药学学报

GGI/MDR1 siRNA逆转A549/DDP细胞多药耐药的研究

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王子瑞 , 白凤 , 张小英 , 吴佳敏 , 郭羚 , 利智 , 冯敏 ^*

药学学报 | 药剂学 2017,52(2): 309-317

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GGI/MDR1 siRNA逆转A549/DDP细胞多药耐药的研究

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王子瑞, 白凤, 张小英, 吴佳敏, 郭羚, 利智, 冯敏^*

作者信息

中山大学药学院, 广东广州 510006

通讯作者:

* 冯敏, Tel:86-20-39943119, Fax:86-20-39943004, E-mail:fengmin@mail.sysu.edu.cn

GGI as a gene carrier delivering MDR1 siRNA to A549/DDP cells for reversal of multidrug resistance

Zi-rui WANG, Feng BAI, Xiao-ying ZHANG, Jia-min WU, Ling GUO, Zhi LI, Min FENG^*

Affiliations

School of Pharmaceutical Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510006, China

出版时间: 2017-02-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2016-1033

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摘要

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通过RNA干扰（RNAi）技术靶向耐药性人肺腺癌细胞内的MDR1基因实现多药耐药性的逆转作用。构建聚乙二醇-聚谷氨酸-聚乙烯亚胺（PEG-b-PLG-g-PEIs，GGI）阳离子聚合物载体，通过¹H NMR表征确认结构，动态光散射法测定GGI/siRNA的粒径及电位，并以A549敏感株和A549/DDP耐药株细胞系为模型，采用MTT法考察GGI的细胞毒性，以流式细胞术评价新型聚合物载体GGI递送siRNA的效率和强度，RT-PCR法考察GGI转染A549和A549/DDP（cisplatin）后MDR1 mRNA水平的表达；Western blot法测定A549/DDP细胞中P-gp的表达。同时，以MTT法和Annexin V-FITC/PI双染法考察siRNA干扰后抗肿瘤药物对药物敏感性的变化。结果显示，GGI/siRNA复合物粒径为150~200 nm，电位稳定在16~28 mV。GGI细胞毒性远低于PEI 25K，且具有更高运载siRNA至细胞内的效率，并能极大降低A549/DDP细胞内MDR1 mRNA和P-gp的表达，能更大程度地增强耐药细胞株对顺铂的敏感性，说明GGI有望在基因传递系统中成为一种新型的聚合物载体并广泛应用。

关键词

基因传递系统 / RNA干扰 / 多药耐药性 / MDR1 siRNA / A549/DDP细胞

Abstract

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This study was designed to reverse multidrug resistance of lung cancer cells by downregulating MDR1 genes through RNA interference (RNAi) technology. A novel biodegradable cationic polymer (PEG-b-PLG-g-PEIs, GGI) was synthesized and characterized by ¹H NMR. The particle size and zeta potential were measured by dynamic light scattering (DLS). The cell viability profile of GGI was tested by MTT method with both A549 and A549/DDP cell lines. Flow cytometry (FCM) technology was used to investigate the efficiency and intensity of delivering siRNA to cells by GGI polymer. RT-PCR and Western blot were used to detect the mRNA and P-gp expression after GGI/MDR1 siRNA transfection assay. The sensitivity of cisplatin administration after transfecting GGI/MDR1 siRNA polyplexs was performed with MTT and Annexin V-FITC/PI methods. The results suggest that the particle size and zeta potential of GGI/siRNA were 150-200 nm and 16-28 mV. GGI exhibited a lower cell cytotoxity than PEI 25K and higher efficiency of delivering siRNA, which dramatically decreased the expression of MDR1 mRNA and P-gp of A549/DDP cells and increased much sensitivity to cisplatin in A549/DDP cells. GGI holds a great potential in gene delivery as a novel cationic polymer for further investigation.

Key words

gene delivery system / RNA interference / multidrug resistance / MDR1 siRNA / A549/DDP cell

引用本文

王子瑞, 白凤, 张小英, 吴佳敏, 郭羚, 利智, 冯敏. GGI/MDR1 siRNA逆转A549/DDP细胞多药耐药的研究. 药学学报, 2017 , 52 (2) : 309 -317 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-1033

Zi-rui WANG, Feng BAI, Xiao-ying ZHANG, Jia-min WU, Ling GUO, Zhi LI, Min FENG. GGI as a gene carrier delivering MDR1 siRNA to A549/DDP cells for reversal of multidrug resistance[J]. Acta Pharmaceutica Sinica, 2017 , 52 (2) : 309 -317 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2016-1033

正文

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肿瘤细胞多药耐药性(multidrug resistance, MDR)^[1-4]是临床上导致患者化疗失败的主要原因之一。多药耐药性是指肿瘤细胞对多种结构和作用机制完全不同的化疗药物产生交叉耐药性的现象。多药耐药的产生是个错综复杂的过程, 但是肿瘤细胞中由MDR1基因编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)^[5-9]的过表达被认为是重要的原因之一。P-gp是一种分子质量为170 kDa的跨膜糖蛋白, 属于ABC(ATP-binding cassette) 转运蛋白超家族, 可以转运多种结构与功能不同的化疗药物。其耐药机制主要是含有外排泵将药物泵出胞外, 降低化疗药物在耐药肿瘤细胞中的蓄积。目前, 随着基因治疗的深入研究, RNA干扰技术^[10-13] (RNA interference, RNAi) 为逆转肿瘤的多药耐药性提供了一个更加高效、特异和低毒的方法。

RNA干扰是将与目的基因同源的含21~23个核苷酸的小分子干扰RNA片段(small interfering RNAs, siRNA) 转染至靶细胞, 与细胞内的内切酶形成诱导沉默复合体(RNA in-duced silencingcomplex, RISC), 引起特定mRNA的降解, 从而在mRNA水平抑制靶蛋白的表达, 实现特定基因沉默的技术。但是由于siRNA分子携带负电荷, 不易通过细胞膜, 且易被核酸酶降解等, 使其难以到达靶细胞发挥基因沉默作用, 因此需要安全稳定高效的基因传递载体以保护siRNA在体内稳定传递并高效地作用于靶细胞^{[14, 15]}。

聚乙烯亚胺(polythyleneimine, PEI)^[16]是目前应用广泛的一类聚阳离子载体。一般来说, 随着PEI分子量的增加, 其进入细胞的转染能力也增强, 但是同时PEI毒性也随之提高。当分子质量达到25 kDa时, 转染效率最高, 但毒性也增大; 而分子质量较低时( < 2kDa), 虽然毒性较低, 但不能有效结合和压缩DNA而导致转染效率降低, 这在很大程度上限制了PEI的应用和发展。

聚谷氨酸^[17]是一种人体生物酶降解的多聚肽类化合物, 在体内可降解为内源性物质谷氨酸, 具有生物相容性、低毒性和低免疫原性的特点。其已广泛应用于缓控释药物载体、基因载体及组织工程的研究。

聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)^[18-20]属无毒、无免疫原性的材料, 由于其自身的特殊结构性质, 可与水形成氢键, 形成水化“晕”层, 且具有一定的流动性, 可有效降低与体内蛋白的吸附作用, 不容易被网状内皮系统(RES) 识别, 具有长循环效应, 是一种应用广泛前景良好的生物材料。目前PEG修饰大多采用单甲氧基聚乙二醇(mPEG), 其性能与PEG相似, 且可避免在修饰其他化合物过程中发生交联或团聚。

本文设计并构建低毒高效的PEG-b-PLG-g-PEIs (GGI) 聚合物载体, 其结构主要是以生物可降解的聚乙二醇-聚谷氨酰胺两嵌段共聚物为骨架, 利用低分子量的聚乙烯亚胺PEI 800表面伯胺基通过氨解反应接枝于谷氨酰胺侧链上, 以期得到一个高转染效率、低细胞毒性和可生物降解的基因载体, 且以MDR1基因为靶基因, 试图下调P-gp表达, 逆转肺癌细胞的多药耐药性, 降低抗肿瘤药物的给药量。

材料与方法

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材料 L-谷氨酸(L-glutamic acid, L-Glu, 国药集团化学试剂有限公司); 甲氧基聚乙二醇胺(mPEG-NH2, M_W=2kDa), 聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI 800, M_w=25kDa), 四甲基偶氮唑盐[3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyletrazoliumbromide, MTT], DDP(Aldrich-Sigma公司); 人肺癌细胞系A549和A549/DDP购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心; FAM-siRNA (5-carboxyfluorescein siRNA), MDR1siRNA (上海吉玛生物科技有限公司); MDR1一抗, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase, GAPDH) 一抗(Cell Signalling, 美国), Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG (H+L) (碧云天生物技术研究所)。

聚合物GGI的合成

聚乙二醇-b-谷氨酸苄酯(PEG-b-PBLG) 的合成以L-谷氨酸为原料, 采用苯甲醇对其γ-羧酸进行酯化保护, 再通过三光气法合成中间产物L-谷氨酸γ苄酯-N羧酸酐(BLG-NCA)。称取BLG-NCA单体6 g于无水氯仿中(20:1, w/v), 按单体BLG与引发剂甲氧基聚乙二醇胺为50:1比例, 室温搅拌反应72 h。反应结束后用无水乙醚沉淀反应液, 过滤, 真空干燥, 得淡黄色半透明固体PEG-b-PBLG。

聚合物PEG-b-PLG-PEIs (GGI) 的合成称取上述合成的PEG-b-PBLG嵌段聚合物1 g, 溶解于无水N, N-二甲基甲酰胺(DMF) (20:1, w/v), 按一定比例加入PEI 800 (Mol_{PEI 800}/Mol_BLG=10:1) 和催化剂2-羟基吡啶(2-HP) (Mol_2-HP/Mol_BLG=5:1), 于40 ℃搅拌反应48 h。反应结束后, 用大量冰冷乙醚沉淀反应物, 透析, 冻干, 得白色疏松粉末GGI。

聚合物GGI的¹H NMR表征 以D₂O或CDCl₃为溶剂, 四甲基硅烷(TMS) 为内标, 温度为25 ℃, 在核磁共振谱仪上(Varian INOVA500NB, 美国Varian公司) 对所得样品mPEG-NH₂、PEI 800、PEG-b-PBLG及GGI进行测定。通过¹H NMR, 可以根据PEG特征峰a的峰面积与苄基e峰的峰面积, 估算PEG-b-PBLG的聚合度(DP_PBLG) 及GGI的分子质量。公式如下:

$ \text{D}{{\text{P}}_{\text{PBLG}}}\text{=}\frac{\text{2000}}{\text{44}}\text{ }\!\!\times\!\!\text{ }\frac{\text{2e}}{\text{a}} $

GGI/siRNA复合物的制备与粒径电位的测定 以水为介质, 将GGI和siRNA分别在去离子水和无核酶水中配成一定浓度的溶液, 按照不同的N/P比(n_GGI_{中氨基基团}/n_DNA_{中磷酸基团}), 将两者等体积混合, 涡旋30 s, 室温静置30 min, 即得GGI/DNA复合物纳米粒, 终体积为1 mL。采用动态光散射粒度分析仪(Zetasizer Nano Series90, 英国Malvern公司) 对复合物粒径和电位进行测定。设定自动扫描模式, 测试温度为25 ℃, 每个样品测定3次。

细胞毒性实验 采用MTT法检测聚合物载体GGI的细胞毒性。以细胞数5×10³个/孔将A549、A549/DDP细胞接种于96孔板中, 在37 ℃、5%CO₂条件下生长24 h后, 吸弃培养液, 分别加入200 μL不同浓度的GGI溶液(以不含血清培养基溶解), 4 h后更换为含10%血清培养基继续培养44 h, 加入MTT处理, 于570nm和630 nm波长下检测各孔吸光度(OD) 值, 计算细胞的存活率, 公式如下:

$ \text{细胞存活率=}\frac{\text{O}{{\text{D}}_{\text{570}\left( \text{样品} \right)}}\text{-O}{{\text{D}}_{\text{630}\left( \text{样品} \right)}}}{\text{O}{{\text{D}}_{\text{570}\left( \text{空白} \right)}}\text{-O}{{\text{D}}_{\text{630}\left( \text{空白} \right)}}}\text{ }\!\!\times\!\!\text{ 100 }\!\!%\!\!\text{ } $

GGI/FAM-siRNA纳米粒的细胞摄取 采用流式细胞术评价GGI/FAM-siRNA的细胞摄取情况。取对数生长期的A549、A549/DDP细胞以5×10⁴个/孔接种于12孔板中, 在37 ℃、5%CO₂条件下生长24 h后, 吸弃培养液, 加入不同N/P比的GGI/FAM-siRNA复合物, 继续孵育4 h后, 通过倒置荧光显微镜观察结果, 并消化收集细胞, 用PBS清洗3次以除去背景, 于流式细胞仪上测定细胞摄取率及其荧光强度。实验中以PEI 25K和Lipofectamine 2000为对照。

GGI/MDR1 siRNA复合物的细胞转染 将A549、A549/DDP细胞以1×10⁵个/孔接种于6孔培养板中, 37 ℃、5% CO₂条件下培养24 h后弃去培养基, 加入不同N/P的GGI/MDR1 siRNA复合物, 在无血清培养基条件下于37 ℃孵箱中孵育4 h, 换含10%完全培养基继续培养48 h。同时设置GGI/siRNA_NC、PEI/MDR siRNA、Lipofectamine2000/MDR siRNA、裸MDR1 siRNA和空白对照组。

实时定量PCR (RT-PCR) 采用TRIZOL试剂法提取细胞转染后各组细胞的总RNA, 按Promega反转录试剂盒操作合成cDNA, 以GAPDH基因为检测的内参照, PCR反应引物由Invitrogen公司合成, MDR1序列如下:上游: 5'-GGAUAUUAGGACCAU AAAUTT-3';下游: 5'-AUUUAUGGUCCUAAUAUC CTG-3'。GAPDH序列:上游5'-GAACGGGAAGCTC ACTGG-3':下游: 5'-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。设置PCR反应条件为94 ℃预变性3 min, 之后94 ℃ 1 min、58 ℃ 1 min、72 ℃ 1.5 min, 循环33次, 72 ℃ 15 min终止反应。于琼脂糖凝胶电泳上检测PCR产物, 条件为:电压100 V, 时间10 min。于凝胶成像系统扫描, 以Image J软件分析。公式如下:目的基因mRNA表达量=每例标本目的基因平均荧光强度值/同一标本GAPDH平均荧光强度值。

Western blot法检测P-gp蛋白的表达 转染实验结束后, 用RIPA裂解液充分裂解细胞提取总蛋白, 运用BCA蛋白检测试剂盒测定总蛋白含量。采用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE) 凝胶电泳分离蛋白, 按一定比例的MDR1一抗孵育过夜, Alexa Fluor488标记山羊抗兔二抗孵育, 曝光, 显影, 凝胶成像, Image J软件分析P-gp与GAPDH条件的灰度比。

MDR1 siRNA干扰后对顺铂的敏感性 采用MTT法检测转染前后A549和A549/DDP细胞的顺铂敏感性。以细胞数5×10³个/孔接种于96孔板, 加入各组载体/MDR1 siRNA复合物转染48 h后, 加入一定浓度的顺铂溶液(A549和A549/DDP细胞给药质量浓度分别为7、20 μg·mL^-1), 于37 ℃、5% CO₂条件下继续培养24 h, 在570 nm和630 nm处测定各孔OD值, 并计算顺铂对A549及A549/DDP细胞的生长抑制率, 以顺铂浓度为横坐标, 细胞存活率为纵坐标绘制曲线图。

Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡 A549和A549/DDP经各组载体/MDR1 siRNA复合物转染48 h后, 胰酶消化收集细胞, 并用PBS清洗3次, 重悬于Binding Buffer, 加入Annexin V-FITC 5 μL避光孵育15 min后, 加入PI溶液10 μL, 避光孵育5 min, 于流式细胞仪上检测, 激发波长488 nm。

统计学处理 采用SPSS18.0统计软件处理数据, 对以上结果均进行t检验与方差分析, P < 0.05说明具有统计学差异。

结果与讨论

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1 聚合物GGI的¹H NMR分析

聚合物GGI的合成见反应路线图 1。氢核磁谱见图 1, A和C为原料mPEG-NH₂和PEI 800的¹H NMR谱图, 其中PEG嵌段为特征峰(-CH₂CH₂-) a的化学位移为3.65, PEI 800中有乙撑基(-CH₂CH₂NH-, 2.12~2.96) 的吸收峰, B为中间产物PEG-b-PBLG, BLG-NCA开环后形成聚合物, 出现聚谷氨酰胺骨架上(-CH-, 3.91) 的e峰, 其次还有侧链上谷氨酸一端羧基保护后的苄基(-CH₂Ph-, 5.024) e峰和苯环(-C₆H₅-, 7.24) f峰。证明PEG-b-PBLG聚合成功。而在GGI (D) 中, 该e和f峰消失, 出现新的酰胺键j峰(-CONH-, 7.094) 以及小分子PEI 800的乙撑基特征峰i和h, 说明经过PEI 800氨解反应, 侧链上苄基脱去, 成功接枝上了PEI 800, 形成GGI聚合物。同理可得GGI各组分分子质量的估算值, PEG为2 000, PLG为10 160, 而PEI为46 626, 由此可知, 聚合物GGI的相对分子质量为58 786。

2 GGI/siRNA复合物的粒径电位

GGI/siRNA纳米复合物在不同的N/P值下粒径均保持在150~200 nm, 随N/P比的增大, 复合物粒径变化不大(图 2A), 说明GGI/siRNA复合物在适当N/P比范围内能保持适合细胞转染的粒径, 如图 2B所示, 不同N/P的PEI 25K/siRNA纳米复合物的电位值维持在+19.7~36.7 mV, 具有较高的正电荷密度, 而GGI/siRNA复合物电位在各N/P比例下的电位值均低于PEI组, 维持在+16~28.6 mV, 有利于细胞内吞作用的同时降低对细胞的毒性。且在N/P=20时, GGI/siRNA复合物呈正态分布, 多分散系数(PDI) 小, 分布集中(图 2C)。阳离子聚合物的电荷密度对进入细胞的效率有重要的影响。正电荷过高, 易与带负电的细胞膜相互作用内吞进入细胞, 同时也会造成严重的细胞毒性; 而密度过低, 则会极大影响其进入细胞的效率。GGI/siRNA复合物在N/P=20时的电位在25 mV左右, 既能保持进入细胞的效率又不会造成严重的细胞毒性。

3 细胞毒性

采用MTT法考察聚合物GGI在不含血清条件下对A549和A549/DDP细胞的毒性。由图 3可知, 在质量浓度范围为10~125 μg·mL^-1时, 聚合物GGI在A549和A549/DDP细胞毒性均低于PEI 25K。聚合物GGI相比PEI 25K具有更好的生物相容性及更广泛的应用前景。

4 GGI/MDR1 siRNA复合物对A549和A549/DDP细胞的摄取情况

从荧光显微镜结果图和流式定量分析结果(图 4) 可以看出, 在转染相同浓度的FAM-siRNA的条件下, 未经任何处理的空白对照组无荧光; 其余3组的平均荧光强度(MFI) 顺序是GGI (339.3) > PEI(283.4) > Lipofectamine 2000 (189.6), 且GGI不同N/P比的平均荧光强度顺序为N/P=20 > N/P=30 > N/P=10, 说明N/P最优比例为20时GGI/siRNA复合物的转染能力强于PEI 25K和Lipofectamine2000, 更容易内吞进入细胞。

5 MDR1 mRNA表达水平

以GAPDH为内参, 采用RT-PCR法检测MDR1 mRNA的表达水平。在空白对照组中, A549/DDP细胞系中的MDR1 mRNA表达水平较A549细胞系更显著, 表明其耐药性与MDR1表达量的差异相关。GGI_siNC组与裸siRNA组的MDR1表达水平与空白对照相当, 而相对siMDR1转染的实验组, Lipo_siMDR1组、PEI25K_siMDR1组MDR1 mRNA的相对表达量都有明显的降低, 分别为50%和25.4%, 而如图 5所示, GGI_siMDR1组MDR1mRNA的相对表达量降低最为明显(14.1%), 表明裸siRNA并不能下调MDR1 mRNA水平, 而经过GGI复合的siMDR1则具有很强的抑制效果。

6 MDR基因干扰后P-gp的表达水平

以Western blot法检测各组复合物经转染后对肺癌细胞P-gp蛋白表达的影响。由图 6可知, P-gp蛋白在A549/DDP细胞系的表达水平显著高于敏感株A549细胞系, 与mRNA表达结果一致, 表明P-gp高表达与肺癌细胞的耐药有关。同时, 相对于空白对照组, PEI 25K组、Lipo组和GGI组的P-gp表达水平顺序如下: GGI (19.54%) < PEI(27.6%) < Lipo (38%), 说明GGI/siMDR1复合物可以有效下调P-gp的表达。

7 Annexin V-FITC/PI双染法检测载体对细胞凋亡的影响

与PEI25K (6.64%)、Lipofectamine 2000 (7.12%) 对照组相比, GGI诱导A549/DDP凋亡效果较弱, 凋亡率为4.83% (图 7), 说明GGI/MDR1 siRNA纳米粒不会产生显著的细胞凋亡。

8 MDR1 siRNA干扰后对顺铂的敏感性

8.1 MTT法考察

根据顺铂处理及复合物转染后再用顺铂处理细胞的存活率计算各组的半数抑制率(IC₅₀), 如图 8所示。对于A549细胞而言, 单独给予顺铂(IC₅₀=13.25 μg·mL^-1) 和经转染GGI/MDR1 siRNA组(IC₅₀=9.74μg·mL^-1) 并没有明显差别, 而在A549/DDP细胞系, 经转染后给予顺铂药物组的细胞存活率大大降低, IC₅₀为19.77 μg·mL^-1, 较游离顺铂给药组(IC₅₀=42.89 μg·mL^-1) 敏感性增加, 证明在耐药株中经GGI/MDR1 siRNA复合物转染能有效抑制P-gp的表达, 从而在一定程度上增加顺铂在细胞内的积累, 提高对顺铂的敏感性。

8.2 流式细胞术考察细胞凋亡

8.2.1 敏感株A549细胞系的凋亡检测

经GGI/si_NC(negative control siRNA) 转染组凋亡率与阴性对照组无明显差异, 说明在体外转染的最佳用量下, GGI对细胞并不会诱导细胞凋亡。同时, GGI/si_MDR1转染后加顺铂处理组与游离顺铂给药处理组的细胞凋亡亦无显著差异, 分别为21.94%和25.16%, 说明转染后并不能增加A549细胞对顺铂的敏感性, 与MTT法检测结果一致。

8.2.2 耐药株A549/DDP细胞系的凋亡检测

游离顺铂给药组细胞总凋亡率为23.97%, 转染GGI/si_NC后加顺铂处理组为22.59%, 转染GGI/si_MDR1加顺铂处理组则达到52.07%, 为单独顺铂给药组的2.17倍, 具有统计学差异(图 9), 说明在耐药株A549/DDP细胞系中, 由于si_MDR1基因的干扰作用导致P-gp蛋白下调, 从而有效地增加了其对顺铂的敏感性。

结论

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本研究创新构建并合成载体GGI (PEG-b-PLG-g-PEIs) 聚合物, 以聚谷氨酰胺为骨架, 并在侧链接枝低分子量的聚乙烯亚胺, 通过酯键及酰胺键聚合连接成稳定的高分子聚合物, 以期得到生物可降解的、低毒高效的基因传递载体, 使其有效地包裹siRNA, 形成稳定的GGI/siRNA复合物, 且证明GGI聚合物的细胞毒性显著低于PEI 25K (阳离子金标准), 实现低毒的目的。同时由GGI/siRNA复合物的细胞摄取及转染结果可知, GGI可高效地运载siRNA进入A549和A549/DDP细胞, 其转染效果远高于PEI和Lipofectamine 2000, 低分子量PEI的聚合可显著下调A549/DDP中MDR1mRNA和P-gp的表达量, 并可增强其对顺铂的敏感性, 使得GGI有望成为一种前景良好的阳离子载体。

基金

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国家自然科学基金资助项目(81373332)
广东省自然科学基金资助项目(2014A030313155)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2017年第52卷第2期

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doi: 10.16438/j.0513-4870.2016-1033

接收时间：2016-10-24
首发时间：2026-01-14
出版时间：2017-02-12

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作者

出版历史

收稿日期：2016-10-24
修回日期：2016-12-08

基金

国家自然科学基金资助项目(81373332)

广东省自然科学基金资助项目(2014A030313155)

作者信息

中山大学药学院, 广东广州 510006

通讯作者:

* 冯敏, Tel:86-20-39943119, Fax:86-20-39943004, E-mail:fengmin@mail.sysu.edu.cn

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/yxxb/CN/10.16438/j.0513-4870.2016-1033

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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