药学学报

Compound	DP	CE	Parent ion → daughter ion
Ephedrine	35	13	166.2→148.1
Pseudoephedrine	38	10	166.2→148.1
Norephedrine	42	10	152.1→134.1
Norpseudoephedrine	40	10	152.1→134.1
Methylephedrine	42	15	180.1→162.1
Vincristine	48	25	825.4→413.2

Compound

Parent ion → daughter ion

Ephedrine

166.2→148.1

Pseudoephedrine

166.2→148.1

Norephedrine

152.1→134.1

Norpseudoephedrine

152.1→134.1

Methylephedrine

180.1→162.1

Vincristine

825.4→413.2

Compound	DP	CE	Parent ion → daughter ion
Ephedrine	35	13	166.2→148.1
Pseudoephedrine	38	10	166.2→148.1
Norephedrine	42	10	152.1→134.1
Norpseudoephedrine	40	10	152.1→134.1
Methylephedrine	42	15	180.1→162.1
Vincristine	48	25	825.4→413.2

Compound

Parent ion → daughter ion

Ephedrine

166.2→148.1

Pseudoephedrine

166.2→148.1

Norephedrine

152.1→134.1

Norpseudoephedrine

152.1→134.1

Methylephedrine

180.1→162.1

Vincristine

825.4→413.2

No.	t_R/min	Compound	Formula	MS	ppm	MS/MS
1^*	2.98	Norephedrine	C₉H₁₃NO	151.21 [M+H]⁺	0.3	134.092 3, 117.070 2, 105.950 0
2^*	3.23	Norpseudoephedrine	C₉H₁₃NO	151.21 [M+H]⁺	0.3	134.092 3, 117.070 2, 105.950 0
3^*	3.83	Ephedrine	C₁₀H₁₅NO	166.12 [M+H]⁺	-0.2	148.107 9, 133.083 1, 117.067 1
4^*	4.00	Pseudoephedrine	C₁₀H₁₅NO	166.12 [M+H]⁺	-0.2	148.107 9, 133.083 1, 117.067 1
5^*	4.31	Methylephedrine^△	C₁₁H₁₇NO	180.133 9 [M+H]⁺	-0.2	162.124 2, 148.106 1, 117.064 1

No.

t_R/min

Compound

Formula

ppm

MS/MS

1^*

2.98

Norephedrine

C₉H₁₃NO

151.21 [M+H]⁺

0.3

134.092 3, 117.070 2, 105.950 0

2^*

3.23

Norpseudoephedrine

C₉H₁₃NO

151.21 [M+H]⁺

0.3

134.092 3, 117.070 2, 105.950 0

3^*

3.83

Ephedrine

C₁₀H₁₅NO

166.12 [M+H]⁺

-0.2

148.107 9, 133.083 1, 117.067 1

4^*

4.00

Pseudoephedrine

C₁₀H₁₅NO

166.12 [M+H]⁺

-0.2

148.107 9, 133.083 1, 117.067 1

5^*

4.31

Methylephedrine^△

C₁₁H₁₇NO

180.133 9 [M+H]⁺

-0.2

162.124 2, 148.106 1, 117.064 1

No.	t_R/min	Compound	Formula	MS	ppm	MS/MS
1^*	2.98	Norephedrine	C₉H₁₃NO	151.21 [M+H]⁺	0.3	134.092 3, 117.070 2, 105.950 0
2^*	3.23	Norpseudoephedrine	C₉H₁₃NO	151.21 [M+H]⁺	0.3	134.092 3, 117.070 2, 105.950 0
3^*	3.83	Ephedrine	C₁₀H₁₅NO	166.12 [M+H]⁺	-0.2	148.107 9, 133.083 1, 117.067 1
4^*	4.00	Pseudoephedrine	C₁₀H₁₅NO	166.12 [M+H]⁺	-0.2	148.107 9, 133.083 1, 117.067 1
5^*	4.31	Methylephedrine^△	C₁₁H₁₇NO	180.133 9 [M+H]⁺	-0.2	162.124 2, 148.106 1, 117.064 1

No.

t_R/min

Compound

Formula

ppm

MS/MS

1^*

2.98

Norephedrine

C₉H₁₃NO

151.21 [M+H]⁺

0.3

134.092 3, 117.070 2, 105.950 0

2^*

3.23

Norpseudoephedrine

C₉H₁₃NO

151.21 [M+H]⁺

0.3

134.092 3, 117.070 2, 105.950 0

3^*

3.83

Ephedrine

C₁₀H₁₅NO

166.12 [M+H]⁺

-0.2

148.107 9, 133.083 1, 117.067 1

4^*

4.00

Pseudoephedrine

C₁₀H₁₅NO

166.12 [M+H]⁺

-0.2

148.107 9, 133.083 1, 117.067 1

5^*

4.31

Methylephedrine^△

C₁₁H₁₇NO

180.133 9 [M+H]⁺

-0.2

162.124 2, 148.106 1, 117.064 1

Compounds	Regression equation	Correlation coefficient (r²)
Ephedrine	Y = 0.009 56X + 0.508 3	0.995 7
Pseudoephedrine	Y = 0.012 42X + 0.060 3	0.997 1
Norephedrine	Y = 0.000 602X + 0.000 321	0.998 6
Norpseudoephedrine	Y = 0.005 807X + 0.017 045	0.996 8
Methylephedrine	Y = 0.005 56X -0.022 92	0.998 5

Compounds

Regression equation

Correlation coefficient (r²)

Ephedrine

Y = 0.009 56X + 0.508 3

0.995 7

Pseudoephedrine

Y = 0.012 42X + 0.060 3

0.997 1

Norephedrine

Y = 0.000 602X + 0.000 321

0.998 6

Norpseudoephedrine

Y = 0.005 807X + 0.017 045

0.996 8

Methylephedrine

Y = 0.005 56X -0.022 92

0.998 5

Compounds	Regression equation	Correlation coefficient (r²)
Ephedrine	Y = 0.009 56X + 0.508 3	0.995 7
Pseudoephedrine	Y = 0.012 42X + 0.060 3	0.997 1
Norephedrine	Y = 0.000 602X + 0.000 321	0.998 6
Norpseudoephedrine	Y = 0.005 807X + 0.017 045	0.996 8
Methylephedrine	Y = 0.005 56X -0.022 92	0.998 5

Compounds

Regression equation

Correlation coefficient (r²)

Ephedrine

Y = 0.009 56X + 0.508 3

0.995 7

Pseudoephedrine

Y = 0.012 42X + 0.060 3

0.997 1

Norephedrine

Y = 0.000 602X + 0.000 321

0.998 6

Norpseudoephedrine

Y = 0.005 807X + 0.017 045

0.996 8

Methylephedrine

Y = 0.005 56X -0.022 92

0.998 5

Compounds	Cerebral cortex	Cerebellum	Hypothalamus	Striatum	Hippocampus	Medulla oblongata
Ephedrine	0.65	0.53	0.58	0.61	0.70	0.27
Pseudoephedrine	0.68	0.49	0.48	0.47	0.63	0.40
Norephedrine	0.37	0.22	0.23	0.23	0.27	0.09
Norpseudoephedrine	0.35	0.24	0.26	0.23	0.29	0.10
Methylephedrine^△	0.64	0.40	0.37	0.40	0.59	0.17

Compounds

Cerebral cortex

Cerebellum

Hypothalamus

Striatum

Hippocampus

Medulla oblongata

Ephedrine

0.65

0.53

0.58

0.61

0.70

0.27

Pseudoephedrine

0.68

0.49

0.48

0.47

0.63

0.40

Norephedrine

0.37

0.22

0.23

0.27

0.09

Norpseudoephedrine

0.35

0.24

0.26

0.23

0.29

0.10

Methylephedrine^△

0.64

0.40

0.37

0.40

0.59

0.17

Compounds	Cerebral cortex	Cerebellum	Hypothalamus	Striatum	Hippocampus	Medulla oblongata
Ephedrine	0.65	0.53	0.58	0.61	0.70	0.27
Pseudoephedrine	0.68	0.49	0.48	0.47	0.63	0.40
Norephedrine	0.37	0.22	0.23	0.23	0.27	0.09
Norpseudoephedrine	0.35	0.24	0.26	0.23	0.29	0.10
Methylephedrine^△	0.64	0.40	0.37	0.40	0.59	0.17

Compounds

Cerebral cortex

Cerebellum

Hypothalamus

Striatum

Hippocampus

Medulla oblongata

Ephedrine

0.65

0.53

0.58

0.61

0.70

0.27

Pseudoephedrine

0.68

0.49

0.48

0.47

0.63

0.40

Norephedrine

0.37

0.22

0.23

0.27

0.09

Norpseudoephedrine

0.35

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0.26

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0.29

0.10

Methylephedrine^△

0.64

0.40

0.37

0.40

0.59

0.17

UHPLC-QTOF-MS^E与UHPLC-MS/MS分析麻黄生物碱在血脑屏障间的移行及脑区分布特征

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彭秘 , 苏丹 ^* , 李晗芸 , 冯冰薇 , 徐鹏飞 , 宋永贵 ^*

药学学报 | 研究论文 2017,52(9): 1437-1443

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药学学报 | 研究论文 2017, 52(9): 1437-1443

UHPLC-QTOF-MS^E与UHPLC-MS/MS分析麻黄生物碱在血脑屏障间的移行及脑区分布特征

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彭秘, 苏丹^*, 李晗芸, 冯冰薇, 徐鹏飞, 宋永贵^*

作者信息

江西中医药大学, 江西南昌 330006

通讯作者:

* 苏丹, Tel/Fax: 86-791-87119652, E-mail: sudan_nj@163.com;

宋永贵, E-mail: songyonggui1999@163.com

Study of brain distribution of Ephedra alkaloids based on UHPLC-QTOF-MS^E and UHPLC-MS/MS method

Mi PENG, Dan SU^*, Han-yun LI, Bing-wei FENG, Peng-fei XU, Yong-gui SONG^*

Affiliations

Jiangxi University of traditional Chinese Medicine, Nanchang 330006, China

出版时间: 2017-09-15 doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0262

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摘要

收起

利用超高效液相色谱-质谱（UHPLC-MS）联用技术，建立麻黄生物碱同分异构体的UHPLC分离方法，定性分析麻黄生物碱移行入血与入脑成分，定量测定并比较麻黄生物碱在血脑屏障间的分布情况，并获得在大鼠中枢神经系统不同部位（大脑皮层、小脑、海马、纹状体、延髓和下丘脑）的分布特征与差异。研究表明，麻黄碱、伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱和甲基麻黄碱（甲基伪麻黄碱）经胃肠吸收后可通过血脑屏障快速入脑，定量测定结果显示，麻黄生物碱主要分布在大脑皮层、海马区域，其次为下丘脑、纹状体与小脑，最少分布在延髓部位。不同生物碱的血脑屏障分布情况：以AUC_0-t，brain/AUC_0-t，blood计，麻黄碱类 > 甲基麻黄碱类 > 去甲基麻黄碱类。麻黄生物碱能够在血脑屏障间快速分布，在中枢系统分布具有组织趋向性，不同生物碱的血脑分布情况具有差异性。本文为中药麻黄的中枢作用机制研究提供了物质效应部位与依据。

关键词

麻黄 / 生物碱 / 中枢系统 / UHPLC-QTOF-MS^E / UHPLC-MS/MS

Abstract

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Using ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) coupled with mass spectrum (MS) technology, a method has been established for separation and analysis of alkaloid isomers. Alkaloids in Ephedra sinica transitionally crossed blood brain barrier (BBB) and the distribution were investigated. The concentrations of Ephedra alkaloids in rat central nervous system (CNS) were determined to acquire the distribution characteristics and differences in cerebral cortex, cerebellum, hippocampus, striatum, medulla oblongata and hypothalamus. It was founded that pseudoephedrine, norephedrine, norpseudoephedrine, methylephedrine (methylpseudoephedrine) were able to cross BBB fast via gastro-intestinal tract after administrated with Ephedra sinica. Cortex and hippocampus was the main distribution region, followed by hypothalamus, striatum and cerebellum, in which medulla oblongata had the least. The distribution of various alkaloids, as AUC_{0-_t, brain}/AUC_{0-t, blood} was ephedrine > methylephedrine > demethyl ephedrine. Alkaloids in Ephedra sinica crossed BBB rapidly, showing the regional distribution tendency in central nervous system, and the distribution was diversity. This group of data provides distribution of bioactive constituents of Ephedra in CNS.

Key words

Ephedra sinica / alkaloids / central nervous system / UHPLC-QTOF-MS^E / UHPLC-MS/MS

引用本文

彭秘, 苏丹, 李晗芸, 冯冰薇, 徐鹏飞, 宋永贵. UHPLC-QTOF-MS^E与UHPLC-MS/MS分析麻黄生物碱在血脑屏障间的移行及脑区分布特征. 药学学报, 2017 , 52 (9) : 1437 -1443 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0262

Mi PENG, Dan SU, Han-yun LI, Bing-wei FENG, Peng-fei XU, Yong-gui SONG. Study of brain distribution of Ephedra alkaloids based on UHPLC-QTOF-MS^E and UHPLC-MS/MS method[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2017 , 52 (9) : 1437 -1443 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0262

正文

收起

麻黄(Ephedra sinica Stapf)始载于《神农本草经》, 是一味具有近2000年广泛应用历史的中药, 中医临床常用来治疗外感风寒表实证, 以及胸闷咳喘、风水浮肿等证。其草质茎部位是主要入药部位, 蕴含丰富的生物碱、黄酮、挥发油、多糖、酚酸等物质。而麻黄生物碱结构非常相似, 存在多对同分异构体, 其分离分析一直是难点。毛细管电泳、离子液体添加剂法、共轭方向法都曾被用于麻黄碱与伪麻黄碱的拆分, 并且生物碱类成分对神经系统的运行影响较大^[1-4]。近年来, 关于麻黄生物碱中枢系统作用越来越受到重视, 有文献报道麻黄碱的平喘作用与中枢作用相关, 可促使支气管平滑肌松弛、黏膜毛细血管收缩^[5,6], 还可通过神经途径影响下丘脑的体温调节中枢从而发挥发汗作用^[7,8]。另一方面, 麻黄生物碱类物质由于兴奋大脑皮层和皮层下中枢所带来的不良反应, 对麻黄的开发利用造成了障碍。可见, 如何对中药麻黄合理有效使用, 需要对麻黄生物碱的中枢作用及其机制形成正确认识。众所周知, 支配神经信号传导的主要器官为脑和脊髓, 因此, 不论是药理作用还是潜在的不良反应^[9-13], 能否跨过血脑屏障顺利入脑是影响麻黄发挥中枢作用的根本性因素。不同生物碱在中枢组织的分布特征与血脑透过能力的研究可以为揭示这类物质的效应(不良反应)部位与作用机制提供信息和依据, 进而形成全面客观评价, 发挥中药麻黄不可替代的临床价值。

麻黄生物碱作为一类特殊活性成分, 所产生的中枢系统作用从物质基础上看, 涉及到该类物质血脑屏障间移行成分的确认及其分布; 从作用部位上看, 涉及到不同生物碱在中枢系统的分布特征。将两者结合起来, 才能从药物和机体相互作用的角度全面认识中枢系统对麻黄生物碱的处置规律与特征。本文建立并采用UHPLC-QTOF-MS^E ^[14]与UHPLC-MS/ MS方法, 对麻黄生物碱在血脑屏障间的移行成分、分布情况与脑组织分布进行定性定量分析, 全面系统地阐述了中药麻黄中枢作用的物质基础、处置规律与脑组织亲和能力, 为麻黄中枢作用机制研究提供基础。

材料与方法

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材料麻黄(Ephedra sinica Stapf)产自内蒙古, 经江西中医药大学的吴蜀瑶药师鉴定为麻黄科植物草麻黄的干燥草质茎。盐酸麻黄碱(批号: 171241-201508)、伪麻黄碱(批号: 171237-201208)、盐酸去甲基麻黄碱(批号: 100217-200303)、盐酸甲基麻黄碱(批号: 171247-200301) 对照品均购自中国食品药品检定研究院。盐酸去甲基伪麻黄碱(批号: 20100412) 购自赤峰艾克制药科技股份有限公司, 长春新碱(内标, 批号: 3924631) 购自Sigma公司。甲醇、乙腈、甲酸试剂均为色谱纯; 水为纯净水(屈臣氏集团), 其余试剂均为分析纯。

仪器 Waters Acquity I-CLASSTM UHPLC超高效液相色谱系统(Waters Corporation, Milford, MA, USA); Synapt G2-Si^TM高分辨率飞行时间质谱仪(Waters Corporation, Manchester, UK)。Waters Xevo三重四极杆串联质谱仪(Waters Corporation, Milford, MA, USA), Masslynx 4.1质谱数据系统(Waters Corporation, Manchester, UK)。

动物雄性无病原体SD大鼠(n = 24, 200~220 g), 由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。实验动物在适宜条件下(22 ± 2 ℃, 相对湿度50% ± 20%)适应性饲养3天。动物实验按照中华人民共和国国家科学技术委员会颁发的实验动物管理条例执行。

色谱条件 MS^E扫描模式:采用Acquity UHPLC BEH C₁₈ (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm, Waters公司); 流动相: 0.2%甲酸水(A)-乙腈(B); 梯度洗脱程序: 0~2 min, 98%~95% A; 2~5 min, 95%~90% A; 5~7 min, 90% A; 7~15 min, 90%~45% A; 15~18 min, 45%~10% A; 18~22 min, 10% A; 22~24 min, 10%~98% A; 24~26min, 98% A; 流速: 0.3 mL·min^-1; 柱温: 40 ℃; 进样量: 2 µL。

MRM扫描模式:采用Acquity UHPLC BEH C₁₈ (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm, Waters公司); 流动相: 0.2%甲酸水(A)-乙腈(B); 梯度洗脱程序: 0~2 min, 98%~95% A; 2~5 min, 95%~90% A; 5~7 min, 90%~73% A; 7~9 min, 73%~60% A; 9~12 min, 60%~98% A; A相98%保持2 min, 流速: 0.3 mL·min^-1; 柱温: 40 ℃; 进样量: 2 µL。

质谱条件 MS^E扫描模式:采用电喷雾离子源正离子模式, 离子源参数设置:脱溶剂气流量(氮气) 800 L·h^-1, 脱溶剂气温度为600 ℃, 离子源温度120 ℃, 毛细管电压3.0 kV。锥孔电压(sampling cone) 40 V, 补偿电压(source offset) 80 V。MS^E扫描模式检测, 低能量扫描时(function 1) 传输碰撞能量为4 eV, 高能量扫描时(function 2) 传输碰撞能量为20~50 eV, 喷雾器压力为6.5 Bar, 气帘气(锥孔反吹气)流速(cone gas flows)为50 L·h^-1, 扫描范围为m/z 50~1 000 Da。准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽(m/z 556.277 1) 作为外标(Lock Spray^TM)进行实时校正, 流速设为5 μL·min^-1。

MRM扫描模式:采用电喷雾离子源正离子模式, 毛细管电压: 1.5 kV; 脱溶剂温度: 350 ℃; 脱溶剂气流量(氮气): 800 L·h^-1; 碰撞气流量(氩气): 0.17 L·h^-1; 气帘气(锥孔反吹气)流速为50 L·h^-1, 具体各化合物质谱优化参数见表 1。

提取液的制备 称取适量麻黄药材, 分别用10倍、8倍、8倍量的水提取3次, 每次恒温提取2 h, 合并3次的水提液后进行浓缩成浸膏, 浸膏加适量蒸馏水溶解, 制成混悬液(3 g·mL^-1), 即得。其中含有麻黄碱、伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、甲基麻黄碱(含甲基伪麻黄碱)分别为2.53、1.19、0.30、0.32和2.70 μg·mL^-1。

对照品溶液和质控样本的制备 分别精密称取麻黄碱、伪麻黄碱、去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、甲基麻黄碱对照品适量, 置于不同的10 mL量瓶中, 加甲醇超声溶解、定容作为储备液。精密移取各储备液, 置于同一量瓶中, 加甲醇定容制成浓度均为50 μg·mL^-1的混合溶液, 并逐级稀释得到系列溶液用于制备标准曲线和质控样本。所有对照品溶液均于4 ℃保存。

内标溶液的制备 精密称定长春新碱5 mg于10 mL量瓶中, 加入甲醇超声溶解定容, 得浓度为500 μg·mL^-1的内标储备液, 于4 ℃保存备用。

生物样品取材 血浆样品:灌胃给予大鼠相应的麻黄提取液(24 g·kg^-1)。分别于0、5、10、30、60和120 min从大鼠眼眶后静脉丛取血约0.5 mL, 置肝素化离心管中离心(1 425×g, 5 min), 离心后立即分离血浆, 置-40 ℃冰箱中冷冻保存, 备用。脑组织样品:灌胃给予大鼠相应的麻黄提取液(24 g·kg^-1)。分别于给药后1、1.5和2 h, 将大鼠断头处死, 在冰台上立即取脑。用冰冷的生理盐水冲洗, 分离大脑、小脑、延髓、纹状体、海马、下丘脑, 分别放于离心管中, 于-40 ℃保存备用。

血浆样品处理 取血浆样品100 µL置于1.5 mL离心管中, 加内标(长春新碱) 20 µL, 0.2%甲酸-乙腈溶液20 µL, 加入0.2%甲酸-乙腈溶液360 µL沉淀, 涡旋3 min, 离心(22 810×g, 10 min), 取上清液200 µL于进样小瓶, 进样体积为2 µL, 进行UHPLC-MS/MS分析。

脑组织样品处理 样品A:脑组织适量于匀浆管中, 精密称重, 按1:4 (g·mL^-1)的比例加入4倍体积的匀浆介质(0.2%甲酸-水), 匀浆5 min。取脑匀浆液0.2 mL置于1.5 mL的离心管中, 迅速加入冰冷的0.2%甲酸-乙腈0.4 mL, 涡旋混匀3 min, 4 ℃离心(12 830×g, 5 min), 取上清液200 μL于进样小瓶, 供UHPLC-Q-TOF-MS^E分析用。

样品B:取脑组织匀浆样品100 µL置于1.5 mL离心管中, 加内标(长春新碱) 20 µL, 冰冷的0.2%甲酸-乙腈溶液20 µL, 之后加入冰冷的0.2%甲酸-乙腈溶液沉淀360 µL, 涡旋3 min, 离心(22 810×g, 10 min), 取上清液200 µL于进样小瓶, 进样体积为2 µL, 进行UHPLC-MS/MS分析用。

方法学验证

专属性分别按照血浆样品及脑组织样品方法处理, 分别考察空白血浆及脑组织样品, 空白血浆加入对照品及内标, 给药后大鼠血浆及脑组织加内标, 记录相应的色谱图。

线性与最低定量限取大鼠标准血浆或脑组织系列样品100 μL, 分别按照血浆样品及脑组织样品方法处理, 得到终质量浓度各为5、20、40、80、200、600和1 000 ng·mL^-1的血浆及脑组织匀浆标曲样品, 进行测定。以每个待测物浓度为横坐标, 待测物与内标物的面积比值为纵坐标, 用加权最小二乘法进行回归运算。

精密度与准确度取大鼠空白血浆及脑组织配制成低、中、高(10、200和800 ng·mL^-1) 3种浓度的质控样品, 每个浓度平行处理5份, 根据当日标曲测定3天, 计算得到QC样品的浓度, 得出该方法的日内、日间精密度与准确度。

提取回收率及基质效应以空白血浆及脑组织配制成3个浓度的质控样品, 每个浓度平行5份, 分别按照血浆样品及脑组织样品方法处理(A)。同时取空白血浆及脑组织, 分别按照血浆样品及脑组织样品方法处理, 取上清液配制相同浓度的对照样品(B), 计算其回收率(RE) = A / B; 同时以水代替空白血浆及脑组织配制3个浓度混标溶液作为无基质样品, 进样测得峰面积(C), 计算其基质效应= A / C。

稳定性考察低、中、高3个浓度的质控样品在生物样品模拟环境下室温放置24 h、-20 ℃放置15天、经历3次冻-融循环的稳定性。

数据处理 采用MassLynx4.1对正离子模式总离子流图进行处理, 结合各离子质量数、保留时间和分子式匹配软件Elemental composition^TM, 同时运用化合物结构匹配MassFragment^TM及UNIFI^TM数据处理系统对各主要分子离子峰进行归属。

结果

收起

1 麻黄生物碱血-脑移行成分鉴定

1.1 入血成分分析

麻黄药材、空白对照组和给药组大鼠生物样品供试液进行UHPLC-Q-TOF-MS^E分析, 得到相应的色谱图, 见图 1。由图可见麻黄碱、伪麻黄碱, 去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、甲基麻黄碱(含甲基伪麻黄碱)成分均可经胃肠道吸收进入体循环。此外, 根据文献报道的麻黄碱代谢物, 推测该类生物碱可能代谢产物, 分别提取色谱图进行寻找, 未见有明显代谢产物, 可能因为麻黄生物碱成分在体内基本以原形存在^[15], 生物碱原形是药理作用的主要物质基础, 见表 2。

1.2 入脑成分分析

对已经寻找到的血中生物碱类成分和文献中可能吸收入脑的化学成分进行MS/MS分析, 结果显示, 入脑的生物碱为麻黄碱、伪麻黄碱, 去甲基麻黄碱、去甲基伪麻黄碱、甲基麻黄碱(含甲基伪麻黄碱), 吸收入血后可以迅速透过血脑屏障。此外, 根据麻黄提取物中的化学成分及推测的可能代谢产物, 分别从给药脑组织和空白脑组织中得到提取离子色谱图并进行对比, 也未见有明显代谢产物, 说明麻黄生物碱在中枢神经系统是以原形为主要存在形式, 见表 2。

2 血-脑中不同生物碱类成分的定量分析与分布

麻黄有机胺类生物碱, 属于苯丙胺类中枢兴奋剂, 能够激活多巴胺(dopamine, DA)和α1受体, 刺激单胺类物质、去甲肾上腺素(norepinephrine, NE)、5-羟色胺(5-hydroxy tryptamine, 5-HT)等, 对大脑皮层、海马、纹状体等脑区的神经细胞产生影响^[7-9], 故而选取这六个脑区进行定量分析。

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性

如图 2所示, 脑组织匀浆液中内源性成分不干扰分析物的测定。

2.1.2 线性及最低定量下限

结果见表 3, 脑组织样品与血浆样品中各待测物均呈现良好线性关系(r² > 0.99), 血浆样品在5~1 000 ng·mL^-1内线性关系良好, 最低定量限均为5 ng·mL^-1。

2.1.3 精密度、准确度及提取回收率

大鼠脑匀浆中各化合物的日内、日间精密度及提取回收率RSD值均小于15%, RE值均在± 15%范围内, 血浆样品中各待测物的精密度与准确度实验均符合要求(RSD% < 14.3%, -8.7% < RE% < 13.8%)、提取回收率在87%~93%, 表明该方法精密度与准确度良好。

2.1.4 基质效应

各待测物在脑匀浆的基质效应介于90.6%~102.1%之间, 血浆样品的基质效应在94%~102%, 该方法的基质效应可忽略不计。

2.1.5 稳定性

对各待测物在血浆及脑匀浆中的稳定性实验结果表明, 不同条件下所测各化合物低、中、高3个浓度的QC样品RE值均在± 15%以内, RSD值也小于15%。

2.2 脑组织分布

从图 3可见, 麻黄生物碱在大脑皮层、小脑、海马、纹状体、延髓和下丘脑6个脑区均有吸收分布。相对其他各区而言, 该类生物碱成分均以大脑皮层、海马分布为最多, 其次为下丘脑、纹状体与小脑, 最少分布在延髓部位。但在2 h内所测得的多个生物碱成分在延髓中大致呈现一个上升的趋势, 小脑部位为下降的趋势。

2.3 麻黄生物碱的血脑屏障分布

通过DAS 3.0软件处理所得的各个脑部组织和血浆中的AUC_0-t值, 获得不同麻黄生物碱的血脑屏障移行率, 比较药物在血浆和各脑组织的分布情况, 见表 4。可以看出, 麻黄碱成分在脑部6个区域中透血脑屏障能力普遍高于其他结构生物碱。去甲基麻黄碱的透血脑屏障能力最弱, 应与该物质具有更大的极性密切相关。

讨论

收起

通过不断寻找和优化色谱和质谱条件, 本研究实现了麻黄碱与伪麻黄碱、去甲基麻黄碱与去甲基伪麻黄碱的同时分离测定, 为避免出现较多的基质峰干扰, 影响化合物的鉴定, 增大分析难度, 故采用0.2%甲酸-水作为匀浆介质。确定了以0.2%甲酸水-乙腈(98:2) 为初始流动相比例进行梯度洗脱的简便易行的液质联用测试条件。目前不足之处是甲基麻黄碱与甲基伪麻黄碱未能在这同一条件下成功分离, 故上述结果中, 对甲基麻黄碱与甲基伪麻黄碱作了整体分析。

麻黄生物碱能够激活多巴胺(DA)受体, 刺激单胺类物质、去甲肾上腺素(NE)等。DA作为脑内重要的神经递质, 是NE的前体物质, 在脑部中枢神经系统中多巴胺能神经细胞主要分布在纹状体、海马、下丘脑等脑区, 其中D1受体在脑内表达广泛, D2受体主要分布在纹状体的中等多棘神经细胞中^[16,17], 这与上述麻黄生物碱的分布趋势相一致, 海马、纹状体和下丘脑是其潜在的作用部位, 值得后续研究进一步探索。麻黄生物碱与大脑皮层的高亲和力, 则是该类物质产生中枢兴奋性的主要原因。此外, 值得注意的是, 麻黄生物碱在咳嗽中枢所在的延髓部位分布较少, 提示该类物质更为复杂的作用物质基础与作用机制。

基金

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江西省自然科学基金资助项目(20142BAB215064)
江西省自然科学基金资助项目(20171BAB205092)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2017年第52卷第9期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0262

接收时间：2017-03-23
首发时间：2026-01-14
出版时间：2017-09-15

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收稿日期：2017-03-23
修回日期：2017-06-26

基金

江西省自然科学基金资助项目(20142BAB215064)

江西省自然科学基金资助项目(20171BAB205092)

作者信息

江西中医药大学, 江西南昌 330006

通讯作者:

* 苏丹, Tel/Fax: 86-791-87119652, E-mail: sudan_nj@163.com;

宋永贵, E-mail: songyonggui1999@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Compound	DP	CE	Parent ion → daughter ion
Ephedrine	35	13	166.2→148.1
Pseudoephedrine	38	10	166.2→148.1
Norephedrine	42	10	152.1→134.1
Norpseudoephedrine	40	10	152.1→134.1
Methylephedrine	42	15	180.1→162.1
Vincristine	48	25	825.4→413.2

Compound

Parent ion → daughter ion

Ephedrine

166.2→148.1

Pseudoephedrine

166.2→148.1

Norephedrine

152.1→134.1

Norpseudoephedrine

152.1→134.1

Methylephedrine

180.1→162.1

Vincristine

825.4→413.2

No.	t_R/min	Compound	Formula	MS	ppm	MS/MS
1^*	2.98	Norephedrine	C₉H₁₃NO	151.21 [M+H]⁺	0.3	134.092 3, 117.070 2, 105.950 0
2^*	3.23	Norpseudoephedrine	C₉H₁₃NO	151.21 [M+H]⁺	0.3	134.092 3, 117.070 2, 105.950 0
3^*	3.83	Ephedrine	C₁₀H₁₅NO	166.12 [M+H]⁺	-0.2	148.107 9, 133.083 1, 117.067 1
4^*	4.00	Pseudoephedrine	C₁₀H₁₅NO	166.12 [M+H]⁺	-0.2	148.107 9, 133.083 1, 117.067 1
5^*	4.31	Methylephedrine^△	C₁₁H₁₇NO	180.133 9 [M+H]⁺	-0.2	162.124 2, 148.106 1, 117.064 1

No.

t_R/min

Compound

Formula

ppm

MS/MS

1^*

2.98

Norephedrine

C₉H₁₃NO

151.21 [M+H]⁺

0.3

134.092 3, 117.070 2, 105.950 0

2^*

3.23

Norpseudoephedrine

C₉H₁₃NO

151.21 [M+H]⁺

0.3

134.092 3, 117.070 2, 105.950 0

3^*

3.83

Ephedrine

C₁₀H₁₅NO

166.12 [M+H]⁺

-0.2

148.107 9, 133.083 1, 117.067 1

4^*

4.00

Pseudoephedrine

C₁₀H₁₅NO

166.12 [M+H]⁺

-0.2

148.107 9, 133.083 1, 117.067 1

5^*

4.31

Methylephedrine^△

C₁₁H₁₇NO

180.133 9 [M+H]⁺

-0.2

162.124 2, 148.106 1, 117.064 1

Compounds	Regression equation	Correlation coefficient (r²)
Ephedrine	Y = 0.009 56X + 0.508 3	0.995 7
Pseudoephedrine	Y = 0.012 42X + 0.060 3	0.997 1
Norephedrine	Y = 0.000 602X + 0.000 321	0.998 6
Norpseudoephedrine	Y = 0.005 807X + 0.017 045	0.996 8
Methylephedrine	Y = 0.005 56X -0.022 92	0.998 5

Compounds

Regression equation

Correlation coefficient (r²)

Ephedrine

Y = 0.009 56X + 0.508 3

0.995 7

Pseudoephedrine

Y = 0.012 42X + 0.060 3

0.997 1

Norephedrine

Y = 0.000 602X + 0.000 321

0.998 6

Norpseudoephedrine

Y = 0.005 807X + 0.017 045

0.996 8

Methylephedrine

Y = 0.005 56X -0.022 92

0.998 5

Compounds	Cerebral cortex	Cerebellum	Hypothalamus	Striatum	Hippocampus	Medulla oblongata
Ephedrine	0.65	0.53	0.58	0.61	0.70	0.27
Pseudoephedrine	0.68	0.49	0.48	0.47	0.63	0.40
Norephedrine	0.37	0.22	0.23	0.23	0.27	0.09
Norpseudoephedrine	0.35	0.24	0.26	0.23	0.29	0.10
Methylephedrine^△	0.64	0.40	0.37	0.40	0.59	0.17

Compounds

Cerebral cortex

Cerebellum

Hypothalamus

Striatum

Hippocampus

Medulla oblongata

Ephedrine

0.65

0.53

0.58

0.61

0.70

0.27

Pseudoephedrine

0.68

0.49

0.48

0.47

0.63

0.40

Norephedrine

0.37

0.22

0.23

0.27

0.09

Norpseudoephedrine

0.35

0.24

0.26

0.23

0.29

0.10

Methylephedrine^△

0.64

0.40

0.37

0.40

0.59

0.17