药物分析杂志

成分（component）	保留时间（retention time）/min	离子模式（ion mode）	MRM	锥孔电压 (cone voltage)/V	碰撞能（collision energy）/V
葛根素（puerarin）	4.18	-	415.096>267.106	30	32
槲皮素（quercetin）	5.89	+	302.954>69.019	20	45
芦丁（rutin）	5.89	+	611.332>303.352	30	20
大豆苷元（daidzein）	7.03	+	255.018>91.043	24	36
木犀草素（luteolin）	7.59	-	285.232>133.298	66	32
山柰酚（kaempferol）	8.02	-	285.1>93.025	15	35
芹菜素（apigenin）	8.19	-	269.223>117.291	36	36
芒柄花黄素（formononetin）	8.55	+	269.16>197.358	18	36
芫花素（genkwanin）	9.57	+	285.032>242.072	50	30

成分（component）	保留时间（retention time）/min	离子模式（ion mode）	MRM	锥孔电压 (cone voltage)/V	碰撞能（collision energy）/V
葛根素（puerarin）	4.18	-	415.096>267.106	30	32
槲皮素（quercetin）	5.89	+	302.954>69.019	20	45
芦丁（rutin）	5.89	+	611.332>303.352	30	20
大豆苷元（daidzein）	7.03	+	255.018>91.043	24	36
木犀草素（luteolin）	7.59	-	285.232>133.298	66	32
山柰酚（kaempferol）	8.02	-	285.1>93.025	15	35
芹菜素（apigenin）	8.19	-	269.223>117.291	36	36
芒柄花黄素（formononetin）	8.55	+	269.16>197.358	18	36
芫花素（genkwanin）	9.57	+	285.032>242.072	50	30

成分（component）	线性方程（linear equation）	r	线性范围（liner range）/（ng·mL^-1）	LOQ/（pg·mL^-1）	LOD/（pg·mL^-1）
葛根素（puerarin）	Y=8.857×10³X+43.04	0.998 0	0.11~2 240.00	10.00	3.00
槲皮素（quercetin）	Y=0.714 0×10³X-31.63	0.998 0	0.11~5 350.00	10.00	3.00
芦丁（rutin）	Y=1.052×10⁴X+0.634 6×10³	0.997 0	0.10~4 900.00	10.00	3.00
大豆苷元（daidzein）	Y=2.305×10⁴X-65.35	0.995 0	0.11~1 050.00	10.00	3.00
木犀草素（luteolin）	Y=7.035×10³X+1.111×10³	0.996 0	0.10~1 920.00	10.00	3.00
山柰酚（kaempferol）	Y=0.898 0×10³X+0.517 4×10³	0.995 0	0.10~2 020.00	10.00	3.00
芹菜素（apigenin）	Y=7.686×10³X+0.432 0×10³	0.995 0	0.11~1 140.00	10.00	3.00
芒柄花黄（formononetin）	Y=2.884×10⁴X+0.866 5×10³	0.992 0	0.09~1 880.00	9.00	3.00
芫花素（genkwanin）	Y=6.177×10⁴X+2.276×10³	0.998 0	0.10~1 020.00	10.00	3.00

成分（component）	线性方程（linear equation）	r	线性范围（liner range）/（ng·mL^-1）	LOQ/（pg·mL^-1）	LOD/（pg·mL^-1）
葛根素（puerarin）	Y=8.857×10³X+43.04	0.998 0	0.11~2 240.00	10.00	3.00
槲皮素（quercetin）	Y=0.714 0×10³X-31.63	0.998 0	0.11~5 350.00	10.00	3.00
芦丁（rutin）	Y=1.052×10⁴X+0.634 6×10³	0.997 0	0.10~4 900.00	10.00	3.00
大豆苷元（daidzein）	Y=2.305×10⁴X-65.35	0.995 0	0.11~1 050.00	10.00	3.00
木犀草素（luteolin）	Y=7.035×10³X+1.111×10³	0.996 0	0.10~1 920.00	10.00	3.00
山柰酚（kaempferol）	Y=0.898 0×10³X+0.517 4×10³	0.995 0	0.10~2 020.00	10.00	3.00
芹菜素（apigenin）	Y=7.686×10³X+0.432 0×10³	0.995 0	0.11~1 140.00	10.00	3.00
芒柄花黄（formononetin）	Y=2.884×10⁴X+0.866 5×10³	0.992 0	0.09~1 880.00	9.00	3.00
芫花素（genkwanin）	Y=6.177×10⁴X+2.276×10³	0.998 0	0.10~1 020.00	10.00	3.00

成分（component）	原始量（original amount）/(μg·mL^-1)	加入量（added amount）/(μg·mL^-1)	测得量（measured amount）/(μg·mL^-1)	回收率（recovery）/%	平均回收率（average recovery）/%	RSD/%
大豆苷元（daidzein）	17.97	18.00	34.22	90.2	92.9	2.4
	17.97	18.00	34.47	91.7
	17.97	18.00	34.50	91.8
	17.97	18.00	34.69	92.9
	17.97	18.00	35.07	95.0
	17.97	18.00	35.29	96.2
芒柄花黄素（formononetin）	1.67	1.65	3.25	96.2	99.9	5.0
	1.67	1.65	3.24	95.3
	1.67	1.65	3.27	97.2
	1.67	1.65	3.29	98.3
	1.67	1.65	3.43	106.7
	1.67	1.65	3.41	105.8
芫花素（genkwanin）	0.08	0.08	0.15	96.9	97.3	3.53
	0.08	0.08	0.16	101.5
	0.08	0.08	0.15	96.9
	0.08	0.08	0.15	92.7
	0.08	0.08	0.16	101.0
	0.08	0.08	0.15	94.8
槲皮素（quercetin）	1.34	1.30	2.79	111.4	108.9	2.0
	1.34	1.30	2.76	109.2
	1.34	1.30	2.72	105.9
	1.34	1.30	2.79	111.1
	1.34	1.30	2.74	107.4
	1.34	1.30	2.75	108.4
芦丁（rutin）	0.70	0.70	1.38	97.5	103.7	5.4
	0.70	0.70	1.42	102.9
	0.70	0.70	1.49	113.21
	0.70	0.70	1.42	103.5
	0.70	0.70	1.39	99.1
	0.70	0.70	1.44	106.2
芹菜素（apigenin）	0.98	1.05	2.15	111.1	111.8	3.3
	0.98	1.05	2.17	112.8
	0.98	1.05	2.17	113.2
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	0.98	1.05	2.09	106.0
	0.98	1.05	2.14	110.5
山柰酚（kaempferol）	0.90	0.90	1.84	104.5	104.2	2.6
	0.90	0.90	1.81	100.6
	0.90	0.90	1.88	108.9
	0.90	0.90	1.84	104.4
	0.90	0.90	1.83	102.7
	0.90	0.90	1.84	104.2
木犀草素（luteolin）	0.15	0.18	0.33	100.2	104.8	3.0
	0.15	0.18	0.34	102.3
	0.15	0.18	0.34	104.8
	0.15	0.18	0.34	105.2
	0.15	0.18	0.35	107.8
	0.15	0.18	0.35	108.3
葛根素（puerarin）	190.79	190.50	345.37	81.1	82.7	2.7
	190.79	190.50	343.89	80.4
	190.79	190.50	352.88	85.1
	190.79	190.50	346.34	81.7
	190.79	190.50	347.72	82.4
	190.79	190.50	354.31	85.83

成分（component）	原始量（original amount）/(μg·mL^-1)	加入量（added amount）/(μg·mL^-1)	测得量（measured amount）/(μg·mL^-1)	回收率（recovery）/%	平均回收率（average recovery）/%	RSD/%
大豆苷元（daidzein）	17.97	18.00	34.22	90.2	92.9	2.4
	17.97	18.00	34.47	91.7
	17.97	18.00	34.50	91.8
	17.97	18.00	34.69	92.9
	17.97	18.00	35.07	95.0
	17.97	18.00	35.29	96.2
芒柄花黄素（formononetin）	1.67	1.65	3.25	96.2	99.9	5.0
	1.67	1.65	3.24	95.3
	1.67	1.65	3.27	97.2
	1.67	1.65	3.29	98.3
	1.67	1.65	3.43	106.7
	1.67	1.65	3.41	105.8
芫花素（genkwanin）	0.08	0.08	0.15	96.9	97.3	3.53
	0.08	0.08	0.16	101.5
	0.08	0.08	0.15	96.9
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	0.08	0.08	0.15	94.8
槲皮素（quercetin）	1.34	1.30	2.79	111.4	108.9	2.0
	1.34	1.30	2.76	109.2
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	1.34	1.30	2.74	107.4
	1.34	1.30	2.75	108.4
芦丁（rutin）	0.70	0.70	1.38	97.5	103.7	5.4
	0.70	0.70	1.42	102.9
	0.70	0.70	1.49	113.21
	0.70	0.70	1.42	103.5
	0.70	0.70	1.39	99.1
	0.70	0.70	1.44	106.2
芹菜素（apigenin）	0.98	1.05	2.15	111.1	111.8	3.3
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	0.98	1.05	2.14	110.5
山柰酚（kaempferol）	0.90	0.90	1.84	104.5	104.2	2.6
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	0.90	0.90	1.84	104.2
木犀草素（luteolin）	0.15	0.18	0.33	100.2	104.8	3.0
	0.15	0.18	0.34	102.3
	0.15	0.18	0.34	104.8
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	0.15	0.18	0.35	108.3
葛根素（puerarin）	190.79	190.50	345.37	81.1	82.7	2.7
	190.79	190.50	343.89	80.4
	190.79	190.50	352.88	85.1
	190.79	190.50	346.34	81.7
	190.79	190.50	347.72	82.4
	190.79	190.50	354.31	85.83

批号（lot No.）	含量（content）/（μg·mL^-1）
20220101	14.80	1.36	0.06	1.54	0.84	0.90	0.81	0.16	167.95
20220301	15.91	1.44	0.06	1.54	0.82	0.88	0.72	0.14	194.56
20220701	8.47	0.64	0.03	2.15	1.11	0.48	0.21	0.10	225.98
20221001	8.46	0.62	0.03	2.22	1.14	0.48	0.20	0.10	227.75
20230101	17.52	1.64	0.07	1.34	0.71	0.99	0.85	0.15	189.38
20230401	17.97	1.67	0.08	1.34	0.70	0.98	0.90	0.15	190.79

批号（lot No.）	含量（content）/（μg·mL^-1）
20220101	14.80	1.36	0.06	1.54	0.84	0.90	0.81	0.16	167.95
20220301	15.91	1.44	0.06	1.54	0.82	0.88	0.72	0.14	194.56
20220701	8.47	0.64	0.03	2.15	1.11	0.48	0.21	0.10	225.98
20221001	8.46	0.62	0.03	2.22	1.14	0.48	0.20	0.10	227.75
20230101	17.52	1.64	0.07	1.34	0.71	0.99	0.85	0.15	189.38
20230401	17.97	1.67	0.08	1.34	0.70	0.98	0.90	0.15	190.79

UPLC-MS/MS同法测定熥敷颈腰痛酊中9个有效成分的含量^*

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赵继荣 ¹ , 杨文通 ¹^,^** , 李硕 ¹ , 朱宝 ² , 李喜香 ² , 冯文渊 ¹ , 裴亮 ¹

药物分析杂志 | 成分分析 2024,44(6): 952-959

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药物分析杂志 | 成分分析 2024, 44(6): 952-959

UPLC-MS/MS同法测定熥敷颈腰痛酊中9个有效成分的含量^*

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赵继荣¹, 杨文通¹^,^**, 李硕¹, 朱宝², 李喜香², 冯文渊¹, 裴亮¹

作者信息

^1.甘肃中医药大学，兰州　730030

^2.甘肃省中医院，兰州　730050

Tel： 15084981201；E-mail： zhaojr@gszy.edu.cn

通讯作者:

^** Tel：13659449464；E-mail：2239578929@qq.com

Simultaneous determination of 9 active ingredients in Tongfu Jingyaotong tincture by UPLC-MS/MS^*

Ji-rong ZHAO¹, Wen-tong YANG¹^,^**, Shuo LI¹, Bao ZHU², Xi-xiang LI², Wen-yuan FENG¹, Liang PEI¹

Affiliations

^1.Gansu University of Traditional Chinese Medicine Lanzhou 730030, China

^2.Gansu Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Lanzhou 730050, China

出版时间: 2024-06-30 doi: 10.16155/j.0254-1793.2024.06.05

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摘要

收起

目的：

建立一种同时测定熥敷颈腰痛酊中大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素、葛根素含量的超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS/MS）。

方法：

采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱，流速为0.3 mL·min^-1，柱温为45 ℃，进样量为2.0 μL；电喷雾（ESI）离子源，正、负离子模式多反应监测采集。

结果：

芹菜素、芫花素、大豆苷元在0.2~1 000 ng·mL^-1范围内线性良好，葛根素、芦丁、木犀草素、山柰酚、芒柄花黄素在0.2~2 000 ng·mL^-1范围内线性良好，槲皮素在1.0~5 000 ng·mL^-1范围内线性良好；分离度较好，精密度、重复性、重现性、稳定性试验RSD均小于5%（n=6）；平均加样回收率在82.7%~111.8%，RSD为2.0%~5.4%（n=6）。6批熥敷颈腰痛酊中大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素、葛根素的含量范围分别为8.46~17.97 μg·mL^-1、0.62~1.67 μg·mL^-1、0.03~0.08 μg·mL^-1、1.34~2.22 μg·mL^-1、0.70~1.14 μg·mL^-1、0.48~0.99 μg·mL^-1、0.20~0.90 μg·mL^-1、0.10~0.16 μg·mL^-1、167.95~227.75 μg·mL^-1。

结论：

本方法专属性强，线性范围宽，准确高效，可同时对熥敷颈腰痛酊中9个有效成分进行含量检测，为该方建立有效的质量控制方法。

关键词

熥敷颈腰痛酊 / 超高效液相色谱串联质谱法 / 液质联用 / 活性成分 / 含量测定 / 质量控制

Abstract

收起

Objective:

To establish an ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) for the simultaneous determination of daidzein, formononetin, genkwanin, quercetin, rutin, apigenin, kaempferol, luteolin and puerarin in Tongfu Jingyaotong tincture.

Methods:

The Waters ACQUITY UPLC HSS T3 Column (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) was used with methanol and 0.1% formic acid (gradient elution) as the mobile phase at a flow rate of 0.3 mL·min^-1. Column temperature was 45 ℃, and injection volume was 2.0 μL. Electrospray ion source was adopted with positive and negative ion modes and multi-reaction monitoring and acquisition.

Results:

Apigenin, genkwanin and daidzein had good linearity in the range of 0.2-1 000 ng·mL^-1, puerarin, rutin, luteolin, kaempferol and formononetin in the range of 0.2-2 000 ng·mL^-1, and quercetin in the range of 1.0-5 000 ng·mL^-1. The resolution was good, and the RSDs of precision, repeatability, reproducibility and stability test were all below 5% (n=6). The average recoveries ranged from 82.7% to 111.8% with RSDs (n=6) of 2.0%-5.4%. The contents of daidzein, formononetin, genkwanin, quercetin, rutin, apigenin, kaempferol, luteolin and puerarin in 6 batches of Tongfu Jingyaotong tincture were 8.46-17.97 μg·mL^-1, 0.62-1.67 μg·mL^-1, 0.03-0.08 μg·mL^-1, 1.34-2.22 μg·mL^-1, 0.70-1.14 μg·mL^-1, 0.48-0.99 μg·mL^-1, 0.20-0.90 μg·mL^-1, 0.10-0.16 μg·mL^-1 and 167.95-227.75 μg·mL^-1, respectively.

Conclusion:

This method has strong specificity, wide linear range, accuracy and efficiency, and can detect the contents of 9 active ingredients in Tongfu Jingyaotong tincture at the same time, which offers an effective quality control method for Tongfu Jingyaotong tincture.

Key words

Tongfu Jingyaotong tincture / ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry / LC-MS / active ingredients / Content determination / quality control

引用本文

赵继荣, 杨文通, 李硕, 朱宝, 李喜香, 冯文渊, 裴亮. UPLC-MS/MS同法测定熥敷颈腰痛酊中9个有效成分的含量^*. 药物分析杂志, 2024 , 44 (6) : 952 -959 . DOI: 10.16155/j.0254-1793.2024.06.05

Ji-rong ZHAO, Wen-tong YANG, Shuo LI, Bao ZHU, Xi-xiang LI, Wen-yuan FENG, Liang PEI. Simultaneous determination of 9 active ingredients in Tongfu Jingyaotong tincture by UPLC-MS/MS^*[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2024 , 44 (6) : 952 -959 . DOI: 10.16155/j.0254-1793.2024.06.05

正文

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熥敷颈腰痛酊是甘肃省名中医赵继荣教授的经验效方，是由伸筋草、透骨草、威灵仙、葛根等8味药物经酊剂之浸渍法制备而成的外用制剂，方中伸筋草、透骨草为君药，以舒筋通络、活血止痛，两药相须为用增强彼此疗效；威灵仙、木瓜、桂枝、葛根共为臣药，威灵仙和木瓜祛风湿、通经络，桂枝温经通络、散寒止痛，葛根解肌舒筋止痛，桂枝与葛根相配伍，表里同治、寒温相合，温通筋脉，解肌养筋；红花、鸡血藤为佐药，补血活血、通络止痛。以上诸药合用，共奏温经通络、舒筋活血、散寒止痛的之功效^[1]。

既往研究表明，伸筋草乙醇、正丁醇、三氯甲烷提取物抗炎镇痛作用良好，可降低佐剂性关节炎大鼠血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)的水平^[2]。申鸽等^[3]的动物实验研究发现，珍珠透骨草醇提取物通过多组分、多靶点联合发挥抗炎活性。威灵仙中槲皮素、山柰酚、芦丁等多种化合物具有抗炎、抗氧化、镇痛的药物作用^[4]。葛根中的葛根素、大豆苷元对神经组织损害和炎症导致的神经性疼痛具有缓解作用，抑制IL-1、IL-6和TNF-α的表达，减轻大鼠背根神经节引起的机械痛觉敏化^[5]。桂枝醇提物具有较好的抗炎活性，木瓜中芦丁、槲皮素、山柰酚通过抑制Akt/NF-κB信号通路激活及促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α生成发挥抗炎镇痛活性^[6-7]。鸡血藤中的儿茶素、芒柄花黄素具有抗炎、保护血管、改善血液流速的药理作用，红花中的山柰酚、芫花素、姜黄素等通过抑制一氧化氮（NO）的释放而起到抗炎活性^[8-9]。综上可知，熥敷颈腰痛酊药物组成中所含共有化合物槲皮素、山柰酚、芒柄花黄素、芦丁等具有广泛的抗炎、镇痛、抗氧化、保护血管、抑制神经病理性疼痛的作用，其机制可能是多药物、多途径、多靶点共同起效，因此值得进一步研究。2020年版《中华人民共和国药典》中关于伸筋草、透骨草等中药的质量控制仅限于高效液相色谱法，但该法的专属性及灵敏性不及液质联用技术^[10-11]。本课题组前期研究表明，“熥敷系列”中成药能够改善腰椎间盘突出症患者腰腿疼痛症状，降低炎性指标水平，提高生活质量，其功效为活血化瘀、温通经络、抗炎镇痛，但对其有效成分和作用机制尚未研究^[12-14]。故此，本研究采用UPLC-MS/MS同时测定熥敷颈腰痛酊中9个化学成分的含量，旨在为该制剂的质量控制提供方法学参考，为中药酊剂的开发研究提供借鉴。

1　材料

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1.1　仪器

ACQUITY UPLC I-Class超高液相色谱仪、XEVO TQ-XS串联四极杆质谱系统、Masslynx质谱数据采集软件（Waters公司），Mikro 220R台式高速冷冻离心机（Hettich科学仪器公司），Vortex 2涡旋混匀仪（IKA集团），ME55/155DU十万分之一电子分析天平（METTLER TOLEDO科技有限公司），KQ3200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2　试剂及试药

对照品大豆苷元（含量99.99%，批号MUST-22101117）、芒柄花黄素（含量99.03%，批号MUST-23033005）、芫花素（含量98.80%，批号MUST-23061014）、槲皮素（含量98.85%，批号MUST-23042008）、芹菜素（含量98.12%，批号MUST-22120111）、山柰酚（含量99.99%，批号MUST-23030915）购于成都曼思特生物科技有限公司；对照品芦丁（含量≥98%，批号MUST-22039021）、木犀草素（含量≥98%，批号MUST-23010018）、葛根素（含量≥98%，批号MUST-22110405）购于中国食品药品检定研究院；色谱级甲酸和甲醇购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司，超纯水（杭州娃哈哈集团有限公司）；熥敷颈腰痛酊样品（甘肃省中医院药学部，批号20220101、20220301、20220701、20221001、20230101、20230401）。

2　方法与结果

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2.1　色谱条件

采用Waters ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱系统，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以0.1%甲酸水溶液为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱（0~1 min，80% A；1~11 min，80% A→0% A；11~15 min，0% A；15~15.1 min，0% A→80% A；15.1~17 min，80% A），流速为0.3 mL·min^-1，柱温为45 ℃，进样量为2.0 μL。

2.2　质谱条件

采用Waters XEVO TQ XS串联四极杆质谱系统，电喷雾离子源，正、负离子模式多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）采集，正离子离子源电压为3.0 kV，负离子离子源电压为2.0 kV，去溶剂温度为550 ℃，去溶剂气体流速为1 000 L·h^-1，锥孔气体流速为150 L·h^-1。各成分的质谱采集参数见表1。

2.3　溶液的制备

2.3.1　对照品溶液

精密称取大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素、葛根素的对照品各10 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇-水（1∶1）5 mL充分溶解，定容至10 mL，制成质量浓度分别为1.12、1.07、0.98、1.05、0.96、1.01、1.14、0.94、1.02 mg·mL^-1的对照品储备液。取上述对照品储备液各1 mL，置于同一20 mL量瓶中，加50%的甲醇水溶液稀释至刻度，摇匀，得到大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素、葛根素的质量浓度分别为56.00、53.50、49.00、52.50、48.00、50.50、57.00、47.00、51.00 μg·mL^-1的对照品溶液。

2.3.2　供试品溶液

精密量取100 μL样品，置于1.5 mL离心管中，加入甲醇-水（1∶1）900 μL，涡旋混匀10 min后，在4 ℃、12 000 r·min^-1离心10 min。再用移液枪移取100 μL上清，置于1.5 mL离心管中，加入甲醇-水（1∶1）700 μL，涡旋混匀10 min后，在4 ℃、12 000 r·min^-1离心10 min。取上清液200 μL，置于带250 μL内插管的进样瓶中，进行质谱检测。

2.4　方法学考察

2.4.1　专属性

精密吸取“2.3.1”项下配制的对照品溶液和“2.3.2”项下制备的供试品溶液、50%甲醇水溶液分别进样，色谱图见图1，各成分均未检测到干扰性成分，表明该方法专属性良好。

2.4.2　线性关系考察

精密吸取“2.3.1”项下配制的对照品溶液，逐级稀释，以S/N=10时被测定成分的浓度为定量限(LOQ)，S/N=3时被测定成分的浓度为检测限(LOD)。依次进样，以各成分的质量浓度X为横坐标、峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，结果见表2，各成分的线性关系良好。

2.4.3　精密度试验

精密吸取“2.3.1”项下配制的中浓度（100 ng·mL^-1）的对照品溶液，连续进样6次，测得大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素和葛根素峰面积的RSD分别是0.63%、0.40%、1.2%、1.4%、1.3%、1.3%、13%、0.66%、0.59%，RSD均小于2%，表明该方法具有良好的精密度。

2.4.4　重复性试验

取同一批号（20220101）样品6份，按“2.3.2”项方法配制供试品溶液，依次进样，计算得大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素和葛根素的平均含量分别为15.32、1.48、0.06、1.52、0.78、0.80、0.66、0.14、196.79 μg·mL^-1，各成分RSD分别为0.51%、1.4%、3.6%、4.0%、1.9%、2.1%、3.1%、1.6%、0.77%，RSD均小于5%，表明该方法具有良好的重复性。

2.4.5　稳定性试验

取同一批号（20220101）样品6份，按“2.3.2”项方法制备供试品溶液，等分为6份，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h后测定，记录峰面积，计算得大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素和葛根素峰面积的RSD分别为0.42%、0.76%、2.2%、4.3%、1.7%、1.8%、1.0%、1.2%、0.92%，RSD均小于5%，表明供试品溶液于室温下放置24 h内保持稳定。

2.4.6　加样回收率试验

精密量取已知目标成分含量的熥敷颈腰痛酊样品溶液6份，按照目标成分约100%的含量精密加入相应质量的对照品溶液，按照“2.3.2”项方法制备供试品溶液并进行测定，记录峰面积。计算加样回收率及RSD，结果见表3，平均回收率范围为82.7%~111.8%，RSD<6%，表明该方法准确。

2.5　样品含量测定

取6批样品，分别按“2.3.2”项方法制备供试品溶液并进行测定，记录峰面积，计算各成分含量，结果见表4。

3　讨论

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3.1　检测技术的选择

HPLC法是药物制剂成分测定的常用方法，但对于多组分的制剂检测，同时检测的难度较大，需要使用DAD二极管阵列检测器筛选各自合适的检测波长，早年质谱前端连接的都是HPLC，但近些年发现UPLC有更好的分离效果，更适合作为质谱前端的分离设备^[15]。预试验阶段曾尝试以HPLC法对熥敷颈腰痛酊进行定量分析，结果发现复方中各成分含量差异较大，究其原因为HPLC法无法达到同法检测，因此采用分离能力高、选择能力强、灵敏度精准的UPLC-MS/MS技术进行筛选、检测^[16]。

3.2　提取方法的选择

实验过程中将熥敷颈腰痛酊样品分别稀释10、50、80、100和150倍后上机检测，最后发现80倍浓度时所有待测成分都能够在各自的线性范围内显示，所以对熥敷颈腰痛酊样品的提取方法规定为以50%的甲醇水溶液稀释至80倍浓度。

3.3　检测参数的设置

测试过程中对流动相梯度进行了优化，结果表明梯度条件甲醇从20%升高到100%的时间越长，各色谱峰的分离会越好，但是槲皮素和芦丁2个成分在各种时间的梯度洗脱下都难使其保留时间分离，由于使用的是质谱检测，保留时间虽然区分不开，但是2个成分的检测离子对不同：槲皮素是302.954>69.019，芦丁是611.332>303.352，2个成分的提取离子流图不互相干扰，因此2个成分的含量测定不受影响。检测结果中，样品批号20220101和20220301结果较为相似，批号20220701和20221001结果较为相似，20230101和20230401结果较为相似，这可能与熥敷颈腰痛酊中各中药原料原产地、采收季节和炮制工艺的差异有关。

3.4　小结

本研究建立的同时测定熥敷颈腰痛酊中9个成分大豆苷元、芒柄花黄素、芫花素、槲皮素、芦丁、芹菜素、山柰酚、木犀草素、葛根素的UPLC-MS/MS方法，具备简单易操作，准确效率高，专属性强，精密度重复性好，可作为熥敷颈腰痛酊质量评价参考。

基金

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^*甘肃省中医药项目(GZKZ-2020-3)
甘肃省中医药产业精准对接就业创业人才科学化基地(3016170106)

参考文献

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文献

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2024年第44卷第6期

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doi: 10.16155/j.0254-1793.2024.06.05

接收时间：2023-10-27
首发时间：2026-03-13
出版时间：2024-06-30

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收稿日期：2023-10-27

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^*甘肃省中医药项目(GZKZ-2020-3)

甘肃省中医药产业精准对接就业创业人才科学化基地(3016170106)

作者信息

^1.甘肃中医药大学，兰州　730030

^2.甘肃省中医院，兰州　730050

通讯作者:

^** Tel：13659449464；E-mail：2239578929@qq.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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成分（component）	保留时间（retention time）/min	离子模式（ion mode）	MRM	锥孔电压 (cone voltage)/V	碰撞能（collision energy）/V
葛根素（puerarin）	4.18	-	415.096>267.106	30	32
槲皮素（quercetin）	5.89	+	302.954>69.019	20	45
芦丁（rutin）	5.89	+	611.332>303.352	30	20
大豆苷元（daidzein）	7.03	+	255.018>91.043	24	36
木犀草素（luteolin）	7.59	-	285.232>133.298	66	32
山柰酚（kaempferol）	8.02	-	285.1>93.025	15	35
芹菜素（apigenin）	8.19	-	269.223>117.291	36	36
芒柄花黄素（formononetin）	8.55	+	269.16>197.358	18	36
芫花素（genkwanin）	9.57	+	285.032>242.072	50	30

成分
（component）

保留时间
（retention time）/min

离子模式
（ion mode）

MRM

锥孔电压
(cone voltage)/V

碰撞能
（collision energy）/V

葛根素（puerarin）

4.18

415.096>267.106

槲皮素（quercetin）

5.89

302.954>69.019

芦丁（rutin）

5.89

611.332>303.352

大豆苷元（daidzein）

7.03

255.018>91.043

木犀草素（luteolin）

7.59

285.232>133.298

山柰酚（kaempferol）

8.02

285.1>93.025

芹菜素（apigenin）

8.19

269.223>117.291

芒柄花黄素（formononetin）

8.55

269.16>197.358

芫花素（genkwanin）

9.57

285.032>242.072

成分（component）	线性方程（linear equation）	r	线性范围（liner range）/（ng·mL^-1）	LOQ/（pg·mL^-1）	LOD/（pg·mL^-1）
葛根素（puerarin）	Y=8.857×10³X+43.04	0.998 0	0.11~2 240.00	10.00	3.00
槲皮素（quercetin）	Y=0.714 0×10³X-31.63	0.998 0	0.11~5 350.00	10.00	3.00
芦丁（rutin）	Y=1.052×10⁴X+0.634 6×10³	0.997 0	0.10~4 900.00	10.00	3.00
大豆苷元（daidzein）	Y=2.305×10⁴X-65.35	0.995 0	0.11~1 050.00	10.00	3.00
木犀草素（luteolin）	Y=7.035×10³X+1.111×10³	0.996 0	0.10~1 920.00	10.00	3.00
山柰酚（kaempferol）	Y=0.898 0×10³X+0.517 4×10³	0.995 0	0.10~2 020.00	10.00	3.00
芹菜素（apigenin）	Y=7.686×10³X+0.432 0×10³	0.995 0	0.11~1 140.00	10.00	3.00
芒柄花黄（formononetin）	Y=2.884×10⁴X+0.866 5×10³	0.992 0	0.09~1 880.00	9.00	3.00
芫花素（genkwanin）	Y=6.177×10⁴X+2.276×10³	0.998 0	0.10~1 020.00	10.00	3.00

成分
（component）

线性方程
（linear equation）

线性范围
（liner range）/（ng·mL^-1）

LOQ/（pg·mL^-1）

LOD/（pg·mL^-1）

葛根素（puerarin）

Y=8.857×10³X+43.04

0.998 0

0.11~2 240.00

10.00

3.00

槲皮素（quercetin）

Y=0.714 0×10³X-31.63

0.998 0

0.11~5 350.00

10.00

3.00

芦丁（rutin）

Y=1.052×10⁴X+0.634 6×10³

0.997 0

0.10~4 900.00

10.00

3.00

大豆苷元（daidzein）

Y=2.305×10⁴X-65.35

0.995 0

0.11~1 050.00

10.00

3.00

木犀草素（luteolin）

Y=7.035×10³X+1.111×10³

0.996 0

0.10~1 920.00

10.00

3.00

山柰酚（kaempferol）

Y=0.898 0×10³X+0.517 4×10³

0.995 0

0.10~2 020.00

10.00

3.00

芹菜素（apigenin）

Y=7.686×10³X+0.432 0×10³

0.995 0

0.11~1 140.00

10.00

3.00

芒柄花黄（formononetin）

Y=2.884×10⁴X+0.866 5×10³

0.992 0

0.09~1 880.00

9.00

3.00

芫花素（genkwanin）

Y=6.177×10⁴X+2.276×10³

0.998 0

0.10~1 020.00

10.00

3.00

成分（component）	原始量（original amount）/(μg·mL^-1)	加入量（added amount）/(μg·mL^-1)	测得量（measured amount）/(μg·mL^-1)	回收率（recovery）/%	平均回收率（average recovery）/%	RSD/%
大豆苷元（daidzein）	17.97	18.00	34.22	90.2	92.9	2.4
	17.97	18.00	34.47	91.7
	17.97	18.00	34.50	91.8
	17.97	18.00	34.69	92.9
	17.97	18.00	35.07	95.0
	17.97	18.00	35.29	96.2
芒柄花黄素（formononetin）	1.67	1.65	3.25	96.2	99.9	5.0
	1.67	1.65	3.24	95.3
	1.67	1.65	3.27	97.2
	1.67	1.65	3.29	98.3
	1.67	1.65	3.43	106.7
	1.67	1.65	3.41	105.8
芫花素（genkwanin）	0.08	0.08	0.15	96.9	97.3	3.53
	0.08	0.08	0.16	101.5
	0.08	0.08	0.15	96.9
	0.08	0.08	0.15	92.7
	0.08	0.08	0.16	101.0
	0.08	0.08	0.15	94.8
槲皮素（quercetin）	1.34	1.30	2.79	111.4	108.9	2.0
	1.34	1.30	2.76	109.2
	1.34	1.30	2.72	105.9
	1.34	1.30	2.79	111.1
	1.34	1.30	2.74	107.4
	1.34	1.30	2.75	108.4
芦丁（rutin）	0.70	0.70	1.38	97.5	103.7	5.4
	0.70	0.70	1.42	102.9
	0.70	0.70	1.49	113.21
	0.70	0.70	1.42	103.5
	0.70	0.70	1.39	99.1
	0.70	0.70	1.44	106.2
芹菜素（apigenin）	0.98	1.05	2.15	111.1	111.8	3.3
	0.98	1.05	2.17	112.8
	0.98	1.05	2.17	113.2
	0.98	1.05	2.21	117.0
	0.98	1.05	2.09	106.0
	0.98	1.05	2.14	110.5
山柰酚（kaempferol）	0.90	0.90	1.84	104.5	104.2	2.6
	0.90	0.90	1.81	100.6
	0.90	0.90	1.88	108.9
	0.90	0.90	1.84	104.4
	0.90	0.90	1.83	102.7
	0.90	0.90	1.84	104.2
木犀草素（luteolin）	0.15	0.18	0.33	100.2	104.8	3.0
	0.15	0.18	0.34	102.3
	0.15	0.18	0.34	104.8
	0.15	0.18	0.34	105.2
	0.15	0.18	0.35	107.8
	0.15	0.18	0.35	108.3
葛根素（puerarin）	190.79	190.50	345.37	81.1	82.7	2.7
	190.79	190.50	343.89	80.4
	190.79	190.50	352.88	85.1
	190.79	190.50	346.34	81.7
	190.79	190.50	347.72	82.4
	190.79	190.50	354.31	85.83

成分
（component）

原始量
（original amount）/(μg·mL^-1)

加入量
（added amount）/(μg·mL^-1)

测得量
（measured amount）/(μg·mL^-1)

回收率
（recovery）/%

平均回收率
（average recovery）/%

RSD/%

大豆苷元（daidzein）

17.97

18.00

34.22

90.2

92.9

2.4

17.97

18.00

34.47

91.7

17.97

18.00

34.50

91.8

17.97

18.00

34.69

92.9

17.97

18.00

35.07

95.0

17.97

18.00

35.29

96.2

芒柄花黄素（formononetin）

1.67

1.65

3.25

96.2

99.9

5.0

1.67

1.65

3.24

95.3

1.67

1.65

3.27

97.2

1.67

1.65

3.29

98.3

1.67

1.65

3.43

106.7

1.67

1.65

3.41

105.8

芫花素（genkwanin）

0.08

0.15

96.9

97.3

3.53

0.08

0.16

101.5

0.08

0.15

96.9

0.08

0.15

92.7

0.08

0.16

101.0

0.08

0.15

94.8

槲皮素（quercetin）

1.34

1.30

2.79

111.4

108.9

2.0

1.34

1.30

2.76

109.2

1.34

1.30

2.72

105.9

1.34

1.30

2.79

111.1

1.34

1.30

2.74

107.4

1.34

1.30

2.75

108.4

芦丁（rutin）

0.70

1.38

97.5

103.7

5.4

0.70

1.42

102.9

0.70

1.49

113.21

0.70

1.42

103.5

0.70

1.39

99.1

0.70

1.44

106.2

芹菜素（apigenin）

0.98

1.05

2.15

111.1

111.8

3.3

0.98

1.05

2.17

112.8

0.98

1.05

2.17

113.2

0.98

1.05

2.21

117.0

0.98

1.05

2.09

106.0

0.98

1.05

2.14

110.5

山柰酚（kaempferol）

0.90

1.84

104.5

104.2

2.6

0.90

1.81

100.6

0.90

1.88

108.9

0.90

1.84

104.4

0.90

1.83

102.7

0.90

1.84

104.2

木犀草素（luteolin）

0.15

0.18

0.33

100.2

104.8

3.0

0.15

0.18

0.34

102.3

0.15

0.18

0.34

104.8

0.15

0.18

0.34

105.2

0.15

0.18

0.35

107.8

0.15

0.18

0.35

108.3

葛根素（puerarin）

190.79

190.50

345.37

81.1

82.7

2.7

190.79

190.50

343.89

80.4

190.79

190.50

352.88

85.1

190.79

190.50

346.34

81.7

190.79

190.50

347.72

82.4

190.79

190.50

354.31

85.83

批号（lot No.）	含量（content）/（μg·mL^-1）
20220101	14.80	1.36	0.06	1.54	0.84	0.90	0.81	0.16	167.95
20220301	15.91	1.44	0.06	1.54	0.82	0.88	0.72	0.14	194.56
20220701	8.47	0.64	0.03	2.15	1.11	0.48	0.21	0.10	225.98
20221001	8.46	0.62	0.03	2.22	1.14	0.48	0.20	0.10	227.75
20230101	17.52	1.64	0.07	1.34	0.71	0.99	0.85	0.15	189.38
20230401	17.97	1.67	0.08	1.34	0.70	0.98	0.90	0.15	190.79

批号
（lot No.）

含量（content）/（μg·mL^-1）

大豆苷元
（daidzein）

芒柄花黄素
（formononetin）

芫花素
（genkwanin）

槲皮素
（quercetin）

芦丁
（rutin）

芹菜素
（apigenin）

山柰酚
（kaempferol）

木犀草素
（luteolin）

葛根素
（puerarin）

20220101

14.80

1.36

0.06

1.54

0.84

0.90

0.81

0.16

167.95

20220301

15.91

1.44

0.06

1.54

0.82

0.88

0.72

0.14

194.56

20220701

8.47

0.64

0.03

2.15

1.11

0.48

0.21

0.10

225.98

20221001

8.46

0.62

0.03

2.22

1.14

0.48

0.20

0.10

227.75

20230101

17.52

1.64

0.07

1.34

0.71

0.99

0.85

0.15

189.38

20230401

17.97

1.67

0.08

1.34

0.70

0.98

0.90

0.15

190.79