中国药学杂志

Species/varieties	No.	Collection site(in Chinese)	Latitude (N)	Longitude (E)	Type	Number of samples
Rabdosia serra	X1	Shixing,Shaoguan,Guangdong(广东韶关始兴)	24°51'	114°11'	wild	13
	X2	Yangshan,Qingyuan,Guangdong(广东清远阳山)	24°20'	112°39'	wild	10
	X3	Boluo,Huizhou,Guangdong(广东清远博罗)	23°12'	114°02'	wild	15
	X4	Yingde,Qingyuan,Guangdong(广东清远英德)	24°20'	112°56'	semi-wild	15
	X5	Qujiang,Shaoguan,Guangdong(广东韶关曲江)	24°32'	113°31'	cultivated	10
	X6	Panyu,Guangzhou,Guangdong(广东广州番禺)	23°03'	113°23'	cultivated	12
	X7	Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)	24°53'	116°02'	cultivated	10
	X8	Xingning,Meizhou,Guangdong(广东梅州兴宁)	24°07'	115°42'	wild	10
R. lophanthoides	W1	Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)	24°29'	115°50'	semi-wild	16
	W2	Shixing,Shaoguan,Guangdong(广东韶关始兴)	24°50'	114°04'	wild	8
R. lophanthoides	H1	Xinfeng,Shaoguan,Guangdong(广东韶关新丰)	24°13'	114°10'	wild	16
var. graciliflora	H2	Conghua,Guangzhou,Guangdong(广东广州从化)	23°44'	113°47'	wild	11
	H3	Meijiang,Meizhou,Guangdong(广东梅州梅江)	24°13'	116°07'	cultivated	12
	H4	Yingde,Qingyuan,Guangdong(广东清远英德)	24°20'	112°56'	cultivated	10
	H5	Yao Autonomous County of Liannan,Qingyuan,Guangdong(广东清远连南瑶族自治县)	24°39'	112°17'	cultivated	15
	H6	Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)	24°53'	115°57'	semi-wild	10
	H7	Xunwu,Ganzhou,Jiangxi(江西赣州寻乌)	24°56'	115°48'	wild	9
	H8	Puning,Jieyang,Guangdong(广东揭阳普宁)	23°21'	116°05'	cultivated	14
	H9	Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)	24°44'	115°48'	wild	11
	H10	Panyu,Guangzhou,Guangdong(广东广州番禺)	23°03'	113°23'	cultivated	12
	H11	Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)	24°53'	116°02'	wild	10
	H12	Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)	24°53'	116°02'	cultivated	10
	H13	Tianhe,Guangzhou,Guangdong(广东广州天河)	23°12'	113°22'	cultivated	10
	H14	Chenghai,Shantou,Guangdong(广东汕头澄海)	23°24'	116°44'	cultivated	8
R. stracheyi	Y1	Xinyi,Maoming,Guangdong(广东茂名信宜)	22°47'	111°58'	wild	10
	Y2	Yangchun,Yangjiang,Guangdong(广东阳江阳春)	22°33'	111°45'	wild	10
	Y3	Yangchun,Yangjiang,Guangdong(广东阳江阳春)	22°22'	112°04'	wild	3
	Y4	Yangchun,Yangjiang,Guangdong(广东阳江阳春)	22°22'	112°04'	wild	10
R. nervosa	M1	Tianhe,Guangzhou,Guangdong(广东广州天河)	23°11'	113°22'	cultivated	6

Species/varieties	No.	Collection site(in Chinese)	Latitude (N)	Longitude (E)	Type	Number of samples
Rabdosia serra	X1	Shixing,Shaoguan,Guangdong(广东韶关始兴)	24°51'	114°11'	wild	13
	X2	Yangshan,Qingyuan,Guangdong(广东清远阳山)	24°20'	112°39'	wild	10
	X3	Boluo,Huizhou,Guangdong(广东清远博罗)	23°12'	114°02'	wild	15
	X4	Yingde,Qingyuan,Guangdong(广东清远英德)	24°20'	112°56'	semi-wild	15
	X5	Qujiang,Shaoguan,Guangdong(广东韶关曲江)	24°32'	113°31'	cultivated	10
	X6	Panyu,Guangzhou,Guangdong(广东广州番禺)	23°03'	113°23'	cultivated	12
	X7	Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)	24°53'	116°02'	cultivated	10
	X8	Xingning,Meizhou,Guangdong(广东梅州兴宁)	24°07'	115°42'	wild	10
R. lophanthoides	W1	Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)	24°29'	115°50'	semi-wild	16
	W2	Shixing,Shaoguan,Guangdong(广东韶关始兴)	24°50'	114°04'	wild	8
R. lophanthoides	H1	Xinfeng,Shaoguan,Guangdong(广东韶关新丰)	24°13'	114°10'	wild	16
var. graciliflora	H2	Conghua,Guangzhou,Guangdong(广东广州从化)	23°44'	113°47'	wild	11
	H3	Meijiang,Meizhou,Guangdong(广东梅州梅江)	24°13'	116°07'	cultivated	12
	H4	Yingde,Qingyuan,Guangdong(广东清远英德)	24°20'	112°56'	cultivated	10
	H5	Yao Autonomous County of Liannan,Qingyuan,Guangdong(广东清远连南瑶族自治县)	24°39'	112°17'	cultivated	15
	H6	Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)	24°53'	115°57'	semi-wild	10
	H7	Xunwu,Ganzhou,Jiangxi(江西赣州寻乌)	24°56'	115°48'	wild	9
	H8	Puning,Jieyang,Guangdong(广东揭阳普宁)	23°21'	116°05'	cultivated	14
	H9	Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)	24°44'	115°48'	wild	11
	H10	Panyu,Guangzhou,Guangdong(广东广州番禺)	23°03'	113°23'	cultivated	12
	H11	Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)	24°53'	116°02'	wild	10
	H12	Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)	24°53'	116°02'	cultivated	10
	H13	Tianhe,Guangzhou,Guangdong(广东广州天河)	23°12'	113°22'	cultivated	10
	H14	Chenghai,Shantou,Guangdong(广东汕头澄海)	23°24'	116°44'	cultivated	8
R. stracheyi	Y1	Xinyi,Maoming,Guangdong(广东茂名信宜)	22°47'	111°58'	wild	10
	Y2	Yangchun,Yangjiang,Guangdong(广东阳江阳春)	22°33'	111°45'	wild	10
	Y3	Yangchun,Yangjiang,Guangdong(广东阳江阳春)	22°22'	112°04'	wild	3
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R. nervosa	M1	Tianhe,Guangzhou,Guangdong(广东广州天河)	23°11'	113°22'	cultivated	6

Name	Primers	T_m /℃	T(Actual annealing)/℃
P10Xian-F	GAGAGAGAGAGAGAGATGGCAGCT	61.2	62.2
P10Xian-R	GAGAGAGAGAGAGAGATCATGTACGTAC	61.1	62.2
P10Xi-F	GAGAGAGAGAGAGAGATATAGATATAAAC	56.8	60.6
P10Xi-R	GAGAGAGAGAGAGAGATGAGTG	57.6	60.6
P12Chang-F	GAGAGAGAGAGAGAGAATACTGT	56.0	59.8
P12Chang-R	GAGAGAGAGAGAGAGAATAAAAGAATC	56.5	59.8
P15Xi-F	CTCTCTCTCTCTCTCTGGATTT	55.8	59.6
P15Xi-R	CTCTCTCTCTCTCTCTGTATATGTATAT	56.7	59.6

Name	Primers	T_m /℃	T(Actual annealing)/℃
P10Xian-F	GAGAGAGAGAGAGAGATGGCAGCT	61.2	62.2
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P10Xi-R	GAGAGAGAGAGAGAGATGAGTG	57.6	60.6
P12Chang-F	GAGAGAGAGAGAGAGAATACTGT	56.0	59.8
P12Chang-R	GAGAGAGAGAGAGAGAATAAAAGAATC	56.5	59.8
P15Xi-F	CTCTCTCTCTCTCTCTGGATTT	55.8	59.6
P15Xi-R	CTCTCTCTCTCTCTCTGTATATGTATAT	56.7	59.6

溪黄草药材基原植物及近缘植物ISSR-SCAR分子标记开发

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刘靖 ¹^,² , 孟爽爽 ³ , 刘军民 ¹^,²^,^* , 萧晓吉 ⁴ , 古敬锋 ¹^,² , 龚彩玲 ¹^,⁵ , 谢文波 ⁶ , 赵双双 ⁷ , 詹若挺 ¹^,²^,^*

中国药学杂志 | 论著 2024,59(15): 1400-1407

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中国药学杂志 | 论著 2024, 59(15): 1400-1407

溪黄草药材基原植物及近缘植物ISSR-SCAR分子标记开发

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刘靖¹^,², 孟爽爽³, 刘军民¹^,²^,^*, 萧晓吉⁴, 古敬锋¹^,², 龚彩玲¹^,⁵, 谢文波⁶, 赵双双⁷, 詹若挺¹^,²^,^*

作者信息

¹ 广州中医药大学中药学院, 广州 51000

² 岭南中药资源教育部重点实验室(广州中医药大学), 广州 510006

³ 深圳市中医院药学部, 广东深圳 518033

⁴ 广东云浮中医药职业学院中药学院, 广东云浮 527400

⁵ 广州市医药职业学校, 广州 510430

⁶ 华润三九医药股份有限公司, 广东深圳 518002

⁷ 广东农垦热带农业研究院有限公司, 广州 511365

刘靖,男,硕士研究生研究方向:中药材种质资源鉴定与品质评价

通讯作者:

* 刘军民,女,教授,硕士生导师研究方向:中药材种质资源的鉴定与品质评价 Tel:(020)39358062;

詹若挺,男,研究员,博士生导师研究方向:中药资源可持续利用研究和开发Tel:(020)39356128

Development of ISSR-SCAR Molecular Markers for Original Plants and Related Plants of Rabdosia Herba

Jing LIU¹^,², Shuangshuang MENG³, Junming LIU¹^,²^,^*, Xiaoji XIAO⁴, Jingfeng GU¹^,², Cailing GONG¹^,⁵, Wenbo XIE⁶, Shuangshuang ZHAO⁷, Ruoting ZHAN¹^,²^,^*

Affiliations

¹ School of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

² Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan (Guangzhou University of Chinese Medicine), Ministry of Education, Guangzhou 510006, China

³ Department of Pharmacy, Shenzhen Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen 518033, China

⁴ Guangdong Yunfu Vocational College of Chinese Medicine, Yunfu 527400, China

⁵ Guangzhou Pharmaceutical Vocational School, Guangzhou 510430, China

⁶ China Resources Sanjiu Medical & Pharmaceutical Co., Ltd., Shenzhen 518110, China

⁷ Guangdong Agribusiness Tropical Agriculture Research Institute Co., Ltd., Guangzhou 511365, China

出版时间: 2024-08-08 doi: 10.11669/cpj.2024.15.006

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摘要

收起

目的研究建立溪黄草药材基原植物及其近缘植物的特征性片段扩增区域(SCAR)分子标记技术,为溪黄草药材的基原鉴定提供新的分子鉴别手段。方法采集溪黄草药材的基原植物及其近缘植物共5种29个居群,采用简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)分子标记对代表居群的基因组DNA进行聚合酶链式反应(PCR)扩增,获得ISSR特异性片段,经回收纯化、克隆、测序后,根据特异性片段测序结果设计可以直接用于它们高效鉴定的SCAR引物。结果采用14对ISSR引物对18个代表样本进行聚合酶链式反应PCR扩增,获得4条特异性片段并成功转化为ISSR-SCAR 分子标记,可分别用于特异性识别线纹香茶菜Rabdosia lophanthoides(Buch.-Ham. ex D. Don) H. Hara、长叶香茶菜R. stracheyi (Benth. Ex Hook. f.) Hara、溪黄草R. serra(Maxim.)H. Hara和显脉香茶菜R. nervosa (Hemsl.) C.Y.Wu et H. W. Li。结论建立的ISSR-SCAR分子标记条带清晰明亮,结果稳定,能够准确、快速鉴别溪黄草药材的基原植物及其近缘植物,为溪黄草药材基原的分子鉴别提供了新的方法。

关键词

溪黄草药材基原植物 / 分子标记 / 简单序列重复区间扩增多态性 / 特异片段

Abstract

收起

OBJECTIVE To study and establish sequence characterized amplifiedregion(SCAR) molecular marker for identifying the original plants and related plants of Rabdosia Herba, and provide a new molecular identification method for the original plants of Rabdosia Herba. METHODS A total of 29 populations of the original plants and related plants of Rabdosia Herba were collected, and inter-simple sequence repeat (ISSR) molecular marker was used to perform PCR amplification on the genomic DNA of the representative population of Rabdosia Herba to obtain ISSR-specific segments. After the ISSR-specific fragments were recovered, purified, cloned and sequenced, SCAR primers were designed based on the sequencing results, which were directly used for the efficient identification of the original plants of Rabdosia Herba. RESULTS Fourteen pairs of ISSR primers were used to perform PCR amplification on 18 representative samples of original plants and related plants of Rabdosia Herba, and 4 specific segments were obtained and successfully transformed into ISSR-SCAR molecular markers. These molecular markers can be used to specifically identify the Rabdosia lophanthoides (Buch. -Ham. ex D. Don) H. Hara, Rabdosia stracheyi (Benth. Ex Hook. f.) Hara, Rabdosia serra (Maxim.) H. Hara, and Rabdosia nervosa (Hemsl.) C. Y. Wu et H. W. Li, respectively. CONCLUSION The established ISSR-SCAR molecular markers produce clear and bright bands with stable results, which can accurately and rapidly identify the original plants and related plants of Rabdosia Herba, providing a new method for the identification of the original plants of Rabdosia Herba.

Key words

Rabdosia Herba original plant / molecular marker / ISSR / specific segment

引用本文

刘靖, 孟爽爽, 刘军民, 萧晓吉, 古敬锋, 龚彩玲, 谢文波, 赵双双, 詹若挺. 溪黄草药材基原植物及近缘植物ISSR-SCAR分子标记开发. 中国药学杂志, 2024 , 59 (15) : 1400 -1407 . DOI: 10.11669/cpj.2024.15.006

Jing LIU, Shuangshuang MENG, Junming LIU, Xiaoji XIAO, Jingfeng GU, Cailing GONG, Wenbo XIE, Shuangshuang ZHAO, Ruoting ZHAN. Development of ISSR-SCAR Molecular Markers for Original Plants and Related Plants of Rabdosia Herba[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (15) : 1400 -1407 . DOI: 10.11669/cpj.2024.15.006

正文

收起

溪黄草药材(Rabdosia Herba)具有清热利湿、凉血散瘀的功效,临床上常用于治疗急性肝炎、急性胆囊炎、肠炎、痢疾等疾病,在我国岭南地区被广泛应用,是消炎利胆片的组方原料。《广东省中药材标准》(20版)收载溪黄草药材为香茶菜属植物线纹香茶菜[Rabdosia lophanthoides(Buch. -Ham. ex D. Don) H. Hara]及其变种纤花香茶菜[Rabdosia lophanthoides var. graciliflora(Benth.)H. Hara]或溪黄草[Rabdosia serra(Maxim. )H. Hara]的干燥地上部分^[1],而2020年版《中国药典》四部记载其基原植物为线纹香茶菜(R. lophanthoides)或溪黄草(R. serra)^[2]。香茶菜属植物在我国民间有30余种作为药材使用^[3],本课题组在溪黄草药材种质资源调研与收集过程中发现,显脉香茶菜[Rabdosia nervosa (Hemsl.) C. Y. Wu et H. W. Li]与长叶香茶菜[Rabdosia stracheyi (Benth. Ex Hook. f.) Hara]在岭南地区的民间也作为溪黄草药材使用^[4]。植物分类学上,溪黄草、显脉香茶菜属于香茶菜属香茶菜组(Sect. Amethystoides),线纹香茶菜、纤花香茶菜、长叶香茶菜则属于香茶菜属皱叶香茶菜组(Sect. Rabdosia)^[5],两组间性状差异较为明显,但组内植物由于性状特征较为相似,尤其是线纹香茶菜、纤花香茶菜和长叶香茶菜的性状特征较为相似(图1)。此外,香茶菜属的植物多为异花授粉植物,自然界中存在不少的过渡类型植物。调查还发现,由于环境的异质性,即便是同一种植物的不同居群植物的形态特征变异亦较大。这些因素都造成溪黄草药材基原的鉴定难以从性状特征上加以鉴别。

在分子水平的鉴定研究上,迄今,学者们先后采用了DNA条形码、随机扩增多态性DNA(randomamplified polymorphic DNA,RAPD)与简单序列重复区间扩增多态性(inter-simple sequence repeat,ISSR)分子标记技术^[6-8]对溪黄草(R. serra)、线纹香茶菜(R. lophanthoides)及其纤花变种(R. lophanthoides var. graciliflora)和狭基变种[Rabdosia lophanthoides var. gerardianus (Bentham) H. Hara]的种间差异和亲缘关系进行研究,但研究结果均不能对溪黄草药材的基原实现简单、快速和准确地鉴定。特征性片段扩增区域(sequence characterized amplified region,SCAR)分子标记是采用通用引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增的分子标记技术[如RAPD、ISSR、相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism,SRAP)、特异扩增多态性DNA(specifically amplified polymorphic DNA,SAPD)和扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)等分子标记技术]的进一步发展^[9-14],即采用通用引物进行扩增,将扩增得到的特异性片段进行测序,根据测序结果设计引物,一般在原引物的基础上向内延伸10~15个bp,将原有的通用性引物转化为特异性引物,并用该引物进行基因组DNA检测^[15]。SCAR分子标记操作简便,成本较低,且可在较高退火温度下进行扩增,具有稳定性高、重复性好、简便快速的优点,对于未建立已知品种DNA数据库的物种,也能够高效准确地进行鉴别,如今SCAR分子标记已在人参、白术、黄精等中药材的鉴定研究中成功应用^[16-21]。鉴于此,本研究采用ISSR分子标记技术,对溪黄草药材基原植物及其近缘植物的基因组DNA进行PCR扩增,根据扩增图谱筛选特异性片段,再将特异性片段转化为具有溪黄草药材基原植物或近缘植物特异性的ISSR-SCAR分子标记,以达到快速鉴定溪黄草药材基原植物及其近缘物种的目的,为溪黄草药材基原的分子鉴定提供新的鉴定方法。

1 仪器与材料

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1.1 仪器

PowerPac Basic电泳仪(美国Bio-Rad公司);T100^TMThermal Cycler PCR 仪(美国Bio-Rad公司);NanoDrop2000 超微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher 公司);OSE-470L TGreen Plus 切胶仪(天根生化科技有限公司);Gel View 1500 Pro全自动凝胶成像系统(广州博鹭腾仪器仪表有限公司);Wise SpinCF-10迷你型高速离心机(普瑞麦迪实验室技术有限公司);H2O3-100C加热制冷型金属浴(卡尤迪生物科技有限公司);LDZX-30KBS型立式压力蒸气灭菌器(上海申安医疗器械厂);八道移液器(0.5~10 μL,宝予德有限公司)。

1.2 试药

植物基因组DNA提取试剂盒(批号:Q6135)、大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(批号:R1174)、DH5α感受态细胞(CB101)(天根生化科技有限公司);DNA Marker(DL2000,TSJ011)、琼脂糖(批号:21AG80102)、2×TSINGKE Master Mix(批号:22ST11105)、pClone007 Vector Kit(TSV-007)、ISSR引物合成(北京擎科新业生物技术有限公司);核酸染料SYBR Safe DNA Gel Stain(A8743,美国APExBIO公司);胰蛋白胨(LP0024)、酵母提取物(LP0021)(英国OXOID公司);NaCl、氨苄西林(Ampicillin,Amp)、琼脂粉均为国产分析纯。

植物材料采集自广东、江西、福建等地区的野生或栽培居群(表1),均经广州中医药大学刘军民教授鉴定,并移栽于广州中医药大学时珍山溪黄草药材种质资源圃内,样品标本均存放于广州中医药大学中药资源教研室。采集各居群生长良好、无病虫害的植株嫩叶,于-20 ℃冰箱中保存备用。

2 方法

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2.1 基因组DNA的提取与检测

参照植物基因组DNA提取试剂盒的方法提取植株嫩叶基因组DNA,提取的样品基因组DNA用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量,微量分光光度计检测DNA浓度和纯度,并用试剂盒中的洗脱液TE调整DNA质量浓度至10 ng·μL^-1,保存在-20 ℃冰箱中备用。

2.2 ISSR-PCR扩增体系

参照Meng等^[8]建立的ISSR-PCR反应体系及在该体系下筛选出的14条ISSR引物,进行溪黄草药材基原植物ISSR-SCAR分子标记开发。ISSR-PCR反应体系及扩增程序:2×Taq Master Mix 12.5 μL(Mg²⁺浓度为4 mmol·L^-1,dNTP浓度为0.4 mmol·L^-1),引物1.5 μL(0.6 μmol·L^-1),DNA模板1 μL,去离子水10 μL,总体积25 μL;94 ℃预变性7 min,94 ℃变性30 s,52 ℃退火45 s,72 ℃延伸2 min,共循环30次,72 ℃延伸10 min,4 ℃保存扩增产物。

2.3 特异性片段的获取与测序

从29个植物居群中选9个代表居群(溪黄草R. serra X6、X8,线纹香茶菜R. lophanthoides W1、W2,纤花香茶菜R. lophanthoides var. graciliflora H3、H14,长叶香茶菜R. stracheyi Y2、Y3,显脉香茶菜R. nervosa M1),每个居群取2个样本,共18个样本,利用14条ISSR引物分别对18个样本的基因组DNA进行PCR扩增,并进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。紫外光下查看筛选DNA特异性片段,利用大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对特异片段进行DNA纯化回收。将纯化回收的DNA特异性片段,按pClone 007 Vector Kit(TSV-007)的说明书将DNA特异性片段与载体连接,再将该连接体系加入100 μL DH5α感受态细胞中,进行转化培养。培养后进行PCR扩增(引物使用载体通用引物,反应体系及扩增程序同“2.2”项下)。PCR产物于1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测,对特异性片段进行测序,测序工作由北京擎科新业生物技术有限公司完成。

2.4 SCAR标记引物的设计及验证

根据特异性片段的测序结果,利用Primer5.0设计SCAR引物,根据引物合成报告单的T_m值设计梯度退火温度,以有目的条带出现的最高温度作为退火温度。用设计合成的引物对18个代表样本进行基因组DNA扩增,验证引物是否在代表样本中保持条带特异性。若引物经验证仍然保持条带特异性,则对其他居群进行进一步的基因组DNA扩增验证。SCAR 扩增反应体系:2×Taq Master Mix 12.5 μL (Mg²⁺浓度为4 mmol·L^-1,dNTP浓度为0.4 mmol·L^-1),正反引物各1.5 μL(0.6 μmol·L^-1),DNA模板1 μL,去离子水8.5 μL,总体积25 μL。反应程序同ISSR反应扩增程序。

3 结果与分析

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3.1 特异性片段的获取与测序

利用14条ISSR引物分别对18个代表样本的基因组DNA进行PCR扩增,在ISSR引物的PCR扩增产物图谱中筛选获得4条特异性片段,分别命名为S10线、S10溪、S12长、S15溪。其中,特异性片段S10线为随机引物UBC810在310 bp处仅线纹香茶菜(5~6)具有的多态性条带;S10溪为UBC810在290 bp处仅溪黄草(13~16)具有的多态性条带;S12长为UBC812在1 643 bp处仅长叶香茶菜(1~4)具有的多态性条带;S15溪为UBC815在816 bp处仅溪黄草(13~16)具有的多态性条带(图2)。将4条特异性片段纯化回收后,与载体连接并进行转化培育,挑取阳性菌落扩增并测序,获取4条特异性条带序列信息,初步转化为SCAR标记。

3.2 SCAR引物的设计及验证

根据纯化回收的4条特异性片段的测序数据,在原有引物的基础上向内延伸5~12个碱基,设计4对引物(P10线、P10溪、P12长、P15溪),引物对序列见表2。

将4对SCAR引物对18个代表样本进行PCR扩增,如结果只扩增出目标条带,则继续取其他居群的样本继续进行验证,避免因居群间的多样性出现假阳性的结果;如18个样本的扩增结果出现了非目标条带,则说明引物特异性消失,需要调高退火温度或者重新设计引物。

4对引物均成功转化为特异性标记,P10线引物的扩增产物图谱中,只有线纹香茶菜能扩增出特异性片段;P10溪引物的扩增产物图谱中,溪黄草与显脉香茶菜均能扩增出特异性片段;P12长引物的扩增产物图谱中,只有长叶香茶菜能扩增出特异性片段;P15溪引物的扩增产物图谱中,只有溪黄草能扩增出特异性片段(图3)。而纤花香茶菜的特异性条带在转化为SCAR标记后其特异性消失,目前未能准确鉴别出纤花香茶菜。

将4对引物对其他居群进行进一步的基因组DNA扩增验证,验证结果中4对引物只对特定的溪黄草药材基原植物或近缘植物扩增出特异性条带,而在其他物种的扩增图谱中均未出现扩增条带(表3),可见ISSR标记已成功转化为SCAR标记。

P10溪引物的PCR扩增图谱中,溪黄草与显脉香茶菜均能扩增出特异性片段,但两者显示出片段大小的差异(图3)。为进一步区分溪黄草与显脉香茶菜,将P10溪引物扩增出的溪黄草与显脉香茶菜的片段进行测序,发现溪黄草与显脉香茶菜有部分碱基的差异(图4)。根据这一碱基差异设计引物,正向引物不变,反向引物根据差异片段设计,将重新设计得到的引物命名为P10显,序列如下:

正向引物不变:GAGAGAGAGAGAGAGATATAGATATAAAC

反向引物为R:ATATATATATATATATGTGTGTGTGTGTGTGTG

取P10溪引物对溪黄草与显脉香茶菜进行第一次PCR扩增;取1 μL第一次PCR扩增后的产物与9 μL灭菌水混合,再以混合物1 μL为模板,P10显为引物进行第二次PCR扩增,设置55.9~65.9 ℃之间8个退火温度梯度分别对溪黄草与显脉香茶菜进行扩增(引物T_m值为55.9 ℃)。

在第三泳道,显脉香茶菜出现条带而溪黄草无条带(错配消失),故选择63.9 ℃作为退火温度(图5)。以P10显为引物,63.9℃为退火温度对溪黄草和显脉香茶菜进行PCR扩增,结果可见显脉香茶菜出现条带,而溪黄草未出现条带,即可区分出显脉香茶菜与溪黄草(图6)。

4 讨论

收起

随着分子生物技术的迅速发展,中药鉴定已经进入分子水平,DNA分子标记具有特异性高、重复性好、结果可靠、不易受外在环境限制、所需材料少、标记广、操作相对简便快捷、成本较低等特点,目前在中药材鉴别、中药资源亲缘关系、种质资源遗传多样性评价等方面的研究中应用广泛^[22]。溪黄草药材具有多基原植物入药的特点,由于部分基原植物之间的形态特征较为相似,传统的性状鉴定方法很难对药材进行鉴别区分,导致溪黄草商品药材一直存在品种资源混乱的现象。研究表明,溪黄草药材不同基原之间的化学成分的种类和含量差异较大,且功效也具有一定的差异^[23]。因此,开发高效分子标记体系,从分子水平上对溪黄草药材的基原植物及近缘植物进行有效的分类鉴别,对于溪黄草药材基原的规范和药材质量标准的制定具有重要意义。Ye等^[24]采用ISSR技术对6个溪黄草药材基原植物及近缘植物进行鉴别,用13条引物扩增出491个条带,其中多态性条带490条,证明ISSR方法可以区分溪黄草药材不同基原。ISSR分子标记本身具有重复性好、稳定性高等特点,用其转化的SCAR标记也更加可靠,SCAR分子标记成功开发后,可根据PCR扩增图上条带的有无及片段大小的不同来判断供试样本的物种,无须通过基因测序,直观体现出各物种基因组DNA的差异,操作简便,成本低廉。本研究采集了我国广东、江西、福建等地区的溪黄草药材5种基原植物及近缘植物共29个居群,在ISSR指纹图谱的基础上,成功开发出4条具有物种特异性ISSR-SCAR分子标记,其中P10线、P12长、P15溪引物可分别特异性鉴别出线纹香茶菜、长叶香茶菜、溪黄草,P10溪引物可将溪黄草与显脉香茶菜与其他种区分。本研究共发现了17条特异性片段,但仅有4条成功转化并在后续验证中仍保留其特异性,其中纤花香茶菜特异性条带在转化为SCAR标记后未能保留其特异性。

SCAR标记的转化是个十分复杂的过程,回收纯化过程中受到污染,引物设计不合适,退火温度选择不恰当等都可能导致转化失败^[25]。其中退火温度的优化对于SCAR标记的成功转化至关重要。在本研究中,以引物T_m值为退火温度时,往往会由于退火温度过低而扩增出非特异性片段;而在进行温度梯度实验时,发现过高的温度会扩增不到特异性条带,SCAR标记的特异性扩增需要在较高且适合的退火温度下才能实现,一般比其T_m值高2~5 ℃,如P12长引物以其T_m值56.0 ℃为退火温度时,出现多条非目的性的条带,引物特异性消失,将退火温度以56.0~66.0 ℃为梯度进行退火温度的优化,扩增图谱中有条带出现的最高温度为59.8 ℃,再以59.8 ℃为退火温度对原18个样本进行扩增,只出现了长叶香茶菜的条带,P12长引物的特异性保留。此外,特异性引物对多个物种进行扩增,可能是这些物种的亲缘关系较近的原因,如P10溪引物扩增产物中同时出现溪黄草与显脉香茶菜的条带,可能是P10溪引物在两者基因组中具有同源序列。Ye等^[24]根据ISSR分子标记的PCR扩增结果,对溪黄草药材基原植物及近缘植物4种2变种,共33个居群进行聚类分析,在遗传一致度在0.80水平上将总体分为2大类,属于香茶菜组的溪黄草与显脉香茶菜为第一类,属于皱叶香茶菜组的长叶香茶菜、线纹香茶菜及其两个变种为第二类,且显脉香茶菜居群混于溪黄草居群中,未单独成一支,同样说明显脉香茶菜与溪黄草的遗传背景可能较为接近。本研究中观察到P10溪引物扩增图谱中溪黄草与显脉香茶菜有片段大小的差异,为进一步区分溪黄草与显脉香茶菜,对两者的扩增片段进行测序,并根据测序结果的差异重新设计出能够特异性鉴定显脉香茶菜的P10显引物,成功将溪黄草与显脉香茶菜区分开。

溪黄草药材基原植物为异花授粉,种与变种或变种与变种间存在过渡类型,为溪黄草药材基原植物的分类与鉴定工作带来极大的不便,而SCAR分子标记的一个显著特点是可以由显性标记发展为更加有用的共显性标记^[15],因此本研究开发获得的溪黄草药材基原植物显性SCAR分子标记,可进一步发展为共显性的SCAR标记,从而应用于溪黄草药材基原植物杂合子的高效鉴定,为建立香茶菜属植物的分子标记辅助选择育种体系提供新的技术支撑。

基金

收起

2022年省级乡村振兴战略专项资金种业振兴项目(2022-NJS-00-002)
云浮中医药(南药)产业创新团队项目(云科函〔2023〕96号)
云浮中医药(南药)产业创新团队项目(202301)
广东省教育厅2021年广东省本科高校教学质量与教学工程改革建设项目(粤教高函〔2021〕29号)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

[1]

Guangdong Food and Drug Administration. Guangdong Chinese Materia Medica Standards(广东省中药材标准)[M]. Vol 2. Guangzhou: Guangdong Science and Technology Press, 2011: 347-353.

[2]

Ch.P(2020) Vol Ⅳ(中国药典 2020 年版四部)[S]. 2020: 558.

[3]

DENF

Q H

. Study on distribution and development of Herbra Isodonis Lophanthoidis[J]. Pharm Today(今日药学), 2009, 19(9): 21-25.

[4]

DENG

Q H

, WANG

D Q

, HUANG

, et al. Resource Investigation of Rabdosia serra (Maxim.) H.Hara [C]. The 10th National Symposium on Natural Medicinal Material Resources Proceedings and Abstracts(海峡两岸暨CSNR全国第十届中药及天然药物资源学术研讨会论文集), Lanzhou: The Society of Natural Medicinal Material Resources CSNR, 2012: 125-127.

[5]

Editorial Committee of Flora of China. Flora Reipublicae Popularis Sinicae(中国植物志)[M]. Beijing: Science Press, 1977: 416.

[6]

TAN

R X

, HUANG

, XU

, et al. DNA Molecular identification of Rabdosia Serrae rotundus and its Confused Products[J]. J Chin Med Mater(中药材), 2017, 40(2): 320-324.

[7]

X L

, ZENG

Q Q

, HUANG

S S

, et al. Identification of Herba Rabdosiae Serrae from Different Plant Resources by RAPD Method[J]. J Chin Med Mater(中药材), 2012, 35(9): 1388-1391.

[8]

MENG

S S

, LIU

J M

, LUO

D F

, et al. Establishment and Optimization of ISSR-PCR System for Rabdosia serra and Rabdosia lophanthoides[J]. Tradit Chin Drug Res Clin Pharmacol(中药新药与临床药理), 2018, 29(5): 652-656.

[9]

LIU

, LAN

A F

, ZHANG

Q Q

, et al. Genetic diversity analyses and species specificity RAPD-SCAR marker exploitation of the cultivated Morchella strains[J]. Mycosystema(菌物学报), 2018, 37(12): 1650-1660.

[10]

ALBANI

M C

, BATTEY

N H

, WILKINSON

M J

. The development of ISSR-derived SCAR markers around the SEASONAL FLOWERING LOCUS (SFL) in Fragaria vesca[J]. Theor Appl Genet, 2004, 109(3): 571-579.

[11]

ZHAO

Q J

, LI

H B

, QU

, et al. SCAR markers-based molecular identification of 20 flowering cherries (Cerasus) cultivars[J]. J Nanjing For Univ Nat Sci Ed(南京林业大学学报自然科学版), 2016, 40(5): 34-40.

[12]

ZHAO

Y H

, ZAHO

H T

, HOU

W H

, et al. Developments of SRAP and SCAR molecular markers associated with sex in bama hemp[J/OL]. Mol Plant Breed(分子植物育种), 2021 [2021-09-29]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210928.1406.029.html. http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20210928.1406.029.html

[13]

SHIRASAWA

, KISHITANI

, NISHIO

. Conversion of AFLP markers to sequence-specific markers for closely related lines in rice by use of the rice genome sequence[J]. Mol Breeding, 2004, 14(3): 283-292.

[14]

ZHAO

H Y

, XIAO

, DU

D Z

. AFLP and SCAR markers for seed colour in rape Dahuang (Brassica rapa L.)[J]. Chin J Oil Crop Sci(中国油料作物学报), 2013, 35(5): 476-483.

[15]

PARAN

, Michelmore

. Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce[J]. Theor Appl Genet, 1993, 85(8): 985-993.

[16]

JIANG

, LIU

, XIAO

, et al. Panax ginseng-specific sequence characterized amplified region (SCAR) marker for testing medicinal products[J]. J Cent South Univ(中南大学学报英文版), 2018, 25(5): 1052-1062.

[17]

, CHEN

, MAO

X Q

. The screening and cloning of SCAR molecular marker from Atractylodes macrocephaLa Koidz[J]. J Zhejiang Univ Technol(浙江工业大学学报), 2015, 43(2): 148-153.

[18]

B H

, CHEN

Y W

, HU

C J

, et al. SCAR Molecular Identification of Polygonatum filipe[J]. Chin Pharm J(中国药学杂志), 2019, 54(20): 1647-1652.

[19]

LUO

, HUANG

C X

, CAI

D Z

, et al. Cloning and validation of SCAR molecular markers of Sarcandra glabra[J]. Chin Tradit Pat Med(中成药), 2020, 42(10): 2796-2799.

[20]

ZHOU

. The development and bioinformatics analysis of RAPD-SCAR markers of Rehmannia Glutinosa. L[D]. Xinxiang: Henan Normal University, 2012.

[21]

WANG

J K

. Construction of RAPD-SCAR system for Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl and their utilization to assess genetic diversity of germplasm[D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University, 2016.

[22]

MAO

, LIU

C Q

, XIANG

T T

, et al. DNA-based Authentication of TCM by Molecular Biological Techniques[J]. Chin J Exp Tradit Med Form(中国实验方剂学杂志), 2014, 20(5): 238-242.

[23]

SUN

L Q

, QIAN

, LI

Y M

, et al. Research progress on chemical constituents and pharmacological effects of Linearstripe Rabdosia Herb from various origins[J]. J Shanghai Univ Tradit Chin Med(上海中医药大学学报), 2020, 34(6): 88-98.

[24]

, MENG

, ZHAO

, et al. Analysis of genetic diversity among five closely related species used as 'Xihuangcao' herbs using ISSR and SCoT molecular markers[J]. Phytotaxa, 2022, 556(1): 49-62.

[25]

SUN

B J

, LI

Z L

, LI

Z X

, et al. Reasons for SCAR Conversion Failure and its Remedies[J]. Mol Plant Breed(分子植物育种), 2010, 8(3): 589-594.

2024年第59卷第15期

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doi: 10.11669/cpj.2024.15.006

接收时间：2023-05-19
首发时间：2026-01-14
出版时间：2024-08-08

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收稿日期：2023-05-19

基金

2022年省级乡村振兴战略专项资金种业振兴项目(2022-NJS-00-002)

云浮中医药(南药)产业创新团队项目(云科函〔2023〕96号)

云浮中医药(南药)产业创新团队项目(202301)

广东省教育厅2021年广东省本科高校教学质量与教学工程改革建设项目(粤教高函〔2021〕29号)

作者信息

¹ 广州中医药大学中药学院, 广州 51000

² 岭南中药资源教育部重点实验室(广州中医药大学), 广州 510006

³ 深圳市中医院药学部, 广东深圳 518033

⁴ 广东云浮中医药职业学院中药学院, 广东云浮 527400

⁵ 广州市医药职业学校, 广州 510430

⁶ 华润三九医药股份有限公司, 广东深圳 518002

⁷ 广东农垦热带农业研究院有限公司, 广州 511365

通讯作者:

* 刘军民,女,教授,硕士生导师研究方向:中药材种质资源的鉴定与品质评价 Tel:(020)39358062;

詹若挺,男,研究员,博士生导师研究方向:中药资源可持续利用研究和开发Tel:(020)39356128

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Species/varieties	No.	Collection site(in Chinese)	Latitude (N)	Longitude (E)	Type	Number of samples
Rabdosia serra	X1	Shixing,Shaoguan,Guangdong(广东韶关始兴)	24°51'	114°11'	wild	13
	X2	Yangshan,Qingyuan,Guangdong(广东清远阳山)	24°20'	112°39'	wild	10
	X3	Boluo,Huizhou,Guangdong(广东清远博罗)	23°12'	114°02'	wild	15
	X4	Yingde,Qingyuan,Guangdong(广东清远英德)	24°20'	112°56'	semi-wild	15
	X5	Qujiang,Shaoguan,Guangdong(广东韶关曲江)	24°32'	113°31'	cultivated	10
	X6	Panyu,Guangzhou,Guangdong(广东广州番禺)	23°03'	113°23'	cultivated	12
	X7	Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)	24°53'	116°02'	cultivated	10
	X8	Xingning,Meizhou,Guangdong(广东梅州兴宁)	24°07'	115°42'	wild	10
R. lophanthoides	W1	Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)	24°29'	115°50'	semi-wild	16
	W2	Shixing,Shaoguan,Guangdong(广东韶关始兴)	24°50'	114°04'	wild	8
R. lophanthoides	H1	Xinfeng,Shaoguan,Guangdong(广东韶关新丰)	24°13'	114°10'	wild	16
var. graciliflora	H2	Conghua,Guangzhou,Guangdong(广东广州从化)	23°44'	113°47'	wild	11
	H3	Meijiang,Meizhou,Guangdong(广东梅州梅江)	24°13'	116°07'	cultivated	12
	H4	Yingde,Qingyuan,Guangdong(广东清远英德)	24°20'	112°56'	cultivated	10
	H5	Yao Autonomous County of Liannan,Qingyuan,Guangdong(广东清远连南瑶族自治县)	24°39'	112°17'	cultivated	15
	H6	Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)	24°53'	115°57'	semi-wild	10
	H7	Xunwu,Ganzhou,Jiangxi(江西赣州寻乌)	24°56'	115°48'	wild	9
	H8	Puning,Jieyang,Guangdong(广东揭阳普宁)	23°21'	116°05'	cultivated	14
	H9	Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)	24°44'	115°48'	wild	11
	H10	Panyu,Guangzhou,Guangdong(广东广州番禺)	23°03'	113°23'	cultivated	12
	H11	Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)	24°53'	116°02'	wild	10
	H12	Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)	24°53'	116°02'	cultivated	10
	H13	Tianhe,Guangzhou,Guangdong(广东广州天河)	23°12'	113°22'	cultivated	10
	H14	Chenghai,Shantou,Guangdong(广东汕头澄海)	23°24'	116°44'	cultivated	8
R. stracheyi	Y1	Xinyi,Maoming,Guangdong(广东茂名信宜)	22°47'	111°58'	wild	10
	Y2	Yangchun,Yangjiang,Guangdong(广东阳江阳春)	22°33'	111°45'	wild	10
	Y3	Yangchun,Yangjiang,Guangdong(广东阳江阳春)	22°22'	112°04'	wild	3
	Y4	Yangchun,Yangjiang,Guangdong(广东阳江阳春)	22°22'	112°04'	wild	10
R. nervosa	M1	Tianhe,Guangzhou,Guangdong(广东广州天河)	23°11'	113°22'	cultivated	6

Species/varieties

No.

Collection site(in Chinese)

Latitude (N)

Longitude (E)

Type

Number of samples

Rabdosia serra

Shixing,Shaoguan,Guangdong(广东韶关始兴)

24°51'

114°11'

wild

Yangshan,Qingyuan,Guangdong(广东清远阳山)

24°20'

112°39'

wild

Boluo,Huizhou,Guangdong(广东清远博罗)

23°12'

114°02'

wild

Yingde,Qingyuan,Guangdong(广东清远英德)

24°20'

112°56'

semi-wild

Qujiang,Shaoguan,Guangdong(广东韶关曲江)

24°32'

113°31'

cultivated

Panyu,Guangzhou,Guangdong(广东广州番禺)

23°03'

113°23'

cultivated

Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)

24°53'

116°02'

cultivated

Xingning,Meizhou,Guangdong(广东梅州兴宁)

24°07'

115°42'

wild

R. lophanthoides

Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)

24°29'

115°50'

semi-wild

Shixing,Shaoguan,Guangdong(广东韶关始兴)

24°50'

114°04'

wild

R. lophanthoides

Xinfeng,Shaoguan,Guangdong(广东韶关新丰)

24°13'

114°10'

wild

var. graciliflora

Conghua,Guangzhou,Guangdong(广东广州从化)

23°44'

113°47'

wild

Meijiang,Meizhou,Guangdong(广东梅州梅江)

24°13'

116°07'

cultivated

Yingde,Qingyuan,Guangdong(广东清远英德)

24°20'

112°56'

cultivated

Yao Autonomous County of Liannan,Qingyuan,Guangdong(广东清远连南瑶族自治县)

24°39'

112°17'

cultivated

Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)

24°53'

115°57'

semi-wild

Xunwu,Ganzhou,Jiangxi(江西赣州寻乌)

24°56'

115°48'

wild

Puning,Jieyang,Guangdong(广东揭阳普宁)

23°21'

116°05'

cultivated

Pingyuan,Meizhou,Guangdong(广东梅州平远)

24°44'

115°48'

wild

H10

Panyu,Guangzhou,Guangdong(广东广州番禺)

23°03'

113°23'

cultivated

H11

Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)

24°53'

116°02'

wild

H12

Wuping,Longyan,Fujian(福建龙岩武平)

24°53'

116°02'

cultivated

H13

Tianhe,Guangzhou,Guangdong(广东广州天河)

23°12'

113°22'

cultivated

H14

Chenghai,Shantou,Guangdong(广东汕头澄海)

23°24'

116°44'

cultivated

R. stracheyi

Xinyi,Maoming,Guangdong(广东茂名信宜)

22°47'

111°58'

wild

Yangchun,Yangjiang,Guangdong(广东阳江阳春)

22°33'

111°45'

wild

Yangchun,Yangjiang,Guangdong(广东阳江阳春)

22°22'

112°04'

wild

Yangchun,Yangjiang,Guangdong(广东阳江阳春)

22°22'

112°04'

wild

R. nervosa

Tianhe,Guangzhou,Guangdong(广东广州天河)

23°11'

113°22'

cultivated

Name	Primers	T_m /℃	T(Actual annealing)/℃
P10Xian-F	GAGAGAGAGAGAGAGATGGCAGCT	61.2	62.2
P10Xian-R	GAGAGAGAGAGAGAGATCATGTACGTAC	61.1	62.2
P10Xi-F	GAGAGAGAGAGAGAGATATAGATATAAAC	56.8	60.6
P10Xi-R	GAGAGAGAGAGAGAGATGAGTG	57.6	60.6
P12Chang-F	GAGAGAGAGAGAGAGAATACTGT	56.0	59.8
P12Chang-R	GAGAGAGAGAGAGAGAATAAAAGAATC	56.5	59.8
P15Xi-F	CTCTCTCTCTCTCTCTGGATTT	55.8	59.6
P15Xi-R	CTCTCTCTCTCTCTCTGTATATGTATAT	56.7	59.6

Name

Primers

T_m
/℃

T(Actual
annealing)/℃

P10Xian-F

GAGAGAGAGAGAGAGATGGCAGCT

61.2

62.2

P10Xian-R

GAGAGAGAGAGAGAGATCATGTACGTAC

61.1

62.2

P10Xi-F

GAGAGAGAGAGAGAGATATAGATATAAAC

56.8

60.6

P10Xi-R

GAGAGAGAGAGAGAGATGAGTG

57.6

60.6

P12Chang-F

GAGAGAGAGAGAGAGAATACTGT

56.0

59.8

P12Chang-R

GAGAGAGAGAGAGAGAATAAAAGAATC

56.5

59.8

P15Xi-F

CTCTCTCTCTCTCTCTGGATTT

55.8

59.6

P15Xi-R

CTCTCTCTCTCTCTCTGTATATGTATAT

56.7

59.6

SCAR
primes

R. serra

R.
nervosa

R.
lophanthoides

R. lophanthoides
var. graciliflora

R. stracheyi

H10

H11

H12

H13

H14

P10 Xian

P10 Xi

P12 Chang

P15 Xi