceae family. The ability of compounds 1-8 to inhibit cholinesterase was determined with an improved Ellman method. Compound 1 showed strong inhibitory activity against butyrylcholinesterase. The molecular docking results indicated that Trp82, His438, Phe329 and Ala328 played an important role in the binding of compound 1 to butyrylcholinesterase.

Key words

Galbanum / triterpenes / cholinesterase inhibition activities / molecular docking

引用本文

王书云, 孙富周, 孙义凡, 黄健, 王金辉, 杨宝峰. 维药格蓬脂中三萜类化学成分研究及其抗胆碱酯酶活性评价. 药学学报, 2020 , 55 (2) : 283 -288 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0484

Shu-yun WANG, Fu-zhou SUN, Yi-fan SUN, Jian HUANG, Jin-hui WANG, Bao-feng YANG. Triterpenoids from Galbanum of uygur medicine and their anticholinesterase activities[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2020 , 55 (2) : 283 -288 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0484

正文

收起

伞形科(Apiaceae)阿魏属(Ferula)植物全世界有150余种, 主要分布于中西亚地区, 我国有26种和1变种, 主要分布于新疆^[1]。阿魏属植物广泛应用于药品、食品、化妆品等行业, 文献[2-5]报道阿魏属植物中化学成分主要有倍半萜类、香豆素类、倍半萜香豆素类、三萜类、木脂素类、挥发油类等。

格蓬脂为伞形科植物格蓬阿魏(Ferula galbaniflua Boissier et Bubse)的乳状胶脂, 维吾尔药名为加吾西尔, 产于伊朗、土耳其等地, 具有祛寒散风、利尿退肿、补胃除胀、止咳平喘、通经止痛等功效, 主治湿寒性或黏液质性疾病, 如瘫痪、癫痫、肠梗阻、尿闭水肿、胃虚腹胀、咳嗽哮喘、闭经痛经等^[6]。目前国内外对其化学成分及药理活性的研究欠缺, 为揭示格蓬脂的药效物质基础, 丰富格蓬脂的化学成分研究, 本文对格蓬脂中的化学成分进行系统研究, 从中分离得到8个三萜类化合物(图 1), 其中化合物1为新化合物, 其他7个化合物为首次从该科中分离得到。运用改进Ellman法对化合物1~8进行胆碱酯酶抑制活性筛选, 化合物1表现出较强的胆碱酯酶抑制活性, 提示Trp82、His438、Phe329及Ala328等4个氨基酸残基是化合物1与丁酰胆碱酯酶结合的关键位点。

结果与讨论

收起

1 新化合物结构解析

化合物1为白色羽状结晶(甲醇), 易溶于二氯甲烷、甲醇、乙腈等有机溶剂, 10%硫酸-香草醛显色剂显紫红色。HR-ESI-MS给出m/z 489.361 2 [M+H]⁺ (Calcd. 489.361 0, C₃₀H₄₉O₅⁺), 计算化合物的分子式为: C₃₀H₄₈O₅, 不饱和度为7。IR谱中, 3 409、1 709、1 630 cm^-1吸收带显示其含有羟基、羧基和双键。

¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N)谱中(表 1)给出7个角甲基质子信号: δ_H 0.96 (3H, s), 1.06 (3H, s), 1.11 (3H, s), 1.20 (3H, s), 1.26 (3H, s), 1.54 (3H, s), 1.67 (3H, s); δ_H 3.47 (1H, dd, J = 11.3, 4.9 Hz), 3.87 (1H, dd, J = 6.6, 2.9 Hz), 4.03 (1H, br s)为3个连氧次甲基上的氢质子信号, δ_H 5.64 (1H, m)为1个双键上的氢质子信号。

¹³C NMR (100 MHz, C₅D₅N)给出30个碳信号, 其中包括: 1个羰基碳信号(δ_C 181.0), 2个环内双键碳信号(δ_C 124.3, 144.8), 3个连氧次甲基碳信号(δ_C 75.8, 78.6, 84.8)。根据HSQC谱, 将所有氢信号和相关的碳信号归属, 再次确认化合物中含有1个羧基、1个双键、3个连氧次甲基和7个甲基等结构片段, 推测该化合物为三位羟基取代的齐墩果烯型三萜酸类化合物^[7]。化合物1的¹H NMR和¹³C NMR数据与化合物3相似^[8], 化合物1在C-21多一个羟基, 可由HMBC谱中H-21 (δ_H 4.03)与C-17 (δ_C 46.6)、C-19 (δ_C 84.8)、C-20 (δ_C 39.9)相关得以确证。

此外, HMBC谱(图 2)中, CH₃-23 (δ_H 1.26)和CH₃-24 (δ_H 1.06)与C-3 (δ_C 78.6)、C-4 (δ_C 39.9)、C-5 (δ_C 56.4)相关, CH₃-29 (δ_H 1.20)和CH₃-30 (δ_H 1.54)与C-19 (δ_C 84.8)、C-20 (δ_C 39.9)、C-21 (δ_C 75.8)相关, 提示CH₃-23和CH₃-24、CH₃-29和CH₃-30是连在同一碳上的偕甲基; H-3 (δ_H 3.47)与C-2 (δ_C 28.6)、C-4 (δ_C 39.9)、C-23 (δ_C 29.3)、C-24 (δ_C 17.0)相关, H-19 (δ_H 3.87)与C-17 (δ_C 46.6)、C-21 (δ_C 75.8)相关, 提示3, 19位存在羟基; H-12 (δ_H 5.64)分别与C-9 (δ_C 48.8)、C-11 (δ_C 24.6)、C-14 (δ_C 42.8)、C-18 (δ_C 44.7)相关, 推测三取代双键在12, 13位碳上; H₂-16 (δ_H 2.52, 2.96)、H-18 (δ_H 3.82)、H₂-22 (δ_H 2.55, 2.64)分别与C-28 (δ_C 181.0)相关, 由以上数据, 进一步确定化合物的平面结构。

化合物的相对构型通过NOESY谱(图 2)和¹H NMR谱的峰型及耦合常数确定。在NOESY谱中, H-3/H-5, H-3/ CH₃-23, H-5/H-9, H-9/CH₃-27, CH₃-27/H-16α, H-16α/H-22α, H-22α/CH₃-29; CH₃-24/CH₃-25, CH₃-25/CH₃-26, CH₃-26/H-18, H-18/H-19, H-19/CH₃-30, CH₃-30/H-21, 由3位氢的峰型及耦合常数可以推测H-3为α构型, 即OH-3为β构型^[9], 从而确定H-5、H-9、CH₃-27、CH₃-29为α构型, H-18、H-19、H-21、CH₃-24、CH₃-25、CH₃-26、CH₃-30为β构型, 即OH-19、OH-21均为α构型, 最终确定该化合物为3β, 19α, 21α-三羟基-12-烯-28-油酸(3β, 19α, 21α-trihydroxyl-12-en-28-oic acid)。经Scifinder检索, 为一未见报道的新化合物。

2 胆碱酯酶抑制活性测试

采用改进的Ellman法对化合物1~8进行了乙酰胆碱酯酶及丁酰胆碱酯酶活性测试, 石杉碱甲及Iso-OMPA作为阳性对照。结果显示, 化合物1~8对乙酰胆碱酯酶抑制活性较弱, 对丁酰胆碱酯酶抑制活性较强。其中化合物1、3和5表现较强的丁酰胆碱酯酶抑制活性。结构上这3个化合物3位和19位均为羟基, 对比化合物2, 推测19位羟基取代有利于活性提高。化合物1中, 21位也被羟基取代, 其20 μmol·L^-1时抑制率达到88%, 说明E环羟基的取代对丁酰胆碱酯酶抑制活性起着重要的作用。

3 分子对接

为了考察化合物1与胆碱酯酶的潜在作用模式, 对其进行分子对接研究。结果显示化合物1不能够结合到乙酰胆碱酯酶活性位点(PDB code 4EY5), 而与丁酰胆碱酯酶(PDB code 4TPK)结合较好, 其结果如图 3所示。化合物1深嵌入丁酰胆碱酯酶活性位点, 21位羟基与氨基酸残基Asn289的侧链形成一个保守的氢键, A环进入有Trp82、Phe329形成的疏水口袋。23, 24位两个甲基与Trp82、His438、Phe329及Ala328形成疏水作用。

实验部分

收起

Bruker AVANCE Ⅲ HD-400核磁共振谱仪和Bruker IFS-55光谱仪(德国Bruker公司), Perkin-Elmer 241 MC旋光仪(美国Perkin-Elmer公司), 日立液相色谱仪(日本日立株式会社), Waters LCT Premier XE TOF-MS (美国Waters公司)。薄层色谱硅胶GF₂₅₄和柱色谱硅胶(200~300目, 青岛海洋化工有限公司生产), ODS (30~80 μm, 天津市化学试剂厂色谱技术开发公司生产), 所有试剂若无特别说明, 级别为分析纯或色谱纯(山东禹王实业有限公司生产)。

格蓬脂购于新疆乌鲁木齐市药材市场, 经石河子大学药学院朱芸副教授鉴定为伞形科(Apiaceae)植物格蓬阿魏(Ferula galbaniflua Boissier et Bubse)的乳状胶脂, 标本(SN0208)保存于沈阳药科大学中药学院天然药化实验室。

1 提取与分离

格蓬脂(200 g)经粉碎后, 以甲醇2 L超声提取3次, 每次1 h, 减压浓缩至干, 得到浸膏168 g。取浸膏150 g进行硅胶柱色谱分离, 以石油醚-丙酮系统(100:0~0:100)进行梯度洗脱, 得到10个流份(Fr.1~Fr.10)。流份Fr.3 (12.5 g)经硅胶柱色谱分离, 以石油醚-丙酮系统(100:0, 100:3, 100:5, 100:8, 100:10, 100:20, 100:50)梯度洗脱, 得到7个亚流份(Fr.3.1~Fr.3.7)。Fr.3.4 (3.7 g)经开放ODS柱色谱, 以甲醇-水(10%~100%)梯度洗脱, 得到Fr.3.4.1~Fr.3.4.10, 亚流份Fr.3.4.6 (276 mg)经重结晶得到化合物8 (52.4 mg), Fr.3.4.8 (1.5 g)再经硅胶柱, 石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统(100:4:4, 100:5:5, 100:6:6, 100:7:7, 100:20:20)梯度洗脱, 得到5个亚流份(Fr.3.4.8.1~Fr.3.4.8.5), Fr.3.4.8.3 (573 mg)经重结晶得到化合物7 (104.3 mg)。流份Fr.5 (4.9 g)经开放ODS柱色谱, 以甲醇-水(10%~100%)梯度洗脱, 得到Fr.5.1~Fr.5.10, Fr.5.7 (159 mg)经重结晶得到化合物2 (25.7 mg)。Fr.5.8 (1.2 g)再经硅胶柱, 石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统(100:4:4, 100:5:5, 100:6:6, 100:7:7, 100:20:20)梯度洗脱, 得到5个亚流份(Fr.5.8.1~Fr.5.8.5), Fr.5.8.3 (101 mg)经重结晶得到化合物6 (23.2 mg)。流份Fr.6 (5.2 g)经开放ODS柱色谱, 以甲醇-水(10%~100%)梯度洗脱, 得到Fr.6.1~Fr.6.10, Fr.6.6 (96 mg)经重结晶得到化合物3 (13.3 mg)。Fr.6.8 (242 mg) RP-HPLC分离, 以乙腈-水(85:15)为流动相(2.0 mL·min^-1, 210 nm), 制备得到化合物1 (t_R=47.3 min, 50.6 mg)。流份Fr.7 (4.7 g)经开放ODS柱色谱, 以甲醇-水(10%~100%)梯度洗脱, 得到Fr.7.1~Fr.7.10, Fr.7.6 (1.3 g)再经硅胶柱, 石油醚-乙酸乙酯-丙酮系统(100:10:10, 100:12:12, 100:14:14, 100:25:25)梯度洗脱, 得到4个亚流份(Fr.7.6.1~Fr.7.6.4), Fr.7.6.3 (126 mg)经重结晶得到化合物4 (31.1 mg)。Fr.7.7 (242 mg)经RP-HPLC分离, 以乙腈-水(85:15)为流动相(2.0 mL·min^-1, 210 nm), 制备得到化合物5 (t_R=82.3 min, 48.5 mg)。

2 结构鉴定

化合物1 白色羽状结晶(甲醇), [α] -47.6 (c 0.92, CHCl₃); IR (KBr) v_max (cm^-1): 3 409, 2 938, 2 873, 1 709, 1 630, 1 453, 1 385, 1 288, 1 050, 914, 626; ¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N), ¹³C NMR (100 MHz, C₅D₅N)见表 1, HR-ESI-MS给出m/z 489.361 2 [M+H]⁺ (Calcd. 489.361 0, C₃₀H₄₉O₅⁺)。

化合物2 白色固体粉末, HR-ESI-MS m/z 471.347 6 [M-H]^- (Calcd. for 471.347 4, C₃₀H₄₇O₄^-)。¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N): δ_H 0.90 (3H, s, CH₃-29), 0.92 (3H, s, CH₃-30), 1.07 (6H, s, CH₃-23, CH₃-26), 1.11 (3H, s, CH₃-27), 1.18 (3H, s, CH₃-24), 1.30 (3H, s, CH₃-25), 3.16 (1H, dd, J = 10.3, 5.8 Hz, H-3), 4.54 (1H, br s, H-6), 5.31 (1H, t, J = 3.4 Hz, H-12); ¹³C NMR (100 MHz, C₅D₅N): δ_C 40.5 (C-1), 27.5 (C-2), 79.3 (C-3), 39.7 (C-4), 55.9 (C-5), 68.8 (C-6), 40.7 (C-7), 36.7 (C-8), 38.6 (C-9), 48.1 (C-10), 23.5 (C-11), 122.9 (C-12), 143.0 (C-13), 42.5 (C-14), 27.8 (C-15), 23.2 (C-16), 46.7 (C-17), 41.1 (C-18), 46.1 (C-19), 30.8 (C-20), 34.1 (C-21), 32.5 (C-22), 28.1 (C-23), 17.2 (C-24), 17.1 (C-25), 26.1 (C-26), 18.4 (C-27), 183.6 (C-28), 33.2 (C-29), 23.7 (C-30)。以上数据与文献对比^[10], 确定化合物2为苏门树脂脑酸。

化合物3 白色片状结晶, HR-ESI-MS m/z 471.347 6 [M-H]^- (Calcd. for 471.347 4, C₃₀H₄₇O₄^-)。¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N): δ_H 0.94 (3H, s, CH₃-25), 1.04 (3H, s, CH₃-24), 1.08 (3H, s, CH₃-26), 1.13 (3H, s, CH₃-30), 1.20 (3H, s, CH₃-29), 1.25 (3H, s, CH₃-23), 1.65 (3H, s, CH₃-27), 3.44 (1H, dd, J = 10.8, 5.2 Hz, H-3), 5.58 (1H, t, J = 4.0 Hz, H-12); ¹³C NMR (100 MHz, C₅D₅N): δ_C 38.9 (C-1), 28.6 (C-2), 78.3 (C-3), 39.5 (C-4), 56.1 (C-5), 19.1 (C-6), 33.8 (C-7), 40.1 (C-8), 48.5 (C-9), 37.7 (C-10), 24.3 (C-11), 123.5 (C-12), 145.0 (C-13), 42.3 (C-14), 30.0 (C-15), 28.2 (C-16), 46.1 (C-17), 44.9 (C-18), 81.4 (C-19), 35.9 (C-20), 29.0 (C-21), 33.5 (C-22), 29.3 (C-23), 16.6 (C-24), 15.6 (C-25), 17.6 (C-26), 25.0 (C-27), 180.9 (C-28), 29.0 (C-29), 25.0 (C-30)。以上数据与文献对比^[8], 确定化合物3为3β, 19α-二羟基-12-烯-28-油酸。

化合物4 白色羽状结晶, HR-ESI-MS m/z 455.353 9 [M-H]^- (Calcd. for 455.352 5, C₃₀H₄₇O₃^-)。¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N): δ_H 0.92 (3H, s, CH₃-29), 0.97 (3H, s, CH₃-30), 1.03 (3H, s, CH₃-23), 1.05 (3H, s, CH₃-24), 1.07 (3H, s, CH₃-25), 1.27 (3H, s, CH₃-26), 1.31 (3H, s, CH₃-27), 3.43 (1H, dd, J = 10.7, 5.2 Hz, H-3), 5.53 (1H, br s, H-12); ¹³C NMR (100 MHz, C₅D₅N): δ_C 39.9 (C-1), 28.6 (C-2), 78.6 (C-3), 40.3 (C-4), 56.3 (C-5), 19.3 (C-6), 34.7 (C-7), 42.5 (C-8), 50.2 (C-9), 39.4 (C-10), 24.2 (C-11), 123.1 (C-12), 145.3 (C-13), 42.7 (C-14), 28.8 (C-15), 24.3 (C-16), 47.2 (C-17), 46.9 (C-18), 48.6 (C-19), 31.5 (C-20), 37.9 (C-21), 33.7 (C-22), 29.2 (C-23), 17.0 (C-24), 16.0 (C-25), 17.9 (C-26), 26.7 (C-27), 180.9 (C-28), 33.7 (C-29), 24.3 (C-30)。以上数据与文献对比^[11], 确定化合物4为齐墩果酸。

化合物5 白色羽状结晶, HR-ESI-MS给出m/z 489.361 2 [M+H]⁺ (Calcd. 489.361 0, C₃₀H₄₉O₅⁺)。¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N): δ_H 1.15 (3H, s, CH₃-30), 1.21 (3H, s, CH₃-29), 1.45 (3H, s, CH₃-23), 1.65 (3H, s, CH₃-27), 1.67 (3H, s, CH₃-26), 1.70 (3H, s, CH₃-24), 1.74 (3H, s, CH₃-25), 3.49 (1H, dd, J = 11.6, 4.1 Hz, H-3), 3.68 (1H, br s, H-19), 4.87 (1H, br s, H-6), 5.68 (1H, br s, H-12); ¹³C NMR (100 MHz, C₅D₅N): δ_C 39.9 (C-1), 28.9 (C-2), 79.2 (C-3), 41.0 (C-4), 57.3 (C-5), 68.4 (C-6), 42.0 (C-7), 41.5 (C-8), 49.5 (C-9), 37.8 (C-10), 24.7 (C-11), 124.3 (C-12), 144.3 (C-13), 43.1 (C-14), 29.8 (C-15), 28.8 (C-16), 46.6 (C-17), 45.3 (C-18), 81.8 (C-19), 36.8 (C-20), 29.4 (C-21), 34.2 (C-22), 29.6 (C-23), 17.5 (C-24), 18.5 (C-25), 25.4 (C-26), 18.8 (C-27), 181.4 (C-28), 29.1 (C-29), 25.4 (C-30)。以上数据与文献对比^[12], 确定化合物5为3β, 6β, 19α-三羟基-12-烯-28-油酸。

化合物6 白色针状结晶, HR-ESI-MS m/z 469.331 3 [M-H]^- (Calcd. for 469.331 8, C₃₀H₄₆O₄^-)。¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ_H 0.77 (3H, s, CH₃-26), 0.97 (3H, s, CH₃-29), 0.98 (3H, s, CH₃-30), 1.04 (3H, s, CH₃-24), 1.05 (3H, s, CH₃-25), 1.08 (3H, s, CH₃-23), 1.26 (3H, s, CH₃-27), 3.34 (1H, d, J = 3.7 Hz, H-19), 5.44 (1H, t, J = 3.8 Hz, H-12); ¹³C NMR (100 MHz, CDCl₃): δ_C 38.8 (C-1), 34.1 (C-2), 217.5 (C-3), 47.5 (C-4), 55.4 (C-5), 19.6 (C-6), 32.0 (C-7), 39.6 (C-8), 47.1 (C-9), 37.0 (C-10), 23.7 (C-11), 124.8 (C-12), 142.7 (C-13), 41.3 (C-14), 28.0 (C-15), 27.4 (C-16), 45.3 (C-17), 43.4 (C-18), 81.5 (C-19), 34.6 (C-20), 28.0 (C-21), 32.4 (C-22), 26.2 (C-23), 21.5 (C-24), 14.7 (C-25), 17.1 (C-26), 24.4 (C-27), 184.7 (C-28), 28.0 (C-29), 24.9 (C-30)。以上数据与文献对比^[13], 确定化合物6为19α-羟基齐墩果酮酸。

化合物7 白色针状结晶, HR-ESI-MS m/z 469.331 3 [M-H]^- (Calcd. for 469.331 8, C₃₀H₄₆O₄^-)。¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N): δ_H 0.98 (3H, s, CH₃-29), 1.03 (3H, s, CH₃-30), 1.28 (3H, s, CH₃-27), 1.37 (3H, s, CH₃-23), 1.62 (3H, s, CH₃-24), 1.68 (6H, s, CH₃-25, CH₃-26), 4.68 (1H, br s, H-6), 5.59 (1H, t, J = 3.4 Hz, H-12); ¹³C NMR (100 MHz, C₅D₅N): δ_C 41.5 (C-1), 33.7 (C-2), 216.1 (C-3), 47.2 (C-4), 57.4 (C-5), 68.6 (C-6), 42.3 (C-7), 39.7 (C-8), 48.4 (C-9), 37.4 (C-10), 24.2 (C-11), 123.1 (C-12), 144.8 (C-13), 43.3 (C-14), 26.7 (C-15), 24.4 (C-16), 49.8 (C-17), 42.6 (C-18), 46.9 (C-19), 31.5 (C-20), 35.2 (C-21), 34.7 (C-22), 28.8 (C-23), 24.6 (C-24), 16.8 (C-25), 19.2 (C-26), 26.3 (C-27), 180.6 (C-28), 33.8 (C-29), 24.3 (C-30)。以上数据与文献对比^[14], 确定化合物7为6α-羟基齐墩果酮酸。

化合物8 白色羽状结晶, HR-ESI-MS m/z 487.349 5 [M+H]⁺ (Calcd. for 487.348 2, C₃₀H₄₇O₅⁺)。¹H NMR (400 MHz, C₅D₅N): δ_H 0.79 (3H, s, CH₃-30), 0.88 (3H, s, CH₃-29), 1.22 (3H, s, CH₃-27), 1.41 (3H, s, CH₃-23), 1.64 (3H, s, CH₃-25), 1.72 (3H, s, CH₃-24), 1.83 (3H, s, CH₃-26), 3.31 (1H, m, H-11), 3.33 (1H, m, H-12), 3.46 (1H, dd, J = 12.0, 3.9 Hz, H-3), 4.81 (1H, br s, H-6); ¹³C NMR (100 MHz, C₅D₅N): δ_C 40.2 (C-1), 28.4 (C-2), 79.0 (C-3), 41.0 (C-4), 56.5 (C-5), 67.9 (C-6), 41.2 (C-7), 41.6 (C-8), 52.5 (C-9), 37.0 (C-10), 53.6 (C-11), 57.9 (C-12), 88.2 (C-13), 41.8 (C-14), 27.5 (C-15), 22.1 (C-16), 44.6 (C-17), 50.4 (C-18), 38.6 (C-19), 32.0 (C-20), 34.9 (C-21), 28.1 (C-22), 28.4 (C-23), 18.1 (C-24), 19.5 (C-25), 21.8 (C-26), 19.6 (C-27), 179.4 (C-28), 33.5 (C-29), 23.9 (C-30)。以上数据与文献对比^[15], 确定化合物8为3α, 6α-二羟基-11R, 12R-环氧齐墩果烷-28, 13α-内酯。

3 胆碱酯酶活性测试

将准确质量的待测化合物溶于一定量二甲基亚砜(DMSO)配置成20 mmol·L^-1的母液, 取4 μL母液加入500 μL PBS配成400 μmol·L^-1的溶液。

丁酰胆碱酯酶抑制活性测定方法:在96孔板上测定样品的BuChE抑制活性。具体操作如下:在96孔酶标板中依次加入PBS (100 mmol·L^-1, pH 8.0) 25 μL, BuChE (≥0.04 U·mL^-1, pH 8.0 PBS溶解稀释) 25 μL, 样品溶液(400 μmol·mL^-1) 25 μL。冰浴5 min后, 依次加入BuSCH (1.6 mmol·L^-1, pH 8.0 PBS溶解稀释) 25 μL及DTNB (4.0 mmol·L^-1, pH 8.0 PBS溶解稀释) 25 μL, 37 ℃孵育60 min后, 用酶标仪在412 nm下测定其吸光度值。

其中, 标准组用25 μL PBS (pH 8.0)代替25 μL样品溶液; 空白组用25 μL PBS (pH 8.0)代替25 μL样品溶液及25 μL PBS (pH 8.0)代替25 μL BuChE液; 完全抑制组用25 μL Iso-OMPA (16.0 μmol·L^-1)代替25 μL样品溶液。

乙酰胆碱酯酶抑制活性测定方法:在96孔酶标板上测定样品的AChE抑制活性。具体操作如下:在96孔酶标板中依次加入PBS (100 mmol·L^-1, pH 8.0) 35 μL, AChE (0.132 U·mL^-1, pH 8.0 PBS溶解稀释) 25 μL, 样品溶液(400 μmol·L^-1) 25 μL, ATCI (4 mmol·L^-1, pH 7.0 PBS溶解稀释) 15 μL及DTNB (6 mmol·L^-1, pH 8.0 PBS溶解稀释) 15 μL。37 ℃孵育60 min后, 用酶标仪在412 nm下测定其吸光度值。

其中, 标准组用25 μL PBS (pH 8.0)代替25 μL样品溶液; 空白组用50 μL PBS (pH 8.0)代替25 μL样品溶液及25 μL AChE液; 完全抑制组用20 μL石杉碱甲液(0.8 μmol·L^-1)代替25 μL样品溶液, 不足100 μL用PBS (pH 8.0)补齐。

酶抑制率的计算方法如下公式:

$抑制率 = \frac{{\left( {标准组 - 空白组} \right) - \left( {样品组 - 样品空白组} \right)}}{{\left( {标准组 - 空白组} \right)}} \times 100\% $

4 分子对接

本文中分子对接采用Discovery Studio 3.5软件进行^[16]。蛋白文件的准备包括添加氢原子, 删除水分子和施加Charmm力场。打分软件采用的是Goldscore, 其他参数采用的是系统默认值。丁酰胆碱酯酶结构从PDB数据库下载^[17], 每次对接试验中保留10个最佳的分子构象作为候选, 并且计算RMSD值作为参考标准。

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国家“重大新药创制”科技重大专项(2018ZX09305005)

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2020年第55卷第2期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-0484

接收时间：2019-06-18
首发时间：2026-01-20
出版时间：2020-02-12

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收稿日期：2019-06-18
修回日期：2019-11-11

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国家“重大新药创制”科技重大专项(2018ZX09305005)

作者信息

1.河南大学药学院, 河南开封 475004

2.哈尔滨医科大学药化教研室, 省部共建生物医药工程重点实验室, 黑龙江哈尔滨 150081

3.沈阳药科大学中药学院, 辽宁沈阳 110016

4.深圳弘汇生物医药有限公司, 广东深圳 518118

通讯作者:

*王金辉, Tel/Fax:86-451-86685745, E-mail:wangjinhui@hrbmu.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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