药学学报

TRIM25增强EGFR稳定性及信号促进肺癌发展

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周丹丹 , 余娇娇 , 胡卓伟 , 花芳 ^*

药学学报 | 研究论文 2019,54(6): 1026-1035

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药学学报 | 研究论文 2019, 54(6): 1026-1035

TRIM25增强EGFR稳定性及信号促进肺癌发展

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周丹丹, 余娇娇, 胡卓伟, 花芳^*

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 天然药物活性物质与功能国家重点实验室, 新药作用机制研究与药效评价北京市重点实验室(BZ0150), 北京 100050

通讯作者:

*花芳, Tel: 86-10-83165034, E-mail: huafang@imm.ac.cn

TRIM25 enhances EGFR stability and signaling activity to promote lung cancer progression

Dan-dan ZHOU, Jiao-jiao YU, Zhuo-wei HU, Fang HUA^*

Affiliations

State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Beijing Key Laboratory of New Drug Mechanisms and Pharmacological Evaluation Study(BZ0150), Institute of Meteria Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

出版时间: 2019-06-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-0289

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摘要

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表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因是非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中最常见的驱动基因之一，尤其EGFR突变和扩增都参与了肺癌的恶性进程。本文旨在探究E3泛素连接酶TRIM25（tripartite motif 25）对肺癌发生发展的作用及分子机制。应用CCK-8和Transwell实验评价TRIM25对肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响，结果发现敲低TRIM25，显著抑制了细胞的增殖（抑制率为34%）和侵袭（抑制率为42%）；采用基因集富集分析、免疫印迹和免疫组化法分析TRIM25对EGFR及其下游信号活性的影响，结果显示，TRIM25不仅上调了EGFR的表达水平，而且促进了EGFR信号活化；利用免疫共沉淀、实时定量PCR以及放线菌酮（cycloheximide，CHX）抑制蛋白质合成实验，初步探究TRIM25上调EGFR信号的分子机制。研究结果表明，TRIM25主要通过促进EGFR第63位赖氨酸位点发生泛素化修饰，进而增加EGFR蛋白稳定性、上调EGFR下游信号活性；而恢复EGFR蛋白表达后可逆转敲低TRIM25对肺癌细胞A549、H1975增殖和侵袭的抑制作用，在A549细胞中，细胞增殖率增加了1.5倍，侵袭率提高了1.6倍；同样，在H1975细胞中，细胞增殖率增加了2倍，侵袭率提高了1.7倍。以上研究结果表明，TRIM25通过维持EGFR信号持续活化，促进肺癌细胞的增殖和侵袭。本研究中所用的人肺癌组织由中国医学科学院肿瘤医院的肺癌患者提供，根据《赫尔辛基宣言》，已取得所有肺癌患者的知情同意。该研究得到了中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会的批准。

关键词

TRIM25 / 表皮生长因子受体 / K63位泛素化 / 蛋白稳定性

Abstract

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Mutation and amplification of epidermal growth factor receptor (EGFR), one of the most important driver gene, are both reported to participate in the regulation of lung cancer development and progression. Here we investigated the effect and molecular mechanism of tripartite motif 25 (TRIM25) in the regulation of development of lung cancer. CCK-8 and Transwell assays were used to explore the tumor-promoting effect of TRIM25. Results showed that knockdown of TRIM25 significantly inhibited cell proliferation (34% inhibition rate) and invasion (42% inhibition rate). Gene set enrichment analysis (GSEA), Western blot and immunohistochemistry were adopted to detect the effect of TRIM25 on EGFR expression and its downstream signal activity. The results explained that TRIM25 not only up-regulated the expression level of EGFR, but also promoted EGFR signal activation. Co-immunoprecipitation, real-time PCR and cycloheximide (CHX) inhibit protein degradation assays were employed to explore the molecular mechanism of TRIM25 in regulating EGFR stability. Preliminary exploration results indicate that TRIM25 increases the expression level of EGFR and activates its downstream signaling activity through promoting K63-linked ubiquitination of EGFR. Restoration of EGFR expression rescues the phenotype of TRIM25 depletion. In A549 cells, overexpression of EGFR increased cell proliferation rate 1.5-fold and invasion rate 1.6-fold compared with knockdown of TRIM25 cells. Similarly, in H1975 cells, cell proliferation rate was enhanced 2-fold and invasion rate was improved 1.7-fold. These data suggest that TRIM25 promotes lung cancer development via maintaining EGFR stability and continuous EGFR signaling activation. The human lung cancer tissues were obtained from lung cancer patients at Cancer Hospital Chinese Academy of Medical Sciences. Informed consent was obtained from all participants in accordance with the Declaration of Helsinki. The study was approved by the Ethics Committee of the Cancer Hospital Chinese Academy of Medical Sciences.

Key words

tripartite motif 25 / epidermal growth factor receptor / K63-linked ubiquitination / protein stability

引用本文

周丹丹, 余娇娇, 胡卓伟, 花芳. TRIM25增强EGFR稳定性及信号促进肺癌发展. 药学学报, 2019 , 54 (6) : 1026 -1035 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0289

Dan-dan ZHOU, Jiao-jiao YU, Zhuo-wei HU, Fang HUA. TRIM25 enhances EGFR stability and signaling activity to promote lung cancer progression[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2019 , 54 (6) : 1026 -1035 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2019-0289

正文

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肺癌是世界范围内发病率和死亡率排名首位的恶性肿瘤, 主要包括非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC), 其中非小细胞肺癌所占比例约为80%~85%^[1]。多数肺癌患者起病隐匿, 临床确诊时常常已处于中晚期, 失去了根治性切除的机会。尽管近年来肺癌的诊疗在早期筛查、微创手术及靶向治疗等方面已取得一定进展, 然而肺癌5年的相对存活率仍然只有16.6%, 其中远处转移患者5年存活率仅有3.9%^[2]。

肺癌的发生发展涉及多种基因的改变, 特别是一些促生长因子的激活和肿瘤抑制子的抑制^{[3, 4]}。如活化的转化生长因子-β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)不仅促进肿瘤的血管生成, 而且对肺癌患者的肿瘤进展和转移具有重要的促进作用^[5]; 肺癌肿瘤抑制物1 (tumor suppressor in lung cancer 1, TSLC1)是最近发现的一种抑癌基因, 它的缺失、低表达或抑制其表达等促进了肺癌的发生、侵袭和转移^[6]。三结构域蛋白家族(tripartite motif, TRIM)是一类重要的E3泛素连接酶, 参与细胞增殖、天然免疫、细胞分化及细胞凋亡等多种生物学功能的调节。雌激素反应指蛋白(estrogen-responsive finger protein, EFP), 又名tripartite motif 25 (TRIM25), 是TRIM家族成员之一, 在早期筛选雌激素反应基因时被发现命名^[7]。早期的研究主要集中于TRIM25作为E3泛素连接酶, 通过介导多种蛋白质如RIG-I^[8]、KLF5^[9]和ATBF1^[10]的泛素化降解过程, 参与细胞生物功能的调节。近年来研究发现TRIM25不仅作为免疫细胞感应器, 参与先天性免疫调节, 同时也是一种促癌蛋白, 促进乳腺癌^[11]、卵巢癌^[12]、胃癌^[13]和肺癌^[14]等多种肿瘤的发生发展。尽管研究发现肺癌组织中高表达的TRIM25促进了肺癌的发展进程, 然而有关TRIM25调节肺癌恶性进展的分子机制尚不明确。

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种受体酪氨酸激酶, 与配体结合被激活后可以活化下游多种信号通路如MAPK/ERK信号通路、PI3K/Akt信号通路、STAT3信号通路等, 与肺癌增殖能力强、分化能力差、淋巴结转移率高、预后不良等密切相关^[15-17]。大量研究发现40%~80%的NSCLC患者中具有EGFR异常高表达或信号过度活化的现象^[18]。EGFR过表达不仅导致对靶向EGFR药物的耐受^[19-21], 也导致肿瘤对多种化疗药物的耐受^{[22, 23]}。在很多情况下, EGFR的表达量与EGFR的基因拷贝数并不直接相关, 表明EGFR的过表达可能是由于EGFR蛋白降解调节异常所致。阐明EGFR降解机制, 将有助于寻找新的靶向分子, 制定新的治疗策略, 为新型靶向药物的研发提供重要的理论依据。

通过基因集富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA), 本课题组发现在TRIM25高表达的肺癌患者中, EGFR信号明显富集。基于此, 猜想在肺癌肿瘤组织中, TRIM25与促癌蛋白EGFR可能存在一定的联系, TRIM25可能通过调节EGFR信号通路, 发挥促肿瘤功能。迄今为止, 未有文献报道TRIM25与EGFR之间的关系。本研究拟探寻TRIM25、EGFR和肺癌恶性进展之间的联系, 阐明TRIM25促进肺癌发生发展的作用和机制。

材料与方法

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试剂和抗体 人表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)购于PeproTech公司; 放线菌酮(cycloheximide, CHX)购于Sigma Aldrich公司; 胰酶、胎牛血清、RPMI-1640培养基、IMDM培养基购于Gibco公司; RIPA细胞裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司; 转染试剂VigoFect购于北京威格拉斯生物技术有限公司; Western blot超敏发光液购自北京普利莱基因技术有限公司。TransZol Up、EasyScript One-Step gDNA Removal和cDNA Synthesis Super Mix购自北京全式金生物技术有限公司。所用抗体: pERK (ERK1/2, Thr202/Tyr204)、ERK (ERK1/2)、pAkt (Ser473)、Akt、pEGFR (Tyr1068)、EGFR、pSTAT5 (Tyr694)、STAT5和TRIM25均购于Cell Signaling Technology公司; DDK、Myc、GFP抗体均购于北京博尔迈生物技术有限公司; GAPDH、HRP标记二抗购于中杉金桥生物技术有限公司。

细胞及细胞培养 肺癌细胞系A549、H1975、PC-9购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心; HEK 293T细胞由本实验室长期保存。A549、H1975和PC-9细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基中; HEK 293T细胞培养于含10% FBS的IMDM培养基中, 所有细胞置于37 ℃、5% CO₂的孵箱中培养, 根据细胞生长状态进行传代。

质粒 pcDNA6A-EGFR-MYC质粒由本实验室前期保存; 表达质粒TRIM25-DDK、UB-GFP购于北京义翘神州科技有限公司。

人肺癌组织 人肺癌组织样本来源于中国医学科学院肿瘤医院的肺癌患者, 根据《赫尔辛基宣言》, 已取得所有肺癌患者的知情同意, 并得到了中国医学科学院肿瘤医院伦理委员会的批准。

主要仪器 电泳仪(北京六一仪器厂)、qPCR仪(美国BIO-RAD公司)、ImageQuant LAS 4000mini成像系统(美国通用电气公司)、激光扫描共聚焦显微镜(日本奥林巴斯公司)。

实时荧光定量PCR (real-time PCR)检测

细胞总RNA提取用PBS溶液洗涤细胞后, 将TransZol Up加入到细胞中, 裂解并收集细胞, 向裂解液中加入氯仿涡旋混匀, 静置5 min, 4 ℃、10 000 ×g离心15 min, 取上清液置于新的离心管中, 并加入一定比例的异丙醇, 颠倒混匀, 静置10 min后4 ℃、10 000 ×g离心10 min, 弃去上清, 加入一定量的75%乙醇, 4 ℃、7 500 ×g离心5 min, 弃上清室温晾干后加入RNA溶解酶。

RNA逆转录成cDNA按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA。引物由睿博兴科生物技术有限公司合成, 序列如下所示: EGFR F: 5'-GACAGG CCACCTCGTCG-3'; EGFR R: 5'-TGCGTGAGCTTGT TACTCGT-3'; TRIM25 F: 5'- AGAGCCTGACCAAGA GGGAT- 3'; TRIM25 R: 5' - GTGGATTTGTGTGTGGA CGC - 3'; Actin F: 5' - AGAGCTACGAGCTGCCTGAC - 3'; Actin R: 5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'。

Q-PCR反应反应体系(20 μL)如下: SYBR PremixExTaqTM 10 μL, 去离子水6 μL, 上下游引物各1 μL, 模板cDNA 2 μL。两步法反应过程如下: 95 ℃预变性30 s, 进入循环, 95 ℃变性5 s, 60 ℃退火和延伸30 s, 循环次数40次。以Actin作为内参, 将所得Ct值按照2^-ΔΔCt的方的方法进行处理。

Western blot (WB) 收集细胞, 加入裂解液, 置于冰上裂解30 min, 4 ℃、12 000 r · min^-1离心30 min, 收集上清液, 测定其蛋白浓度并进行定量处理, 加入5×上样缓冲液, 98 ℃变性10 min。蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳, 湿法转膜, 5%脱脂牛奶室温封闭0. 5 h, 4 ℃一抗孵育过夜, 次日, 用TBST洗膜液洗涤3次, 每次10 min, 加入相应二抗室温孵育2 h, 洗膜3次后加入ECL solution进行显影。

RNAi实验 TRIM25 siRNA由广州锐博生物科技有限公司合成, 序列如下: si-h-TRIM25_001, GCAA ATGTTCCCAGCACAA; si-h-TRIM25_002, CCTGAGC TCCTGGAGTATT。将适量细胞接种于6孔板中, 待其密度合适时, 将TRIM25 siRNA稀释于100 μL的RPMI-1640中, 轻轻混匀; 另外, 将Lipofectamine RNAi MAX2 μL稀释于100 μL的RPMI-1640中, 室温放置5 min后, 将含有Lipofectamine RNAi MAX的培养基滴加到含有siRNA的培养基中, 轻轻混匀, 室温孵育5 min后滴加到细胞中。

免疫荧光染色 将细胞接种于预先铺有盖玻片的12孔板中, 待细胞密度合适时, 用PBS清洗细胞, 4%多聚甲醛固定细胞20 min, PBS清洗3次, 0.5% Triton X-100透化20 min, PBS清洗3次, 3% BSA室温封闭0.5 h, 加入一抗(1:100稀释), 4 ℃孵育过夜, PBS清洗细胞3次, 每次3 min, 加入对应的二抗(1:200稀释), 室温避光孵育2 h, PBS清洗细胞3次, 每次3 min, 用含有DAPI的封片剂进行封片, 荧光显微镜观察图像并拍照。

免疫组化染色 将病理石蜡切片放于60 ℃孵箱烘烤1 h, 冷却至室温后进行以下流程:二甲苯30 min, 二甲苯30 min, 100%乙醇3 min, 90%乙醇3 min, 80%乙醇3 min, 70%乙醇3 min, 一相水3 min; 将石蜡切片浸入枸椽酸抗原修复液中, 进行微波抗原修复; 之后冷却至室温后, 一相水5 min, PBS 5 min, 0.5% Triton透化20 min, 过氧化氢孵育15 min, 封闭液孵育30 min, 滴加一抗4℃孵育过夜; 次日, 用PBS清洗3次后滴加相应的二抗, 室温孵育2 h, PBS清洗3次。DAB显色, 一相水冲洗, 苏木素染色数分钟, 过1%盐酸酒精, 流水返蓝15 min后, 70%乙醇3 min, 80%乙醇3 min, 90%乙醇3 min, 二甲苯15 min, 二甲苯15 min进行脱水, 中性树胶封片。

免疫共沉淀实验(Co-immunoprecipitation, CO-IP) 待细胞生长到70%的密度时进行质粒转染, 质粒转染24~48 h后收集细胞, 加入细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂), 冰上裂解30 min, 4 ℃、12 000 r·min^-1离心30 min, 将上清转移至新的1.5 mL离心管中。吸取少量的裂解液用于Western blot分析, 剩余的裂解液加入3 μg的抗体和20 μL protein A琼脂糖珠, 4 ℃缓慢摇晃孵育过夜, 使抗体与protein A琼脂糖珠偶连。次日, 用缓冲洗液清洗4次, 每次3 000 r · min^-1离心5 min。加入2×上样缓冲液, 98 ℃变性10 min, 样品进行Western blot分析。

CCK-8检测细胞活力 收集对数期生长的A549-Control siRNA和A549-TRIM25 siRNA细胞, 对其进行计数后按3×10³个细胞/孔接种于96孔培养板中, 置于37 ℃、5% CO₂的孵箱中培养72 h后, 弃去原培养基, 每孔加入混合有10 μL CCK-8和90 μL完全培养基的混合液, 置于培养箱中孵育1 h, 酶标仪检测450 nm波长下的吸光度值(A), 计算细胞活力。

Transwell细胞侵袭实验 用培养基稀释2μg·μL^-1的Fibronectin母液, 均匀混合, 将30 μL Fibronectin工作液均匀地涂到小室外侧晾干; 用培养基稀释50 mg·L^-1的Matrigel, 并将Matrigel工作液均匀地滴加至Transwell小室内, 小室晾干后加入无血清的培养基水化30 min; 用胰酶消化收集细胞后PBS清洗1~2次, 用无血清的培养基重悬细胞并进行计数; 将适量细胞接种于Transwell小室内, Transwell小室放置于含有完全培养基的24孔板中, 置于细胞培养箱中培养; 培养24 h后, 弃去Transwell小室内的培养基, 用PBS清洗小室外侧, 放入4%多聚甲醛中固定20 min, PBS清洗3次, 结晶紫染色30 min; 棉签擦去小室内部细胞, PBS清洗, 置于倒置显微镜下观察图像并拍照。

GSEA分析 从http://xena.ucsc.edu/网站下载肺腺癌TCGA数据LUAD HiSeqV2_PANCAN (n= 576)。按照TRIM25表达高低进行排序, 前20%患者(n = 116)和后20% (n = 116)分别被认为是TRIM25高表达组和TRIM25低表达组。从http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp网站下载EGFR (BIOCARTA_EGF_ PATHWAY)、RAS (BIOCARTA_RAS_PATHWAY)和ALK (BIOCARTA_ALK_PATHWAY)基因集。运用GSEA软件分别对TRIM25高表达组和低表达组中EGFR、RAS、ALK信号集进行富集分析。其中FDR值(false discovery rate)小于0.25被视为具有显著性差异。

统计学分析 实验平均重复3次以上, 数据用mean ± SEM表示, 使用Graphpad Prism 5统计分析软件进行数据统计和计算, 用t检验各组间的差异, 组中的数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA), 显著性结果以P < 0.01 或P < 0.001 表示。

结果

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1 高表达的TRIM25与肺癌不良预后正相关

为了探究TRIM25的表达水平与肺癌患者不良预后之间的关系, 本研究首先利用R2: Genomics Analysisand Visualization Platform (http://r2.amc.nl)进行生存率分析, 结果发现低表达TRIM25的肺癌患者生存期明显高于高表达TRIM25的患者(图 1A)。免疫印迹检测肺癌患者中肿瘤组织和癌旁组织中TRIM25蛋白表达水平, 结果显示肿瘤组织中TRIM25的表达水平显著高于癌旁组织(图 1B)。利用TRIM25特异性siRNA敲低肺癌细胞A549中的TRIM25, 结果发现, 与对照组相比, 敲低TRIM25不仅抑制肿瘤细胞增殖, 其抑制率为34% (图 1C); 而且降低了肿瘤细胞的侵袭能力, 其抑制率为42% (图 1D)。以上结果表明, 肺癌组织中高表达的TRIM25, 促进了肺癌细胞的增殖和侵袭, 并与肺癌不良预后正相关。

2 肺癌组织中TRIM25和EGFR呈正相关

鼠类肉瘤病毒癌基因(kirsten rat sarcoma viral oncogene homologue, KRAS)突变、EGFR突变和棘皮动物微管相关蛋白4-间变性淋巴瘤激酶(echinoderm microtubule-associate protein-like 4 - anaplastic lymphoma kinase, EML4-ALK)融合是肺癌发病过程中最常见的几个驱动基因。基于TCGA肺癌患者数据库, 课题组利用GSEA方法分析了TRIM25与这几个驱动基因之间的关系, 结果显示高表达TRIM25时EGFR信号显著富集(图 2A); 但这种现象在RAS和ALK信号通路中并不存在(图 2B、C)。采用免疫印迹对肺癌患者肿瘤组织中TRIM25和EGFR表达情况进行检测, 结果表明高表达TRIM25的患者, 其肺癌组织中EGFR的表达量也高(图 2D)。免疫组化检测结果进一步印证肺癌组织中TRIM25与EGFR蛋白表达水平具有良好的正相关性(图 2E、F)。以上结果表明, 肺癌组织中TRIM25和EGFR呈正相关, 这提示TRIM25可能通过调节EGFR或EGFR信号通路发挥促肿瘤功能。

3 敲低TRIM25下调EGFR及其下游信号

为了验证TRIM25是否参与EGFR的调节, 本研究利用TRIM25特异性siRNA敲低肺癌细胞系A549中的TRIM25, 结果显示, 敲低TRIM25降低了EGFR表达量; 在H1975、PC-9等肺癌细胞系中也得到了一致的结果(图 3A)。此外, 与对照组相比, 敲低肺癌细胞中TRIM25后, EGF诱导的EGFR、ERK以及STAT5的磷酸化水平也受到抑制(图 3B)。以上结果表明, 敲低肺癌细胞中的TRIM25, 不仅下调了EGFR的表达水平, 而且也抑制了EGFR下游信号活性。

4 TRIM25维持EGFR蛋白稳定性

TRIM25正向调节了EGFR蛋白表达, 为确认TRIM25对EGFR表达调控的机制, 本研究从EGFR转录和蛋白稳定性两个层次进行分析。实时定量PCR结果显示, 敲低A549细胞中的TRIM25并没有影响EGFR的转录水平(图 4A), 由此提示TRIM25可能调节EGFR的蛋白稳定性。随后, 在不同的时间点加入蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX), 利用CHX阻断EGFR从头合成途径, 进而观察EGFR的降解速度, 结果发现, 对照组A549细胞中EGFR的半衰期超过24 h, 而敲低细胞中的TRIM25后, EGFR的半衰期缩短至8 h以内(图 4B), 由此表明TRIM25延长了EGFR的半衰期, 增加了EGFR的蛋白稳定性。真核细胞内蛋白质的降解途径主要包括泛素-蛋白酶体途径和溶酶体途径^[24], 为进一步探索TRIM25对EGFR降解途径的调节, 本研究利用蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂chloroquine观察EGFR的降解过程, 结果发现蛋白酶体抑制剂MG132可以逆转EGFR的降解(图 4C), 但自噬抑制剂chloroquine则不能(图 4D), 表明TRIM25主要通过泛素-蛋白酶体途径抑制EGFR降解, 维持EGFR蛋白稳定性。EGFR与配体结合后内化首先进入早期内体, 进入早期内体的EGFR通常有两条去路: ①再次循环回到细胞膜; ②转运到溶酶体进行降解。利用EGF刺激对照组和敲低TRIM25的A549细胞, 分别观察了EGFR和Rab11 (再循环内体标记物), 或与LAMP1 (溶酶体标记物)的共定位情况。结果显示, 对照组中大量的EGFR和Rab11共定位; 而敲低TRIM25后EGFR与Rab11的共定位显著减少, 而主要和LAMP1共定位(图 4E)。该结果进一步表明, TRIM25抑制了EGFR降解。

5 TRIM25通过介导EGFR发生K63位泛素化而维持EGFR蛋白稳定性

为进一步探究TRIM25维持EGFR蛋白稳定性的机制, 本研究利用Co-IP实验检测TRIM25和EGFR两者的相互作用。结果显示, TRIM25与EGFR存在相互作用(图 5A)。免疫荧光实验进一步显示这两种蛋白存在共定位(图 5B)。前期结果表明TRIM25主要通过泛素-蛋白酶体途径抑制EGFR降解, 维持EGFR蛋白稳定性(图 4C、D), TRIM25是一种E3泛素连接酶。基于此, 课题组猜想TRIM25可能是EGFR的E3泛素连接酶, 通过调节EGFR泛素化过程增加其蛋白稳定性。Co-IP结果显示, 敲低A549细胞中的TRIM25后, EGFR泛素化降低(图 5C), 提示TRIM25可增加EGFR的泛素化。多数研究发现K48位泛素化主要介导蛋白质降解, 而K63位泛素化主要调节蛋白质的功能和稳定性^[25-28]。因此, 本研究进一步分析TRIM25对EGFR K48和K63位泛素化修饰的影响。结果显示, 在细胞中过表达TRIM25增加了EGFR的K63位泛素化修饰(图 5D), 而对K48位的泛素化没有影响(图 5E)。以上结果提示, TRIM25可能是EGFR的E3泛素连接酶, 通过促进EGFR的K63位泛素化修饰维持其蛋白稳定性。

6 TRIM25通过上调EGFR信号促进细胞增殖和侵袭

为进一步确认TRIM25是通过维持EGFR蛋白稳定性, 上调EGFR信号发挥促进肺癌细胞增殖和侵袭能力, 本研究利用EGFR表达质粒进行回复实验。结果发现与对照组相比, 敲低肺癌细胞A549中的TRIM25, 细胞的增殖和侵袭能力明显下降(图 6A、B); 而在此基础上, 恢复EGFR的蛋白表达后, 敲低TRIM25产生的抑制增殖和侵袭表型得到部分逆转:与敲低TRIM25为进一步确认TRIM25是通过维持EGFR蛋白稳相比, 其细胞增殖率增加了1.5倍, 侵袭率提高了1.6倍(图 6A、B); 同样, 在H1975肺癌细胞中得到了一致的结论:细胞增殖率增加了2倍, 侵袭率提高了1.7倍(图 6A、B)。此外, WB结果也表明在A549细胞中敲低TRIM25, 抑制了EGF诱导的ERK1/2、STAT5和EGFR的磷酸化水平, 而恢复EGFR蛋白表达后, 显著提高了EGF诱导的ERK1/2、STAT5和EGFR的磷酸化水平(图 6C)。以上结果表明, TRIM25的确通过维持EGFR及其下游信号, 发挥促肿瘤功能。

讨论

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肺癌由于发病率高、易转移以及缺乏有效的治疗策略, 成为严重影响人类健康的恶性肿瘤。大量研究发现, EGFR高表达或异常活化与肺癌的发生发展、复发转移以及耐药密切相关^[29]。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)作为一线药物, 已广泛应用于EGFR突变的非小细胞肺癌患者, 但其长期疗效却并不令人满意。主要原因在于, 有的肿瘤患者对EGFR靶向治疗不敏感; 而那些最初对EGFR靶向治疗敏感的患者往往也在一年内产生耐药。研究发现除了获得耐药性突变, EGFR信号的持续活化和传导不仅为癌细胞提供了生存优势, 而且也增加了肿瘤细胞的耐药性^[30]。基于此, 研究者需要寻找靶向EGFR治疗肺癌的新策略。本研究发现在临床肺癌患者样本中, TRIM25与EGFR存在正相关性。敲低TRIM25减弱了其与EGFR的相互作用, 促进EGFR降解, 并抑制EGFR下游信号活化。因此, 靶向干扰TRIM25/EGFR相互作用、促进EGFR降解, 可能是肺癌治疗的新策略。

近年来研究发现TRIM家族与肿瘤的形成密切相关, 既可以作为癌基因也可作为抑癌基因。已有文献报道TRIM25可促进肺癌的发生发展, 但其具体的分子机制并未阐明。TRIM25作为重要的E3泛素连接酶, 主要通过对底物进行泛素化修饰发挥作用。泛素分子本身有7个赖氨酸残基, 这些赖氨酸残基都可以参与多聚泛素链的合成过程, 目前对K48位和K63位上的泛素化修饰研究的最为深入。K48位的泛素化通常介导蛋白质降解, K63位的泛素化则通常调节蛋白质功能以及维持蛋白稳定性^[25-28]。已有文献报道, TRIM25可对RIG-1 (retinoic-acid-inducible gene I)进行K63位泛素化修饰, 增加其蛋白稳定性及其活性, 在抗病毒先天性免疫反应过程中发挥重要作用^[31]。而且还能介导蛋白质发生K48位泛素化修饰进行降解^{[9, 32]}, 如Liu等^[33]研究发现亲环素A (cyclophilin A, CypA)通过与TRIM25竞争性地结合线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondria antiviral signaling protein, MAVS), 抑制TRIM25介导的MAVS K48位泛素化降解, 增强其蛋白稳定性。本研究结果提示, TRIM25可能通过介导EGFR K63位泛素化, 维持了EGFR的蛋白稳定性及其下游信号活性。在后续研究中, 课题组还需采用体内、外泛素化实验进一步验证TRIM25是否能促进EGFR K63位泛素化, 并寻找关键的泛素化位点; 同时, 还需要在整体动物水平进一步明确TRIM25对肺癌发生发展的作用和机制。

综上所述, 本研究结果表明, TRIM25通过介导EGFR K63位泛素化, 维持了EGFR的蛋白稳定性以及EGFR下游信号的持续活化, 增强了肺癌细胞的增殖和侵袭能力。本研究结果, 有利于深入了解TRIM25发挥促肿瘤功能的机制, 为今后相关新型靶向药物的研究提供了重要的理论基础。

基金

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国家自然科学基金面上资助项目(81472717)
国家自然科学基金面上资助项目(81673474)
北京市自然科学基金面上资助项目(7162133)
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2019年第54卷第6期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2019-0289

接收时间：2019-04-17
首发时间：2026-01-26
出版时间：2019-06-12

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收稿日期：2019-04-17
修回日期：2019-05-13

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*花芳, Tel: 86-10-83165034, E-mail: huafang@imm.ac.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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