中国药学杂志

Concentration levels/%	Analyst A/U·mL^-1	Analyst B/U·mL^-1
50	403.70	441.70	422.06	416.12	374.26	426.16
	383.68	450.66	417.38	423.08	388.52	435.92
	396.42	431.74	431.74	389.28	377.44	400.54
80	415.54	440.44	407.76	394.38	384.99	380.46
	406.04	442.26	411.03	387.28	391.71	377.25
	423.90	430.08	414.53	391.71	386.26	363.65
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	395.73	404.70	401.35	384.95	398.69	412.69
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Concentration levels/%	Analyst A/U·mL^-1	Analyst B/U·mL^-1
50	403.70	441.70	422.06	416.12	374.26	426.16
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Condition	Activity/U·mL^-1	CV/%
Temperature/℃	36.5	391.73	2.44
	37.0	404.65
	37.5	411.01
Reaction time/min	14	400.23	1.03
	15	406.59
	16	408.08
Concentration of substrate	45	401.60	0.54
solution/mol·L^-1	50	398.51
	55	397.46

Condition	Activity/U·mL^-1	CV/%
Temperature/℃	36.5	391.73	2.44
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Reaction time/min	14	400.23	1.03
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Concentration of substrate	45	401.60	0.54
solution/mol·L^-1	50	398.51
	55	397.46

c(p-Nitrophenol) /mmol·L^-1	Test	Mean ΔOD40	c(Experimental)/mmol·L^-1	Recovery/%	Mean Recovery/%
0.01	test 1	0.192	0.010	104.74	105.07
	test 2	0.193	0.011	105.65
	test 3	0.192	0.010	104.84
0.025	test 1	0.434	0.024	94.94	95.51
	test 2	0.445	0.024	97.19
	test 3	0.432	0.024	94.40
0.05	test 1	0.894	0.049	97.73	98.56
	test 2	0.900	0.049	98.39
	test 3	0.911	0.050	99.55
0.10	test 1	1.815	0.099	99.19	98.83
	test 2	1.790	0.098	97.82
	test 3	1.821	0.099	99.49
0.15	test 1	2.642	0.144	96.24	95.97
	test 2	2.633	0.144	95.92
	test 3	2.629	0.144	95.76

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	test 3	2.629	0.144	95.76

罕见病酶替代疗法药物重组人α-半乳糖苷酶A酶活性测定方法研究

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王绿音 , 张孝明 , 李晶 ^* , 梁成罡 ^*

中国药学杂志 | 论著 2024,59(8): 738-744

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中国药学杂志 | 论著 2024, 59(8): 738-744

罕见病酶替代疗法药物重组人α-半乳糖苷酶A酶活性测定方法研究

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王绿音, 张孝明, 李晶^*, 梁成罡^*

作者信息

中国食品药品检定研究院激素室, 国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室, 国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室, 北京 102629

王绿音,女,硕士,助理研究员研究方向:激素类药物质量控制研究

通讯作者:

^*梁成罡,男,研究员研究方向:激素类药物质量控制研究 Tel:(010)67095380;

李晶,女,主任药师研究方向:激素类药物质量控制研究 Tel:(010)53851638

Activity Assay of Recombinant Human α-Galactosidase A for Enzyme Replacement Therapy of Rare Diseases

Lüyin WANG, Xiaoming ZHANG, Jing LI^*, Chenggang LIANG^*

Affiliations

NMPA Key Laboratory for Quality Research and Evaluation of Biological Products, NMPA Key Laboratory for Quality Research and Evaluation of Chemical Drugs, Division of Hormone, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629, China

出版时间: 2024-04-22

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摘要

收起

目的基于酶反应动力学理论对重组人α-半乳糖苷酶A (recombinant human α-galactosidase A, rhα-GAL) 酶活性测定反应条件进行系统研究,建立更灵敏简便、准确稳定的rhα-GAL酶活性测定方法。方法优化反应体系后的最适条件为:以50 mmol·L^-1对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷的为底物,酶质量浓度为1.67 μg·mL^-1,于37 ℃水浴准确反应15 min后,加入甘氨酸缓冲液(pH10.5)终止反应,采用酶标仪在400 nm波长处测定产物对硝基苯酚的光密度值。结果该方法专属性良好,rhα-GAL在(0.83~2.51 mg·mL^-1)(r=0.999 8)质量浓度范围内与酶促反应速率呈良好的线性关系;rhα-GAL在50%、80%、100%、125%及150%浓度水平验证溶液的回收率在94.2%~101.8%范围内(n=18),测定结果的变异系数(CV)在2.0%~5.5%(n=18);同一份供试品溶液的12次独立测定结果的CV为2.21%;考察反应体系中的水浴温度、反应时间和底物浓度微小变化对测定结果的影响,结果表明方法的耐用性较好;复溶后的样品于2~8 ℃存放48 h稳定性较好;水解产物对硝基苯酚在(0.01~0.15 mmol·L^-1)(r=0.999 7)范围内与光密度呈良好的线性关系,5个浓度水平的回收率在94.9%~105.1%之间(n=9),CV均小于2%(n=9);采用该法分析2个已上市产品的酶活性。结论建立了生色底物法测定rhα-GAL的酶活性,该方法灵敏度高、精密度及准确度较好,可用于rhα-GAL产品的酶活性评价和质量控制。

关键词

罕见病用药 / 酶替代疗法 / 重组人α-半乳糖苷酶A / 酶活性测定 / 生色底物法 / 方法验证

Abstract

收起

OBJECTIVE To establish a more sensitive, simple, accurate and stable method for determining the activity of recombinant human α-galactosidase A (rhα-GAL) based on the kinetic theory of enzyme reaction and study the assay conditions for the activity assay. METHODS The optimum conditions of the assay system were as follows: 50 mmol·L^-1 p-nitrophenyl-α-D-galactopyranoside was used as the substrate, the concentration of the enzyme was 1.67 μg·mL^-1, the reaction was accurately carried out in a water bath at 37 ℃ for 15 min, then the reaction was terminated by glycine buffer (pH 10.5), and the absorbance was measured at 400 nm using a microplate reader. RESULTS The method had good specificity. Rhα-GAL showed a good linear relationship with the enzymatic reaction rate in the range of 0.83-2.51 mg·mL^-1 (r=0.999 8). The recoveries of validation solutions at 50%, 80%, 100%, 125% and 150% concentrations were in the range of 94.2%-101.8% (n=18), and the CVs of the measured results were between 2.0% and 5.5% (n=18). The CV of 12 independent tests of the same sample was 2.21% (n=12). The effects of slight changes in water bath temperature, reaction time and substrate concentration in the reaction system on the results were investigated,confirming the good robustness of the method. The reconstituted sample showed good stability when stored at 2-8 ℃ for 48 h. p-Nitrophenol showed a good linear relationship with the absorbance in the range of 0.01-0.15 mmol·L^-1 (r=0.999 7). The recoveries of p-nitrophenol solution at five concentrations were in the range of 94.9%-105.1% (n=9),and the CVs were all below 2.0% (n=9). The activity of two rhα-GAL products was determined by this method. CONCLUSION A chromogenic substrate method was established to determine the activity of rhα-GAL and validated with good sensitivity, precision and accuracy, which can be used for the activity evaluation and quality control of the product.

Key words

rare disease product / enzyme replacement therapy / rhα-GAL / activity assay / chromogenic substrates assay / method validation

引用本文

王绿音, 张孝明, 李晶, 梁成罡. 罕见病酶替代疗法药物重组人α-半乳糖苷酶A酶活性测定方法研究. 中国药学杂志, 2024 , 59 (8) : 738 -744 .

Lüyin WANG, Xiaoming ZHANG, Jing LI, Chenggang LIANG. Activity Assay of Recombinant Human α-Galactosidase A for Enzyme Replacement Therapy of Rare Diseases[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (8) : 738 -744 .

正文

收起

罕见病用药是用于治疗、诊断、预防罕见疾病的药品,这类疾病具有发病率低、诊断难度大、治疗可及性差的特点^[1]。溶酶体贮积症(lysosomal storage disorders, LSD)是一种与遗传因素密切相关的代谢性罕见病,由于溶酶体内的酶、转运蛋白或酶修饰剂等缺陷致使代谢物无法被有效降解而在溶酶体中过度贮积,引发进行性的多器官多系统病变^[2-3]。法布里病是一种位于X染色体上编码α-半乳糖苷酶A基因突变导致的遗传性溶酶体贮积症,已被列入中国首批罕见病目录,酶替代疗法(enzyme replacement therapy, ERT)是目前公认最有效的治疗手段^[4-5],患者需持续终生用药。注射用阿加糖酶β(fabrazyme,法布赞)和阿加糖酶α注射用浓溶液(replagal,瑞普佳)分别于2019年和2020年在我国获准上市,目前尚无国产药物上市^[6]。上述两个产品均系利用重组DNA技术生产的重组人α-半乳糖苷酶A(recombinant human α-galactosidase A, rhα-GAL),这是一种能够特异性催化α-半乳糖从中性糖鞘脂(neutral glycosphingolipid)分子上水解的人溶酶体酸性水解酶。这种以α-半乳糖为末端的中性糖鞘脂主要是酰基鞘氨醇三己糖苷(globotriaosylceramide, GL-3),还包括半乳糖神经酰胺(galabiosylceramide)等^[7-8]。

rhα-GAL(EC 3.2.1.22)是一种相对分子质量约为1×10⁵的同源二聚体糖蛋白,由2个相对分子质量约为5×10⁴的亚基组成,每个亚基含398个氨基酸。成熟的rhα-GAL通过切除信号肽,随后在4个N-连接糖基化位点引入糖链,进行翻译后糖基化修饰,通过甘露糖-6-磷酸(M6P)受体介导的路径靶向进入溶酶体^[9]。作为一个结构复杂的糖基化修饰重组蛋白酶,酶活性是反映此类产品有效性的关键质量属性,研究建立特异性强、快速简便、准确稳定的酶活性测定方法对于产品的质量控制至关重要。目前,已上市产品采用可以被rhα-GAL催化水解的合成底物来测定其酶活性,分别为荧光底物4-甲基伞形酮基-α-D-吡喃半乳糖苷和生色底物对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷,通过定量酶解底物产生的荧光分子4-甲基伞形酮或发色基团对硝基苯酚检测酶活性。荧光底物法利用荧光分光光度计依次测定配制的标准曲线溶液和酶底物反应溶液中4-甲基伞形酮的荧光值,由于4-甲基伞形酮的荧光衰减较快,不够稳定,方法的准确性有待提高。与荧光底物法相比,生色底物法检测时间更短,产物对硝基苯酚也更稳定。但该方法采用外标法测定样品反应液中的对硝基苯酚,依赖于经标化的对硝基苯酚标准品,为充分溶解底物,在稀释溶液中加入了乙醇,这不仅会影响酶促反应速率,其挥发性还会导致方法精密度变差。因此,有必要对现有的酶活性测定方法进行优化,进一步提高方法的灵敏度、准确度和精密度。

本研究以酶反应动力学理论为指导,对生色底物法酶活性测定体系中的底物浓度、酶量、缓冲液的pH值、反应时间进行了优化,利用对硝基苯酚在400 nm波长下的摩尔消光系数对该物质进行定量,建立了更灵敏、快速简便、准确稳定的rhα-GAL酶活性测定方法,并按照国际人用药品注册技术协调会-分析方法验证(ICHQ2)进行了方法学研究。

1 仪器与试药

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1.1 仪器

多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司,型号:SpectraMax M5e);恒温水浴锅(美国Thermo Scientific公司,型号:HAAKE S30);电子天平(METTLER TOLEDO公司,型号:AG245);超纯水机(美国Millipore公司,型号:Milli-Q IQ7000)。

1.2 试药

rhα-GAL产品(企业A,科室留样,批号:DW0305、DW0306、DW0283,每瓶5 mg);rhα-GAL产品(企业B,科室留样,批号:TRVL22A04、TRVJ18A01、TRVB04A06,每瓶3.5 mg,3.5 mL);对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷、对硝基苯酚、柠檬酸一水合物、无水磷酸氢二钠、甘氨酸、氢氧化钠、牛血清白蛋白、氯化钠(美国Sigma公司)分析纯;实验用水为纯化水。

2 方法与结果

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2.1 溶液制备

2.1.1 稀释缓冲液

称取枸橼酸一水合物4.15 g,无水磷酸氢二钠4.30 g,加水900 mL,加入5% 牛血清白蛋白溶液20 mL,混匀后测定溶液的pH值,如有必要,以1 mol·L^-1枸橼酸溶液或10 mol·L^-1氢氧化钠溶液调节pH值至5.00,加水稀释至1 000 mL。以稀释缓冲液作为空白溶液。

2.1.2 底物溶液

称取对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷15.00 g,加入稀释缓冲液1 000 mL,于室温下搅拌混匀90 min直至完全溶解,制成每1 L含对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷50 mmol的底物溶液,分装冻存于-80 ℃。

2.1.3 终止缓冲液

称取甘氨酸37.54 g,加水900 mL充分溶解,以10 mol·L^-1氢氧化钠溶液调节pH值至10.50,加水稀释至1 000 mL。

2.1.4 供试品溶液

取rhα-GAL,照说明书加注射用水复溶为每1 mL含5 mg rhα-GAL的溶液,采用稀释缓冲液,先连续进行2次10倍稀释,再稀释30倍,3次共稀释3 000倍,即为每1 mL含 rhα-GAL 1.67 mg的供试品溶液。

2.2 测定方法

于37 ℃水浴中避光解冻底物溶液,直至所有固体完全溶解,将底物溶液置于37 ℃保温(不超过5 h)。取稀释缓冲液500 μL,加入终止缓冲液500 μL,混匀后加入酶标仪配套的光程校正比色皿中,放入酶标仪的比色皿槽中,用于校正最终反应混合液在96孔板中的液面光程。

精密量取底物溶液225 μL于1.2 mL微管中,置于37 ℃保温5 min。用排枪加入供试品和空白溶液各25 μL,立即计时,于37 ℃准确反应15 min,加入终止缓冲液250 μL。混匀后取上述各反应混合溶液200 μL于透明96孔板中,打开酶标仪的光程路径校正,在400 nm波长下测定空白和供试品溶液的光密度。在上述条件下,定义每分钟水解底物产生1 μmol·L^-1对硝基苯酚所需要的酶量为1个酶活性单位U,按公式1计算比活性:

公式(1)比活性=$\frac{\mathrm{\Delta }\mathrm{O}{\mathrm{D}}_{400}\times \mathrm{稀}\mathrm{释}\mathrm{倍}\mathrm{数}\times 20}{\mathrm{\Delta }t\times \epsilon \times \rho }$

式中比活性为每1 mg rhα-GAL的酶活性;ΔOD₄₀₀为供试品反应液与空白溶液光密度之差;Δt为反应时间15 min;ε为摩尔消光系数18.3 L·mmol^-1·cm^-1;ρ为酶质量浓度,约5 mg·mL^-1;20为供试品溶液在反应体系中的稀释倍数。

2.3 方法优化

酶活性测定的本质就是以最大反应速率表征酶量,因此需要对酶促反应体系中的关键实验条件进行优化,使得反应速率趋近于最大反应速率。

2.3.1 底物浓度

取rhα-GAL,照“2.2”项下方法测定其在底物浓度分别为0.5、2.5、6.0、12.0、19.2、36.0、42.0、48.0 mmol·L^-1时的酶活性。以底物浓度对比活性作图,得到Michaelis-Menten方程,计算酶动力学参数K_m和V_max,K_m为5.0 mmol·L^-1,V_max为88 U·mg^-1。当底物浓度足够大时,反应速率趋近于最大反应速率,反应速率不受底物浓度影响,而与酶质量浓度成正比,见图1。根据酶反应动力学理论,底物浓度通常选择5~10K_m,本方法中为25~50 mmol·L^-1,同时还应综合考虑底物分子的溶解性^[10]。原方法采用了更高浓度的底物溶液(100 mmol·L^-1),为了提高底物的溶解性,采用含乙醇的缓冲液进行配制,有机溶剂的加入不利于酶底物反应,其挥发性也会影响方法的精密度。本实验采用无有机溶剂的稀释缓冲液配制浓度为50 mmol·L^-1(10K_m)的底物溶液,可实现充分溶解。通过进一步优化反应体系中底物和酶的加入体积,最终反应体系中底物与酶的摩尔比高于原方法,更有助于消除底物浓度对酶活性测定的影响。综上,选择50 mmol·L^-1的底物浓度进行酶活性测定。

2.3.2 酶质量浓度

按照“2.2”项下方法测定不同稀释倍数(12 000、6 000、3 000、1 500、750、375)对应的不同酶质量浓度(0.42、0.83、1.67、3.33、6.67、13.33 mg·mL^-1)供试品溶液的酶促反应速率 (ΔOD₄₀₀·min^-1),考察酶质量浓度与反应速率的关系。根据Michaelis-Menton方程,当酶质量浓度远小于底物浓度时,反应速率与酶质量浓度成正比,当反应体系达到酶饱和后,底物浓度的迅速下降会使得反应速率增加变慢。当加入的酶质量浓度在0.42~3.33 mg·mL^-1时,反应速率与酶质量浓度成线性增加;当加入的酶质量浓度大于3.33 mg·mL^-1时,反应速率增加幅度变小,不再与酶质量浓度成线性关系,见图2。由此可见,应选择小于等于3.33 mg·mL^-1的酶质量浓度。酶质量浓度为3.33 mg·mL^-1时,酶标仪测得的OD₄₀₀为4.6左右,超出了仪器的检测上限4.0。而当酶质量浓度为1.67 mg·mL^-1时OD₄₀₀读数为2.8左右,较好地处于仪器检测范围内,因此反应体系中加入的酶质量浓度应为1.67 mg·mL^-1。

2.3.3 反应时间

取rhα-GAL,照“2.2”项下方法测定不同反应时间(2、5、10、15、20、30 min)的酶促反应速率(μmol·L^-1·min^-1),结果见图3。在反应时间2~15 min内,反应速率较为恒定。随着酶催化反应的进行,底物浓度不断降低,反应速率越来越慢。反应时间超过15 min后,反应速率开始下降。由于反应时间较短时,测定误差较大,本实验选择15 min作为反应时间进行酶活性测定。

2.3.4 稀释缓冲液的pH值

影响酶促反应速率的因素,除上述内因以外,还包括反应pH、离子强度、反应温度等。为考察不同pH值对反应速率的影响,本实验采用不同pH值的稀释缓冲液制备供试品溶液。共配制9种不同pH值的稀释缓冲液,分别为3.0、4.0、4.3、4.5、5.0、5.5、7.0、8.0和9.0。稀释缓冲液pH值为5.0时,反应速率最大,酶的催化能力最强。pH值小于4或大于5.5时,偏离了最适pH范围,过酸或过碱导致酶失活,酶促反应速率显著下降。以5.0为最适pH值,也与rhα-GAL在人溶酶体pH为5的酸性环境中对底物进行水解的生物学功能相适应。见图4。

2.3.5 反应温度和离子强度

作为ERT治疗用产品,rhα-GAL最终进入人体细胞的溶酶体中发挥其水解作用。为更接近人体生理温度,选择37 ℃作为方法的反应温度。在考察离子强度这一影响因素时,尝试配制了7种磷酸钠浓度不同的稀释缓冲液,分别为5、10、20、30、40、50和60 mmol·L^-1。结果表明,磷酸钠浓度不同的稀释缓冲液测得的酶活性没有显著差异(419.24、424.71、414.40、421.92、416.56、417.83、414.51 U·mL^-1,P>0.05)。

3 方法学验证

收起

3.1 专属性

以rhα-GAL制剂缓冲液作为辅料空白溶液、以稀释缓冲液代替供试品溶液作为样品空白溶液,取rhα-GAL分别按“2.2”项下方法进行测定。辅料空白溶液、样品空白溶液和rhα-GAL的光密度平均值分别为0.887、0.886、2.734,表明样品中的辅料基质对酶活性测定无干扰。

3.2 中间精密度

本验证考察不同实验人员、不同检测时间对方法中间精密度的影响,采用稀释缓冲液对rhα-GAL溶液(批号:DW0305)进行稀释,得到5个酶质量浓度为0.83、1.34、1.67、2.09、2.51 mg·mL^-1的待测溶液,rhα-GAL浓度水平分别为50%、80%、100%、125%及150%。由2名实验人员按“2.2”项下方法在3 d内进行酶活性测定,每天每人重复测定3次,每次以2份结果的均值为测定值,结果见表1。5个稀释水平测定值的平均值分别为:411.69、402.74、403.15、390.51、379.83;变异系数(CV)分别为2.00%、3.33%、3.42%、5.53%、5.51%,符合中间精密度的可接受标准(≤15%)。

3.3 重复性

取同一批rhα-GAL(批号:DW0305),由2名实验人员分别按“2.1”项下方法平行制备6份,在同一天内按“2.2”项下的方法测定酶活性。12份供试品溶液的测定结果的平均值为403.10 U·mL^-1, CV为2.21%,符合重复性的可接受标准(≤10%)。

3.4 准确度

以本文中间精密度和重复性测定结果的平均值作为该批次rhα-GAL(批号:DW0305)酶活性的参考值(403.13 U·mL^-1),以反映测定值与参考值之间的接近程度回收率(公式2)来评价准确度。表1中5个稀释水平(50%、80%、100%、125%和150%)的回收率分别为94.22%、96.47%、100.01%、99.18%、101.81%,均在90%~110%范围内,符合准确度的验证标准(75%~125%)。

公式(2)回收率(%)=酶活性测定值/酶活性参考值×100%

3.5 线性与范围

以“3.2”项下5个待测溶液的酶促反应速率(μmol·L^-1·min^-1)参考值为X轴,以相应的测定值为Y轴,线性回归方程为Y=0.911 6X+0.067 9,r=0.999 4,斜率接近于1.0,表明本方法在50%~150%的稀释水平范围内具有良好的线性。

3.6 耐用性

考察反应温度、反应时间、底物浓度发生微小变化对实验结果的影响。取rhα-GAL,按照“2.1”项下方法制备供试品溶液,按照“2.2”项下方法,将水浴锅温度分别设置为36.5、37.0、37.5 ℃,测定酶活性;将同一份供试品溶液加至底物溶液中,分别反应14、15、16 min后测定其酶活性;取浓度为45、50、55 mmol·L^-1的底物溶液用于分析同一份供试品溶液的酶活性。结果表明,上述参数发生微小变化时,测定结果的CV均小于5%,方法的耐用性符合可接受标准(≤10%)(表2)。

3.7 样品溶液的稳定性

取rhα-GAL加水复溶后存放于2~8 ℃,分别于0、8、24、48 h取样进行酶活性测定。计算8、24、48 h相对于0 h酶活性测定结果之比,分别为98.34%、96.86%、94.12%,均在90%~110%之间。

3.8 对硝基苯酚的检测范围

本方法定义单位时间内rhα-GAL水解底物产生1 μmol·L^-1对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活性单位,采用消光系数法对产物对硝基苯酚进行定量。因此,除了考察酶浓度与酶促反应速率的线性关系以外,还应考察对硝基苯酚与光密度的线性范围。根据“3.1”项下样品空白溶液的测定结果可知,底物溶液在400 nm处存在较高的背景光密度,因此本研究在底物溶液中配制不同浓度的对硝基苯酚。为模拟酶促反应体系,于上述含不同浓度对硝基苯酚的底物溶液中加入等体积的终止缓冲液,通过测定各溶液在400 nm波长下的光密度计算对硝基苯酚浓度,从而评价对硝基苯酚在检测范围内的准确度和精密度。

3.8.1 准确度

精密称取对硝基苯酚27.8 mg于25 mL量瓶中,加入“2.1”项下的底物溶液溶解并稀释至刻度线,即为对硝基苯酚浓度为8 mmol·L^-1的底物溶液。将含8 mmol·L^-1对硝基苯酚的底物溶液逐步稀释为每1L 含对硝基苯酚0.02、0.04、0.10、0.20和0.50 mmoL的底物缓冲液,以底物溶液为空白溶液。于上述各溶液中分别加入等体积的终止缓冲液,取200 μL于透明96孔板中,打开酶标仪的光程路径校正,在400 nm波长下测定OD,计算各溶液的ΔOD₄₀₀。共进行3次实验,每次实验报告3份溶液测定结果的均值,通过消光系数法计算对硝基苯酚的毫摩尔浓度,通过计算回收率(测定值与理论值之比)评价准确度,测定结果见表3。加入等体积终止缓冲液后,底物溶液中对硝基苯酚理论浓度分别为0.01、0.025、0.05、0.10和0.15 mmol·L^-1,5个浓度水平的回收率均在90.0%~110%之间,回收率较好。

3.8.2 线性与范围

以表3中对硝基苯酚的理论浓度对3次测定的ΔOD₄₀₀作图,结果见图5,线性回归方程为Y=17.60X+0.015 8,r=0.999 7,水解产物对硝基苯酚在0.01~0.15 mmol·L^-1浓度范围内与光密度呈线性,对应的ΔOD₄₀₀范围为0.183~2.745。该范围可涵盖本方法酶质量浓度范围(0.83~2.51 mg·mL^-1)下测得的对硝基苯酚上下限(0.05~0.15 mmol·L^-1)。

3.8.3 精密度

计算表3中各对硝基苯酚浓度水平的CV值,分别为0.47%、1.55%、0.93、0.90%和0.25%,本方法在0.01~0.15 mmol·L^-1对硝基苯酚范围内的精密度小于2%。

3.9 样品测定

采用本方法对已上市的两种rhα-GAL产品进行酶活性测定,每批样品平行制备3份,来自生产企业A的3批rhα-GAL产品的比活性分别为82.37、81.11、84.51 U·mg^-1,来自生产企业B的3批rhα-GAL产品的比活性分别为 79.74、88.39和85.72 U·mg^-1。

4 讨论与结论

收起

我国的罕见病患者人数已超过2 000万^[11],为改善ERT罕见病治疗酶类药物目前完全依赖国外进口的现状,国家大力支持罕见病用药的研制和生产,国内ERT罕见病酶类产品的开发正逐渐发展^[12-13]。然而ERT罕见病酶类产品大多为含有多个糖基化位点的复杂糖蛋白,其质量评价方法的开发仍是国内企业开发此类药物的主要技术挑战。作为rhα-GAL的关键质量属性,酶活性测定方法的优化与建立不仅有利于推动此类产品的质量标准提升与国际接轨,也为国内同类产品的早期研发、工艺优化、提升产品质量的可控性提供技术支持。

本研究对生色底物法测定体系中的关键因素进行了优化,根据酶反应动力学理论确定了最适底物浓度、酶浓度、反应时间、水浴温度和稀释缓冲液的pH值,确定了最适酶促反应条件。采用该条件降低了所使用的底物浓度,解决了高浓度底物不易溶解的问题,避免了助溶剂乙醇的加入,提高了检测的灵敏度。本方法无需使用对硝基酚标准品,提高了检测效率,节省了检测成本,可以更灵敏、简便、准确地表征rhα-GAL的酶活性。根据ICHQ2对所建立的方法进行了完整的方法学验证,采用50%、80%、100%、125%和150%共5个不同的酶稀释水平评价方法的中间精密度和准确度,通过对同一份供试品溶液的12次测定评价重复性。此外,微调酶促反应温度、反应时间和底物浓度并未给实验结果带来明显变化。复溶后的样品于2~8 ℃存放48 h后,溶液稳定性较好。为确保产物对硝基苯酚在其检测范围内可被准确定量,采用底物溶液配制5个不同浓度的对硝基苯酚溶液,考察对硝基苯酚浓度与光密度的线性关系,通过计算各浓度水平测定值相对于其理论值的回收率百分比以及各浓度水平9个测定结果的CV考察对硝基苯酚检测范围内的准确度和精密度。最后,应用本研究建立的方法,测定了不同企业的rhα-GAL产品的酶活性。

综上所述,本研究优化建立了一种生色底物法测定rhα-GAL的酶活性。与现有方法相比,本方法操作更简便、灵敏度更高、结果更稳定准确,可作为常规检验方法用于rhα-GAL产品的质量控制。

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收起

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收起

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2024年第59卷第8期

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接收时间：2023-09-29
首发时间：2026-04-08
出版时间：2024-04-22

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收稿日期：2023-09-29

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通讯作者:

^*梁成罡,男,研究员研究方向:激素类药物质量控制研究 Tel:(010)67095380;

李晶,女,主任药师研究方向:激素类药物质量控制研究 Tel:(010)53851638

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Concentration levels/%	Analyst A/U·mL^-1	Analyst B/U·mL^-1
50	403.70	441.70	422.06	416.12	374.26	426.16
	383.68	450.66	417.38	423.08	388.52	435.92
	396.42	431.74	431.74	389.28	377.44	400.54
80	415.54	440.44	407.76	394.38	384.99	380.46
	406.04	442.26	411.03	387.28	391.71	377.25
	423.90	430.08	414.53	391.71	386.26	363.65
100	398.22	402.67	407.24	387.26	409.71	423.22
	396.22	406.02	405.08	388.70	391.35	442.87
	395.73	404.70	401.35	384.95	398.69	412.69
125	409.08	394.40	399.19	377.71	374.46	387.21
	406.23	392.60	396.92	383.16	370.31	396.92
	404.11	394.16	402.42	374.62	366.52	399.19
150	385.15	384.67	375.32	368.19	376.03	393.87
	383.58	380.57	380.43	369.58	374.44	388.91
	384.37	381.45	373.51	371.81	372.95	392.20

Concentration
levels/%

Analyst A/U·mL^-1

Analyst B/U·mL^-1

Day 1

Day 2

Day 3

Day 1

Day 2

Day 3

403.70

441.70

422.06

416.12

374.26

426.16

383.68

450.66

417.38

423.08

388.52

435.92

396.42

431.74

389.28

377.44

400.54

415.54

440.44

407.76

394.38

384.99

380.46

406.04

442.26

411.03

387.28

391.71

377.25

423.90

430.08

414.53

391.71

386.26

363.65

100

398.22

402.67

407.24

387.26

409.71

423.22

396.22

406.02

405.08

388.70

391.35

442.87

395.73

404.70

401.35

384.95

398.69

412.69

125

409.08

394.40

399.19

377.71

374.46

387.21

406.23

392.60

396.92

383.16

370.31

396.92

404.11

394.16

402.42

374.62

366.52

399.19

150

385.15

384.67

375.32

368.19

376.03

393.87

383.58

380.57

380.43

369.58

374.44

388.91

384.37

381.45

373.51

371.81

372.95

392.20

Condition	Activity/U·mL^-1	CV/%
Temperature/℃	36.5	391.73	2.44
	37.0	404.65
	37.5	411.01
Reaction time/min	14	400.23	1.03
	15	406.59
	16	408.08
Concentration of substrate	45	401.60	0.54
solution/mol·L^-1	50	398.51
	55	397.46

Condition

Activity/U·mL^-1

CV/%

Temperature/℃

36.5

391.73

2.44

37.0

404.65

37.5

411.01

Reaction time/min

400.23

1.03

406.59

408.08

Concentration of substrate

401.60

0.54

solution/mol·L^-1

398.51

397.46

c(p-Nitrophenol) /mmol·L^-1	Test	Mean ΔOD40	c(Experimental)/mmol·L^-1	Recovery/%	Mean Recovery/%
0.01	test 1	0.192	0.010	104.74	105.07
	test 2	0.193	0.011	105.65
	test 3	0.192	0.010	104.84
0.025	test 1	0.434	0.024	94.94	95.51
	test 2	0.445	0.024	97.19
	test 3	0.432	0.024	94.40
0.05	test 1	0.894	0.049	97.73	98.56
	test 2	0.900	0.049	98.39
	test 3	0.911	0.050	99.55
0.10	test 1	1.815	0.099	99.19	98.83
	test 2	1.790	0.098	97.82
	test 3	1.821	0.099	99.49
0.15	test 1	2.642	0.144	96.24	95.97
	test 2	2.633	0.144	95.92
	test 3	2.629	0.144	95.76

c(p-Nitrophenol) /mmol·L^-1

Test

Mean ΔOD40

c(Experimental)/mmol·L^-1

Recovery/%

Mean Recovery/%

0.01

test 1

0.192

0.010

104.74

105.07

test 2

0.193

0.011

105.65

test 3

0.192

0.010

104.84

0.025

test 1

0.434

0.024

94.94

95.51

test 2

0.445

0.024

97.19

test 3

0.432

0.024

94.40

0.05

test 1

0.894

0.049

97.73

98.56

test 2

0.900

0.049

98.39

test 3

0.911

0.050

99.55

0.10

test 1

1.815

0.099

99.19

98.83

test 2

1.790

0.098

97.82

test 3

1.821

0.099

99.49

0.15

test 1

2.642

0.144

96.24

95.97

test 2

2.633

0.144

95.92

test 3

2.629

0.144

95.76