药物分析杂志

编号 (No.)	肽段序列 (sequence of peptides)	Peptideranker分数 (Peptideranker score)	BBPpred分数 (BBPpred score)	ToxIBTL分数 (ToxIBTL score)
1	FDHFDFDAF	0.928 378	0.776 434	2.11E-37
2	EHYAWGIK	0.505 231	0.656 983	5.13E-05
3	TDYPPLGRFAVR	0.595 257	0.520 742	1.66E-17
4	TGPNLHGLFGR	0.715 478	0.527 883	4.01E-17
5	DPDWIIQGL	0.874 649	0.555 630	1.07E-07
6	GYPFDRPIDMA	0.770 226	0.556 179	8.52E-16
7	KYENDVLFF	0.593 086	0.881 704	3.40E-08
8	AGAGAGSGAGAGY	0.518 538	0.601 538	7.25E-35
9	AGAGYGAGAGGY	0.547 863	0.776 981	1.93E-21
10	VIVSPVRTGML	0.513 123	0.645 221	2.53E-24
11	AGAGAGAGAGYG	0.574 380	0.592 948	1.30E-29
12	SSDASVARLF	0.630 919	0.519 144	1.24E-15
13	DMPEPVGPIAIL	0.532 587	0.543 729	4.96E-24
14	AGAGAGAGYGAGAGAGYGAGY	0.853 083	0.740 499	4.32E-30
15	AGAGAGSGAGAGSGAGAGY	0.686 617	0.569 124	3.62E-24
16	AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	0.709 182	0.594 214	5.51E-28
17	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	0.702 189	0.577 591	1.75E-36
18	AGSGAGAGSGAGAGSGAGY	0.648 656	0.561 638	1.24E-24
19	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGY	0.675 282	0.589 259	5.02E-18

编号 (No.)	肽段序列 (sequence of peptides)	Peptideranker分数 (Peptideranker score)	BBPpred分数 (BBPpred score)	ToxIBTL分数 (ToxIBTL score)
1	FDHFDFDAF	0.928 378	0.776 434	2.11E-37
2	EHYAWGIK	0.505 231	0.656 983	5.13E-05
3	TDYPPLGRFAVR	0.595 257	0.520 742	1.66E-17
4	TGPNLHGLFGR	0.715 478	0.527 883	4.01E-17
5	DPDWIIQGL	0.874 649	0.555 630	1.07E-07
6	GYPFDRPIDMA	0.770 226	0.556 179	8.52E-16
7	KYENDVLFF	0.593 086	0.881 704	3.40E-08
8	AGAGAGSGAGAGY	0.518 538	0.601 538	7.25E-35
9	AGAGYGAGAGGY	0.547 863	0.776 981	1.93E-21
10	VIVSPVRTGML	0.513 123	0.645 221	2.53E-24
11	AGAGAGAGAGYG	0.574 380	0.592 948	1.30E-29
12	SSDASVARLF	0.630 919	0.519 144	1.24E-15
13	DMPEPVGPIAIL	0.532 587	0.543 729	4.96E-24
14	AGAGAGAGYGAGAGAGYGAGY	0.853 083	0.740 499	4.32E-30
15	AGAGAGSGAGAGSGAGAGY	0.686 617	0.569 124	3.62E-24
16	AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	0.709 182	0.594 214	5.51E-28
17	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	0.702 189	0.577 591	1.75E-36
18	AGSGAGAGSGAGAGSGAGY	0.648 656	0.561 638	1.24E-24
19	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGY	0.675 282	0.589 259	5.02E-18

编号 (No.)	肽段或对照药物 (peptides or control drug)	HADDOCK分数 (HADDOCK score)
1	FDHFDFDAF	-189.0 +/-1.2
2	EHYAWGIK	-164.1 +/-12.4
3	TDYPPLGRFAVR	-162.4 +/-5.9
4	TGPNLHGLFGR	-137.9 +/-4.7
5	DPDWIIQGL	-131.0 +/-2.6
6	GYPFDRPIDMA	-130.3 +/-7.4
7	KYENDVLFF	-128.5 +/-11.9
8	AGAGAGSGAGAGY	-112.7 +/-3.0
11	AGAGAGAGAGYG	-101.6 +/-5.3
12	SSDASVARLF	-96.9 +/-11.9
13	DMPEPVGPIAIL	-91.9 +/-7.7
14	AGAGAGAGYGAGAGAGYGAGY	-90.8 +/-9.3
15	AGAGAGSGAGAGSGAGAGY	-88.9 +/-8.0
16	AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	-88.2 +/-4.2
17	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	-86.9 +/-4.7
18	AGSGAGAGSGAGAGSGAGY	-85.7 +/-2.5
19	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGY	-79.2 +/-5.4
20	噻加宾（Tiagabine）	-43.7 +/-0.8

编号 (No.)	肽段或对照药物 (peptides or control drug)	HADDOCK分数 (HADDOCK score)
1	FDHFDFDAF	-189.0 +/-1.2
2	EHYAWGIK	-164.1 +/-12.4
3	TDYPPLGRFAVR	-162.4 +/-5.9
4	TGPNLHGLFGR	-137.9 +/-4.7
5	DPDWIIQGL	-131.0 +/-2.6
6	GYPFDRPIDMA	-130.3 +/-7.4
7	KYENDVLFF	-128.5 +/-11.9
8	AGAGAGSGAGAGY	-112.7 +/-3.0
11	AGAGAGAGAGYG	-101.6 +/-5.3
12	SSDASVARLF	-96.9 +/-11.9
13	DMPEPVGPIAIL	-91.9 +/-7.7
14	AGAGAGAGYGAGAGAGYGAGY	-90.8 +/-9.3
15	AGAGAGSGAGAGSGAGAGY	-88.9 +/-8.0
16	AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	-88.2 +/-4.2
17	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	-86.9 +/-4.7
18	AGSGAGAGSGAGAGSGAGY	-85.7 +/-2.5
19	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGY	-79.2 +/-5.4
20	噻加宾（Tiagabine）	-43.7 +/-0.8

复合物 (complexes)	氢键相互作用 (hydrogen bond interaction)	疏水相互作用 (hydrophobic interaction)	静电相互作用 (electrostatic interaction)	其他 (others)
GAT-1+噻加宾（Tiagabine）	LEU 64，GLY 65，TYR 140，SER 295	LEU 306，CYS 399		CYS 399
GAT-1+FDHFDFDAF	ARG 69，THR 236，GLN 291，PHE 294，SER 295^*，SER 302，ASN 327，SER 396，ALA 455	ILE 62，PHE 70，TYR 86，PHE 294，LEU 306^，MET 332，ASP 395，CYS 399^	ARG 69	GLY 63
GAT-1+EHYAWGIK	ALA 61，LEU64^，GLY 65^，TRP 68，AGR 69，TYR 139，PHE 294，SER 295^*，SER 302，TYR 309，PHE 365，THR 400，GLY 403，ASP 451	ILE 62，TYR 139，ILE 143，PHE 294，LEU 306^*，LEU 389	ARG 69，PHE 365	GLY 63

复合物 (complexes)	氢键相互作用 (hydrogen bond interaction)	疏水相互作用 (hydrophobic interaction)	静电相互作用 (electrostatic interaction)	其他 (others)
GAT-1+噻加宾（Tiagabine）	LEU 64，GLY 65，TYR 140，SER 295	LEU 306，CYS 399		CYS 399
GAT-1+FDHFDFDAF	ARG 69，THR 236，GLN 291，PHE 294，SER 295^*，SER 302，ASN 327，SER 396，ALA 455	ILE 62，PHE 70，TYR 86，PHE 294，LEU 306^，MET 332，ASP 395，CYS 399^	ARG 69	GLY 63
GAT-1+EHYAWGIK	ALA 61，LEU64^，GLY 65^，TRP 68，AGR 69，TYR 139，PHE 294，SER 295^*，SER 302，TYR 309，PHE 365，THR 400，GLY 403，ASP 451	ILE 62，TYR 139，ILE 143，PHE 294，LEU 306^*，LEU 389	ARG 69，PHE 365	GLY 63

蛋白残基 (protein residue)	RMSF/Å
GLY 59	1.17	1.22	1.45	1.20
TYR 60	1.59	1.60	2.35	1.72
ALA 61	1.22	0.88	1.34	1.05
GLY 63	0.78	0.67	0.82	1.36
LEU 64	0.86	0.78	0.89	2.00
GLY 65	0.94	0.80	0.83	1.50
ASN 66	1.06	1.04	1.04	1.41
TYR 140	0.97	1.14	1.02	1.15
SER 295	0.91	0.68	1.46	1.19
SER 302	1.25	1.55	2.49	1.44
LEU 303	1.25	1.50	2.73	1.51
LEU 306	1.28	1.37	2.54	1.73
ASP 395	1.15	1.06	1.17	1.81
SER 396	0.94	0.96	0.87	1.32
CYS 399	1.16	0.87	1.03	1.48
THR 400	1.07	0.90	0.89	1.27

蛋白残基 (protein residue)	RMSF/Å
GLY 59	1.17	1.22	1.45	1.20
TYR 60	1.59	1.60	2.35	1.72
ALA 61	1.22	0.88	1.34	1.05
GLY 63	0.78	0.67	0.82	1.36
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GLY 65	0.94	0.80	0.83	1.50
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SER 295	0.91	0.68	1.46	1.19
SER 302	1.25	1.55	2.49	1.44
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SER 396	0.94	0.96	0.87	1.32
CYS 399	1.16	0.87	1.03	1.48
THR 400	1.07	0.90	0.89	1.27

麸炒僵蚕汤剂的多肽成分表征及抗GAT-1活性肽的虚拟筛选^*

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黄雅阳 ¹ , 刘亚雄 ²^,^** , 萧晓彤 ¹ , 罗卓雅 ²^,^** , 杨志业 ²

药物分析杂志 | 生物检定 2024,44(8): 1356-1364

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药物分析杂志 | 生物检定 2024, 44(8): 1356-1364

麸炒僵蚕汤剂的多肽成分表征及抗GAT-1活性肽的虚拟筛选^*

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黄雅阳¹, 刘亚雄²^,^**, 萧晓彤¹, 罗卓雅²^,^**, 杨志业²

作者信息

^1.广州医科大学药学院，广州 511436

^2.广东省药品检验所国家药品监督管理局药品快速检验技术重点实验室广东省生物医药科技协同创新中心，广州 510663

Tel：17722886248；E-mail：huang_ya_yang@163.com

通讯作者:

^** 刘亚雄　Tel：(020)32447981；E-mail：liuyaxiong@gdidc.org.cn

罗卓雅　Tel：(020)32447981；E-mail：lzyGDIDC@163.com

Characterization of peptide components of bran-fried Bombyx batryticatus decoction and virtual screening of anti-GAT-1 active peptides

Ya-yang HUANG¹, Ya-xiong LIU²^,^**, Xiao-tong XIAO¹, Zhuo-ya LUO²^,^**, Zhi-ye YANG²

Affiliations

^1.School of Pharmaceutical Sciences，Guangzhou Medical University，Guangzhou 511436，China

^2.Guangdong Institute for Drug Control，NMPA Key Laboratory of Rapid Drug Inspection Technology，Guangdong Biomedical Technology Collaborative Innovation Center，Guangzhou 510663，China

出版时间: 2024-08-31 doi: 10.16155/j.0254-1793.2024-0169

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摘要

收起

目的：

分析麸炒僵蚕汤剂的多肽组成，并虚拟筛选具有GAT-1结合活性的抗癫痫多肽。

方法：

利用基于微升流速液相色谱-质谱联用（μLC-MS/MS）的多肽组学技术，对麸炒僵蚕汤剂的多肽成分进行广泛鉴定，通过生物信息学和计算机模拟虚拟筛选潜在的抗癫痫活性肽，包括生物活性预测、血脑屏障通透性预测、毒性预测和分子对接，最后，利用分子动力学模拟分析多肽和靶蛋白的相互作用。

结果：

从麸炒僵蚕汤剂中共鉴定得到384条多肽，从中虚拟筛选出19条结合亲和力高于对照药物的潜在抗癫痫活性多肽，其中，多肽FDHFDFDAF的结合亲和力最高，其次是EHYAWGIK，2条多肽主要通过氢键、疏水和静电相互作用与GAT-1结合，分子动力学模拟研究验证了FDHFDFDAF和EHYAWGIK与GAT-1的结合稳定性。

结论：

基于多肽组学和计算机虚拟筛选技术有利于快速发现动物药的活性多肽成分，本研究对麸炒僵蚕汤剂抗癫痫活性多肽的研究有着重要参考价值，同时为动物药多肽成分研究提供新思路。

关键词

微升流速液相色谱-质谱联用 / 麸炒僵蚕 / GAT-1 / 癫痫 / 活性肽 / 多肽组学 / 虚拟筛选

Abstract

收起

Objective:

To analyze the peptide components of bran-fried Bombyx batryticatus decoction and virtually screen anti-epileptic peptides with GAT-1 binding activity.

Methods:

The peptide compounds in bran-fried Bombyx batryticatus decoction were extensively identified by micro-flow liquid chromatography-tandem mass spectrometry（μLC-MS/MS） technology. Potential anti-epileptic peptides were screened through bioinformatics and in silico simulations，including bioactivity prediction，blood-brain barrier permeability prediction，toxicity prediction，and molecular docking. Finally，molecular dynamics simulations were employed to analyze the interactions between peptides and the target protein.

Results:

A total of 384 peptides were identified from bran-fried Bombyx batryticatus decoction，and 19 peptides with higher binding affinities to GAT-1 than that of the control drug were screened as potential anti-epileptic peptides. The FDHFDFDAF exhibited the highest binding affinity，followed by the EHYAWGIK. Two peptides primarily interacted with GAT-1 through hydrogen bonds，hydrophobic，and electrostatic interactions. Molecular dynamics simulations confirmed the binding stability of FDHFDFDAF and EHYAWGIK to GAT-1.

Conclusion:

Peptidomics and in silico virtual screening techniques facilitate the rapid discovery of active peptide components in animal-derived traditional Chinese medicine. This study has significant reference value for researching anti-epileptic peptides in bran-fried Bombyx batryticatus decoction，and provides new insights for the study of peptide components in animal-derived traditional Chinese medicine.

Key words

μLC-MS/MS / bran-fried Bombyx batryticatus / GAT-1 / epilepsy / active peptide / peptidomics / virtual screening

引用本文

黄雅阳, 刘亚雄, 萧晓彤, 罗卓雅, 杨志业. 麸炒僵蚕汤剂的多肽成分表征及抗GAT-1活性肽的虚拟筛选^*. 药物分析杂志, 2024 , 44 (8) : 1356 -1364 . DOI: 10.16155/j.0254-1793.2024-0169

Ya-yang HUANG, Ya-xiong LIU, Xiao-tong XIAO, Zhuo-ya LUO, Zhi-ye YANG. Characterization of peptide components of bran-fried Bombyx batryticatus decoction and virtual screening of anti-GAT-1 active peptides[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2024 , 44 (8) : 1356 -1364 . DOI: 10.16155/j.0254-1793.2024-0169

正文

收起

僵蚕Bombyx batryticatus Bombyx mori Linnaeus是家蚕Bombyx mori L.幼虫感染病原白僵菌Beauveria bassiana (Bals.) Vuill诱发白僵病后而致死的干燥虫体，已经作为一种动物类中药被载入2020年版《中华人民共和国药典》（简称《中国药典》）^[1]。僵蚕临床上常炮制后使用，即麸炒僵蚕，麸炒后的僵蚕可以起到矫味和降低毒性的作用，其成方制剂在临床上已广泛用于治疗癫痫等疾病^[2]。然而，尽管麸炒僵蚕有着明显的药效，但对其抗癫痫药效物质和药理作用机制的认识仍然不足^[3]，阻碍其临床推广以及现代化发展。

多肽是动物药药效物质基础的重要组成部分^[4]，多肽组学技术是分析生物组织或细胞内源性肽的组成和特征的方法^[5]，基于质谱的多肽组学技术为动物类中药的多肽成分分析提供了便捷方法。同时，基于计算机模拟的虚拟筛选技术有助于加快生物活性物质的发现进程^[6-7]，具有重要的应用价值。

癫痫发作与突触间隙中γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）的失衡有关^{[8- 9]}。GABA是中枢神经系统中1种抑制性神经递质，主要通过GABA转运体1（γ-aminobutyric acid transport-1，GAT-1）从突触间隙循环进入细胞^[10]。当抑制GAT-1转运GABA时，会使突触间隙中的GABA含量增多，从而使GABA持续减弱神经冲动，减少癫痫发作，因此，几十年来，GAT-1一直被认为是治疗癫痫的药物靶点^{[11- 12]}。目前，GAT-1抑制剂噻加宾（Tiagabine）已被批准用于癫痫的辅助治疗。既往研究表明，僵蚕提取物可通过调控GABA信号通路保护癫痫细胞模型^[13]。

本研究首先利用基于微升流速LC-MS/MS（μLC-MS/MS）的多肽组学技术，系统地表征麸炒僵蚕汤剂的多肽成分；随后利用生物信息学方法和分子对接技术，从麸炒僵蚕多肽中筛选能与癫痫治疗密切相关的靶点蛋白GAT-1结合的潜在生物活性肽；最后利用分子对接和分子动力学模拟分析了多肽与靶点蛋白的相互作用。本研究为动物类中药生物活性肽的发现提供了1种快速有效的方法。

1　仪器与试药

收起

麸炒僵蚕药材来自华润三九医药股份有限公司，经检测符合《中国药典》标准，乙腈（质谱级）和甲酸（质谱级）购自Merck公司，蒸馏水购自屈臣氏公司，3 kDa超滤离心管购自Millipore公司，牛血清白蛋白胰蛋白酶酶切对照品购自Thermo公司。

VANQUISH超高效液相色谱仪和Q Exactive四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪（Thermo公司），MS1003S万分之一分析天平（METTLER TOLEDO公司），X1R高速低温离心机（Thermo公司），KQ-500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），MS 3 digital涡旋震荡器（IKA公司）。

多肽生物活性预测软件PeptideRanker（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/），血脑屏障通透性预测软件BBPpred（http：//bbppred.xialab.info/#），多肽毒性预测软件ToxIBTL(https：//server.wei-group.net/ToxIBTL/Server.html)，分子对接软件HADDOCK 2.4（https：//wenmr.science.uu.nl/haddock2.4/），分子动力学模拟软件Discovery Studio 2024。

2　方法

收起

2.1　麸炒僵蚕汤剂的准备

按照《医疗机构中药煎药室管理规范》制备麸炒僵蚕汤剂：取麸炒僵蚕药材1 g，置于圆底烧瓶，加10倍量的水浸泡1 h，加热使微沸20 min，冷却后取上清液，药渣再加8倍量的水，加热使微沸15 min，同样取上清液，合并2次提取液，定容至10 mL，即得麸炒僵蚕汤剂多肽粗提液，用0.22 μm微孔滤膜滤过，转移至3 kDa的超滤管，14 000 r·min^-1离心20 min，取下层多肽溶液进行μLC-MS/MS分析。

2.2　色谱条件

捕集柱为Waters nanoEase M/Z Symmetry C₁₈（300 μm×50 mm，5 μm），分析柱为Waters ACQUITY UPLC Peptide CSH C₁₈（150 mm×1.0 mm，1.7 μm），流动相为0.1%甲酸-0.4%乙酸-水（A）和0.1%甲酸-0.4%乙酸-乙腈（B），线性梯度洗脱（0~1 min，1%B；1~75 min，1%B→35%B；75~80 min，35%B→50%B；80~80.1 min，50%B→99%B；80.1~85 min，99%B；85~85.1 min，99%B→1%B；85.1~100 min，1%B），流速0.05 mL·min^-1，柱温55 ℃，进样体积20 μL。用牛血清白蛋白胰蛋白酶酶切对照品（BSA tryptic digest standard）对仪器进行性能评估，保证检测体系的稳定性。

2.3　质谱条件

采用高能电喷雾离子源（HESI），喷雾电压3.80 kV，毛细管温度320 ℃；管状透镜电压50.0 V，辅助气加热温度157 ℃，鞘气流速31 L·min^-1，辅助气流速10 L·min^-1。扫描类型为全扫描/数据依赖二级质谱扫描（Full MS/dd-MS²），正离子模式。Full MS参数：分辨率35 000，自动增益控制目标离子数（AGC target）3.0×10⁶，最大离子注入时间（IT）110 ms，扫描范围m/z 200~2 000。dd-MS²参数：分辨率17 500，AGC target为1.0×10⁵，IT为100 ms，循环次数（loop count）12，隔离窗口（isolation window）2.0 m/z，归一化碰撞能量（NCE）28%，强度阈值（intensity threshold）为1.0×10⁴，选择电荷1~7，开启动态排除25.0 s。

2.4　数据库检索

序列数据库从uniprot中下载（2023年11月26日），包含僵蚕基源动物家蚕（Bombyx batryticatus）和白僵菌（Beauveria bassiana）；使用pFind软件对数据进行多肽鉴定，参数设置：母离子和碎片离子质量偏差分别为10 ppm和0.02，无酶切，甲硫氨酸（M）氧化为可变修饰，肽水平的错误发现率（false discovery rate，FDR）<1 %，蛋白质水平的FDR<1%。

2.5　多肽的初步筛选

鉴定从麸炒僵蚕汤剂中得到的多肽，首先，利用PeptideRanker（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）工具进行生物活性预测，选择活性评分高于0.5的多肽；然后，利用BBPpred^[14]（http：//bbppred.xialab.info/#）工具进行血脑屏障透过性预测，选择可能性值高于0.5的多肽；最后，应用ToxIBTL^[15]（https：//server.wei-group.net/ToxIBTL/Server.html）工具进行毒性预测，选择毒性概率小于0.5的多肽。具有生物活性、血脑屏障透过性且无毒的多肽被挑选进行下一步的分子对接。

2.6　分子对接

2.6.1　配体分子准备

使用Discovery Studio 2024（DS）软件，为每条候选多肽生成3种不同的构象，右手α螺旋（phi：-57°；psi：-47°）、聚脯氨酸Ⅱ（phi：-78°；psi：149°）和扩展构象（phi：-139°；psi：-135°），这3种构象代表了PDB数据库中大多数的多肽构象^[16]。选择GAT-1蛋白抑制剂噻加宾作为阳性对照配体，从Pubchem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库下载噻加宾的sdf结构文件，导入DS软件进行结构优化，首先应用“Prepare Ligand”程序对配体进行预处理，包括三维结构生成、加氢和配体质子化，再应用“Full Minimization”程序进行CHARMm力场最小化优化结构。

2.6.2　受体蛋白准备

从PDB数据库下载GAT-1晶体复合物结构（ID：7Y7Z），原配体分子为抑制剂噻加宾。导入DS软件，应用“Clean Protein”程序对蛋白文件进行规范，再使用“Prepare Protein”程序进行结构优化，包括加氢、除水、质子化、添加CHARMm力场等，并删除原配体。

2.6.3　HADDOCK分子对接

使用HADDOCK网站进行分子对接分析^[17]。提取蛋白晶体中的配体以构建活性位点，选择配体周围5 Å范围内的残基，即以残基59、60、61、62、63、64、65、66、136、140、236、294、295、296、297、300、302、303、306、395、396、399和400为活性残基，关闭自动定义被动残基；多肽所有氨基酸设为被动残基和完全柔性，多肽的N端和C端离子化带电。随机排除分区数（number of partitions for random exclusion）为1.142 9，刚体对接结构数量（number of structures for rigid body docking）为3 000，半柔性改进的结构数量（number of structures for semi-flexible refinement）、显式溶剂改进的结构数量（number of structures for the explicit solvent refinement）和分析的结构数量（number of structures to analyze）均设为400，其他参数按照“Peptide”模式的默认值。对照药物噻加宾的分子对接采用上述相同的蛋白活性残基，噻加宾设为活性位点和完全柔性，蛋白与配体均关闭自动定义被动残基，其他参数按照“Ligand”模式默认值。选择HADDOCK分数最低的结构作为该复合物的最终结合构象。

2.7　分子动力学模拟

将目标多肽与受体蛋白复合物进一步利用DS软件进行分子动力学模拟。首先，复合物进行“Prepare protein”预处理并施加CHARMm力场；然后，添加显性溶剂水盒子模型，复合物距离水盒子周期性边界15 Å，并加入Na⁺和Cl^-至体系NaCl浓度为0.145 mol·L^-1；随后，体系能量优化至梯度容差<0.1 kcal·(mol·Å)^-1，并升温100 ps至目标温度310 K（36.85 ℃），平衡1 ns；最后，进行40 ns的CHARMm分子动力学模拟，时间间隔为2 fs，每100 ps保存一次能量和坐标文件。模拟完成后，以第一帧为参照分析轨迹，并计算主链的均方根差（root mean square deviation，RMSD）和均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF），以评估复合物的结合稳定性，并与无配体蛋白和噻加宾-受体蛋白复合物的模拟结果进行比较。

3　结果

收起

3.1　麸炒僵蚕多肽的鉴定

采用μLC-MS/MS分析，总离子流色谱图（total ion current，TIC）如图1所示，共鉴定得到384条高可信度的多肽序列，其中，112条多肽鉴定自白僵菌蛋白序列，272条多肽来自家蚕。麸炒僵蚕汤剂多肽的相对分子质量主要范围为1 000~2 000（占比81.51%），长度主要为9~20个氨基酸（占比83.33%）（图2）。

3.2　潜在活性多肽筛选

多肽活性、血脑屏障通透性和毒性预测结果见表1。在鉴定的384条麸炒僵蚕多肽中，共筛选出105条活性多肽，其中20条具有血脑屏障通透性，进一步筛选出19条无毒多肽。将这19条多肽与癫痫相关治疗靶点蛋白GAT-1进行分子对接分析。

3.3　分子对接

分子对接结果（表2）显示，19条多肽的HADDOCK分数均低于对照药物噻加宾，表明它们与GAT-1的结合亲和力都比较高，其中FDHFDFDAF的分数最低，为189.0，其次为EHYAWGIK。进一步分析这2条多肽与GAT-1的相互作用模式，结果（图3、表3）表明，噻加宾主要通过氢键和疏水相互作用与GAT-1结合，此外，噻加宾的噻吩环还与残基CYS 399的硫原子产生相互作用。多肽由于含有更多的官能团，与GAT-1产生更多的相互作用，主要包括氢键、疏水、静电和范德华力等。活性多肽的高结合亲和力可能归因于它们能与靶蛋白产生更多有利的相互作用，使得结合更加稳定。此外，FDHFDFDAF与SER 295、LEU 306和CYS 399产生氢键或疏水相互作用，而EHYAWGIK与LEU 64、GLY 65、SER 295和LEU 306产生氢键或疏水相互作用，这与噻加宾和GAT-1的相互作用一致。

3.4　分子动力学模拟

基于分子对接的结果，挑选HADDOCK分数最低的2条多肽FDHFDFDAF和EHYAWGIK进一步进行分子动力学模拟试验，并以无配体蛋白和噻加宾-靶蛋白复合物作为对照，通过计算主链的RMSD和RMSF，进行轨迹分析。

RMSD表示某一时刻相对于参考构象的结构偏差，可以反映模拟体系的稳定情况^[18]，RMSD波动小，说明结构偏差小，体系达到稳定。如图4-A所示，在模拟过程中，所有复合物轨迹的RMSD在0~20 ns或0~25 ns上升，随后波动减小，而无配体蛋白则在0~10 ns上升，随后趋于稳定。复合物或蛋白轨迹的RMSD在前期上升可能是由于体系经过升温后温度尚未达到均衡，导致复合物构象的变化，所有体系最终稳定在2.0~4.0 Å，表明所有系统都达到了平衡，构象处于稳定状态。

RMSF指模拟时间内，某一原子相对于参考构象的结构变化^[19]，反映了原子的自由度。如图4-B所示，所有体系的大多数氨基酸残基RMSF<3 Å，表明各体系的蛋白在模拟过程中结构相对稳定，柔性变化在合理范围内^[20]。为研究活性位点残基在模拟期间的稳定性，选择对照药物噻加宾周围4 Å的残基，并计算这些残基在各体系中的RMSF，结果见表4。在所有系统中，这些残基的RMSF均<3 Å，表明活性口袋在肽结合后保持稳定。

4　讨论

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动物类中药富含具有治疗作用的蛋白质和多肽，如动物毒素^[21-22]、抗菌肽^[23]和抗血栓肽^[24]。蛋白多肽类成分是麸炒僵蚕重要的药效成分，研究发现，富含蛋白多肽类物质的僵蚕提取物具有显著的抗癫痫活性，其通过PI3K/Akt信号通路发挥抗氧化和抗凋亡作用^[25-26]。因此，活性肽的研究是动物药药效物质研究中的重要部分。

与植物药丰富的小分子次生代谢产物相比，动物药中的蛋白多肽类大分子化合物分析难度较大^[27]，基于质谱的多肽组学技术为多肽成分的鉴定提供更高效的方法，质谱的高灵敏度可在非常低的浓度水平上检测和鉴定多肽。多肽组学技术的发展使动物药中的多肽类成分受到众多学者的关注^[28-31]，但是多肽的生物活性还需要进一步的研究。传统活性物质研究包括分离纯化、结构鉴定和活性测定等过程，耗时费力，而基于计算机模拟的虚拟筛选技术被证实提高了活性肽发现的效率。如廖倩等^[32]从美洲大蠊多肽中虚拟筛选出具有促创面修复的活性多肽，并进一步通过细胞实验验证了多肽的活性；华羽彤等^[33]同样采用虚拟筛选结合实验验证，从宽体金线蛭多肽库中鉴定得到抗凝活性多肽QNTVGLDDFFSSYER。将多肽组学技术应用于动物药物质基础研究，能全面地检测和分析药用动物的多肽组成，与计算机虚拟筛选技术相结合，是探究动物药生物活性肽及其药效作用机制的有效方法。

本研究从麸炒僵蚕汤剂中分离出相对分子质量<3 000的多肽组分，采用基于μLC-MS/MS的多肽组学技术鉴定得到384条多肽序列，利用生物信息学方法预测多肽的生物活性、血脑屏障通透性和毒性，初步筛选出19条潜在活性多肽，分子对接结果显示19条多肽均能与GAT-1有效结合，进一步对结合亲和力最高的2条多肽FDHFDFDAF和EHYAWGIK进行分子动力学模拟研究，结果显示2条多肽均能与靶蛋白稳定结合，为麸炒僵蚕抗癫痫生物活性肽的研究提供了科学依据。

基金

收起

^*广东省科技厅科技计划项目(2021B1111610005)
广东省自然基金面上项目(2022A1515011850)
广东省中医药局科研项目(20221056)

参考文献

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文献

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2024年第44卷第8期

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doi: 10.16155/j.0254-1793.2024-0169

接收时间：2024-03-14
首发时间：2026-03-13
出版时间：2024-08-31

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收稿日期：2024-03-14

基金

^*广东省科技厅科技计划项目(2021B1111610005)

广东省自然基金面上项目(2022A1515011850)

广东省中医药局科研项目(20221056)

作者信息

^1.广州医科大学药学院，广州 511436

^2.广东省药品检验所国家药品监督管理局药品快速检验技术重点实验室广东省生物医药科技协同创新中心，广州 510663

通讯作者:

^** 刘亚雄　Tel：(020)32447981；E-mail：liuyaxiong@gdidc.org.cn

罗卓雅　Tel：(020)32447981；E-mail：lzyGDIDC@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

编号 (No.)	肽段序列 (sequence of peptides)	Peptideranker分数 (Peptideranker score)	BBPpred分数 (BBPpred score)	ToxIBTL分数 (ToxIBTL score)
1	FDHFDFDAF	0.928 378	0.776 434	2.11E-37
2	EHYAWGIK	0.505 231	0.656 983	5.13E-05
3	TDYPPLGRFAVR	0.595 257	0.520 742	1.66E-17
4	TGPNLHGLFGR	0.715 478	0.527 883	4.01E-17
5	DPDWIIQGL	0.874 649	0.555 630	1.07E-07
6	GYPFDRPIDMA	0.770 226	0.556 179	8.52E-16
7	KYENDVLFF	0.593 086	0.881 704	3.40E-08
8	AGAGAGSGAGAGY	0.518 538	0.601 538	7.25E-35
9	AGAGYGAGAGGY	0.547 863	0.776 981	1.93E-21
10	VIVSPVRTGML	0.513 123	0.645 221	2.53E-24
11	AGAGAGAGAGYG	0.574 380	0.592 948	1.30E-29
12	SSDASVARLF	0.630 919	0.519 144	1.24E-15
13	DMPEPVGPIAIL	0.532 587	0.543 729	4.96E-24
14	AGAGAGAGYGAGAGAGYGAGY	0.853 083	0.740 499	4.32E-30
15	AGAGAGSGAGAGSGAGAGY	0.686 617	0.569 124	3.62E-24
16	AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	0.709 182	0.594 214	5.51E-28
17	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	0.702 189	0.577 591	1.75E-36
18	AGSGAGAGSGAGAGSGAGY	0.648 656	0.561 638	1.24E-24
19	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGY	0.675 282	0.589 259	5.02E-18

编号
(No.)

肽段序列
(sequence of peptides)

Peptideranker分数
(Peptideranker score)

BBPpred分数
(BBPpred score)

ToxIBTL分数
(ToxIBTL score)

FDHFDFDAF

0.928 378

0.776 434

2.11E-37

EHYAWGIK

0.505 231

0.656 983

5.13E-05

TDYPPLGRFAVR

0.595 257

0.520 742

1.66E-17

TGPNLHGLFGR

0.715 478

0.527 883

4.01E-17

DPDWIIQGL

0.874 649

0.555 630

1.07E-07

GYPFDRPIDMA

0.770 226

0.556 179

8.52E-16

KYENDVLFF

0.593 086

0.881 704

3.40E-08

AGAGAGSGAGAGY

0.518 538

0.601 538

7.25E-35

AGAGYGAGAGGY

0.547 863

0.776 981

1.93E-21

VIVSPVRTGML

0.513 123

0.645 221

2.53E-24

AGAGAGAGAGYG

0.574 380

0.592 948

1.30E-29

SSDASVARLF

0.630 919

0.519 144

1.24E-15

DMPEPVGPIAIL

0.532 587

0.543 729

4.96E-24

AGAGAGAGYGAGAGAGYGAGY

0.853 083

0.740 499

4.32E-30

AGAGAGSGAGAGSGAGAGY

0.686 617

0.569 124

3.62E-24

AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY

0.709 182

0.594 214

5.51E-28

AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY

0.702 189

0.577 591

1.75E-36

AGSGAGAGSGAGAGSGAGY

0.648 656

0.561 638

1.24E-24

AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGY

0.675 282

0.589 259

5.02E-18

编号 (No.)	肽段或对照药物 (peptides or control drug)	HADDOCK分数 (HADDOCK score)
1	FDHFDFDAF	-189.0 +/-1.2
2	EHYAWGIK	-164.1 +/-12.4
3	TDYPPLGRFAVR	-162.4 +/-5.9
4	TGPNLHGLFGR	-137.9 +/-4.7
5	DPDWIIQGL	-131.0 +/-2.6
6	GYPFDRPIDMA	-130.3 +/-7.4
7	KYENDVLFF	-128.5 +/-11.9
8	AGAGAGSGAGAGY	-112.7 +/-3.0
11	AGAGAGAGAGYG	-101.6 +/-5.3
12	SSDASVARLF	-96.9 +/-11.9
13	DMPEPVGPIAIL	-91.9 +/-7.7
14	AGAGAGAGYGAGAGAGYGAGY	-90.8 +/-9.3
15	AGAGAGSGAGAGSGAGAGY	-88.9 +/-8.0
16	AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	-88.2 +/-4.2
17	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY	-86.9 +/-4.7
18	AGSGAGAGSGAGAGSGAGY	-85.7 +/-2.5
19	AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGY	-79.2 +/-5.4
20	噻加宾（Tiagabine）	-43.7 +/-0.8

编号
(No.)

肽段或对照药物
(peptides or control drug)

HADDOCK分数
(HADDOCK score)

FDHFDFDAF

-189.0 +/-1.2

EHYAWGIK

-164.1 +/-12.4

TDYPPLGRFAVR

-162.4 +/-5.9

TGPNLHGLFGR

-137.9 +/-4.7

DPDWIIQGL

-131.0 +/-2.6

GYPFDRPIDMA

-130.3 +/-7.4

KYENDVLFF

-128.5 +/-11.9

AGAGAGSGAGAGY

-112.7 +/-3.0

AGAGAGAGAGYG

-101.6 +/-5.3

SSDASVARLF

-96.9 +/-11.9

DMPEPVGPIAIL

-91.9 +/-7.7

AGAGAGAGYGAGAGAGYGAGY

-90.8 +/-9.3

AGAGAGSGAGAGSGAGAGY

-88.9 +/-8.0

AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY

-88.2 +/-4.2

AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGY

-86.9 +/-4.7

AGSGAGAGSGAGAGSGAGY

-85.7 +/-2.5

AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGY

-79.2 +/-5.4

噻加宾（Tiagabine）

-43.7 +/-0.8

复合物 (complexes)	氢键相互作用 (hydrogen bond interaction)	疏水相互作用 (hydrophobic interaction)	静电相互作用 (electrostatic interaction)	其他 (others)
GAT-1+噻加宾（Tiagabine）	LEU 64，GLY 65，TYR 140，SER 295	LEU 306，CYS 399		CYS 399
GAT-1+FDHFDFDAF	ARG 69，THR 236，GLN 291，PHE 294，SER 295^*，SER 302，ASN 327，SER 396，ALA 455	ILE 62，PHE 70，TYR 86，PHE 294，LEU 306^，MET 332，ASP 395，CYS 399^	ARG 69	GLY 63
GAT-1+EHYAWGIK	ALA 61，LEU64^，GLY 65^，TRP 68，AGR 69，TYR 139，PHE 294，SER 295^*，SER 302，TYR 309，PHE 365，THR 400，GLY 403，ASP 451	ILE 62，TYR 139，ILE 143，PHE 294，LEU 306^*，LEU 389	ARG 69，PHE 365	GLY 63

复合物
(complexes)

氢键相互作用
(hydrogen bond interaction)

疏水相互作用
(hydrophobic interaction)

静电相互作用
(electrostatic interaction)

其他
(others)

GAT-1+噻加宾（Tiagabine）

LEU 64，GLY 65，TYR 140，SER 295

LEU 306，CYS 399

CYS 399

GAT-1+FDHFDFDAF

ARG 69，THR 236，GLN 291，PHE 294，SER 295^*，SER 302，ASN 327，SER 396，ALA 455

ILE 62，PHE 70，TYR 86，PHE 294，LEU 306^*，MET 332，ASP 395，CYS 399^*

ARG 69

GLY 63

GAT-1+EHYAWGIK

ALA 61，LEU64^*，GLY 65^*，TRP 68，AGR 69，TYR 139，PHE 294，SER 295^*，SER 302，TYR 309，PHE 365，THR 400，GLY 403，ASP 451

ILE 62，TYR 139，ILE 143，PHE 294，LEU 306^*，LEU 389

ARG 69，PHE 365

GLY 63

蛋白残基 (protein residue)	RMSF/Å
GLY 59	1.17	1.22	1.45	1.20
TYR 60	1.59	1.60	2.35	1.72
ALA 61	1.22	0.88	1.34	1.05
GLY 63	0.78	0.67	0.82	1.36
LEU 64	0.86	0.78	0.89	2.00
GLY 65	0.94	0.80	0.83	1.50
ASN 66	1.06	1.04	1.04	1.41
TYR 140	0.97	1.14	1.02	1.15
SER 295	0.91	0.68	1.46	1.19
SER 302	1.25	1.55	2.49	1.44
LEU 303	1.25	1.50	2.73	1.51
LEU 306	1.28	1.37	2.54	1.73
ASP 395	1.15	1.06	1.17	1.81
SER 396	0.94	0.96	0.87	1.32
CYS 399	1.16	0.87	1.03	1.48
THR 400	1.07	0.90	0.89	1.27

蛋白残基
(protein residue)

RMSF/Å

GAT-1

GAT-1+噻加宾(Tiagabine)

GAT-1+FDHFDFDAF

GAT-1+EHYAWGIK

GLY 59

1.17

1.22

1.45

1.20

TYR 60

1.59

1.60

2.35

1.72

ALA 61

1.22

0.88

1.34

1.05

GLY 63

0.78

0.67

0.82

1.36

LEU 64

0.86

0.78

0.89

2.00

GLY 65

0.94

0.80

0.83

1.50

ASN 66

1.06

1.04

1.41

TYR 140

0.97

1.14

1.02

1.15

SER 295

0.91

0.68

1.46

1.19

SER 302

1.25

1.55

2.49

1.44

LEU 303

1.25

1.50

2.73

1.51

LEU 306

1.28

1.37

2.54

1.73

ASP 395

1.15

1.06

1.17

1.81

SER 396

0.94

0.96

0.87

1.32

CYS 399

1.16

0.87

1.03

1.48

THR 400

1.07

0.90

0.89

1.27