中国药学杂志

Group	Dose	ALT /U·L^-1	AST /U·L^-1	SOD /U·mg^-1	MDA /nmol·mg^-1	IL-6 /pg·mg^-1	TNF-α /pg·mg^-1	ROS /pg·mg^-1
Control		13.45	±3.31⁴⁾	42.02±5.40³⁾	2.03±0.17³⁾	9.34±1.99⁴⁾	14.92±1.68⁴⁾	21.07±3.40⁴⁾	0.74±0.07⁴⁾
Model		148.47	±10.35²⁾	61.82±8.07¹⁾	1.66±0.17¹⁾	13.66±2.42²⁾	25.46±3.67²⁾	40.97±5.27²⁾	1.26±0.16²⁾
Silybin	100 mg·kg^-1	94.72	±20.20	43.92±9.98³⁾	2.60±0.45³⁾	11.39±0.90³⁾	20.90±3.81	34.27±0.98⁴⁾	1.12±0.07
Chaihu	11.4 g·kg^-1	64.69	±10.31⁴⁾	42.85±8.86³⁾	2.53±0.27⁴⁾	11.58±1.03³⁾	21.34±1.99	32.02±0.44³⁾	1.16±0.17
Shugan	22.8 g·kg^-1	67.19	±8.78⁴⁾	43.64±9.95³⁾	2.35±0.16⁴⁾	10.93±1.17⁴⁾	19.72±2.95	30.52±0.92⁴⁾	0.99±0.15⁴⁾
Granules	45.6 g·kg^-1	63.03	±8.59⁴⁾	33.88±7.43⁴⁾	2.17±0.40	10.90±1.00⁴⁾	17.63±1.44⁴⁾	26.94±0.88⁴⁾	0.92±0.16⁴⁾

Group	Dose	ALT /U·L^-1	AST /U·L^-1	SOD /U·mg^-1	MDA /nmol·mg^-1	IL-6 /pg·mg^-1	TNF-α /pg·mg^-1	ROS /pg·mg^-1
Control		13.45	±3.31⁴⁾	42.02±5.40³⁾	2.03±0.17³⁾	9.34±1.99⁴⁾	14.92±1.68⁴⁾	21.07±3.40⁴⁾	0.74±0.07⁴⁾
Model		148.47	±10.35²⁾	61.82±8.07¹⁾	1.66±0.17¹⁾	13.66±2.42²⁾	25.46±3.67²⁾	40.97±5.27²⁾	1.26±0.16²⁾
Silybin	100 mg·kg^-1	94.72	±20.20	43.92±9.98³⁾	2.60±0.45³⁾	11.39±0.90³⁾	20.90±3.81	34.27±0.98⁴⁾	1.12±0.07
Chaihu	11.4 g·kg^-1	64.69	±10.31⁴⁾	42.85±8.86³⁾	2.53±0.27⁴⁾	11.58±1.03³⁾	21.34±1.99	32.02±0.44³⁾	1.16±0.17
Shugan	22.8 g·kg^-1	67.19	±8.78⁴⁾	43.64±9.95³⁾	2.35±0.16⁴⁾	10.93±1.17⁴⁾	19.72±2.95	30.52±0.92⁴⁾	0.99±0.15⁴⁾
Granules	45.6 g·kg^-1	63.03	±8.59⁴⁾	33.88±7.43⁴⁾	2.17±0.40	10.90±1.00⁴⁾	17.63±1.44⁴⁾	26.94±0.88⁴⁾	0.92±0.16⁴⁾

Group	Total numbers	Up-regulated numbers	Down-regulated numbers
Model vs Control	2 465	1 370	1 095
Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1) vs Model	338	223	115
Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1) vs Control	2 658	1 525	1 133
Silybin vs Model	86	48	38
Silybin vs Control	1 523	1 147	376
Silybin vs Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1)	37	13	24

Group	Total numbers	Up-regulated numbers	Down-regulated numbers
Model vs Control	2 465	1 370	1 095
Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1) vs Model	338	223	115
Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1) vs Control	2 658	1 525	1 133
Silybin vs Model	86	48	38
Silybin vs Control	1 523	1 147	376
Silybin vs Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1)	37	13	24

No.	KEGG pathway	Match status	P value	Impact
1	Starch and sucrose metabolism	5/35	2.00×10^-7	0.303 8
2	Galactose metabolism	4/46	2.95×10^-5	0.087 9
3	Ascorbate and aldarate metabolism	2/51	0.017 1	0.086 2
4	Glycerophospholipid metabolism	2/52	0.017 8	0.077 1
5	Arachidonic acid metabolism	3/37	0.000 4	0.000 0

No.	KEGG pathway	Match status	P value	Impact
1	Starch and sucrose metabolism	5/35	2.00×10^-7	0.303 8
2	Galactose metabolism	4/46	2.95×10^-5	0.087 9
3	Ascorbate and aldarate metabolism	2/51	0.017 1	0.086 2
4	Glycerophospholipid metabolism	2/52	0.017 8	0.077 1
5	Arachidonic acid metabolism	3/37	0.000 4	0.000 0

柴胡疏肝颗粒调控Keap1-Nrf2/HO-1信号通路改善四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤

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黄海锋 ¹^,² , 庞晓妍 ¹ , 戴卫波 ¹ , 黄曼婷 ¹ , 曾聪彦 ¹^,^*

中国药学杂志 | 论著 2024,59(8): 703-712

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中国药学杂志 | 论著 2024, 59(8): 703-712

柴胡疏肝颗粒调控Keap1-Nrf2/HO-1信号通路改善四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤

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黄海锋¹^,², 庞晓妍¹, 戴卫波¹, 黄曼婷¹, 曾聪彦¹^,^*

作者信息

¹ 广州中医药大学附属中山中医院, 广东中山 528400

² 广东江门中医药职业学院, 广东江门 529000

黄海锋,男,硕士研究生研究方向:中药临床药理

通讯作者:

^*曾聪彦,男,主任中药师,硕士生导师研究方向:药材研究与制剂开发 Tel:(0760)89980213

Chaihu Shugan Granules Improve Tetrachloromethane-Induced Acute Liver Injury in Mice through Regulating the Keap1-Nrf2/HO-1 Signal Pathway

Haifeng HUANG¹^,², Xiaoyan PANG¹, Weibo DAI¹, Manting HUANG¹, Congyan ZENG¹^,^*

Affiliations

¹ Zhongshan Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Guangzhou University of Chinese Medicine, Zhongshan 528400, China

² Guangdong Jiangmen Chinese Medicine College, Jiangmen 529000, China

出版时间: 2024-04-22

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摘要

收起

目的探讨柴胡疏肝颗粒对小鼠急性肝损伤的保护作用及可能机制。方法将柴胡疏肝颗粒按低、中、高(生药量:11.4、22.8、45.6 g·kg^-1)3个剂量连续给药7 d,末次给药2 h后,除正常对照组外,用体积分数0.2% 四氯化碳(tetrachloromethane,CCl₄)溶液造模,12 h后,收集小鼠的血清和肝组织,制作肝组织病理切片。测定血清中丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)和肝组织中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α),以及活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)含量;转录组学获得肝脏组织差异表达mRNA并富集与差异表达基因显著相关的通路;代谢组学研究肝组织中内源性代谢物变化并进行通路富集分析;免疫组织化学法及Western blot法检测肝组织中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MARK)、Kelch样ECH关联蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)、核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)表达及定位情况。结果与模型组比较,柴胡疏肝颗粒能显著降低小鼠血清ALT、AST和肝组织MDA、IL-6、TNF-α及ROS水平(P<0.05或P<0.01),显著升高肝组织中SOD水平(P<0.01),明显减轻肝细胞坏死及炎性浸润程度;上调Nqo1基因,上调醌氧化还原酶1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1,NQO1]表达;下调Ccl2基因,下调单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)表达,且代谢物中有机酸类显著下调,糖类显著上调。肝组织中JNK、p38 MARK、Keap1表达均显著下调(P<0.05或P<0.01),Nrf2、HO-1表达显著上调(P<0.01)。结论柴胡疏肝颗粒可能通过激活Keap1-Nrf2/HO-1信号通路,对CCl₄诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用。

关键词

柴胡疏肝颗粒 / 急性肝损伤 / 氧化应激 / Kelch样ECH关联蛋白-核因子E1/血红素加氧酶-1信号通路

Abstract

收起

OBJECTIVE To investigate the protective effect and possible mechanism of Chaihu Shugan Granules on acute liver injury in mice. METHODS Chaihu Shugan Granules was administered to mice at low, medium and high dosages (crude drug dose: 11.4, 22.8, 45.6 g·kg^-1) continuously for 7 d. Two hours after the last administration, the animal model was made with 0.2% tetrachloromethane (CCl₄) solution except the control group. The serum and liver tissues were collected after 12 h. The levels of serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) and superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), interleukin 6 (IL-6), tumor necrosis factor α (TNF-α) and reactive oxygen species (ROS) in liver tissues were measured by ELISA. HE staining was conducted to reveal the histopathological changes in liver. Transcriptomics was used to obtain differentially expressed mRNA in liver tissues and enrich differentially expressed pathways, while metabolomics was used to obtain changes in liver endogenous metabolites and enriches pathways of differential metabolites using KEGG database. The expression and location of c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MARK), kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1), nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) and heme oxygenase-1 (HO-1) in liver tissues were measured by immunohistochemistry and Western blot. RESULTS Compared with the model group, the serum levels of ALT, AST and MDA, IL-6, TNF-α and ROS in liver tissues of mice in each group of Chaihu Shugan Granules decreased significantly (P<0.05 or P<0.01), while the level of SOD in liver tissues increased significantly (P<0.01). The degree of necrosis and inflammatory infiltration in liver cells decreased significantly. Nqo1 gene and NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1 (NQO1) expression were up-regulated while Ccl2 gene and monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) expression were down-regulated. Organic acids were significantly down-regulated and carbohydrate was significantly up-regulated, the expressions of JNK, p38 MARK and Keap1 in liver tissues were significantly decreased (P<0.05 or P<0.01), while the expressions of Nrf2 and HO-1 were significantly increased (P<0.01). CONCLUSION Chaihu Shugan Granules might have protective effect on CCl₄-induced acute liver injury in mice by activating the Keap1-Nrf2/HO-1 signal pathway.

Key words

Chaihu Shugan Granules / acute liver injury / oxidative stress / Keap1-Nrf2/HO-1 signal pathway

引用本文

黄海锋, 庞晓妍, 戴卫波, 黄曼婷, 曾聪彦. 柴胡疏肝颗粒调控Keap1-Nrf2/HO-1信号通路改善四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤. 中国药学杂志, 2024 , 59 (8) : 703 -712 .

Haifeng HUANG, Xiaoyan PANG, Weibo DAI, Manting HUANG, Congyan ZENG. Chaihu Shugan Granules Improve Tetrachloromethane-Induced Acute Liver Injury in Mice through Regulating the Keap1-Nrf2/HO-1 Signal Pathway[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (8) : 703 -712 .

正文

收起

肝脏是调节体内代谢和解毒的重要器官,极易受药物或环境等外界因素影响造成肝损伤,严重的发展成肝癌,危害人类健康。肝病目前已经成为影响人类健康的最常见疾病之一,寻找有效的防治药物来应对因各种原因所致的肝损伤,也成为目前研究的热点。近年来中医药在肝损伤防治研究方面取得很多进展,研究表明中药可通过抗氧自由基损伤、抑制脂质过氧化反应、降低炎症反应和凋亡介质产生等方面改善肝损伤^[1-3]。

柴胡疏肝颗粒为广州中医药大学附属中山中医院院内制剂(粤药制字Z20130011),由柴胡、当归、白芍、茯苓等10味中药组成,具有疏肝解郁、养血健脾、散结止痛的功效,临床研究证实其对肝郁气滞、血虚脾弱所致的良性乳腺疾病、月经不调等有良好疗效^[4],但有关其药效机制尚不明确。本研究通过四氯化碳(tetrachloromethane,CCl₄)诱导的急性肝损伤模型探讨柴胡疏肝颗粒对急性肝损伤的保护作用,并揭示其可能的作用机制,为其临床应用和制剂的进一步研究开发提供科学依据。

1 材料与仪器

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1.1 动物

SPF级C57BL/6雄性小鼠60只,5周龄,(18±0.5)g,购于广东省医学实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK(粤)2018-0002,动物质量合格证号:No.44822700002481。饲养于中山市中医院中药药理实验室SPF级动物实验室,实验动物使用许可证SYXK(粤)2020-0109,饲养室温控制在(20±2)℃,相对湿度(50±5)%,给予SPF级标准饲料和无菌饮用水。本实验经中山市中医院实验动物伦理委员会批准,审批号:AEWC-2020028,本实验遵守国家有关实验动物保护与使用准则。

1.2 药物及试剂

水飞蓟宾(批号:C13425764)、CCl₄(批号:C11588428)(上海麦克林生化科技股份有限公司);羧甲基纤维素钠(批号:R008134,上海易恩化学技术有限公司);橄榄油(国药集团化学试剂有限公司);丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT,批号:20210817)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST,批号:20210816)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD,批号:535220730)、丙二醛(malondialdehyde,MDA,批号:417220730)、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6,批号:385220730)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α,批号:569220224)、活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS,批号:653210224)ELISA检测试剂盒(天津安诺瑞康生物技术有限公司);兔抗鼠一抗c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)1/2/3(批号:51n7087)、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MARK,批号:10y0837)、血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1,批号:AF5393)、β-actin(批号:AF7018)抗体(美国Affinity公司);Kelch样ECH关联蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)抗体[批号:D199574,生工生物工程(上海)股份有限公司];核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)抗体(批号:A0674,武汉爱博泰克生物科技有限公司);辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG二抗(批号:7074P2,美国CST公司)。

1.3 药物配制

柴胡疏肝颗粒组方:柴胡10 g、当归10 g、白芍10 g、云苓15 g、白术10 g、川芎10 g、郁金10 g、薄荷3 g、炮姜5 g、甘草5 g,粉碎成粗粉加水煮沸,煎煮液用纱布过滤,滤液浓缩至1.14、2.28、4.56 g·mL^-1(按生药量计)分别作为低、中、高剂量。水飞蓟宾用质量分数0.5%羧甲基纤维素钠溶液配制成10 mg·mL^-1的混悬液。

1.4 仪器

JA-1203型电子天平(上海天平仪器厂);BS224 S型电子分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);F6/10型手持式超细匀浆器(德国FLUKO公司);MULTISKAN FC型酶标仪(美国Thermo公司);化学发光成像系统、Basic电泳仪(美国Bio-Rad公司);2015-RM型切片机(德国Leica公司);2-16R型高速冷冻离心机(湖南恒诺设备仪器有限公司);Eclipse Ci-L正置显微镜(日本Nikon公司);TS-1型脱色摇床(江苏其林贝尔公司)。

2 实验方法

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2.1 实验动物分组及处理

将60只小鼠随机分为正常对照组、模型组、水飞蓟宾组(100 mg·kg^-1)和柴胡疏肝颗粒低、中、高剂量组(11.4、22.8、45.6 g·kg^-1,按照人和小鼠体表面积换算,等效于成人临床剂量的1、2、4倍),每组10只,每组动物体质量差异不超过平均体质量的20%。实验前作1周的动物健康观察,并测定动物体质量。各给药组小鼠给予相应药物,每日2次,连续给药7 d,灌胃体积均为10 mL·kg^-1,正常对照组和模型组小鼠灌胃等体积质量分数0.5%羧甲基纤维素钠溶液。末次给药结束2 h后,模型组和各药物组小鼠均腹腔注射以橄榄油稀释的体积分数0.2% CCl₄溶液,注射体积为10 mL·kg^-1;正常对照组小鼠腹腔注射等体积橄榄油。

2.2 样品采集与检测

2.2.1 小鼠的一般状态观察

给药期间观察小鼠的毛色及生活状态,每日称量小鼠的体质量。造模12 h后,摘眼球取血,脱颈处死小鼠后,取各组小鼠的肝组织,生理盐水清洗干净,使用滤纸吸干水分后,称定肝质量。

2.2.2 血清肝功能酶检测

造模12 h后,各组动物摘眼球取血后,3 000 r·min^-1离心5 min,取上层血清,按照试剂盒说明书步骤检测血清中ALT、AST的含量。

2.2.3 肝组织生化指标及病理检测

取肝左叶组织,制备组织匀浆,根据试剂盒说明书步骤操作,检测SOD、MDA、IL-6、TNF-α及ROS水平。切取肝右叶组织,使用体积分数10%中性甲醛固定、石蜡包埋、切片后,进行苏木精-伊红(hematoxylin eosin,HE)染色,观察肝组织中肝细胞肿胀坏死、炎性浸润等病理变化;组织切片进行免疫组织化学染色,检测组织中JNK、p38 MARK、Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达情况,阳性表达为棕黄色或棕色,通过Image J图像分析软件计算平均光密度(optical density,OD)值。

2.2.4 肝组织相关蛋白表达检测

使用总蛋白提取试剂盒提取肝组织蛋白,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)法测定提取蛋白的浓度。取等量蛋白上样,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶电泳,并转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜。阻断非特异性结合位点后,将膜与一抗Keap1(1∶1 000)、Nrf2(1∶1 000)、HO-1(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)抗体于4 ℃孵育过夜。磷酸盐吐温缓冲液(phosphate buffered saline and tween 20,PBST)溶液洗涤3次,每次5 min,将膜转移至二抗羊抗兔IgG(1∶2 000)中,室温孵育3 h,再用PBST溶液洗涤3次,每次5 min,用化学发光液在显影仪中进行显影。

2.2.5 转录组学与代谢组学研究

取正常对照组、模型组、水飞蓟宾组以及柴胡疏肝颗粒中剂量组动物肝组织快速漂洗,并分别剪切成约50和100 mg两份样品,液氮速冻0.5 h,转至-80 ℃冰箱冻存,干冰覆盖寄往上海美吉生物医药科技有限公司进行分析。

2.3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差(

$\stackrel{-}{x}$

±s)表示。多组间比较采用单因素方差分析,两两比较方差齐时采用LSD检验,方差不齐时采用Tamhane's T2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

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3.1 柴胡疏肝颗粒对CCl₄致肝损伤小鼠一般状态的影响

造模前各组动物毛色、饮食、活动正常,造模前7 d各组小鼠体质量持续增长。造模后,除正常对照组外,其余各组动物状态均发生较明显变化,如毛色暗淡、饮食减少、活动减少、体质量下降,以及尿液黄色加深等。

3.2 柴胡疏肝颗粒对CCl₄致肝损伤小鼠血清肝功能酶及肝组织生化指标的影响

与正常对照组比较,模型组小鼠血清ALT、AST含量显著升高(P<0.01或P<0.05),肝组织中SOD水平显著降低(P<0.05),MDA、IL-6、TNF-α及ROS水平显著升高(P<0.01)。与模型组比较,柴胡疏肝颗粒各剂量组小鼠血清ALT、AST含量均显著降低(P<0.01或P<0.05),肝组织中MDA、TNF-α水平显著降低(P<0.01或P<0.05)。柴胡疏肝颗粒低、中剂量组小鼠肝组织中SOD水平显著升高(P<0.01)。柴胡疏肝颗粒中、高剂量组小鼠肝组织中ROS水平均显著低于模型组(P<0.01);高剂量组小鼠肝组织中IL-6水平显著低于模型组(P<0.01)。结果见表1。

3.3 柴胡疏肝颗粒对CCl₄致肝损伤小鼠肝组织病理学的影响

正常对照组肝组织细胞结构清晰,排列整齐规则,细胞饱满未见损伤;模型组肝组织大量炎性细胞浸润,肝小叶内中央静脉和汇管区肝细胞肿胀,可见明显的肝细胞坏死及弥漫性炎细胞浸润;水飞蓟宾组和柴胡疏肝颗粒各剂量组肝组织炎性细胞浸润明显减轻,肝小叶汇管区附近肝细胞坏死程度明显减轻,肝小叶中肝细胞水肿、气球样变减轻。结果见图1。

3.4 柴胡疏肝颗粒对CCl₄致肝损伤小鼠的转录组与代谢组研究

3.4.1 转录组数据评估

各样品有效数据(clean data)均达到6.03 Gb以上,Q30碱基百分比在95.24%以上,说明数据质量较高。分别将各样品的高质量序列(clean reads)与指定的参考基因组进行序列比对,比对率为95.84%~96.76%。

3.4.2 差异表达基因统计分析

基于表达量定量结果进行组间差异基因分析,获得两组间的差异表达基因。差异分析软件为DESeq2,P值多重检验校正方法为Benjamini-Hochberg(BH),筛选阈值为|log₂FC|≥1和P<0.05。结果见表2。

与模型组比较,柴胡疏肝颗粒中剂量组223个基因表达上调,包括表达醌氧化还原酶1[NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1,NQO1]的Nqo1等,115个基因表达下调,包括表达单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的Ccl2等。正常对照组、模型组、柴胡疏肝颗粒中剂量组共有的差异表达基因有124个,其中47个基因先上调后下调,包括Mthfr、Guca1a、Gdf9、Mcrip1、Pmepa1、Slc25a30、Ahcyl、Aldh1l2、Ccl2等,72个基因先下调后上调,包括Cyp2c54、Retreg1、Cdip1、Adhfe1、Zfp966、Slc1a2、Znrf3、Ahr、Nr1d1等。结果见图2A。

3.4.3 差异表达基因功能分析

基因本体(gene ontology,GO)功能富集分析结果见图2B、C。柴胡疏肝颗粒中剂量组差异表达mRNA显著富集于15项细胞组分,46项分子功能和281项生物学过程。正常对照组、模型组、柴胡疏肝颗粒中剂量组共有的差异表达mRNA显著富集于2项细胞组分和2项生物学过程。

京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析结果见图2D、E。柴胡疏肝颗粒中剂量组差异表达mRNA富集于219条KEGG 通路,显著富集于30条通路(P<0.05)。正常对照组、模型组、柴胡疏肝颗粒中剂量组共有的差异表达mRNA富集于154条KEGG 通路,显著富集于5条通路(P<0.05)。

3.4.4 代谢轮廓分析

偏最小二乘判别分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)表明,组间样本分离明显,组内聚集良好,质控样本紧密聚集,表明该系统稳定性高。置换检验表明,R²和Q²的置换值均小于原始值,且数值均接近1,表明模型可靠。结果见图3。

3.4.5 差异代谢物的鉴定结果

按照P<0.05且VIP>1且|log₂FC|≥1筛选差异显著代谢物,与正常对照组比较,模型组共有206个差异代谢物,其中,上调代谢物108个,下调代谢物98个,经柴胡疏肝颗粒治疗后24个代谢物显著回调,52个代谢物如L-半乳糖、甘露聚糖、糖原、水苏糖等显著上调且向正常对照组转归。与模型组比较,柴胡疏肝颗粒中剂量组共有159个差异代谢物,其中99个上调,60个下调,有机酸类如脱氧胆酸、胆汁酸、胆酸等显著下调。结果见图4。

3.4.6 差异代谢物的代谢通路分析

按照P<0.05将正常对照组、模型组、柴胡疏肝颗粒中剂量组共有的83个差异代谢物作通路分析,显著富集的代谢通路名称、P值和影响值(impact)等见表3,主要富集于5条代谢通路,即淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、抗坏血酸和醛酸代谢、甘油磷脂代谢,以及花生四烯酸代谢。

3.5 免疫组化检测柴胡疏肝颗粒对CCl₄致肝损伤小鼠肝组织JNK、p38MARK、Keap1、Nrf2、HO-1蛋白表达的影响

与正常对照组比较,模型组小鼠肝组织JNK、p38 MARK、Keap1蛋白表达均显著升高(P<0.01),且集中在肝细胞坏死组织附近;Nrf2、HO-1蛋白表达均显著降低(P<0.01)。与模型组比较,柴胡疏肝颗粒各剂量组小鼠肝组织JNK、p38 MARK、Keap1蛋白表达均显著降低(P<0.05或P<0.01),Nrf2、HO-1蛋白表达均显著升高(P<0.01)。结果见图5。

3.6 Western blot 检测柴胡疏肝颗粒对CCl₄致肝损伤小鼠肝组织Keap1、Nrf2、HO-1相关蛋白表达的影响

与正常对照组比较,模型组小鼠肝组织Keap1蛋白表达显著升高,Nrf2、HO-1蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,柴胡疏肝颗粒各剂量组小鼠肝组织Keap1蛋白表达均显著降低,Nrf2、HO-1蛋白表达均显著升高(P<0.01)。结果见图6。

4 讨论

收起

研究表明,CCl₄诱导肝损伤与氧化应激相关。CCl₄在体内经肝细胞色素P450代谢活化,生成三氯甲基自由基和氯自由基。自由基促使肝细胞膜上的磷脂分子发生脂质过氧化反应,产生的氧自由基增多,与细胞膜的脂质和蛋白质以共价键结合,破坏细胞膜结构导致功能丧失^[5-6];同时,组织内抗氧化损伤酶(如SOD等)活性降低,降低肝脏抗氧化损伤的能力,从而造成肝损伤^[7]。ALT、AST主要分布在肝细胞内,当发生炎症损伤时,肝细胞肿胀破裂释放入血,因此血清生化指标能较灵敏地反映肝细胞损伤严重程度,是衡量机体肝功能的重要指标^[8]。本研究建立CCl₄致肝损伤模型,发现模型组小鼠血清中ALT、AST水平与正常对照组比较均明显升高。柴胡疏肝颗粒各剂量组能降低CCl₄诱导肝损伤模型小鼠血清中ALT、AST水平。

ROS可与磷脂、酶、膜受体和核酸的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,该反应改变细胞膜的流动性和渗透性,最终导致细胞结构和功能改变^[9]。SOD是专一性抗氧化酶,为机体抗氧化应激的首道防线,通过与超氧自由基发生歧化反应,催化其转化为过氧化氢和氧气,从而清除体内的超氧阴离子。MDA是ROS诱导膜脂发生过氧化后的终产物,其与胞质、膜蛋白或酶形成聚合体而损害细胞膜结构,导致肝细胞变性、坏死^[10]。因此,检测肝组织中SOD和MDA 的水平,可反映肝脏氧化损伤的程度。TNF-α、IL-6、IL-10均是肝损伤相关的重要炎性介质,加重肝细胞变性坏死的同时,促进炎症因子的释放,进而加剧炎症反应^[11]。本研究表明,CCl₄诱导小鼠肝损伤后肝组织中MDA、IL-6、TNF-α及ROS等炎症因子水平显著升高,SOD 水平显著降低,HE染色结果显示肝小叶汇管区附近肝细胞出现明显坏死,坏死区域可见大量炎性细胞浸润。而柴胡疏肝颗粒可下调Ccl2基因,逆转MCP-1等炎症因子上调,显著升高SOD水平,肝组织炎性细胞浸润和坏死程度明显减轻,提示其能缓解肝组织的炎症反应,改善肝组织损伤,对CCl₄诱导肝损伤小鼠有一定保护作用。

氧化应激造成的生物分子损伤会破坏正常细胞生理学,影响脂类、碳水化合物等代谢过程。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ,PPARγ)是一种核激素受体,可调节葡萄糖和脂质的稳态以及激活Nrf2^[12-13]。柴胡疏肝颗粒可能通过激活PPAR信号通路,上调下游靶基因,从而调节脂肪酸氧化等过程。本研究发现,柴胡疏肝颗粒能下调肝损伤后肝脏胆酸类和花生四烯酸代谢物19(S)-羟基二十碳四烯酸等,同时上调肝内糖原归于正常水平,逆转CCl₄诱导肝损伤所致的糖代谢紊乱。

研究发现,Keap1-Nrf2-ARE信号通路是机体抗氧化应激或外源性损伤等的重要信号通路^[14]。Keap1属于Kelch家族,是胞质肌动蛋白细胞骨架上的一种阻遏蛋白,可负性调节Nrf2^[15]。Nrf2属于Cap-n-Collar调节蛋白家族,是细胞抗氧化应激的关键转录因子。通常Keap1与Nrf2结合在胞质内,为功能抑制状态;当细胞受到刺激,Nrf2即与Keap1解偶联进入细胞核,并结合到抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)的DNA序列上,启动其调控的Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的基因进行表达,如HO-1、NQO1等,从而发挥机体抗氧化应激的作用^[16]。HO-1是血红蛋白加氧酶的氧应激诱导型,当急性肝损伤时大量表达,发挥保护肝细胞的作用^[10]。本研究发现柴胡疏肝颗粒能显著下调肝损伤后肝组织中的Keap1蛋白,上调Nrf2和HO-1蛋白,上调Nqo1基因,从而上调NQO1蛋白。

MAPK级联反应的3条信号转导通路激活后的生物学作用各不相同,研究表明细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)激活有助于肝细胞抗氧化应激,而JNK和p38 MAPK激活常表现为促凋亡,其中JNK信号通路是导致肝细胞坏死及凋亡的最主要途径。CCl₄诱导产生的ROS和炎症因子的升高,可刺激p38 MAPK、JNK磷酸化而激活,激活后又可增加炎症因子的释放^[17]。本研究发现柴胡疏肝颗粒能显著下调肝损伤后肝组织JNK、p38 MARK蛋白的表达。

综上所述,柴胡疏肝颗粒能显著降低CCl₄诱导的肝损伤模型小鼠血清ALT、AST水平,显著升高肝损伤组织中SOD水平,降低MDA、IL-6、TNF-α及ROS水平,提升肝组织抗氧化应激作用,抑制炎症因子释放,缓解肝组织的炎性损伤;并能明显减少肝细胞坏死,减轻炎性细胞浸润,改善肝组织病理损伤,发挥一定的肝功能保护作用。柴胡疏肝颗粒能上调肝损伤后肝组织Nrf2、HO-1蛋白表达,下调Keap1、JNK、p38 MARK蛋白表达,提示柴胡疏肝颗粒可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路缓解肝损伤模型小鼠的氧化应激损伤,抑制JNK/p38 MARK信号通路激活所致炎症反应和肝细胞坏死,从而发挥治疗作用,为临床应用柴胡疏肝颗粒治疗肝损伤提供了理论依据。

基金

收起

国家自然科学基金青年项目资助(82305119)
广东省自然科学基金面上项目资助(2023A1515011699)
广东省医学科研基金资助(A2022479)
全国中药特色技术传承人才培训项目资助(国中医药人教函〔2023〕96号)

参考文献

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文献

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2024年第59卷第8期

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接收时间：2023-11-06
首发时间：2026-04-08
出版时间：2024-04-22

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收稿日期：2023-11-06

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国家自然科学基金青年项目资助(82305119)

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广东省医学科研基金资助(A2022479)

全国中药特色技术传承人才培训项目资助(国中医药人教函〔2023〕96号)

作者信息

¹ 广州中医药大学附属中山中医院, 广东中山 528400

² 广东江门中医药职业学院, 广东江门 529000

通讯作者:

^*曾聪彦,男,主任中药师,硕士生导师研究方向:药材研究与制剂开发 Tel:(0760)89980213

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Group	Dose	ALT /U·L^-1	AST /U·L^-1	SOD /U·mg^-1	MDA /nmol·mg^-1	IL-6 /pg·mg^-1	TNF-α /pg·mg^-1	ROS /pg·mg^-1
Control		13.45	±3.31⁴⁾	42.02±5.40³⁾	2.03±0.17³⁾	9.34±1.99⁴⁾	14.92±1.68⁴⁾	21.07±3.40⁴⁾	0.74±0.07⁴⁾
Model		148.47	±10.35²⁾	61.82±8.07¹⁾	1.66±0.17¹⁾	13.66±2.42²⁾	25.46±3.67²⁾	40.97±5.27²⁾	1.26±0.16²⁾
Silybin	100 mg·kg^-1	94.72	±20.20	43.92±9.98³⁾	2.60±0.45³⁾	11.39±0.90³⁾	20.90±3.81	34.27±0.98⁴⁾	1.12±0.07
Chaihu	11.4 g·kg^-1	64.69	±10.31⁴⁾	42.85±8.86³⁾	2.53±0.27⁴⁾	11.58±1.03³⁾	21.34±1.99	32.02±0.44³⁾	1.16±0.17
Shugan	22.8 g·kg^-1	67.19	±8.78⁴⁾	43.64±9.95³⁾	2.35±0.16⁴⁾	10.93±1.17⁴⁾	19.72±2.95	30.52±0.92⁴⁾	0.99±0.15⁴⁾
Granules	45.6 g·kg^-1	63.03	±8.59⁴⁾	33.88±7.43⁴⁾	2.17±0.40	10.90±1.00⁴⁾	17.63±1.44⁴⁾	26.94±0.88⁴⁾	0.92±0.16⁴⁾

Group

Dose

ALT
/U·L^-1

AST
/U·L^-1

SOD
/U·mg^-1

MDA
/nmol·mg^-1

IL-6
/pg·mg^-1

TNF-α
/pg·mg^-1

ROS
/pg·mg^-1

Control

13.45

±3.31⁴⁾

42.02±5.40³⁾

2.03±0.17³⁾

9.34±1.99⁴⁾

14.92±1.68⁴⁾

21.07±3.40⁴⁾

0.74±0.07⁴⁾

Model

148.47

±10.35²⁾

61.82±8.07¹⁾

1.66±0.17¹⁾

13.66±2.42²⁾

25.46±3.67²⁾

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Silybin

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94.72

±20.20

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11.39±0.90³⁾

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Chaihu

11.4 g·kg^-1

64.69

±10.31⁴⁾

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Shugan

22.8 g·kg^-1

67.19

±8.78⁴⁾

43.64±9.95³⁾

2.35±0.16⁴⁾

10.93±1.17⁴⁾

19.72±2.95

30.52±0.92⁴⁾

0.99±0.15⁴⁾

Granules

45.6 g·kg^-1

63.03

±8.59⁴⁾

33.88±7.43⁴⁾

2.17±0.40

10.90±1.00⁴⁾

17.63±1.44⁴⁾

26.94±0.88⁴⁾

0.92±0.16⁴⁾

Group	Total numbers	Up-regulated numbers	Down-regulated numbers
Model vs Control	2 465	1 370	1 095
Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1) vs Model	338	223	115
Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1) vs Control	2 658	1 525	1 133
Silybin vs Model	86	48	38
Silybin vs Control	1 523	1 147	376
Silybin vs Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1)	37	13	24

Group

Total numbers

Up-regulated numbers

Down-regulated numbers

Model vs Control

2 465

1 370

1 095

Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1) vs Model

338

223

115

Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1) vs Control

2 658

1 525

1 133

Silybin vs Model

Silybin vs Control

1 523

1 147

376

Silybin vs Chaihu Shugan Granules(22.8 g·kg^-1)

No.	KEGG pathway	Match status	P value	Impact
1	Starch and sucrose metabolism	5/35	2.00×10^-7	0.303 8
2	Galactose metabolism	4/46	2.95×10^-5	0.087 9
3	Ascorbate and aldarate metabolism	2/51	0.017 1	0.086 2
4	Glycerophospholipid metabolism	2/52	0.017 8	0.077 1
5	Arachidonic acid metabolism	3/37	0.000 4	0.000 0

No.

KEGG pathway

Match status

P value

Impact

Starch and sucrose metabolism

5/35

2.00×10^-7

0.303 8

Galactose metabolism

4/46

2.95×10^-5

0.087 9

Ascorbate and aldarate metabolism

2/51

0.017 1

0.086 2

Glycerophospholipid metabolism

2/52

0.017 8

0.077 1

Arachidonic acid metabolism

3/37

0.000 4

0.000 0