药物分析杂志

杂质（impurity）	回归方程（regression equation）	r	线性范围（linear range）/（μg·mL^-1）	LOQ/ng	LOD/ng	检出限度（detection limit）^*/（μg·g^-1）	进样量 (added)/mg
杂质E（impurity E）	A=47.645 6C+0.158 6	0.999 5	0.025 1~0.200 7	0.50	0.15	3	0.05
杂质I（impurity I）	A=49.625C+0.173 6	0.999 6	0.020 2~0.302 7	0.40	0.12	1.2	0.1
2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）	A=18.191 3C+0.011 7	0.999 8	0.126 6~2.110 0	2.53	0.84	1.7	0.5

杂质（impurity）	回归方程（regression equation）	r	线性范围（linear range）/（μg·mL^-1）	LOQ/ng	LOD/ng	检出限度（detection limit）^*/（μg·g^-1）	进样量 (added)/mg
杂质E（impurity E）	A=47.645 6C+0.158 6	0.999 5	0.025 1~0.200 7	0.50	0.15	3	0.05
杂质I（impurity I）	A=49.625C+0.173 6	0.999 6	0.020 2~0.302 7	0.40	0.12	1.2	0.1
2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）	A=18.191 3C+0.011 7	0.999 8	0.126 6~2.110 0	2.53	0.84	1.7	0.5

杂质（impurity）	本底（background）/μg	加入量（added）/μg	测得值（measured）/μg	回收率（recovery）/%	平均回收率（mean recovery）/%	RSD （n=9）/%
杂质E（impurity E）	0	0.501 7	0.506 9	101.0	101.2	0.78
		1.003 4	1.024 6	102.1
		1.505 2	1.513 8	100.6
杂质I（impurity I）	0	1.153 6	1.196 2	103.7	102.5	1.1
		2.307 0	2.359 8	102.3
		3.460 6	3.508 4	101.4
2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）	0	5.025 4	4.912 3	97.8	97.7	0.94
		10.050 8	9.918 1	98.7
		15.076 2	14.595 3	96.8

杂质（impurity）	本底（background）/μg	加入量（added）/μg	测得值（measured）/μg	回收率（recovery）/%	平均回收率（mean recovery）/%	RSD （n=9）/%
杂质E（impurity E）	0	0.501 7	0.506 9	101.0	101.2	0.78
		1.003 4	1.024 6	102.1
		1.505 2	1.513 8	100.6
杂质I（impurity I）	0	1.153 6	1.196 2	103.7	102.5	1.1
		2.307 0	2.359 8	102.3
		3.460 6	3.508 4	101.4
2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）	0	5.025 4	4.912 3	97.8	97.7	0.94
		10.050 8	9.918 1	98.7
		15.076 2	14.595 3	96.8

杂质（impurity）	色谱参数（chromatographic parameter）	原条件（primary condition）	变动范围（range of variation）
杂质E（impurity E）	流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)	1.0	0.9、1.1
	柱温（column temperature）/℃	30	25、35
	流动相pH（pH of mobile phase）	7.6	7.4、7.8
杂质I（impurity I）	流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)	1.0	0.9、1.1
	柱温（column temperature）/℃	30	25、35
2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）	流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)	1.0	0.9、1.1
	柱温（column temperature）/℃	30	28、32
	流动相pH（pH of mobile phase）	6.5	6.4、6.6

杂质（impurity）	色谱参数（chromatographic parameter）	原条件（primary condition）	变动范围（range of variation）
杂质E（impurity E）	流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)	1.0	0.9、1.1
	柱温（column temperature）/℃	30	25、35
	流动相pH（pH of mobile phase）	7.6	7.4、7.8
杂质I（impurity I）	流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)	1.0	0.9、1.1
	柱温（column temperature）/℃	30	25、35
2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）	流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)	1.0	0.9、1.1
	柱温（column temperature）/℃	30	28、32
	流动相pH（pH of mobile phase）	6.5	6.4、6.6

HPLC法测定艾司奥美拉唑钠中3个潜在基因毒性杂质的研究及控制

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曹盼 ¹ , 吴会斌 ² , 陈焱 ² , 赵龙山 ¹^,^*

药物分析杂志 | 安全监测 2024,44(2): 290-297

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药物分析杂志 | 安全监测 2024, 44(2): 290-297

HPLC法测定艾司奥美拉唑钠中3个潜在基因毒性杂质的研究及控制

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曹盼¹, 吴会斌², 陈焱², 赵龙山¹^,^*

作者信息

^1.沈阳药科大学，沈阳 110016

^2.辽宁海思科制药有限公司，葫芦岛 125107

Tel：15042922028；E-mail：329099760@qq.com

通讯作者:

*Tel：15809875200；E-mail：longshanzhao@163.com

Determination of three genotoxic impurities in esomeprazole sodium by HPLC

Pan CAO¹, Hui-bin WU², Yan CHEN², Long-shan ZHAO¹^,^*

Affiliations

^1.School of Pharmacy Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China

^2.Liaoning Haisco Pharmaceutical Co., Ltd., Huludao 125107, China

出版时间: 2024-02-29 doi: 10.16155/j.0254-1793.2024.02.12

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摘要

收起

目的：

建立HPLC法测定艾司奥美拉唑钠中潜在基因毒性杂质E、杂质I、2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶。

方法：

杂质E色谱条件：YMC-Triart C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾缓冲液，流动相B为乙腈，梯度洗脱，流速为1.0 mL·min^-1，检测波长为302 nm，柱温为30 ℃；杂质I色谱条件：Agilent Microspher C₁₈色谱柱（100 mm×4.6 mm，3 μm），流动相A为水-磷酸盐缓冲液（pH 7.6）-乙腈（80∶10∶10），流动相B为乙腈-磷酸盐缓冲液（pH 7.6）-水（80∶1∶19），梯度洗脱，流速为1.0 mL·min^-1，检测波长为302 nm，柱温为30 ℃；2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶色谱条件：GL Inertsil ODS-3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.01 mol·L^-1磷酸氢二钠溶液（pH 6.5），流动相B为乙腈，流速为1.0 mL·min^-1，检测波长为265 nm，柱温为30 ℃。

结果：

杂质E、杂质I、2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶的线性范围分别为0.025 1~0.200 7、0.020 2~0.302 7、0.126 6~2.110 0 μg·mL^-1，定量限分别为0.50、0.40、2.53 ng，检测限分别为0.15、0.12、0.84 ng。平均回收率都在96%~104%，RSD均<2%。样品中均未检出潜在毒性杂质。

结论：

该方法检测杂质的重现性好，精密度高，准确度高，线性良好，分析方法简便高效。

关键词

艾司奥美拉唑 / 基因毒性杂质 / 高效液相色谱法 / 杂质E / 杂质I / 2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶

Abstract

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Objective:

To establish an HPLC method for the determination of potentially genotoxic impurity E, impurity I, and 2-chloromethyl-4-methoxy-3，5-dimethlpyridine in esomeprazole sodium.

Methods:

The chromatographic conditions were as follows: impurity E, YMC-Triart C₁₈ column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), mobile phase A 0.05 mol·L^-1 monopotassium phosphate buffer, mobile phase B was acetonitrile, the gradient elution program was used at the flow rate of 1.0 mL·min^-1, the detection wavelength was 302 nm and the column temperature was 30 ℃. Impurities I, Agilent Microspher C₁₈ column (100 mm×4.6 mm, 3 μm), mobile phase A was water-phosphate buffer (pH 7.6)-acetonitrile(80∶10∶10), mobile phase B was acetonitrile-phosphate buffer (pH 7.6)-water (80∶1∶19), the flow rate was 1.0 mL·min^-1, the detection wavelength was 302 nm and the column temperature was 30 ℃. 2-chloromethyl-4-methoxy-3，5-dimethlpyridine, GL Inertsil ODS-3 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), mobile phase A was 0.01 mol·L^-1 disodium phosphate solution (pH 6.5), mobile phase B was acetonitrile, the flow rate was 1.0 mL·min^-1, the detection wavelength was 265 nm and the column temperature was 30 ℃.

Results:

The linear ranges of impurity E, impurity I and 2-chloromethyl-4-methoxy-3，5-dimethlpyridine were 0.025 1-0.200 7, 0.020 2-0.302 7, 0.126 6-2.110 0 μg·mL^-1. The LOQ of impurity E, impurity I, 2-chloromethyl-4-methoxy-3，5-dimethlpyridine were 0.50, 0.40, 2.53 ng, and the LOD were 0.15, 0.12, 0.84 ng. The average recovery rate ranged from 96% to 104%, and the RSD was less than 2%. No potential toxic impurities were detected in the samples.

Conclusion:

The method has the advantages of good repeatability, high precision, high accuracy and good linearity, and the analysis method are simple and efficient.

Key words

esomeprazole / genotoxic impurities / high performance liquid chromatography / impurity E / impurity I / 2-chloromethyl-4-methoxy-3,5-dimethlpyridine

引用本文

曹盼, 吴会斌, 陈焱, 赵龙山. HPLC法测定艾司奥美拉唑钠中3个潜在基因毒性杂质的研究及控制. 药物分析杂志, 2024 , 44 (2) : 290 -297 . DOI: 10.16155/j.0254-1793.2024.02.12

Pan CAO, Hui-bin WU, Yan CHEN, Long-shan ZHAO. Determination of three genotoxic impurities in esomeprazole sodium by HPLC[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2024 , 44 (2) : 290 -297 . DOI: 10.16155/j.0254-1793.2024.02.12

正文

收起

艾司奥美拉唑钠属于抑制胃酸分泌药，是胃壁细胞中质子泵的特异抑制剂^[1-4]，在胃壁细胞泌酸微管中的高酸条件下可以转化为活性模式，抑制该部位的质子泵活动，对于基础胃酸和受刺激后胃酸的分泌都有抑制作用。可以用于治疗急性上消化道出血^[5-7]，急性消化性溃疡出血^[8]，改善重症急性胰腺炎患者肠黏膜屏障功能^[9]等疾病。

杂质是指在药品生产、运输、贮藏等过程中产生或引入的影响药物纯度的物质。基因毒性杂质（genotoxic impurities，GTIs）是指能引起遗传毒性的杂质^[10-11]，极微量水平即能诱发DNA突变，具有重大的遗传毒性安全风险，需要重点控制^[12]。根据艾司奥美拉唑钠的制备工艺，分析了其杂质来源，主要有工艺杂质和降解杂质。艾司奥美拉唑钠有关物质的HPLC检测方法已经收载于2020年版《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》），包括一部分杂质的质量标准^[13]，但并未收载杂质E、杂质I、2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶（基因毒性杂质）的检测方法。参考ICH（M7）中毒理学关注阈值（TCC，1.5 μg·d^-1）作为基因毒性杂质的可接受限度^[14]，按照注射用艾司奥美拉唑钠日最大服用剂量40 mg计算，则计算限度为37.5 μg·g^-1。为了实现对这几个基因毒性杂质的质量控制，利用HPLC法进行测定。

李锐等^[15]采用质谱法对艾司奥美拉唑钠基因毒性杂质杂质E、杂质I进行检查，王璐等^[16]采用质谱法对艾司奥美拉唑钠中基因毒性杂质2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶进行检查。本文采用更加简便的方法、更普及的检测设备进行3个基因毒性杂质的检测。

1　仪器与试药

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Agilent 1260高效液相色谱仪（Agilent公司）；CPA225D电子天平（精度0.001 g，Sartorius公司）；AUW220电子天平（精度0.1 mg，岛津公司）；YMC Triart C₁₈色谱柱（YMC公司）、Agilent Microspher C₁₈色谱柱（Agilent公司）；GL Inertsil ODS-3色谱柱（GL公司）；Waters Symmetry C₁₈色谱柱（Waters公司）。

样品：艾司奥美拉唑钠原料（批号170601、170701、170702、C037-220006，四川海思科制药有限公司）；乙腈（色谱纯，Merck公司）；杂质E对照品（批号ESE20130129，纯度98.57%，上海诺星医药科技有限公司）；杂质I对照品（批号95.16.08.04，纯度99.10%，LGC公司）；2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶盐酸盐对照品（批号02322CEV，纯度99.7%，Sigma公司）；磷酸二氢钾、氢氧化钾、磷酸二氢钠及磷酸氢二钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。

2　方法与结果

收起

2.1　色谱条件

2.1.1　杂质E

采用YMC-Triart C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾缓冲液（1.25 g·mL^-1氢氧化钾溶液调pH 7.6），流动相B为乙腈，梯度洗脱（0~5 min，85%A；5~20 min，85%A→70%A；20~30 min，70%A；30~31 min，70%A→50%A；31~36 min，50%A；36~37 min，50%A→85%A；37~50 min，85%A），流速为1.0 mL·min^-1，检测波长为302 nm，进样量为20 μL，柱温为30 ℃。

2.1.2　杂质I

采用Agilent Microspher C₁₈色谱柱（100 mm×4.6 mm，3 μm），流动相A为水-磷酸盐缓冲液（pH 7.6）（每1 000 mL中含0.005 2 mol磷酸二氢钠与0.032 mol磷酸氢二钠）-乙腈（80∶10∶10），流动相B为乙腈-磷酸盐缓冲液（pH 7.6）-水（80∶1∶19），梯度洗脱（0~10 min，100%A→80%A；10~30 min，80%A→0%A；30~31 min，0%A→100%A；31~45 min，100%A），流速为1.0 mL·min^-1；检测波长为302 nm，进样量为20 μL，柱温为30 ℃。

2.1.3　2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶

采用GL Inertsil ODS-3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A为0.01 mol·L^-1磷酸氢二钠溶液（pH 6.5），流动相B为乙腈，梯度洗脱（0~20 min，60%A；20~21 min，60%A→20%A；21~35 min，20%A；35~36 min，20%A→60%A；36~45 min，60%A），流速为1.0 mL·min^-1，检测波长为265 nm，进样量为20 μL，柱温为30 ℃。

2.2　溶液的制备

2.2.1　杂质E

取样品适量，精密称定，加50%乙腈溶液（稀释剂1）溶解并定量稀释制成每1 mL中约含2.5 mg的艾司奥美拉唑钠溶液，摇匀，作为杂质E供试品溶液。

精密称取杂质E对照品适量，用稀释剂1溶解并定量稀释制成每1 mL中约含1 μg的溶液，摇匀，作为杂质E对照品储备液，精密量取1.00 mL，置10 mL量瓶中，用稀释剂1稀释至刻度，摇匀，作为杂质E对照品溶液（0.1 μg·mL^-1）。

精密称取样品25.00 mg，置10 mL量瓶中，加入杂质E对照品储备液1 mL，用稀释剂1溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质E系统适用性溶液。

2.2.2　杂质I

取样品适量，精密称定，用流动相A[水-磷酸盐缓冲液（pH 7.6）（每1 000 mL中含0.005 2 mol磷酸二氢钠与0.032 mol磷酸氢二钠）-乙腈（80∶10∶10）]（稀释剂2）溶解并定量稀释制成每1 mL中约含5 mg的艾司奥美拉唑钠溶液，摇匀，作为杂质I供试品溶液。

另精密称取杂质I对照品适量，用稀释剂2溶解并定量稀释制成每1 mL中约含2 μg的溶液，摇匀，作为杂质I对照品储备液，精密量取1.00 mL，置10 mL量瓶中，用稀释剂2稀释至刻度，摇匀，作为杂质I对照品溶液（0.2 μg·mL^-1）。

精密称取样品50.00 mg，置10 mL量瓶中，加入杂质I对照品储备液1 mL，用稀释剂2溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质I系统适用性溶液。

2.2.3　2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶

取样品适量，精密称定，用40%乙腈溶液（稀释剂3）溶解并定量稀释制成每l mL中约含25 mg的艾司奥美拉唑钠溶液，摇匀，作为2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶供试品溶液。

精密称取2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶对照品适量，用稀释剂3溶解并定量稀释制成每1 mL中含2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶10 μg的溶液，摇匀，作为2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶对照品储备液，精密量取1.00 mL，置10 mL量瓶中，用稀释剂3稀释至刻度，摇匀，作为2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶对照品溶液（1 μg·mL^-1）。

精密称取样品250.00 mg，置10 mL量瓶中，加入上述对照品储备液1 mL，用稀释剂3溶解并稀释至刻度，摇匀，作为2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶系统适用性溶液。

2.3　方法学验证

2.3.1　专属性试验

取稀释剂1~3，“2.2”项制备的3个成分的对照品溶液、供试品溶液和系统适用性溶液，分别按照拟定的色谱条件进行杂质定位。结果这3个杂质均能够很好地分离，系统适用性溶液样品中其他杂质均不干扰检测，色谱条件的专属性良好（图1）。

2.3.2　线性关系考察

取杂质E对照品适量，精密称定，分别用稀释剂1溶解并制成质量浓度为0.025、0.05、0.08、0.10、0.15、0.20 μg·mL^-1的系列浓度杂质E对照品溶液；取杂质I对照品适量，精密称定，分别用稀释剂2溶解并制成质量浓度为0.02、0.04、0.10、0.15、0.20、0.30 μg·mL^-1的系列浓度杂质I对照品溶液；取2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶的对照品适量，精密称定，分别用稀释剂3溶解并制成质量浓度为0.12、0.20、0.40、0.80、1.0、2.0 μg·mL^-1的系列浓度2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶对照品溶液。按照“2.1”项的色谱条件分别进行测定，以溶液质量浓度C（μg·mL^-1）为横坐标，相对应的峰面积A为纵坐标分别作图，进行线性回归，求得回归方程（表1）。

2.3.3　检测限和定量限

分别取杂质E、杂质I、2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶的对照品溶液并逐步稀释进样，信噪比约3∶1的浓度作为检测限，以信噪比约10∶1的浓度作为定量限。结果见表1。各色谱条件均能有效满足杂质检出的要求。

2.3.4　精密度考察

进样精密度：取3个杂质的对照品溶液，每种溶液分别连续进样6针，记录色谱图。杂质E、杂质I、2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶峰面积的RSD（n=6）分别为1.1%、2.3%、0.060%，表明进样精密度良好。

重复性试验：精密称取样品25.00 mg，置10 mL量瓶中，加入杂质E对照品储备液1 mL，用稀释剂1溶解并稀释至刻度，摇匀，平行制备6份，分别进样，记录色谱图，杂质E重复性试验回收率在99.0%~101.2%，平均回收率为100.1%，RSD（n=6）为0.98%；精密称取样品50.00 mg，置10 mL量瓶中，加入杂质I对照品储备液1 mL，用稀释剂2溶解并稀释至刻度，摇匀，平行制备6份，分别进样，记录色谱图，杂质I重复性试验回收率在100.0%~103.2%，平均回收率为102.0%，RSD（n=6）为1.2%；精密称取样品250.00 mg，置10 mL量瓶中，加入2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶对照品储备液1 mL，用稀释剂3溶解并稀释至刻度，摇匀，平行制备6份，分别进样，记录色谱图，2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶重复性试验回收率在97.0%~99.2%，平均回收率为97.6%，RSD（n=6）为0.98%。结果表明测定方法的重复性均良好。

中间精密度试验：更换不同试验人员，按重复性试验方式进行测定，记录色谱图。杂质E中间精密度试验回收率（n=6）在99.5%~101.8%，平均回收率为100.5%，RSD（n=6）为0.97%；杂质I中间精密度试验回收率（n=6）在100.5%~103.7%，平均回收率为101.9%，RSD（n=6）为1.4%；2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶中间精密度试验回收率（n=6）在96.5%~100.8%，平均回收率为98.0%，RSD（n=6）为1.6%。结果表明中间精密度均良好。

2.3.5　溶液稳定性

取“2.2”项下配制的各对照品溶液和各供试品溶液，按照“2.1”项下方法进样，测定3个杂质的峰面积以考察溶液稳定性。

杂质E对照品及供试品溶液分别于0、2.5、10、14 h进样，结果14 h内杂质E对照品溶液峰面积RSD（n=4）为1.2%，供试品溶液14 h内均未检出杂质E。表明杂质E对照品溶液与供试品溶液14 h内稳定性良好。

杂质I对照品及供试品溶液分别于0、2、4、8、12 h进样，结果12 h内杂质I对照品溶液峰面积RSD（n=5）为1.2%，供试品溶液12 h内均未检出杂质I。表明杂质I对照品溶液与供试品溶液12 h内稳定性良好。

2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶对照品及供试品溶液分别于0、2、4、6、8 h进样，结果8 h内2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶对照品溶液峰面积RSD（n=5）为0.15%，供试品溶液8 h内均未检出2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶。表明2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶对照品溶液与供试品溶液8 h内稳定性良好。

2.3.6　回收率试验

取杂质E对照品适量，精密称定，用稀释剂1制成每1 mL中含杂质约1 μg的杂质E对照品溶液，再取样品9份，按50%、100%、150%限度浓度加入杂质E对照品溶液，进行杂质回收率试验；取杂质I对照品适量，精密称定，用稀释剂2制成每1 mL中含杂质约2 μg的杂质I对照品溶液，再取样品9份，按50%、100%、150%限度浓度加入杂质I对照品溶液，进行杂质回收率试验；取2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶对照品适量，精密称定，用稀释剂3制成每1 mL中含杂质约10 μg的2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶对照品溶液，再取样品9份，按50%、100%、150%限度浓度加入2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶对照品溶液，进行杂质回收率试验。结果见表2。

2.3.7　耐用性试验

采用3个色谱条件下系统适用性溶液的配制方式制备供试品溶液，以“2.1”项的色谱条件为基础，进行部分调整（表3），用以考察色谱条件微小变化下杂质的回收率情况。色谱条件部分微调后，杂质E回收率均在98.8%~100.2%，杂质I回收率均在100.8%~103.2%，2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶回收率均在97.2%~98.4%，表明耐用性良好。

2.4　样品测定

按照“2.1”色谱条件，对多批样品（批号170601、170701、070702、C037-220006）进行测定，记录色谱图，结果多批样品中均未检出杂质E、杂质I、2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶。

3　讨论

收起

3.1　色谱条件选择

本研究通过对流动相组成、pH、洗脱方式及色谱柱的筛选来确定杂质检测的色谱条件，在确定检测杂质E的色谱条件时，探索了3种色谱条件，但以Waters Symmetry C₁₈为色谱柱，水或者0.02 mol·L^-1磷酸二氢钾缓冲液为流动相A时不能很好地分离杂质峰和样品峰，故而选择YMC-Triart C₁₈色谱柱，0.05 mol·L^-1磷酸二氢钾缓冲液作为流动相A，可以实现样品与杂质E的良好分离，且稀释剂1与样品中其他杂质不干扰杂质E的测定。在确定检测2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶的色谱条件时，发现梯度洗脱比等度洗脱相能更好分离样品与杂质，稀释剂3及样品中其他杂质不干扰2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶的测定。

3.2　波长选择

在选择测定波长时，取杂质对照品溶液采用高效液相色谱仪（HPLC-DAD）在190~400 nm波长处进行测定，记录色谱图，通过紫外光谱确定各个杂质的吸收波长，发现杂质E和杂质I在302 nm处有较大吸收，2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶在265 nm处有较大吸收，因此将这几个波长作为相应杂质的检测波长。

3.3　小结

本研究采用高效液相色谱法，对杂质E、杂质I、2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶进行检测，为了确定方法的可靠性，进行了专属性试验、线性考察、中间精密度试验、检测限和定量限确定、准确度试验和耐用性试验，该方法具有重现性好、精密度高、准确度高、线性良好等优点，并且比质谱法操作更加简单，可以用于药品的杂质检测和质量控制，保证药品质量安全。

参考文献

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文献

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2024年第44卷第2期

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doi: 10.16155/j.0254-1793.2024.02.12

接收时间：2023-02-11
首发时间：2026-03-13
出版时间：2024-02-29

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收稿日期：2023-02-11

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^1.沈阳药科大学，沈阳 110016

^2.辽宁海思科制药有限公司，葫芦岛 125107

通讯作者:

*Tel：15809875200；E-mail：longshanzhao@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

杂质（impurity）	回归方程（regression equation）	r	线性范围（linear range）/（μg·mL^-1）	LOQ/ng	LOD/ng	检出限度（detection limit）^*/（μg·g^-1）	进样量 (added)/mg
杂质E（impurity E）	A=47.645 6C+0.158 6	0.999 5	0.025 1~0.200 7	0.50	0.15	3	0.05
杂质I（impurity I）	A=49.625C+0.173 6	0.999 6	0.020 2~0.302 7	0.40	0.12	1.2	0.1
2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）	A=18.191 3C+0.011 7	0.999 8	0.126 6~2.110 0	2.53	0.84	1.7	0.5

杂质
（impurity）

回归方程
（regression equation）

线性范围
（linear range）/（μg·mL^-1）

LOQ/ng

LOD/ng

检出限度
（detection limit）^*/（μg·g^-1）

进样量
(added)/mg

杂质E（impurity E）

A=47.645 6C+0.158 6

0.999 5

0.025 1~0.200 7

0.50

0.15

0.05

杂质I（impurity I）

A=49.625C+0.173 6

0.999 6

0.020 2~0.302 7

0.40

0.12

1.2

0.1

2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶
（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）

A=18.191 3C+0.011 7

0.999 8

0.126 6~2.110 0

2.53

0.84

1.7

0.5

杂质（impurity）	本底（background）/μg	加入量（added）/μg	测得值（measured）/μg	回收率（recovery）/%	平均回收率（mean recovery）/%	RSD （n=9）/%
杂质E（impurity E）	0	0.501 7	0.506 9	101.0	101.2	0.78
		1.003 4	1.024 6	102.1
		1.505 2	1.513 8	100.6
杂质I（impurity I）	0	1.153 6	1.196 2	103.7	102.5	1.1
		2.307 0	2.359 8	102.3
		3.460 6	3.508 4	101.4
2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）	0	5.025 4	4.912 3	97.8	97.7	0.94
		10.050 8	9.918 1	98.7
		15.076 2	14.595 3	96.8

杂质
（impurity）

本底
（background）/μg

加入量
（added）/μg

测得值
（measured）/μg

回收率
（recovery）/%

平均回收率
（mean recovery）/%

RSD
（n=9）/%

杂质E（impurity E）

0.501 7

0.506 9

101.0

101.2

0.78

1.003 4

1.024 6

102.1

1.505 2

1.513 8

100.6

杂质I（impurity I）

1.153 6

1.196 2

103.7

102.5

1.1

2.307 0

2.359 8

102.3

3.460 6

3.508 4

101.4

2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）

5.025 4

4.912 3

97.8

97.7

0.94

10.050 8

9.918 1

98.7

15.076 2

14.595 3

96.8

杂质（impurity）	色谱参数（chromatographic parameter）	原条件（primary condition）	变动范围（range of variation）
杂质E（impurity E）	流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)	1.0	0.9、1.1
	柱温（column temperature）/℃	30	25、35
	流动相pH（pH of mobile phase）	7.6	7.4、7.8
杂质I（impurity I）	流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)	1.0	0.9、1.1
	柱温（column temperature）/℃	30	25、35
2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）	流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)	1.0	0.9、1.1
	柱温（column temperature）/℃	30	28、32
	流动相pH（pH of mobile phase）	6.5	6.4、6.6

杂质
（impurity）

色谱参数
（chromatographic parameter）

原条件
（primary condition）

变动范围
（range of variation）

杂质E（impurity E）

流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)

1.0

0.9、1.1

柱温（column temperature）/℃

25、35

流动相pH（pH of mobile phase）

7.6

7.4、7.8

杂质I（impurity I）

流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)

1.0

0.9、1.1

柱温（column temperature）/℃

25、35

2-氯甲基-3，5二甲基-4-甲氧基吡啶
（2-chloromethyl-3，5-dimethyl-4-methoxypyridine）

流速（velocity of flow）/(mL·min^-1)

1.0

0.9、1.1

柱温（column temperature）/℃

28、32

流动相pH（pH of mobile phase）

6.5

6.4、6.6