药学学报

含没食子酸单元的马蹄金素衍生物的合成及其抗HBV活性研究

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刘毅 ¹^,²^,³ , 卢苇 ¹^,²^,³ , 刘青川 ⁴ , 黄正明 ⁴ , 梁光义 ²^,³^,⁵^,^* , 徐必学 ²^,³^,^*

药学学报 | 研究论文 2017,52(7): 1140-1145

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药学学报 | 研究论文 2017, 52(7): 1140-1145

含没食子酸单元的马蹄金素衍生物的合成及其抗HBV活性研究

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刘毅¹^,²^,³, 卢苇¹^,²^,³, 刘青川⁴, 黄正明⁴, 梁光义²^,³^,⁵^,^*, 徐必学²^,³^,^*

作者信息

1.贵州大学药学院, 贵州贵阳 550002

2.贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室, 贵州贵阳 550014

3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室, 贵州贵阳 550014

4.中国人民解放军第302医院, 北京 100039

5.贵阳中医学院, 贵州贵阳 550002

通讯作者:

* 梁光义, Tel:86-851-83807713, E-mail:guangyi_liang@126.com;

徐必学, E-mail:bixue_xu@126.com

Synthesis and anti-HBV activity evaluation of Matijin-Su derivatives containing gallic acid moiety

Yi LIU¹^,²^,³, Wei LU¹^,²^,³, Qing-chuan LIU⁴, Zheng-ming HUANG⁴, Guang-yi LIANG²^,³^,⁵^,^*, Bi-xue XU²^,³^,^*

Affiliations

1. College of Pharmacy, Guizhou University, Guiyang 550002, China

2. State Key Laboratory of Functions and Applications of Medicinal Plants, Guizhou Medcial University, Guiyang 550014, China

3. The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences, Guiyang 550014, China

4. 302 Hospital of PLA, Beijing 100039, China

5. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China

出版时间: 2017-07-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0059

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摘要

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本文以马蹄金素（Matijin-Su，MTS）为先导化合物进行结构优化，通过加入没食子酸结构单元，设计并合成了11个新的衍生物。对所合成的目标化合物以HepG2 2.2.15细胞进行体外抗HBV活性测试，结果表明：除4a和4b外，其余目标化合物均有一定的体外抗HBV活性，其中5c、6c和6d显示较强的抗HBV活性，其IC₅₀达到了6.12、8.44、9.86 μmol·L^-1，说明含有没食子酸结构的马蹄金素衍生物具有进一步研究的价值。

关键词

乙肝病毒 / 马蹄金素衍生物 / 合成 / 生物活性

Abstract

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In this study, eleven containing gallic acid moiety derivatives of Matijin-Su(MTS)were synthesized and evaluated for their anti-HBV activities in HepG2 2.2.15 cells in an effort to find novel effective anti-hepatitis B virus(HBV)agents. Compounds 5c, 6c and 6d exhibited significant anti-HBV activity with IC₅₀ values of 6.12, 8.44 and 9.86 μmol·L^-1, respectively. Incorporation of gallic acid moiety into MTS derivatives can lead to profound changes in their anti-HBV activity, and could be worth of further research.

Key words

hepatitis B virus / derivative of Matijin-Su / synthesis / biological activity

引用本文

刘毅, 卢苇, 刘青川, 黄正明, 梁光义, 徐必学. 含没食子酸单元的马蹄金素衍生物的合成及其抗HBV活性研究. 药学学报, 2017 , 52 (7) : 1140 -1145 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0059

Yi LIU, Wei LU, Qing-chuan LIU, Zheng-ming HUANG, Guang-yi LIANG, Bi-xue XU. Synthesis and anti-HBV activity evaluation of Matijin-Su derivatives containing gallic acid moiety[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2017 , 52 (7) : 1140 -1145 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2017-0059

正文

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乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)的感染可引起急、慢性的乙型肝炎, 世界卫生组织2016年6月公布的数据显示全球约有2.4亿人感染慢性乙型肝炎(简称乙肝, 乙肝表面抗原阳性持续至少6个月)^[1], 乙肝患者还可能会逐渐发展为肝硬化、肝癌等^{[2, 3]}。

从免疫学角度看, 乙肝病毒携带者比非乙肝病毒携带者的肝癌发生率高100倍^[4]。临床上用药治疗乙肝的药物主要有α-干扰素类药物和核苷类药物^[5], 到目前为止, 还没有药物能够彻底清除体内HBV并最终治愈乙肝^[6], 因此, 寻找和开发具有独特化学结构的创新药物显得尤为重要。本课题组前期从治疗肝炎的民族药马蹄金中发现了具有抗HBV活性的马蹄金素(Matijin-Su, MTS), 并以其为先导化合物设计合成了一系列衍生物。其中对1个优选的MTS衍生物(研发代号Y101, 结构见图 1)进行了深入系统的临床前研究, 获得了国家食品药品监督管理总局颁发的临床批件(原料药及其制剂批件号: 2013L02491, 2014L00070)^{[7, 8]}。

没食子酸酚羟基经过甲基化后的衍生物在药物中得到了广泛应用, 如治疗心率失常药物^[9]、抗疲劳药物^[10]等, 甲氧基都发挥了很重要的作用。很多药物结构中甲氧基也广泛存在^[11-13], 如甲氧基化的黄酮在抗癌、抗炎活性上表现非常好, 且甲氧基的存在提高了化合物的脂溶性, 增加机体的药物吸收^[14]。在前期研究基础上^{[15, 16]}, 本文以马蹄金素为母体, 设计合成了B环为3个羟基被甲基化的没食子酸马蹄金素衍生物, 并对其进行了体外抗HBV活性测试, 希望在拓宽马蹄金素结构修饰产物类型的同时, 获得更多具有深入研究价值的目标分子。

选择L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐或L-酪氨酸甲酯盐酸盐为原料, 首先将其与3, 4, 5-三甲氧基苯甲酸进行缩合反应得到化合物1 (1a、1b), 由化合物1水解得羧酸2 (2a、2b), 再将所得羧酸2分别与L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐、L-酪氨酸甲酯盐酸盐或L-苯丙氨醇进行缩合反应, 即得目标化合物3 (3a、3b)和4 (4a、4b), 最后通过对甲酯的水解和羟基的亲核取代, 即可得目标化合物5 (5a ~5c)和6 (6a ~6d)。见合成路线图 1。

结果与讨论

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1 目标化合物的合成

根据前期研究中积累的马蹄金素衍生物在抗HBV活性方面的构效关系数据, 选取不同的基团在R₁、R₂、R₃三个位点进行取代, 或者通过化学方法换成不同的基团, 共合成目标化合物11个。其理化性质见表 1。

2 衍生物的体外抗HBV活性研究

衍生物体外抗HBV活性评价采用四氮唑盐(MTT)法测定其对细胞的毒性, 选择HepG2 2.2.15细胞为DNA复制的抑制率模型, 以拉米夫定为阳性对照药, 对所合成的11个化合物进行体外抗HBV活性评价。

活性测试结果(表 2)表明:马蹄金素的衍生物在测试浓度范围内除4a、4b外均有抗HBV活性, 其中化合物5c、6c和6d表现出良好的抗HBV活性, IC₅₀优于阳性对照药物拉米夫定, 并且其选择指数也较高。从结构来看, R₃为COOH时化合物活性较好, 其中化合物5c (IC₅₀: 6.12 μmol·L^-1, SI = 73.05) 呈现出较好的抗HBV活性, 说明含有没食子酸结构的马蹄金素衍生物具有进一步研究的价值。

3 小结

本文以L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐、L-酪氨酸甲酯盐酸盐、L-苯丙氨醇、3, 4, 5-三甲氧基苯甲酸等为主要原料, 酰化、烷基化、水解、以及用IBCF和NMM等作为缩合剂形成酰胺(肽)键等反应合成了目标化合物11个, 用核磁共振、质谱对其进行了结构确证, 并以HepG2 2.2.15细胞为HBV载体, 对合成的11个衍生物进行了抗HBV活性研究, 活性筛选结果表明所合成的化合物对HBV DNA复制有一定的抑制作用。在测试浓度范围内, 除化合物4a、4b无活性外, 5c的活性最好, 且抗HBV活性优于阳性对照药拉米夫定(IC₅₀: 18.90 μmol·L^-1, SI: 41.59), 值得进一步研究开发。

实验部分

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熔点用XT-4型熔点仪测定, 温度未校正; 核磁共振谱以TMS为内标, 用Inova-400 MHz型超导核磁共振仪(美国Varian公司)测定; 质谱用HP-5793质谱仪或HP1100 LC-MS液质联用仪测定(美国Hewlett-Packard公司); 柱色谱用硅胶(300~400目)及高效薄层板均为青岛海洋化工厂产品; 其余试剂均为市售分析纯或化学纯产品, 除特别说明外, 未经处理直接使用。

1 化学合成

1.1 目标化合物3a、3b的合成

1.1.1 中间体1a、1b的合成

将L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐25.88 g (120 mmol)与3, 4, 5-三甲氧基苯甲酸21.22 g (100 mmol)混合置于反应瓶内, 于70 ℃真空干燥1 h, 冷却至室温后溶解于500 mL干燥的CH₂Cl₂ (二氯甲烷)和50 mL DMF (N, N-二甲基甲酰胺)中, 再加入NMM (N-甲基吗啡啉) 24.71 mL (225 mmol), 氩气保护, 冰水浴冷却30 min后开始滴加IBCF (氯甲酸异丁酯) 12.65 mL (100 mmol)和80 mL CH₂Cl₂混合液, 控制其流速使其在50 min内滴加完毕, 体系自然升温至室温, 反应8 h。TLC (薄层色谱) (氯仿/甲醇= 30:1, R_f = 0.5, 磷钼酸显色)检测反应完毕; 减压回收CH₂Cl₂, 加入乙酸乙酯和水, 萃取, 所得有机层依次以稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液及饱和氯化钠溶液洗涤, 无水硫酸钠干燥, 减压回收乙酸乙酯至干得中间体1a。将以L-酪氨酸甲酯盐酸盐替换起始原料L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐, 按照以上合成方法可制备得中间体1b。

1.1.2 中间体2a、2b的合成

以2a为例:将中间体1a溶解于50 mL DMF中, 加入100 mL氢氧化钠溶液(1.0 mol·L^-1), 室温搅拌反应2.5 h。TLC (氯仿/甲醇= 10:1, R_f = 0.2, 磷钼酸显色)检测反应完毕; 浓盐酸调pH 2~3, 乙酸乙酯萃取, 依次以蒸馏水、饱和氯化钠溶液洗涤, 无水硫酸钠干燥, 过滤, 减压回收乙酸乙酯至干得粗品2a。

1.1.3 化合物3a、3b、4a、4b的合成

以3a为例:将上述合成的中间体2a (其合成见1.1.2) 35.94 g (100 mmol)与L-酪氨酸甲酯盐酸盐27.80 g (120 mmol)混合置于反应瓶内, 于70 ℃真空干燥1 h, 自然冷却后溶解于350 mL干燥的CH₂Cl₂和80 mL DMF中, 加入NMM 24.71 mL (225 mmol), 取IBCF (氯甲酸异丁酯) 12.65 mL (100 mmol)与50 mL CH₂Cl₂混合置于滴液漏斗中, 氩气保护, 冰水浴(0 ℃)冷却30 min后开始滴加, 控制其流速使其在50 min内滴加完毕, 反应8 h。TLC (氯仿/甲醇= 30:1, R_f = 0.4, 磷钼酸显色)检测反应完毕; 加水少许终止反应, 减压回收部分CH₂Cl₂, 乙酸乙酯萃取, 依次用蒸馏水、稀盐酸、饱和碳酸氢钠溶液及饱和氯化钠溶液洗涤, 再用无水硫酸钠干燥, 过滤, 减压回收部分乙酸乙酯, 析出白色固体经纯化后得白色结晶3a 16.65 g (收率: 31.03%)。3b、4a、4b用类似方法合成。

1.2 目标化合物5a ~5c的合成

1.2.1 化合物5a的合成

将3b 0.43 g (0.81 mmol, 其合成见1.1.3)、碳酸钾0.67 g (4.9 mmol)与二甲氨基氯乙烷盐酸盐0.087 g (0.81 mmol)置于反应瓶内, 加入1, 4-二氧六环(20 mL)与水(0.3 mL), 于内温86 ℃反应3.5 h。TLC (氯仿/甲醇= 10:1, R_f = 0.5, 磷钼酸显色)检测反应完毕; 乙酸乙酯萃取, 水洗使其呈中性, 1.0 mol·L^-1盐酸溶液反萃取, 再以水洗有机层, 合并酸水层。酸水层用1.0 mol·L^-1氢氧化钠溶液调pH 9~10, 析出白色固体, 乙酸乙酯萃取, 无水硫酸钠干燥, 过滤, 减压蒸去乙酸乙酯, 纯化后得白色结晶5a 0.16 g (收率: 32.50%)。

1.2.2 化合物5b的合成

取化合物3b 0.42 g (0.81 mmol, 其合成见1.1.3) 与碳酸钾1.12 g (8.1 mmol)置于反应瓶内, 加入DMF (20 mL)溶解, 再加入碘代正丁烷0.1 mL (0.88 mmol), 35 ℃水浴搅拌8 h。TLC (氯仿, R_f = 0.5, 磷钼酸显色)检测反应完毕; 乙酸乙酯萃取, 依次以水、饱和氯化钠洗涤, 无水硫酸钠干燥, 过滤, 减压蒸去部分乙酸乙酯, 析出白色固体以氯仿/甲醇重结晶即得白色结晶5b 0.23 g (收率: 47.91%)。

1.2.3 化合物5c的合成

将3b (1 mmol)置于反应瓶内, 加入15 mL DMF溶解, 再加入2 mL 1.0 mol·L^-1氢氧化钠溶液, 常温反应3 h。TLC (氯仿/甲醇=10:1, R_f = 0.2, 磷钼酸显色)检测反应完毕; 1.0 mol·L^-1盐酸调pH 2~3, 析出白色固体, 过滤、烘干后得白色结晶5c 0.47 g (收率: 89.94%)。

1.3 化合物6a ~6d的合成

1.3.1 化合物6a、6b的合成

以化合物6a为例:取化合物4a 0.41 g (0.81 mmol, 其合成见1.1.3) 与碳酸钾1.12 g (8.1 mmol)置于反应瓶内, 加入DMF (20 mL)溶解, 再加入碘代正丁烷0.1 mL (0.88 mmol), 35 ℃水浴搅拌8 h。TLC (氯仿/甲醇= 30:1, R_f = 0.6, 磷钼酸显色)检测反应完毕; 乙酸乙酯萃取, 依次以水、饱和氯化钠洗涤, 无水硫酸钠干燥, 过滤, 减压蒸去部分乙酸乙酯, 析出白色固体以氯仿/甲醇重结晶即得白色结晶6a 0.28 g (收率: 61.22%)。6b以类似方法合成。

1.3.2 化合物6c、6d的合成

将化合物4a 0.24 g (0.47 mmol, 其合成见1.1.3) 置于反应瓶内, 加入2.5 mL吡啶溶解, 缓慢滴加乙酸酐0. 4 mL (4.23 mmol), 室温继续搅拌反应8 h。TLC (氯仿/甲醇=30:1, R_f = 0.5, 磷钼酸显色)检测反应完毕; 将反应物倒入水中, 1.0 mol·L^-1盐酸调pH 2~3, 乙酸乙酯萃取, 依次用蒸馏水、饱和氯化钠溶液洗涤, 以无水硫酸钠干燥, 过滤, 减压回收乙酸乙酯至干得白色结晶6c 0.24 g (收率: 86.16%)。6d以类似方法合成。

2 体外抗HBV活性筛选

2.1 MTT法测定药物对细胞的毒性实验

以HepG2 2.2.15细胞传到3到4代时培养瓶长满细胞后, 经0.25%胰酶溶液消化后用10% DMEM配制成每毫升约25万个的细胞悬液, 接种到96孔培养板内, 每孔100 μL, 摇匀后置37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h, 细胞贴壁后即可给药(配药:称取10 mg样品, 加1 mL DMSO溶解, 溶液经无菌微孔滤膜滤过即得10 mg·mL^-1储存液, 取相应量储存液用2% DMEM稀释至所需给药浓度), 每孔给200 μL药液, 每个浓度设6个孔, 以2% DMEM代替药液作为阴性细胞对照组, 以拉米夫定药液代替药液作为阳性对照组。置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养3天, 每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg·mL^-1), 37 ℃、5% CO₂继续培养6 h, 1 000 r·min^-1离心10 min, 吸去孔内培养液, 每孔加入200 μL DMSO, 振荡10 min, 使形成的结晶充分溶解后通过酶联免疫检测仪测定其吸光度值(OD值), 采用改良寇氏法计算药物的半数有毒浓度(TC₅₀)。改良寇氏法计算TC₅₀, TC₅₀ = Log^-1 [Xm-i (ΣP-0.5)]。

2.2 药物对HBV DNA的抑制实验

以HepG2 2.2.15细胞传到3到4代时的细胞, 经0.25%胰酶溶液消化后用10% DMEM配制成每毫升约25万个的细胞悬液, 每孔500 μL接种到24孔细胞培养板, 每孔给700 μL药液, 共3个浓度, 每个浓度设3个孔, 以10% DMEM代替药液作为阴性细胞对照组, 以拉米夫定药液代替药液作为阳性对照组。置于37 ℃、5% CO₂培养箱培养, 3天换原浓度药液或10% DMEM培养。培养6天后即可提取HBV DNA, 经荧光定量PCR测定其DNA含量, 通过含量测定结果计算样品对细胞中HBV DNA的抑制率, 采用改良寇氏法计算样品的半数抑制浓度(IC₅₀)。分别计算得到的半数有毒浓度(TC₅₀)和半数抑制浓度(IC₅₀)即可计算出样品的选择指数(SI)^[17]。改良寇氏法计算IC₅₀, IC₅₀ = Log^-1[Xm-i (ΣP-0.5)], SI = TC₅₀/IC₅₀。

基金

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国家自然科学基金资助项目(81360472)
西部之光人才（2014年）资助项目

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs204/en/201606.

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2017年第52卷第7期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2017-0059

接收时间：2017-01-16
首发时间：2026-01-14
出版时间：2017-07-12

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收稿日期：2017-01-16
修回日期：2017-02-18

基金

国家自然科学基金资助项目(81360472)

西部之光人才（2014年）资助项目

作者信息

1.贵州大学药学院, 贵州贵阳 550002

2.贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室, 贵州贵阳 550014

3.贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室, 贵州贵阳 550014

4.中国人民解放军第302医院, 北京 100039

5.贵阳中医学院, 贵州贵阳 550002

通讯作者:

* 梁光义, Tel:86-851-83807713, E-mail:guangyi_liang@126.com;

徐必学, E-mail:bixue_xu@126.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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