药学学报

Compd.	IC₅₀/μmol·L^-1
1	9.4	> 100	2.0
3	3.3	> 100	0.33

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IC₅₀/μmol·L^-1

PDE1

PDE3

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4	0.79	> 100	0.027
5	0.86	> 100	0.082

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IC₅₀/μmol·L^-1

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4	OC₂H₅	0.79	> 100	0.027
6	H	NT	63	4.5
7	OH	NT	> 100	10
8		NT	47	0.96
9	NO₂	NT	> 100	4.4
10	NHSO₂CH₃	NT	83	0.78

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PDE1

PDE3

PDE5

OC₂H₅

0.79

> 100

0.027

4.5

> 100

0.96

NO₂

> 100

4.4

NHSO₂CH₃

0.78


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4	H	0.79	> 100	0.027	4.0
11		0.26	65	0.003 6	2.4
12		0.46	63	0.001 9	2.0
13		0.11	34	0.002 1	2.3
14		0.39	> 100	0.005 7	1.5

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IC₅₀/μmol·L^-1

log D

PDE1

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0.79

> 100

0.027

4.0

0.26

0.003 6

2.4

0.46

0.001 9

2.0

0.11

0.002 1

2.3

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1.5

基于传统药物化学研制的西地那非

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郭宗儒

药学学报 | 新药发现与研究实例简析 2018,53(9): 1578-1582

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药学学报 | 新药发现与研究实例简析 2018, 53(9): 1578-1582

基于传统药物化学研制的西地那非

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郭宗儒

作者信息

中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所, 北京 100050

Affiliations

出版时间: 2018-09-12 doi: 10.16438/j.0513-4870.2015-1068

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郭宗儒. 基于传统药物化学研制的西地那非. 药学学报, 2018 , 53 (9) : 1578 -1582 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-1068

. Acta Pharmaceutica Sinica, 2018 , 53 (9) : 1578 -1582 . DOI: 10.16438/j.0513-4870.2015-1068

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新药发现与研究实例简析

新药创制是复杂的智力活动, 涉及科学研究、技术创造、产品开发和疗效评价等多维科技活动。每个药物都有自身的研发轨迹, 而构建化学结构是最重要的环节, 因为它涵盖了药效、药代、安全性和生物药剂学等性质。本栏目以药物化学视角, 对有代表性的药物的成功构建, 加以剖析和解读。

根据PDE5酶底物的结构特征, 选定具有相似结构的化合物作为苗头分子, 对结构的“东西南北中”作广泛的变换和构效关系研究, 优化活性强度、选择性和成药性等。西地那非的首创意义在于临床研究中“偶然发现”可以临时克服男性勃起障碍, 虽然原定研发心血管药物的目标没有达到, 却划时代地发明了第一个口服治疗男性勃起障碍的药物, 在一定程度上改善了人们的生活质量, 其首创性意义重大。失之东隅, 收之桑榆, 是因为有相同的机制和作用靶标, 彰显了偶遇的必然性。

(编者按)

1 背景与靶标

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1.1 一氧化氮和环鸟苷酸

一氧化氮(NO)是个化学不稳定的无机分子, 却广泛存在于人体细胞中, 是由精氨酸与O₂在一氧化氮合酶催化下生成的(也可由硝酸盐转变成NO)。NO作为气体分子可迅速穿越细胞膜, 在细胞间传递, 半衰期短(多数内源性介质的共同特征, 履行完生理功能后即行消失)。NO在体内具有多种生理功能, 其中一个重要的作用是在平滑肌细胞内激活鸟苷酸环化酶, 该酶将三磷酸鸟苷(GTP)转变为环鸟苷酸(cGMP), 因而NO可提高胞内cGMP水平, 后者又启动一系列级联反应, 最终降低了胞内钙, 引起平滑肌细胞松弛, 使血管舒张, 从而降低了外周血管阻力, 所以NO可改善心肌缺血状态。然而长时间使用硝酸盐会迅速耐受而失效。辉瑞的科学家希望找到其他可调控NO水平的途径。

cGMP是体内无处不在的第二信使, 在细胞内水平受环核苷酸酶(催化合成)和磷酸二酯酶(催化降解)调控, 促进NO释放或抑制磷酸二酯酶(PDE)可提高cGMP水平。PDE水解cGMP成无活性的GMP。

1.2 磷酸二酯酶

PDEs是一个多基因的大家族, 它包括11类亚型共30余种, 在细胞与亚细胞区域作不同分布。PDEs家族有相似的结构, 都包含调控和催化两个功能区域。各型PDEs催化域的氨基酸序列相似75%以上。显示出家族成员间的同源性。PDEs具有不同的底物特异性: PDE4、7和8水解cAMP, 而PDE5、6和9选择性水解cGMP。PDE1和2既能水解cAMP, 也能水解cGMP。

1.3 PDE5活性中心的特征

在研发西地那非时, PDE5的三维结构尚未解析, 后来经X-射线衍射分析揭示了PDE5的结构。PDE5的催化位点处于C端螺旋束的中心, 结合底物的腔穴大约10 Å深, 口窄内宽, 体积为330 Å³, 由4个亚基组成:金属结合位点、母核结合腔、疏水腔和顶盖区域。金属结合位点含有锌离子和镁离子。锌离子结合于氨基酸残基的His 617 (键长2.1 Å)、Asp 654 (2.1 Å)、Asp 764 (2.2 Å)、His 653 (2.1 Å)和两个水分子(W1 2.2 Å, W2 2.8 Å); 镁离子与Asp 654 (2.0 Å)和5个水分子形成配位键(2.0, 2.0, 2.1, 2.0, 2.6 Å)。母核结合腔容纳cGMP的鸟嘌呤; 疏水腔由Phe 786、Ala 783、Leu 804和Val 782组成, 容纳核糖部分; 顶盖区域在开口处, 由Tyr 664、Met 816、Ala 823和Gly 819构成。这些腔穴都在PDE5抑制剂的结合中体现了出来。

1.4 男性勃起障碍

生理学研究提示, 男性的勃起机制是当男性受到性刺激, 阴茎海绵体细胞内产生NO, NO刺激cGMP的生成, 后者导致勃起组织的螺旋动脉内膜的垫平滑肌松弛, 舒张的平滑肌增加了阴茎海绵组织的血流量, 导致勃起。勃起障碍常常与冠状动脉病平行发生, 是因为生化机制相同的缘故, 也决定了辉瑞意外发现西地那非是必然的。

PDE亚型的组织分布具有特异性, PDE5主要分布在阴茎海绵体平滑肌和血管平滑肌内, 所以PDE5是治疗勃起障碍的药物靶标。不过, 当初辉瑞研发PDE5的抑制剂是以心血管疾病为目标, 并未意识到治疗勃起障碍。

2 苗头化合物扎普司特

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为了研发以PDE5为靶标的抗肺动脉高压药物, 研究者考虑到扎普司特(1, zaprinast)与cGMP (2)的结构相似性而作为起始物。扎普司特是M & Baker公司(后并入安万特公司)研制上市的抗过敏药, 具有解除平滑肌痉挛抗哮喘作用。1991年Haynes等发现扎普司特可降低大鼠因肺泡缺氧而血管收缩得到缓解, 还发现可舒张肺动脉血管, 这些可能与抑制支气管平滑肌的PDE5有关。然而1对多种PDE亚型有抑制作用, 而抑制PDE5的活性强度和选择性都不高。辉瑞设定的研究目标是通过提高对PDE5的选择性抑制作用, 研制新结构类型的降低肺动脉高压等心血管药物。

为了评价化合物的活性和选择性, 用自家兔血小板中分离的PDE5作为筛选活性的模型; 用大鼠肝的PDE1和家兔血小板的PDE3等模型评价化合物的选择性作用。辉瑞的药化合成五人小组在三年中合成并评价了1 600个化合物, 通过分析构效关系, 逐步优化了化合物的活性、选择性、物化和药代性质等。以下是由苗头化合物扎普司特开始经骨架迁越和药效团的探索, 最终研发出西地那非的过程, 所列的化合物是各个阶段有代表性的化合物。

通过对化合物1的三唑并嘧啶酮母核一系列变换, 发现三唑环变换成甲基吡唑化合物3, 对PDE5的活性显著提高, 3对PDE5的选择性10倍于PDE1。表 1列出了1和3抑制PDEs活性数据。因而将化合物3作为先导化合物进行优化(Terrett NK, Bell AS, Brown D, et al. Sildenafil (Viagra(TM)), a potent and selective inhibitor of type 5 cGMP phosphodiesterase with utility for the treatment of male erectile dysfunction. Bioorg Med Chem Lett, 1996, 6: 1819-1824)。

化合物3的骨架是吡唑并嘧啶酮, 经分子模拟对3与鸟苷的母核作结构比较, 表明分子尺寸、形状和偶极矩具有相似性。

3 先导物的优化

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3.1 先导物的3位、5位和1位基团的作用

分析化合物3的母核结构, 3位甲基的处境相当于鸟苷酸的核糖, 因而做出的科学假设是, 甲基履行了核糖片段与受体发生疏水性结合的功能(核糖整体虽是亲水性的, 但糖环面向受体的一侧是疏水性的, 许多酪氨酸激酶抑制剂的设计也如是)。甲基的体积小于戊糖环, 未能充满该疏水腔穴, 故而将3位甲基加大为正丙基, 得到化合物4的活性和选择性都有显著提高。5位存在有取代的苯环是必要的, 它所处的空间相当于cGMP磷酸结合的位置。

N¹的甲基对PDE5的选择性很重要, 去除甲基则降低了对PDE5的活性。例如化合物5对PDE5的抑制作用弱于4(表 2)。

3.2 苯环2'位乙氧基的变换

为了优化5位苯环上的取代基, 保持母核上N¹-甲基和C³-正丙基不变, 变换苯环上2'的乙氧基, 用羟基、硝基和甲磺酰胺基置换, 以及用环丙甲氧基取代, 都使活性下降, 表明乙氧基是重要的基团。表 3列出了有代表性的化合物6~10对不同亚型PDE的活性和选择性。

为了证明2'位乙氧基对活性的优势, 分子模拟和X-射线晶体学研究显示, 乙氧基的氧孤电子对与N⁶的氢原子形成分子内氢键, 提高了苯环与母核的共面性, 并且连接尺寸大的疏水性基团不利于活性。

3.3 5'位的优化——候选物西地那非的确定

至此化合物4成为先导物优化的最佳结果, 但尚未探索苯环5'位置的取代基对活性的影响, 加之由于化合物4的脂溶性高于水溶性10 000倍, 水溶性较低, 不利于口服吸收, 需要在5'位置加入极性基团以利于成药性质。

在苯环上变换或引入基团有三方面的考虑:一是由于这个位置相当于cGMP的磷酯基, 引入模拟磷酯的基团可提高与PDE5酶的互补性结合; 二是加入极性或成盐基团以有利于水溶性; 再一是在研发扎普司特的构效关系时发现, 5'位存在有磺酰基或磺酰胺基可提高抗过敏活性, 提示这个位置可容纳新的基团(Wilson SR, Wilson RB, Shoemaker AL, et al. Antiallergic 8-aza-purines 3. Structural characterization of 2-(2-propoxyphenyl)-8-azahypoxanthine, 2-(2-propoxy- 5-(propylsulfonyl) phenyl)-8-azahypoxanthine, and 2-(2- propoxy-5-(N-methyl-N-isopropylsulfamoyl)phenyl)- 8-azahypoxanthine. J Am Chem Soc, 1982, 104: 259-264)。为此, 在5'位连接(取代的)哌嗪或哌啶基, 得到代表性的化合物11~14, 其结构、活性和分布系数列于表 4。化合物11~14对PDE5的抑制活性和选择性作用明显高于5'位没有取代的化合物4, 而且溶解性提高了数十倍, 提示设计思路的正确性。其中化合物11的体内活性、选择性和药代性质均优于其他化合物, 遂制成枸橼酸盐, 定名为西地那非(sildenafil)进入临床研究(Ghofrani HA, Osterloh IH, Grimminger F. Sildenafil: from angina to erectile dys- function to pulmonary hypertension and beyond. Nat Rev Drug Discov, 2006, 5: 689-702)。

4 临床研究中的意外发现

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4.1 未曾达到对心血管作用的预期作用

在结构优化、候选物的遴选以及临床前的研究, 辉瑞公司的目标是针对PDE5靶标研发治疗冠心病和肺动脉高压药物, 枸橼酸西地那非(11)在经过健康志愿者Ⅰ期试验后, 进入Ⅱ期试验阶段, 对有限数量的心绞痛患者进行实验治疗观察, 结果对心绞痛患者没有达到预期的效果, 因而终止了对治疗心血管病的临床研究。

4.2 偶遇的必然性—西地那非上市

以Osterloh为首的临床试验人员在分析归纳西地那非的临床效果时, 意外地发现了一些男性受试者服药后生殖器出现勃起现象, 勃起程度与服用剂量呈相关性, 高剂量实验组中近90%的人都有勃起现象。这个发现促使辉瑞公司改变了该项目的适应症研究, 在1994年对12个有勃起障碍的患者进行了Ⅱ期临床研究, 结果10名患者的勃起有显著增强。

枸橼酸西地那非的口服生物利用度F = 40%, 血浆达峰时间为1 h, 半衰期t_1/2 = 2 h, 肝脏中主要经CYP3A4代谢, 发生N-去甲基化, 去甲基代谢产物仍具有抑制PDE5作用, 但强度只是原药的50%。

经过Ⅲ期临床研究, 证实西地那非有确实的促进男性勃起的功能, 于1998年FDA批准作为促进勃起的药物上市。西地那非的发现, 比当初旨在治疗心血管病的意义更大, 因为它是首创性地通过口服途径、特异性地抑制PDE5提高了勃起能力, 不同于既往的药物经过性激素介导或神经刺激的方式, 这在一定的程度上改善了生活质量, 并由此开创了以PDE5为靶标的治疗勃起障碍的药物新领域。

4.3 西地那非的不良反应

西地那非是以舒张血管为治疗心血管病而研制的, 在临床阶段改变了适应症成为治疗勃起功能障碍的药物。因而西地那非存留的引起低血压成为它的不良反应:健康男性志愿者单剂口服西地那非, 导致卧位血压下降, 服药后1~2 h血压下降最明显, 8 h则与安慰剂组无差别。若同时服用硝酸酯类药物, 降压作用更大, 是因为提供了NO的来源。另一不良反应是对视觉的影响, 即出现一过性蓝/绿颜色辨别异常, 异常程度与剂量相关, 这是因为西地那非具有抑制PDE6 (IC₅₀ 37 nmol·L^-1)的作用。PDE6参与视网膜中光传导的生理过程。虽然西地那非对PDE6抑制作用弱于PDE5大约10倍, 而且是一过性的, 但勃起的同时有蓝视障碍仍是不适宜的。

4.4 西地那非与PDE5的结合模式

在研发西地那非时, PDE5的三维结构尚未解析, 优化结构是靠传统药物化学方法进行的。后续研究的西地那非与PDE5复合物晶体结构的结合特征表明, 结构骨架和周边的侧链和基团与活性中心呈互补性结合。图 1是西地那非与PDE5复合物的晶体结构立体图。结合的主要特征如下:①母核吡唑并嘧啶酮与cGMP的鸟嘌呤环相似, 结合于Gln 817、Phe 820、Val 782和Tyr 612构成的疏水腔中, 吡唑环与其中的Phe 820发生π-π叠合作用。②吡唑环的N²与水分子形成氢键, 该水分子又同时与Tyr 612和另一个与锌离子配位的水分子形成氢键网络。③嘧啶酮环的C=O和N-H分别与Gln 817形成双齿型氢键, 前者是氢键接受体, 后者是氢键给体。④由Gln 817-Gln 775、Gln 775-Ala 767和Gln 775-Trp 853形成的氢键网络将5位苯环上的两个侧链的走向和氢键的形成起到引导和稳固作用。⑤甲基哌嗪处于活性中心的开口的顶盖处, 磺酰基没有发生氢键结合(Sung BJ, Hwang KY, Jeon YH, et al. Structure of the catalytic domain of human phosphodiesterase 5 with bound drug molecules. Nature, 2003, 425: 98-102)。

5 后继的药物

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5.1 伐地那非

拜耳公司快速跟踪研制的伐地那非(15, vardenafil), 采用了骨架迁越和保持药效团的策略, 新骨架是用咪唑并三嗪酮替换西地那非的吡唑并嘧啶酮环, 是将吡唑环的N¹与并环处的C交换, 形成了新的环系, 赋予化合物以结构新颖性。其实这两个骨架都是cGMP的鸟嘌呤环电子等排体。伐地那非骨架上连接的基团模拟了西地那非的药效团。研制过程也证实了那些药效团特征是呈现活性的必要基团。例如5'无取代基的化合物16抑制PDE5的IC₅₀ = 5 nmol·L^-1, 伐地那非的IC₅₀ = 1.2 nmol·L^-1 (Hanning H, Niewöhner U, Schenke T, et al. Imidazo[5, 1-f][1, 2, 4] triazin-4(3H)-ones: a new class of potent PDE5 inhibitors. Bioorg Med Chem Lett, 2002, 12: 865-868)。伐地那非的口服生物利用度F = 15%, 半衰期t_1/2 = 4~5 h。2003年FDA批准上市。

5.2 乌地那非

乌地那非(17, udenafil)是韩国东亚药业研发的治疗勃起障碍药物, 作用靶标也是PDE5。乌地那非结构骨架与西地那非相同, 药效团特征也大同小异, 是个典型的跟进型药物。乌地那非抑制PDE5的IC₅₀ = 5.2 nmol·L^-1, 口服后迅速起效, t_max = 1.0~1.5 h, 半衰期t_1/2 = 10~12 h (Kim BH, Lim HS, Chung JY, et al. Safety, tolerability and pharmacokinetics of udenafil, a novel PDE-5 inhibitor, in healthy young Korean subjects. Brit J Clin Pharmacol, 2008, 65: 848-854)。

5.3 他达那非

LillyIcos公司研发的他达那非(18, tadanafil)是第三个上市的强效的PDE5抑制剂, IC₅₀ = 1~5 nmol·L^-1, 其结构类型与上述的“那非”药物不同。主要用于男性勃起障碍, 也用于治疗肺动脉高压和尿道功能障碍。用药剂量10 mg, 起效时间内15~30 min, 半衰期t_1/2 = 44~112 h。

5.4 阿伐那非

阿伐那非(19, avanafil)是田边制药研发的PDE5抑制剂, 美国FDA于2012年批准上市, 体外抑制PDE5活性IC₅₀ = 1 nmol·L^-1, 口服15~30 min即发生勃起(Limin M, Johnsen N, Hellstrom WJ. Avanafil, a new rapid-onset phosphodiesterase 5 inhibitor for the treatment of erectile dysfunction. Expert Opin Investig Drugs, 2010, 19: 1427-1437)。

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2018年第53卷第9期

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116

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出版时间：2018-09-12

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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