药物分析杂志

试剂盒（test kit）	细菌内毒素工作标准品溶液浓度（concentration of bacterial endotoxin standards）/（EU · mL^-1）	细菌内毒素检查用水添加量（bacterial endotoxin test water addition）/mL	细菌内毒素工作标准品溶液添加量（addition of endotoxin standards solution）/mL
ENDONEXT	50	0.9	0.1（500 EU · mL^-1）
	5	0.9	0.1（50 EU · mL^-1）
	0.5	0.9	0.1（5 EU · mL^-1）
	0.05	0.9	0.1（0.5 EU · mL^-1）
PyroGene^TM Recombinant Factor C	5	0.75	0.25（20 EU · mL^-1）
	0.5	0.9	0.1（5 EU · mL^-1）
	0.05	0.9	0.1（0.5 EU · mL^-1）
	0.005	0.9	0.1（0.05 EU · mL^-1）

试剂盒（test kit）	细菌内毒素工作标准品溶液浓度（concentration of bacterial endotoxin standards）/（EU · mL^-1）	细菌内毒素检查用水添加量（bacterial endotoxin test water addition）/mL	细菌内毒素工作标准品溶液添加量（addition of endotoxin standards solution）/mL
ENDONEXT	50	0.9	0.1（500 EU · mL^-1）
	5	0.9	0.1（50 EU · mL^-1）
	0.5	0.9	0.1（5 EU · mL^-1）
	0.05	0.9	0.1（0.5 EU · mL^-1）
PyroGene^TM Recombinant Factor C	5	0.75	0.25（20 EU · mL^-1）
	0.5	0.9	0.1（5 EU · mL^-1）
	0.05	0.9	0.1（0.5 EU · mL^-1）
	0.005	0.9	0.1（0.05 EU · mL^-1）

编号（number）	细菌内毒素浓度（bacterial endotoxin concentration）	添加细菌内毒素的溶液（solution to which bacterial endotoxin has been added）	平行试样（number of parallel samples）
A	未添加（none）	供试品溶液（test solution）	至少2个平行（at least two parallels）
B	标准曲线的中点或靠近中点的浓度（设为λm）（concentration at or near the midpoint of the standard curve set as λm）	供试品溶液（test solution）	至少2个平行（at least two parallels）
C	至少3个浓度（浓度最低点为λ）（at least 3 concentrations and the lowest point set as λ）	细菌内毒素检查用水（water for BET）	每个浓度至少2个平行（at least two parallel per concentrations）
D	未添加（none）	细菌内毒素检查用水（water for BET）	至少2个平行（at least two parallels）

编号（number）	细菌内毒素浓度（bacterial endotoxin concentration）	添加细菌内毒素的溶液（solution to which bacterial endotoxin has been added）	平行试样（number of parallel samples）
A	未添加（none）	供试品溶液（test solution）	至少2个平行（at least two parallels）
B	标准曲线的中点或靠近中点的浓度（设为λm）（concentration at or near the midpoint of the standard curve set as λm）	供试品溶液（test solution）	至少2个平行（at least two parallels）
C	至少3个浓度（浓度最低点为λ）（at least 3 concentrations and the lowest point set as λ）	细菌内毒素检查用水（water for BET）	每个浓度至少2个平行（at least two parallel per concentrations）
D	未添加（none）	细菌内毒素检查用水（water for BET）	至少2个平行（at least two parallels）

试剂盒（test kit）	标准曲线（standard curve） log（ΔRFU）=AlogC+B	r	RSD	线性范围（linear range）/EU · mL^-1	阴性对照荧光值（negative control）/RFU	标准曲线最低点荧光值（lowest point of the standard curve）/RFU
ENDONEXT	Y=0.801 9X+4.374 1	0.997 1	0.54	0.05~50	2 619	3431
	Y=0.777 2X+4.393 3	0.997 0			1 723	3607
	Y=0.759 2X+4.536 3	0.992 4			2 351	4364
PyroGene^TM Recombinant Factor C	Y=1.071 4X+5.438 1	0.997 3	0.61	0.005~5	19 378	22 183
Y=1.032 6X+5.451 1	0.991 3			19 183	29 092
Y=1.051 3X+5.502 4	0.994 5			18 732	31 137

试剂盒（test kit）	标准曲线（standard curve） log（ΔRFU）=AlogC+B	r	RSD	线性范围（linear range）/EU · mL^-1	阴性对照荧光值（negative control）/RFU	标准曲线最低点荧光值（lowest point of the standard curve）/RFU
ENDONEXT	Y=0.801 9X+4.374 1	0.997 1	0.54	0.05~50	2 619	3431
	Y=0.777 2X+4.393 3	0.997 0			1 723	3607
	Y=0.759 2X+4.536 3	0.992 4			2 351	4364
PyroGene^TM Recombinant Factor C	Y=1.071 4X+5.438 1	0.997 3	0.61	0.005~5	19 378	22 183
Y=1.032 6X+5.451 1	0.991 3			19 183	29 092
Y=1.051 3X+5.502 4	0.994 5			18 732	31 137

试剂盒（test kit）	批号（sample batch number）	稀释倍数（dilution multiple）	加入内毒素浓度（addition of endotoxin concentration）/（EU · mL^-1）	供试品溶液内毒素含量（endotoxin content of test solutions	含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量（endotoxin content of test solutions containing standard endotoxin）/（EU · mL^-1）	回收率（recovery）/%
ENDONEXT	20201002	20	5	N/A	4.0	80.2
		40	5	N/A	3.4	68.8
		60	5	N/A	6.2	124.2
PyroGene^TM Recombinant Factor C	20201002	200	0.5	N/A	0.19	38.4
	400	0.5	N/A	0.24	47.4
	600	0.5	N/A	0.35	70.0

试剂盒（test kit）	批号（sample batch number）	稀释倍数（dilution multiple）	加入内毒素浓度（addition of endotoxin concentration）/（EU · mL^-1）	供试品溶液内毒素含量（endotoxin content of test solutions	含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量（endotoxin content of test solutions containing standard endotoxin）/（EU · mL^-1）	回收率（recovery）/%
ENDONEXT	20201002	20	5	N/A	4.0	80.2
		40	5	N/A	3.4	68.8
		60	5	N/A	6.2	124.2
PyroGene^TM Recombinant Factor C	20201002	200	0.5	N/A	0.19	38.4
	400	0.5	N/A	0.24	47.4
	600	0.5	N/A	0.35	70.0

试剂盒（test kit）	批号（sample batch number）	稀释倍数（dilution multiple）	加入内毒素浓度（addition of endotoxin concentration）/（EU · mL^-1）	供试品溶液内毒素含量（endotoxin content of test solutions）	含标准内毒素的供试品溶液中的内毒素含量（endotoxin content of test solutions containing standard endotoxin）/（EU · mL^-1）	回收率（recovery）/%
ENDONEXT	20201002	60	5	N/A	7.88	157.6
				N/A	6.97	139.5
				N/A	6.22	124.2
	20201003	60	5	N/A	6.34	126.7
				N/A	4.51	90.1
				N/A	6.86	136.8
	20201101	60	5	N/A	6.84	136.8
				N/A	4.74	94.9
				N/A	7.12	142.3
PyroGene^TM Recombinant Factor C	20201002	600	0.5	N/A	0.45	90.6
			N/A	0.35	70.0
			N/A	0.45	89.3
20201003	600	0.5	N/A	0.36	71.0
			N/A	0.32	63.6
			N/A	0.31	61.5
20201101	600	0.5	N/A	0.52	105.2
			N/A	0.33	66.7
			N/A	0.38	75.3

试剂盒（test kit）	批号（sample batch number）	稀释倍数（dilution multiple）	加入内毒素浓度（addition of endotoxin concentration）/（EU · mL^-1）	供试品溶液内毒素含量（endotoxin content of test solutions）	含标准内毒素的供试品溶液中的内毒素含量（endotoxin content of test solutions containing standard endotoxin）/（EU · mL^-1）	回收率（recovery）/%
ENDONEXT	20201002	60	5	N/A	7.88	157.6
				N/A	6.97	139.5
				N/A	6.22	124.2
	20201003	60	5	N/A	6.34	126.7
				N/A	4.51	90.1
				N/A	6.86	136.8
	20201101	60	5	N/A	6.84	136.8
				N/A	4.74	94.9
				N/A	7.12	142.3
PyroGene^TM Recombinant Factor C	20201002	600	0.5	N/A	0.45	90.6
			N/A	0.35	70.0
			N/A	0.45	89.3
20201003	600	0.5	N/A	0.36	71.0
			N/A	0.32	63.6
			N/A	0.31	61.5
20201101	600	0.5	N/A	0.52	105.2
			N/A	0.33	66.7
			N/A	0.38	75.3

试剂盒（test kit）	批号（sample batch number）	稀释倍数（dilution multiple）	检测结果（test result）/（EU · mL^-1）
ENDONEXT	20201002	60	<0.05
			<0.05
			<0.05
	20201003	60	<0.05
			<0.05
			<0.05
	20201101	60	<0.05
			<0.05
			<0.05
PyroGene^TM Recombinant Factor C	20201002	600	<0.005
		<0.005
		<0.005
20201003	600	<0.005
		<0.005
		<0.005
20201101	600	<0.005
		<0.005
		<0.005

试剂盒（test kit）	批号（sample batch number）	稀释倍数（dilution multiple）	检测结果（test result）/（EU · mL^-1）
ENDONEXT	20201002	60	<0.05
			<0.05
			<0.05
	20201003	60	<0.05
			<0.05
			<0.05
	20201101	60	<0.05
			<0.05
			<0.05
PyroGene^TM Recombinant Factor C	20201002	600	<0.005
		<0.005
		<0.005
20201003	600	<0.005
		<0.005
		<0.005
20201101	600	<0.005
		<0.005
		<0.005

重组C因子法测定注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液中的细菌内毒素

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李玲 ¹ , 程潇 ¹ , 王建 ¹^,^* , 连凯娜 ¹ , 张蕻 ¹ , 范毓慧 ¹ , 孙丹丹 ¹ , 于玉凤 ²

药物分析杂志 | 安全监测 2025,45(3): 530-536

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药物分析杂志 | 安全监测 2025, 45(3): 530-536

重组C因子法测定注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液中的细菌内毒素

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李玲¹, 程潇¹, 王建¹^,^*, 连凯娜¹, 张蕻¹, 范毓慧¹, 孙丹丹¹, 于玉凤²

作者信息

1.山西锦波生物医药股份有限公司功能蛋白山西省重点实验室，太原 030032

2.山西医科大学基础医学院，太原 030001

Tel：15110338498；E-mail：397230757@qq.com

通讯作者:

^*Tel：18635146525；E-mail：Wj7520991@163.com

Determination for the bacterial endotoxin of recombinant typeⅢhumanized collagen solution for injection by the recombinant C-factor method

Ling LI¹, Xiao CHENG¹, Jian WANG¹^,^*, Kai-na LIAN¹, Hong ZHANG¹, Yu-hui FAN¹, Dan-dan SUN¹, Yu-feng YU²

Affiliations

1. Key Laboratory of Functional Proteins of Shanxi Province, Shanxi Jinbo Biopharmaceutical Co., Ltd, Taiyuan 030 032, China

2. School of Basic Medical Sciences, Shanxi Medical University, Taiyuan 030 001, China

出版时间: 2025-03-31 doi: 10.16155/j.0254-1793.2024-0498

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摘要

收起

目的：建立重组C因子检测注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液细菌内毒素含量的方法。方法：通过采用生物梅里埃重组C因子试剂盒、龙沙重组C因子试剂盒，分别对3批注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液进行了测定，并进行方法验证。结果：2种试剂盒的标准曲线浓度点≥ 3个，线性 r >0.980；阴性对照的ΔRFU值小于标准曲线最低点的ΔRFU值；细菌内毒素含量均< 6 EU · mL^-1，重复性良好，细菌内毒素的回收率在50%~200%，符合《中华人民共和国药典》标准要求。结论：注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液中细菌内毒素含量采用2个试剂盒测定的结果分别为<0.05 EU · mL^-1 和<0.005 EU · mL^-1，符合产品细菌内毒素的标准要求。该方法可用于注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液中细菌内毒素含量的测定。本文为采用重组C因子法测定重组蛋白产品中内毒素的相关研究提供参考。

关键词

重组C因子 / 注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液 / 细菌内毒素 / 重组胶原蛋白 / 鲎试剂

Abstract

收起

Objective: To establish a recombinant C-factor method to detect the content of bacterial endotoxin in recombinant type Ⅲ humanized collagen solution for injection. Methods: Three batches of injectable recombinant type Ⅲ humanised collagen solutions were determinedand method validation by using the BIOMERIEUX recombinant C-factor kit and the lonza recombinant C-factor kit，respectively. Results: The results showed that about the two kits the concentration points of the standard curve were ≥ 3, and the linear correlation coefficient was r > 0.980,the ΔRFU value of the negative control was smaller than that of the lowest point of the standard curve; the bacterial endotoxin contents were all < 6 EU · mL^-1. The reproducibility was good, the recoveries of bacterial endotoxin were in the range of 50%-200%, which was in accordance with the standard requirements of the ChP. Conclusion: The bacterial endotoxin content in the solution of recombinant type Ⅲ humanized collagen solution for injection is determined by the two kits. The results were < 0.05 EU · mL^-1 and < 0.005 EU · mL^-1, which are in accordance with the standard requirements for bacterial endotoxin in the product, respectively. The method can be used for the determination of bacterial endotoxin content in the solution of recombinant type Ⅲ humanized collagen solution for injection. This study provides a reference for the research related to the determination of endotoxin in recombinant protein products using recombinant C-factor method.

Key words

recombinant C-factor / recombinant type Ⅲ humanized collagen solution for injection / bacterial endotoxin / recombinant collagen / limulus reagent

引用本文

李玲, 程潇, 王建, 连凯娜, 张蕻, 范毓慧, 孙丹丹, 于玉凤. 重组C因子法测定注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液中的细菌内毒素. 药物分析杂志, 2025 , 45 (3) : 530 -536 . DOI: 10.16155/j.0254-1793.2024-0498

Ling LI, Xiao CHENG, Jian WANG, Kai-na LIAN, Hong ZHANG, Yu-hui FAN, Dan-dan SUN, Yu-feng YU. Determination for the bacterial endotoxin of recombinant typeⅢhumanized collagen solution for injection by the recombinant C-factor method[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2025 , 45 (3) : 530 -536 . DOI: 10.16155/j.0254-1793.2024-0498

正文

收起

目前，重组胶原蛋白作为生物医学材料领域的突破性成果，在医疗美容和生物材料应用方面占重要地位。近年来，我国重组胶原蛋白产业实现跨越式发展，其相关产品凭借卓越的生物相容性和安全性，日益受到临床机构和消费者的青睐。注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液是继冻干纤维剂型后，又一款按照Ⅲ类医疗器械进行管理的新款重组胶原蛋白的医美针剂，是由重组Ⅲ型人源化胶原蛋白和 0.9% 生理盐水组成，采用的重组胶原蛋白生物材料其氨基酸序列的重复单元与人胶原的氨基酸序列特异性功能区100%一致，具有细胞黏附性好、生物活性高、透皮吸收率高的生物学性能^[1]。独特的自组装能力可形成胶原蛋白纤维网状结构，对细胞、组织起支撑作用，这类新型的重组胶原蛋白生物材料在化妆品、医美、医疗器械等领域展现出更广阔的应用前景^[2-3]。

重组胶原蛋白在工业化生产过程中多为细菌或真菌进行发酵生产，细菌内毒素的质量控制是保障产品安全的重要组成部分。目前，细菌内毒素的检测方法主要有凝胶法和光度法，这2种方法主要依赖于鲎试剂。传统凝胶法反应的原理是鲎试剂中的C因子被细菌内毒素激活而使得鲎试剂产生凝集反应^[4-7]。然而鲎试剂的唯一来源是鲎的血液，随着鲎资源的短缺，采用生物重组技术获取的重组C因子目前可以作为鲎血液的代替品，重组C因子法测定细菌内毒素的原理是重组C因子被细菌内毒素激活，被激活后的重组C因子可切割荧光素底物，从而产生荧光化合物，根据底物的荧光差异与样品中的内毒素浓度成比例原理，可测量出样品中的细菌内毒素浓度^[8-12]。该方法已在欧洲药典收录并且也写进了美国FDA在2012年发布的指导原则中，目前我国也将重组C因子写入了2020年版《中华人民共和国药典》（9251 细菌内毒素检查法应用指导原则），我国相关监管部门也对重组C因子法测定进行了一部分探索和研究^[13-17]，但是有关重组C因子法应用范围的研究仍然不够全面。

本文利用重组C因子法，对注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液中的细菌内毒素进行测定，从该方法的灵敏度试验、标曲可靠性试验、初筛试验、干扰试验进行验证。

1　材料

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1.1　试验样品

注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液（批号20201102、20201201、20201202，规格1 mL · 支^-1），产品型号 2 mg · mL^-1，山西锦波生物医药股份有限公司生产。

1.2　试剂及设备

酶标仪（型号：HIM）购自 Bio-Tek公司；ENDONEXT 试剂盒（Lot：609033）购自BIOMERIEUX 公司；Pyro Gene^TM Recombinant Factor C（Lot：0001079736）购自Lonza公司。细菌内毒素检查用水（Lot No. 22096004）和无内毒素玻璃试管（带盖）购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司。

2　实验方法

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2.1　样品前处理

2.1.1　最大有效稀释倍数确定

供试品细菌内毒素含量限值L为<6 EU · mL^-1，浓度（C）为2 mg · mL^-1，则经单位换算供试品细菌内毒素含量限值L可表述为3 EU · mg^-1，测定时将供试品浓度稀释为1 mg · mL^-1，ENDONEXT试剂盒灵敏度为0.05 EU · mL^-1，Pyro Gene^TM Recombinant Factor C试剂盒灵敏度为0.005 EU · mL^-1，最大有效稀释倍数（maximum valid dilute double，MVD）按照公式：MVD=LC/λ，计算可得2款试剂盒的最大有效稀释倍数分别60倍和600倍。

2.1.2　供试品溶液制备

取供试品原液于无热原试管中，根据 ENDONEXT 试剂盒和 Pyro Gene^TM Recombinant Factor C 试剂盒的灵敏度，用细菌内毒素检查用水分别对应逐步稀释至 20、40、60 倍和 200、400、600倍，每一步最大稀释倍数≤10，每一步稀释后旋涡振荡 2 min。

2.1.3　细菌内毒工作标准品系列溶液的制备

取ENDONEXT试剂盒内工作标准品，用细菌内毒素检查用水溶解至500 EU · mL^-1，按照表1再逐步梯度稀释至50、5、0.5、0.05 EU · mL^-1于4支无热原试管中。

取PyroGene^TM Recombinant Factor C 试剂盒内工作标准品，用细菌内毒素检查用水溶解至20 EU · mL^-1，按照表1再逐步梯度稀释至5、0.5、0.05、0.005 EU · mL^-1于4支无热原试管中。

2.1.4　干扰试验供试品溶液制备

按照表2进行制备，其中ENDONEXT试剂盒和PyroGene^TM Recombinant Factor C分别选择60倍稀释和600倍稀释的供试品溶液作为系列A，含有细菌内毒素浓度为5 EU · mL^-1和0.5 EU · mL^-1的供试品溶液作为系列B；取表1中各试剂盒对应的细菌内毒工作标准品系列溶液作为系列C，取细菌内毒素检查用水作为系列D。

2.2　操作步骤

2.2.1　ENDONEXT试剂盒

在每个试样孔中加入供试品溶液100 μL然后再加入结合液20 μL，用封板膜封板后在37 ℃下以450 r · min^-1的速度连续震荡温育120 min。启动酶标仪，确保工作温度在37 ℃。温育后快速翻转96孔板，将液体倒出。用纸巾小心地拍干96孔板，使用移液枪向每个孔中添加洗涤液150 μL，放置1 min，倒出。重复清洗2次。

底物试剂制备：提前取出各试剂，使其温度平衡至室温；按照1 ∶ 1的比例混合分析缓冲液（AB）、底物（SUB）、酶（ENZ），轻轻地充分混合，切勿旋涡混合。

检测步骤：准备足量的底物试剂，向每个试样孔中底物试剂。将96孔板放入酶标仪，等待1 min，以调整温度。读取时间点0处的荧光值，记为RFU₀。在酶标仪中37 ℃下温育90 min后读取荧光值记为RFU₉₀。仪器参数设置：激发波长380 nm，发射波长445 nm，温度37 ℃。

按公式 log（ΔRFU）=log（RFU₉₀-RFU₀]计算，再以细菌内毒素工作标准品溶液浓度的对数为横坐标，净ΔRFU的对数为纵坐标绘图并进行线性拟合，log（ΔRFU）=AlogC+B。其中A为线性回归方程斜率；B为线性回归方程截距；C为细菌内毒素浓度；ΔRFU表示反应终点荧光值与0点荧光值的差值。

2.2.2　PyroGene^TM Recombinant Factor C试剂盒

底物试剂制备：提前30 min取出各试剂，使其温度平衡至室温，按照5 ∶ 4 ∶ 1的比例混合Fluorogenic Substrate、rFC Assay Buffer、rFC Enzyme Solution，轻轻地充分混合，切勿旋涡混合。

检测步骤：在每个试样孔中加入100 μL供试品，在37 ℃±1 ℃的酶标仪中预热10~20min，向每个试样孔中添加100 μL底物试剂。底物试剂加入后立即读取时间点0小时的荧光值记为RFU₀。将微孔板放在37 ℃±1 ℃的酶标仪中，孵育60 min后进行时间点60 min的荧光值读数记为RFU₆₀。采用380 nm作为激发波长，440 nm作为发射波，温度37 ℃进行孵育。

按公式log（ΔRFU）=log（RFU₆₀-RFU₀）计算，再以细菌内毒素工作标准品溶液浓度的对数为横坐标，净ΔRFU的对数为纵坐标绘制曲线图并进行线性拟合，log（ΔRFU）=AlogC+B。

2.3　方法学验证

2.3.1　标准曲线可靠性试验

将内毒素工作标准品用无热原水稀释成系列浓度标准溶液，按照“2.2”项下操作步骤进行测定，以logΔRFU对细菌内毒素浓度的对数值进行线性拟合并计算。

2.3.2　初筛试验

将供试品用无热原水稀释成系列浓度供试品溶液，按照“2.2”项下操作步骤进行测定并以logΔRFU对细菌内毒素浓度的对数值进行线性拟合并计算。

2.3.3　干扰试验

按照“2.1.4”项下方法准备好干扰试验样品，按照“2.2”项下步骤进行测定，以logΔRFU对细菌内毒素浓度的对数值进行线性拟合并计算。

2.3.4　统计分析

标准曲线可靠性试验中当阴性对照的荧光值低于标准曲线最低点的荧光值，将全部数据进行线性回归分析。根据线性回归分析，标准曲线的相关系数（r）的绝对值应大于或等于0.980时表明试验方法有效。干扰试验中当细菌内毒素的回收率在50%~200%时，则认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

3　实验结果

收起

3.1　标曲可靠性试验结果

ENDONEXT和PyroGene^TM Recombinant Factor C 2个试剂盒标准曲线可靠性试验线性回归结果如图1所示，试验结果见表3，结果显示2个试剂盒阴性对照的荧光值低于标准曲线最低点的荧光值，线性相关系数均>0.980，重复性RSD均小于3%，标准曲线可靠性试验结果稳定。

3.2　初筛试验结果

对注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液逐步进行稀释，稀释过程中回收率逐渐提高说明干扰明显减小，且ENDONEXT和PyroGene^TM Recombinant Factor C 2个试剂盒分别在60倍稀释和600倍稀释下回收率均符合50%~200%，试验结果见表4。最终选择60倍和600倍稀释作为注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液的最佳稀释倍数。

3.3　干扰试验结果

采用ENDONEXT和 PyroGene^TM Recombinant Factor C 2个试剂盒分别进行 3 次重复测定，试验结果见表5。结果表明在干扰试验过程中，2种试剂盒的细菌内毒素的回收率均在 50%~200%，在此实验条件下供试品溶液不存在干扰作用。

3.4　样品测定结果

试验考察结果表明ENDONEXT和PyroGene^TM Recombinant Factor C 2个试剂盒经验证，标准曲线的浓度点≥3个；阴性对照值的ΔRFU均低于标准曲线最低点的ΔRFU；线性相关系数|r|>0.980；细菌内毒素回收率在50%~200%，2个试剂盒的标准曲线可靠性试验、初筛试验以及干扰试验均符合2020年版《中华人民共和国药典》细菌内毒素检查法验证标准。可采用经验证的这2种试剂盒对注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液在60倍稀释和600倍稀释的条件下进行细菌内毒素检查。现分别对3批次供试品细菌内毒素进行3次重复试验测定，测定结果见表6。结果表明，在该试验温度下，供试品溶液中所有平行管的平均内毒素含量乘以溶液稀释倍数计算所得的细菌内毒素检测结果低于测定试剂盒标准曲线的最低点（ENDONEXT和PyroGene^TM Recombinant Factor C标准曲线的最低点分别为<0.05 EU · mL^-1和<0.005 EU · mL^-1），符合供试品细菌内毒素标准要求（<6 EU · mL^-1）。

4　讨论与结论

收起

目前，鲎作为国家珍稀动物，保护力度逐渐加大，为了减少鲎试剂的使用并且满足一些特殊产品细菌内毒素检查的需求，除了传统的凝胶法、光度法外，重组C因子法、重组级联试剂显色法等新的细菌内毒素检测方法不断出现，在2020年版《中华人民共和国药典》中（9251细菌内毒素检查法应用指导原则）也收录了重组C因子法。C因子是一种具有特异性的蛋白对细菌内毒素敏感，它存在于鲎试剂中，当与含有细菌内毒素的产品反应时，可以选择性地识别到细菌内毒素。而重组C因子是采用基因重组的方式表达的C因子重组蛋白（recombinant factor C，rFC）当测定存在细菌内毒素的样品时，细菌内毒素会与重组C因子结合并使得重组C因子获得游离的荧光基团，可以通过反应混合物中的细菌内毒素含量与其孵育结束后的荧光数值之间存在的定量关系来确定细菌内毒素的含量，该技术可对相应的产品中细菌内毒素含量进行定量检测，定量检测的数据可以用来分析产品测定结果的趋势，追踪产品质量及评估工艺的稳定性，起到产品质量风险的监测、预警的作用，还可为产品在生产工艺过程中的污染风险评估提供有效数据。

在细菌内毒素检测领域，重组C因子法因其广泛的适用性和高灵敏度而受到青睐。与传统的凝胶法相比，重组C因子法能够通过回收率分析来揭示产品的干扰趋势。得益于其宽广的标准曲线范围，该方法允许对干扰样本进行稀释，以降低干扰。随着回收率的逐步提升，表明产品干扰逐渐减少，从而帮助确定最佳的稀释倍数。这一特性对于处于检验技术研发阶段的企业来说，尤其具有优势。与动态显色法相比，重组C因子法在准确度、精密性、专属性和耐用性方面表现更为出色^[18-19]。重组C因子法不会与β葡聚糖发生反应，而动态显色法则会，这表明在特定条件下，重组C因子法具有更高的专属性。因此，对于那些使用凝胶法无法消除干扰的样本，或者存在β葡聚糖干扰的样本。重组C因子法是一个值得考虑的选择。不同生产厂家在设计生产试剂盒时灵敏度和抗干扰能力不同，在实际检测中，最大稀释倍数需要根据标准曲线最低点灵敏度进行调整；在初筛试验中ENDONEXT试剂盒在20、40、60的稀释倍数下回收率均在50%~200%，PyroGene^TM Recombinant Factor C试剂盒在200、400倍的稀释倍数下回收率小于50%，600倍的稀释倍数下回收率在50%~200%，2个试剂盒不同稀释倍数下回收率的差异，表明ENDONEXT试剂盒的抗干扰能力更强。

在胶原蛋白表达系统中，大肠杆菌表达系统是最早被研究的，也是目前最成熟的表达系统之一，以其快速的细胞繁殖，高产出以及IPTG诱导表达的简便性而成为生产重组蛋白的常用系统^[20-21]。然而，该系统可能会产生内毒素等致热源，并且大肠杆菌本身含有可能混入最终产品的内毒素和有毒蛋白^[22]。因此，在胶原蛋白生产过程中，去除细菌内毒素至关重要。

本实验选取了使用大肠杆菌表达系统生产的注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液作为研究对象，具有一定的代表性，经验证，重组C因子法在测定该产品时结果均能满足2020年版《中华人民共和国药典》规定，说明重组C因子法可应用于注射用重组Ⅲ型人源化胶原蛋白溶液。

本研究为生产企业在产品细菌内毒素质量控制方面提供新的方法，并为新产品应用提供了数据支持。

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收起

文献

收起

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2025年第45卷第3期

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doi: 10.16155/j.0254-1793.2024-0498

接收时间：2024-08-08
首发时间：2026-03-17
出版时间：2025-03-31

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收稿日期：2024-08-08

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作者信息

1.山西锦波生物医药股份有限公司功能蛋白山西省重点实验室，太原 030032

2.山西医科大学基础医学院，太原 030001

通讯作者:

^*Tel：18635146525；E-mail：Wj7520991@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

试剂盒（test kit）	细菌内毒素工作标准品溶液浓度（concentration of bacterial endotoxin standards）/（EU · mL^-1）	细菌内毒素检查用水添加量（bacterial endotoxin test water addition）/mL	细菌内毒素工作标准品溶液添加量（addition of endotoxin standards solution）/mL
ENDONEXT	50	0.9	0.1（500 EU · mL^-1）
	5	0.9	0.1（50 EU · mL^-1）
	0.5	0.9	0.1（5 EU · mL^-1）
	0.05	0.9	0.1（0.5 EU · mL^-1）
PyroGene^TM Recombinant Factor C	5	0.75	0.25（20 EU · mL^-1）
	0.5	0.9	0.1（5 EU · mL^-1）
	0.05	0.9	0.1（0.5 EU · mL^-1）
	0.005	0.9	0.1（0.05 EU · mL^-1）

试剂盒
（test kit）

细菌内毒素工作标准品溶液浓度
（concentration of bacterial endotoxin standards）/（EU · mL^-1）

细菌内毒素检查用水添加量
（bacterial endotoxin test water addition）/mL

细菌内毒素工作标准品溶液添加量
（addition of endotoxin standards solution）/mL

ENDONEXT

0.9

0.1（500 EU · mL^-1）

0.9

0.1（50 EU · mL^-1）

0.5

0.9

0.1（5 EU · mL^-1）

0.05

0.9

0.1（0.5 EU · mL^-1）

PyroGene^TM Recombinant Factor C

0.75

0.25（20 EU · mL^-1）

0.5

0.9

0.1（5 EU · mL^-1）

0.05

0.9

0.1（0.5 EU · mL^-1）

0.005

0.9

0.1（0.05 EU · mL^-1）

编号（number）	细菌内毒素浓度（bacterial endotoxin concentration）	添加细菌内毒素的溶液（solution to which bacterial endotoxin has been added）	平行试样（number of parallel samples）
A	未添加（none）	供试品溶液（test solution）	至少2个平行（at least two parallels）
B	标准曲线的中点或靠近中点的浓度（设为λm）（concentration at or near the midpoint of the standard curve set as λm）	供试品溶液（test solution）	至少2个平行（at least two parallels）
C	至少3个浓度（浓度最低点为λ）（at least 3 concentrations and the lowest point set as λ）	细菌内毒素检查用水（water for BET）	每个浓度至少2个平行（at least two parallel per concentrations）
D	未添加（none）	细菌内毒素检查用水（water for BET）	至少2个平行（at least two parallels）

编号
（number）

细菌内毒素浓度
（bacterial endotoxin concentration）

添加细菌内毒素的溶液
（solution to which bacterial endotoxin has been added）

平行试样
（number of parallel samples）

未添加（none）

供试品溶液
（test solution）

至少2个平行
（at least two parallels）

标准曲线的中点或靠近中点的浓度（设为λm）
（concentration at or near the midpoint of the standard curve set as λm）

供试品溶液
（test solution）

至少2个平行
（at least two parallels）

至少3个浓度（浓度最低点为λ）
（at least 3 concentrations and the lowest point set as λ）

细菌内毒素检查用水
（water for BET）

每个浓度至少2个平行
（at least two parallel per concentrations）

未添加（none）

细菌内毒素检查用水
（water for BET）

至少2个平行
（at least two parallels）

试剂盒（test kit）	标准曲线（standard curve） log（ΔRFU）=AlogC+B	r	RSD	线性范围（linear range）/EU · mL^-1	阴性对照荧光值（negative control）/RFU	标准曲线最低点荧光值（lowest point of the standard curve）/RFU
ENDONEXT	Y=0.801 9X+4.374 1	0.997 1	0.54	0.05~50	2 619	3431
	Y=0.777 2X+4.393 3	0.997 0			1 723	3607
	Y=0.759 2X+4.536 3	0.992 4			2 351	4364
PyroGene^TM Recombinant Factor C	Y=1.071 4X+5.438 1	0.997 3	0.61	0.005~5	19 378	22 183
Y=1.032 6X+5.451 1	0.991 3			19 183	29 092
Y=1.051 3X+5.502 4	0.994 5			18 732	31 137

试剂盒
（test kit）

标准曲线
（standard curve） log（ΔRFU）=AlogC+B

RSD

线性范围
（linear range）/EU · mL^-1

阴性对照荧光值
（negative control）/RFU

标准曲线最低点荧光值
（lowest point of the standard curve）/RFU

ENDONEXT

Y=0.801 9X+4.374 1

0.997 1

0.54

0.05~50

2 619

3431

Y=0.777 2X+4.393 3

0.997 0

1 723

3607

Y=0.759 2X+4.536 3

0.992 4

2 351

4364

PyroGene^TM Recombinant Factor C

Y=1.071 4X+5.438 1

0.997 3

0.61

0.005~5

19 378

22 183

Y=1.032 6X+5.451 1

0.991 3

19 183

29 092

Y=1.051 3X+5.502 4

0.994 5

18 732

31 137

试剂盒（test kit）	批号（sample batch number）	稀释倍数（dilution multiple）	加入内毒素浓度（addition of endotoxin concentration）/（EU · mL^-1）	供试品溶液内毒素含量（endotoxin content of test solutions	含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量（endotoxin content of test solutions containing standard endotoxin）/（EU · mL^-1）	回收率（recovery）/%
ENDONEXT	20201002	20	5	N/A	4.0	80.2
		40	5	N/A	3.4	68.8
		60	5	N/A	6.2	124.2
PyroGene^TM Recombinant Factor C	20201002	200	0.5	N/A	0.19	38.4
	400	0.5	N/A	0.24	47.4
	600	0.5	N/A	0.35	70.0

试剂盒
（test kit）

批号
（sample batch number）

稀释倍数
（dilution multiple）

加入内毒素浓度
（addition of endotoxin concentration）/（EU · mL^-1）

供试品溶液内毒素含量（endotoxin content of test solutions

含标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量（endotoxin content of test solutions containing standard endotoxin）/（EU · mL^-1）

回收率
（recovery）/%

ENDONEXT

20201002

N/A

4.0

80.2

N/A

3.4

68.8

N/A

6.2

124.2

PyroGene^TM Recombinant Factor C

20201002

200

0.5

N/A

0.19

38.4

400

0.5

N/A

0.24

47.4

600

0.5

N/A

0.35

70.0

试剂盒（test kit）	批号（sample batch number）	稀释倍数（dilution multiple）	加入内毒素浓度（addition of endotoxin concentration）/（EU · mL^-1）	供试品溶液内毒素含量（endotoxin content of test solutions）	含标准内毒素的供试品溶液中的内毒素含量（endotoxin content of test solutions containing standard endotoxin）/（EU · mL^-1）	回收率（recovery）/%
ENDONEXT	20201002	60	5	N/A	7.88	157.6
				N/A	6.97	139.5
				N/A	6.22	124.2
	20201003	60	5	N/A	6.34	126.7
				N/A	4.51	90.1
				N/A	6.86	136.8
	20201101	60	5	N/A	6.84	136.8
				N/A	4.74	94.9
				N/A	7.12	142.3
PyroGene^TM Recombinant Factor C	20201002	600	0.5	N/A	0.45	90.6
			N/A	0.35	70.0
			N/A	0.45	89.3
20201003	600	0.5	N/A	0.36	71.0
			N/A	0.32	63.6
			N/A	0.31	61.5
20201101	600	0.5	N/A	0.52	105.2
			N/A	0.33	66.7
			N/A	0.38	75.3

试剂盒
（test kit）

批号
（sample batch number）

稀释倍数
（dilution multiple）

加入内毒素浓度
（addition of endotoxin concentration）/（EU · mL^-1）

供试品溶液内毒素含量（endotoxin content of test solutions）

含标准内毒素的供试品溶液中的内毒素含量（endotoxin content of test solutions containing standard endotoxin）/（EU · mL^-1）

回收率
（recovery）/%

ENDONEXT

20201002

N/A

7.88

157.6

N/A

6.97

139.5

N/A

6.22

124.2

20201003

N/A

6.34

126.7

N/A

4.51

90.1

N/A

6.86

136.8

20201101

N/A

6.84

136.8

N/A

4.74

94.9

N/A

7.12

142.3

PyroGene^TM Recombinant Factor C

20201002

600

0.5

N/A

0.45

90.6

N/A

0.35

70.0

N/A

0.45

89.3

20201003

600

0.5

N/A

0.36

71.0

N/A

0.32

63.6

N/A

0.31

61.5

20201101

600

0.5

N/A

0.52

105.2

N/A

0.33

66.7

N/A

0.38

75.3

试剂盒（test kit）	批号（sample batch number）	稀释倍数（dilution multiple）	检测结果（test result）/（EU · mL^-1）
ENDONEXT	20201002	60	<0.05
			<0.05
			<0.05
	20201003	60	<0.05
			<0.05
			<0.05
	20201101	60	<0.05
			<0.05
			<0.05
PyroGene^TM Recombinant Factor C	20201002	600	<0.005
		<0.005
		<0.005
20201003	600	<0.005
		<0.005
		<0.005
20201101	600	<0.005
		<0.005
		<0.005

试剂盒
（test kit）

批号
（sample batch number）

稀释倍数
（dilution multiple）

检测结果
（test result）/（EU · mL^-1）

ENDONEXT

20201002

<0.05

20201003

<0.05

20201101

<0.05

PyroGene^TM Recombinant Factor C

20201002

600

<0.005

20201003

600

<0.005

20201101

600

<0.005