中国药学杂志

Compound	Molecular formula	Parent(m/z)	Fragment(m/z)	Cone voltage/V	Collision energy/V
Songorine	C₂₂H₃₁NO₃	358.2	340.3	16	15
16β-Hydroxycardiopetaline	C₂₁H₃₃NO₄	364.2	346.3	34	20
Karakoline	C₂₂H₃₅NO₄	378.3	360.3	45	20
Chuan-wu-base A	C₂₃H₃₇NO₅	408.3	390.3	27	15
Senbusine A	C₂₃H₃₇NO₆	424.3	356.2	30	30
Talatizamine	C₂₄H₃₉NO₅	422.3	390.3	28	20
Neoline	C₂₄H₃₉NO₆	438.3	420.3	34	20
Fuziline	C₂₄H₃₉NO₇	454.3	436.3	40	20
Benzoyldeoxyaconine	C₃₂H₄₅NO₉	588.3	105.1	56	45
10-OH-benzoylmesaconine	C₃₁H₄₃NO₁₁	606.3	542.2	30	30
Monoacetyltalatizamine	C₂₆H₄₁NO₆	464.3	432.3	28	15
Benzoyl-8-OH-mesaconine	C₃₁H₄₃NO₁₀	590.3	105.1	52	45
10-OH-mesaconitine	C₃₃H₄₅NO₁₂	648.3	105.1	52	50
Benzoylhypaconine	C₃₁H₄₃NO₉	574.3	478.2	30	30
Hypaconitine	C₃₃H₄₅NO₁₀	616.3	105.1	45	45
Mesaconitine	C₃₃H₄₅NO₁₁	632.3	572.3	60	20
Aconitine	C₃₄H₄₇NO₁₁	646.3	105.1	40	45
10-Hydroxy aconitine	C₃₄H₄₇NO₁₂	662.3	105.1	60	40
Benzoyl-8-OCH₃-mesaconine	C₃₂H₄₅NO₁₀	604.3	105.1	56	60
3-Deoxyaconitine	C₃₄H₄₇NO₁₀	630.3	570.3	58	15

Compound	Molecular formula	Parent(m/z)	Fragment(m/z)	Cone voltage/V	Collision energy/V
Songorine	C₂₂H₃₁NO₃	358.2	340.3	16	15
16β-Hydroxycardiopetaline	C₂₁H₃₃NO₄	364.2	346.3	34	20
Karakoline	C₂₂H₃₅NO₄	378.3	360.3	45	20
Chuan-wu-base A	C₂₃H₃₇NO₅	408.3	390.3	27	15
Senbusine A	C₂₃H₃₇NO₆	424.3	356.2	30	30
Talatizamine	C₂₄H₃₉NO₅	422.3	390.3	28	20
Neoline	C₂₄H₃₉NO₆	438.3	420.3	34	20
Fuziline	C₂₄H₃₉NO₇	454.3	436.3	40	20
Benzoyldeoxyaconine	C₃₂H₄₅NO₉	588.3	105.1	56	45
10-OH-benzoylmesaconine	C₃₁H₄₃NO₁₁	606.3	542.2	30	30
Monoacetyltalatizamine	C₂₆H₄₁NO₆	464.3	432.3	28	15
Benzoyl-8-OH-mesaconine	C₃₁H₄₃NO₁₀	590.3	105.1	52	45
10-OH-mesaconitine	C₃₃H₄₅NO₁₂	648.3	105.1	52	50
Benzoylhypaconine	C₃₁H₄₃NO₉	574.3	478.2	30	30
Hypaconitine	C₃₃H₄₅NO₁₀	616.3	105.1	45	45
Mesaconitine	C₃₃H₄₅NO₁₁	632.3	572.3	60	20
Aconitine	C₃₄H₄₇NO₁₁	646.3	105.1	40	45
10-Hydroxy aconitine	C₃₄H₄₇NO₁₂	662.3	105.1	60	40
Benzoyl-8-OCH₃-mesaconine	C₃₂H₄₅NO₁₀	604.3	105.1	56	60
3-Deoxyaconitine	C₃₄H₄₇NO₁₀	630.3	570.3	58	15

DAI score	Weight loss /%	Stool consistency	Occult/gross bleeding
0	None	Normal	Normal
1	1~5
2	5~10	Loose stools	Hemoccult positive
3	10~20
4	>20	Diarrhea	Gross bleeding

DAI score	Weight loss /%	Stool consistency	Occult/gross bleeding
0	None	Normal	Normal
1	1~5
2	5~10	Loose stools	Hemoccult positive
3	10~20
4	>20	Diarrhea	Gross bleeding

Score	Extent of Inflammation	Infiltration neutrophils+ lympho-histiocytes	Extent of crypt damage	Sub-mucosal oedema	Loss of goblet cells	Reactive epithelialhyperplasia
0	None	None	None	None	None	None
1	Mucosa	Focal	Basal one third	Focal	Focal	Focal
2	Mucosa+submucosa	Multifocal	Basal two third	Multifocal	Multifocal	Multifocal
3	Mucosa+submucosa+muscle layer	Diffuse	Entire crypt damage	Diffuse	Diffuse	Diffuse
4	Transmural	-	Crypt damage + ulceration	-	-	-

Score	Extent of Inflammation	Infiltration neutrophils+ lympho-histiocytes	Extent of crypt damage	Sub-mucosal oedema	Loss of goblet cells	Reactive epithelialhyperplasia
0	None	None	None	None	None	None
1	Mucosa	Focal	Basal one third	Focal	Focal	Focal
2	Mucosa+submucosa	Multifocal	Basal two third	Multifocal	Multifocal	Multifocal
3	Mucosa+submucosa+muscle layer	Diffuse	Entire crypt damage	Diffuse	Diffuse	Diffuse
4	Transmural	-	Crypt damage + ulceration	-	-	-

Peak number	Names	Abbreviations of names	t_R /min	Chemical formula
1	Senbusine A	SA	3.79	C₂₃H₃₇NO₆
2	16β-Hydroxycardiopetaline	16-OH-CPTL	4.37	C₂₁H₃₃NO₄
3	Karakoline	KCL	5.17	C₂₂H₃₅NO₄
4	Isotalatizidine	ITZD	5.39	C₂₃H₃₇NO₅
5	Songorine	SGR	6.06	C₂₂H₃₁NO₃
6	Fuziline	FZL	8.92	C₂₄H₃₉NO₇
7	Neoline	NOL	10.04	C₂₄H₃₉NO₆
8	Talatizamine	TLSM	13.35	C₂₄H₃₉NO₅
9	Monoacetyltalatizamine	Ac-TLSM	15.2	C₂₆H₄₁NO₆
10	Benzoyl-8-OH-mesaconine	BMA	16.31	C₃₁H₄₃NO₁₀
11	Benzoyl-8-OCH₃-mesaconine	8-MeO-BMA	16.74	C₃₂H₄₅NO₁₀
12	10-OH-aconitine	10-OH-MA	17.3	C₃₄H₄₇NO₁₂
13	Hypoaconitine	HA	17.84	C₃₃H₄₅NO₁₀

Peak number	Names	Abbreviations of names	t_R /min	Chemical formula
1	Senbusine A	SA	3.79	C₂₃H₃₇NO₆
2	16β-Hydroxycardiopetaline	16-OH-CPTL	4.37	C₂₁H₃₃NO₄
3	Karakoline	KCL	5.17	C₂₂H₃₅NO₄
4	Isotalatizidine	ITZD	5.39	C₂₃H₃₇NO₅
5	Songorine	SGR	6.06	C₂₂H₃₁NO₃
6	Fuziline	FZL	8.92	C₂₄H₃₉NO₇
7	Neoline	NOL	10.04	C₂₄H₃₉NO₆
8	Talatizamine	TLSM	13.35	C₂₄H₃₉NO₅
9	Monoacetyltalatizamine	Ac-TLSM	15.2	C₂₆H₄₁NO₆
10	Benzoyl-8-OH-mesaconine	BMA	16.31	C₃₁H₄₃NO₁₀
11	Benzoyl-8-OCH₃-mesaconine	8-MeO-BMA	16.74	C₃₂H₄₅NO₁₀
12	10-OH-aconitine	10-OH-MA	17.3	C₃₄H₄₇NO₁₂
13	Hypoaconitine	HA	17.84	C₃₃H₄₅NO₁₀

制附子总生物碱抗小鼠溃疡性结肠炎的作用及其机制研究

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金城 ^b , 喻松霞 ^a , 赵凡 ^c , 吴霞 ^a , 吴明兰 ^a , 张乔 ^a , 赵青威 ^a , 胡兴江 ^a^,^*

中国药学杂志 | 炎症性肠病研究专栏 2024,59(17): 1573-1580

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中国药学杂志 | 炎症性肠病研究专栏 2024, 59(17): 1573-1580

制附子总生物碱抗小鼠溃疡性结肠炎的作用及其机制研究

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金城^b, 喻松霞^a, 赵凡^c, 吴霞^a, 吴明兰^a, 张乔^a, 赵青威^a, 胡兴江^a^,^*

作者信息

^a 浙江大学医学院附属第一医院, 临床药学部, 浙江省药物临床研究与评价技术重点实验室, 浙江省中药临床评价与转化研究中医药重点实验室, 杭州 310003

^b 浙江大学医学院附属第一医院, 动物实验中心, 杭州 310003

^c 浙江大学医学院附属第一医院, 乳腺外科, 杭州 310003

金城,男,学士,助理实验师研究方向:中药药理

通讯作者:

^* 胡兴江,男,硕士,主任药师,硕士生导师研究方向:中药活性成分筛选及其作用机制研究 Tel:(0571)87236537

Anti-Ulcerative Colitis Effects and the Mechanisms of Total Alkaloids Extracted from Processed Aconitum carmichaelii Debx

Cheng JIN^b, Songxia YU^a, Fan ZHAO^c, Xia WU^a, Minglan WU^a, Qiao ZHANG^a, Qingwei ZHAO^a, Xingjiang HU^a^,^*

Affiliations

^a Zhejiang Provincial Key Laboratory for Drug Evaluation and Clinical Research, Zhejiang Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine for Clinical Evaluation and Transformation of Traditional Chinese Medicine, Department of Clinical Pharmacy, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China

^b Laboratory Animal Center, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China

^c Department of General Surgery, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, China

出版时间: 2024-09-08 doi: 10.11669/cpj.2024.17.004

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摘要

收起

目的本实验旨在初步探索制附子的总生物碱成分(Aconitum carmichaelii Debx. alkaloids, ACA)对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)小鼠的潜在治疗作用及其相关作用机制。方法通过液质联用技术对ACA的化学成分进行分析,再通过葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导的小鼠UC模型,评估连续7 d给予柳氮磺吡啶(SASP,200 mg·kg^-1)和ACA(10、20 mg·kg^-1)对小鼠体质量、疾病活动指数、结肠长度和结肠病理损伤等指标的影响,并结合体外抗炎活性实验和酶联免疫吸附以及Western blot等实验考察ACA的抗炎活性和机制。结果 ACA主要由多种特征型单体生物碱组成。ACA(10、20 mg·kg^-1)能显著改善DSS诱导的小鼠体质量减轻、疾病指数升高、结肠缩短和病理损伤等。同时,ACA可降低DSS所致的结肠炎症因子(如IL-1β、IL-18和IL-6)的含量。体外炎症模型同样证实ACA具有类似于NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体的特异性抑制剂MCC950的抑制LPS和Nigericin双重诱导THP-1细胞上清中上述炎症因子分泌的作用。蛋白表达结果提示该作用可能与其抑制NLRP3信号通路有关。结论 ACA含有多种结构类似的单体生物碱,具有抗小鼠UC的活性,可能与抑制NLRP3炎症小体发挥抗炎作用。

关键词

附子 / 生物碱 / 化学成分 / 溃疡性结肠炎 / NOD样受体蛋白3

Abstract

收起

OBJECTIVE To investigate the potential therapeutic effects and underlying mechanisms of total alkaloids derived from processed Aconitum carmichaelii Debx (ACA) on ulcerative colitis (UC) in mice. METHODS The chemical composition of ACA was analyzed using liquid chromatography-mass spectrometry. A mouse model of UC was induced using dextran sodium sulfate (DSS) to assess the effects of continuous administration of salicylazosulfapyridine(SASP) (200 mg·kg^-1) and ACA (10 and 20 mg·kg^-1) over seven days, evaluating parameters such as body weight, disease activity index, colon length, and pathological damage to the colon. The anti-inflammatory activity and mechanisms of ACA were investigated through in vitro experiments, enzyme-linked immunosorbent assay, and Western blotting. RESULTS ACA is primarily composed of various characteristic monomeric alkaloids. Treatment with ACA (10 and 20 mg/kg) significantly mitigated weight loss, disease index elevation, colon shortening, and pathological damage induced by DSS in the mice. Additionally, ACA reduced the levels of inflammatory factors, including IL-1β, IL-18, and IL-6, elevated by DSS in colitis. The in vitro inflammatory model further demonstrated that ACA functions as a specific inhibitor, MCC950, similar to the NLRP3 inflammasome, which suppresses the secretion of the aforementioned inflammatory factors in the supernatant of LPS- and Nigericin-induced THP-1 cells. Protein expression analysis suggested that this effect may be linked to the inhibition of the NLRP3 signaling pathway. CONCLUSION ACA contains multiple structurally similar monomeric alkaloids that exhibit anti-UC activity in mice, potentially exerting anti-inflammatory effects through the inhibition of the NLRP3 inflammasome.

Key words

Aconitum carmichaelii Debx / alkaloid / chemical composition / ulcerative colitis / NLRP3

引用本文

金城, 喻松霞, 赵凡, 吴霞, 吴明兰, 张乔, 赵青威, 胡兴江. 制附子总生物碱抗小鼠溃疡性结肠炎的作用及其机制研究. 中国药学杂志, 2024 , 59 (17) : 1573 -1580 . DOI: 10.11669/cpj.2024.17.004

Cheng JIN, Songxia YU, Fan ZHAO, Xia WU, Minglan WU, Qiao ZHANG, Qingwei ZHAO, Xingjiang HU. Anti-Ulcerative Colitis Effects and the Mechanisms of Total Alkaloids Extracted from Processed Aconitum carmichaelii Debx[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (17) : 1573 -1580 . DOI: 10.11669/cpj.2024.17.004

正文

收起

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种在世界范围内广泛流行的复杂难治性消化系统疾病,与免疫、炎症反应和肠道微生物群等多种因素有关^[1-2],常伴有结肠黏膜和黏膜下层持续的炎性病变和纤维瘢痕以及黏膜糜烂等。NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体是一种先天免疫受体,介导炎症小体复合体的组装,与炎性细胞因子的分泌有关,在UC的发病机制中至关重要^[3-4]。NLRP3炎症小体是由NOD样受体(NLR)、适配分子凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和效应分子前半胱氨酸蛋白酶-1(pro-caspase-1)组成的最重要的与炎症相关的复合物之一。激活的半胱氨酸蛋白酶-1导致IL-1β的成熟和分泌,引发与炎症相关的多种生物效应。临床上虽然已有较为有效的治疗药物,但90%以上的UC患者在疾病诊断后不久即开始口服或直肠给药5-氨基水杨酸类药物,如美沙拉嗪和柳氮磺胺吡啶(sulfasalazin,SASP)^[3]。但此类药物仍然存在有效率低、不良反应大等很多问题^[5-8]。进一步发掘具有显著抗UC作用的高效、低毒和廉价的治疗药物仍具有重要的临床和现实意义。

附子为毛茛科植物乌头(Aconitum carmichaelii Debx.)的子根加工品,味辛、甘,性大热。附子具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效,可治疗亡阳虚脱、虚寒吐泻、肾阳虚衰、风寒湿痹等病症。临床中附子复方制剂如附子理中丸、薏苡附子败酱散等可用于结肠炎的治疗^[9-12]。其中,附子生物碱(Aconitum carmichaelii Debx. alkaloids,ACA)是附子主要生物活性物质之一,具有强心、镇痛、抗炎、抗老年痴呆、组织再生,抗氧化等活性^[13]。前期研究表明附子总生物碱可通过抑制MAPK/NF-κB/STAT3信号通路抑制髓过氧化物酶和促炎细胞因子,具有显著的抗溃疡性结肠炎活性,而脂溶性生物碱通过抑制NF-κB和MAPKs信号通路缓解类风湿性关节炎^[14-16]。一些活性成分已被证明对α-肿瘤坏死因子(TNF-α)刺激的细胞中的NF-κB活性具有强大的调节作用,并对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的大鼠急性肺损伤具有保护作用^[17]。鉴于此,本课题组在前期筛选得到大量具有潜在抗UC作用的植物生物碱的基础上,推测ACA可能具有抗UC的作用,并进一步通过葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导的小鼠UC模型对其活性进行了确证。

1 材料与方法

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1.1 材料

1.1.1 试剂

制附子购自安国市旭芳中药材经营有限公司,经浙江理工大学生命科学与医药学院张琳教授鉴定为制附子。DSS(批号:YD05012,美国MP Biomedical公司);SASP(批号:D1210A,含量>97%,大连美仑生物技术有限公司);酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒(IL-1β、IL-18和IL-6)(美国RayBiotech公司);LPS和尼日利亚菌素(Nigericin)(美国Glpbio公司);所有抗体(caspase-1, IL-1β, β-actin)(英国Abcam公司)。

1.1.2 仪器

UPLC-TOF-MS/MS液质联用系统(UPLC超高效液相仪,美国Waters公司;5600⁺ TOF-MS/MS质谱系统,美国AB Sciex公司);伯乐酶标仪(Microplate Reader 680,美国BIO-RAD公司);切片机(RM-2235,德国Leika公司);全套Western Blot设备(碧云天生物技术股份有限公司);BeyoImager^TM 600化学发光成像系统;电子天平(XP26,瑞士梅特勒公司)。

1.2 方法

1.2.1 TAN的提取和纯化

附子总碱制备:①取附子2.0 kg,粉碎,过24目药筛。②取上述粉末400 g置于5.0 L提取瓶,加入10倍量体积分数85%乙醇溶液(pH值2~3),回流提取2.0 h,抽滤;滤渣再加入10倍量85%乙醇溶液(pH调至2~3),继续回流提取2.0 h,抽滤,合并滤液。平行提取5份。③取上述提取液,减压浓缩(真空度-0.07至-0.1,温度65 ℃)至无醇味,并继续浓缩至投料量的2倍(约4.0 L),离心,取上清液。④取上述上清液,加入等体积石油醚溶液连续萃取3次,合并石油醚层,45 ℃减压回收石油醚,得附子油脂(25.44 g)。⑤取水相加入等体积二氯甲烷溶液连续萃取3次,合并二氯甲烷层,45 ℃减压回收二氯甲烷,得附子弱碱性生物碱(1.74 g)。⑥取酸水层,用质量分数4%氢氧化钠溶液调至pH 10,然后加入等体积二氯甲烷溶液连续萃取3次,合并二氯甲烷层,45 ℃减压回收二氯甲烷,得到附子生物碱(7.8 g)见图1。

1.2.2 ACA的主要成分鉴定

ACA用水溶解,配制成浓度约为2 μg·mL^-1的溶液,经过超声、离心后取上清进行液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)检测。液相条件:ACQUITY UPLC^® BEH C₁₈色谱柱 (2.1 mm×100 mm,1.7 μm),0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脱(0~0.5 min,5%B;0.5~12 min,5%~20%B;12~15 min,20%~30%B;15~18 min,30%~60%B;18~18.5 min,60%~90%B;18.5~22 min,95%B)。质谱条件:正离子模式,SCAN模式扫描获得总离子流图,MRM模式提取化合物离子对。离子源温度,150 ℃;脱溶剂气温度,400 ℃;脱溶剂气流速,800 L·h^-1。分析物分子式,监测离子对,锥孔电压,碰撞能参数见表1。

1.2.3 小鼠UC模型的建立

SPF级C57BL/6小鼠购自浙江省实验动物中心,雄性,体质量:18~22 g。本研究经浙江大学医学院第一附属医院实验动物伦理委员会批准(伦理审查编号:No.2021-1200)。根据之前的研究^[15-17]以及本研究的预实验结果,30只C57BL/6小鼠经适应性饲养一周后,随机分为5组,每组6只:空白组、模型组、SASP(200 mg·kg^-1)组、ACA(10和20 mg·kg^-1)低剂量和高剂量组。除空白组外,所有小鼠自由饮用3% DSS溶液7 d以诱导UC。在整个7 d内,以10 mL·kg^-1体质量的体积灌胃给药,早晚各一次。期间观察所有C57BL/6小鼠的活动状态,每天称重一次。疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分:通过计算小鼠的体质量减轻,观察每只小鼠肛门处稀便和血便的状态等来进行评估^[6] (表2)。

1.2.4 ACA抗UC的活性评价

DAI评分可以通过评估小鼠的体质量减轻、腹泻、粪便中的血液和其他症状来计算^[6]。在实验的第8天,所有小鼠在麻醉后,打开腹腔并对结肠进行解剖、测量和拍照。同时,脾脏系数计算为器官质量/体质量。此外,部分结肠组织用4%多聚甲醛固定两天后进行包埋、切片、HE染色和扫描后观察。采用炎症程度、中性粒细胞浸润、杯状细胞损伤程度等多个指标^[6] (表3)对结肠组织进行病理学评价。其余部分直接冻存在液氮中。

1.2.5 ACA抑制THP-1细胞中NLRP3炎症小体的激活

THP-1细胞购自中国国家鉴定细胞培养物保藏中心,接种到24孔板中(每孔5×10⁵个细胞),并向每个孔中加入0.5 μg·mL^-1 LPS刺激细胞4 h。随后加入不同质量浓度的ACA(5、10和20 μg·mL^-1)和NLRP3抑制剂MCC950(5 μmol·L^-1)1 h。然后加入10 μmol·L^-1NLRP3激活剂Nigericin处理1 h。最后,收集细胞培养基的上清液和细胞质蛋白进行ELISA和蛋白质印迹分析。

1.2.6 ELISA分析炎症因子水平

按照制造商的说明进行ELISA分析。将准确称量后的小鼠结肠组织置于2.0 mL离心管中,加入100 μL的预冷磷酸盐缓冲溶液(PBS)缓冲液(1∶9, pH 7.4,不含Mg²⁺和Ca²⁺),在碎冰上进行机械匀浆。离心后,通过BCA试剂盒测定蛋白质浓度。收集结肠组织的匀浆和THP-1细胞的上清液,并立即使用ELISA试剂盒和Microplate Reader 680分析促炎细胞因子IL-1β、IL-6和IL-18的水平。

1.2.7 WB实验评价ACA对小鼠结肠组织NLRP3炎症小体的激活作用

与之前的研究方法^[7]类似,本研究对小鼠结肠组织进行破碎、裂解、蛋白提取和定量后,标准化所有样品至相同的浓度。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离所有蛋白质样品,并电泳转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。然后将膜与相应的一级和二级抗体孵育。抗体的稀释比:IL-1β(1∶5 000)、Caspase-1(1∶5 000)、β-actin(1∶2 000)和二抗(15 000)。使用电化学发光仪检测所有蛋白质条带的灰度值,使用β-actin作为内参对照。

1.2.8 统计分析

所有数据以3次检测的平均值±标准差表示,并使用GraphPad Prism 7.0软件的Tukey's HSD检验通过单因素方差分析评估统计学差异,P<0.05被认为具有统计学显著性。

2 结果

收起

2.1 ACA的化学成分分析

LC-MS/MS指认ACA的主要成分见图2,在其中发现了含量较高的乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、新乌宁碱、塔拉乌头胺、准噶尔乌头碱、附子宁碱、川乌碱甲、森布星A、16β-羟基心瓣翠雀碱、10-羟基新乌头碱、苯甲酰乌头原碱、次乌头碱和苯甲酰-8-甲氧基-新乌头原碱(表4)。

2.2 ACA改善UC小鼠的多种症状

空白组小鼠生长状况良好,体质量一直稳定上升,模型组与药物组小鼠体质量均出现不同程度的下降(图3A)。其中,ACA(10和20 mg·kg^-1)和SASP(200 mg·kg^-1)组均于第7天明显改善了这种下降的幅度(图3A)。同时,DSS处理的小鼠DAI评分显著增加,而ACA(10和20 mg·kg^-1)和SASP(200 mg·kg^-1)均能显著降低DAI评分(图3B)。此外,模型组小鼠结肠长度(5.11±0.37)cm,较空白组结肠长度 (7.57±0.66)cm出现显著下降,而ACA(10和20 mg·kg^-1)高低剂量组结肠长度分别为(6.04±0.35)cm和(6.24±0.23)cm,可显著改善DSS引起的结肠缩短(图3C),与SASP组改善DSS引起的结肠缩短至(6.07±0.25)cm的作用相当(图3D)。以上数据表明,SASP和ACA可以显著改善DSS诱导的小鼠多种UC症状。

2.3 ACA减轻DSS诱导的UC小鼠的结肠组织损伤

正常小鼠结肠上皮组织完整,组织结构正常,腺体排列规则,无炎症细胞浸润。相比之下,模型组小鼠结肠组织黏膜层不完整,腺体不规则,炎性细胞浸润较多。SASP(200 mg·kg^-1)和ACA(10 和20 mg·kg^-1)组小鼠结肠组织具有更完整的组织和规则的腺体排列,以及更少的浸润炎症细胞(图4A)。SASP和ACA显著逆转了结肠组织损伤,并改善了结肠炎症的组织病理学评分(图4B)。这些结果表明SASP和ACA可以减轻DSS诱导的小鼠结肠损伤。

2.4 ACA可在体内和体外抑制NLRP3炎症小体的激活

与空白组相比,DSS诱导小鼠结肠中的炎症因子IL-1β(图5A)、IL-6(图5B)和IL-18(图5C)水平出现显著升高。而与模型组相比,ACA和SASP均可显著降低IL-1β、IL-6和IL-18的水平。为了进一步证实这种作用机制,本研究检测了ACA对LPS和Nigericin联合诱导的THP-1细胞中NLRP3炎症小体激活的抑制作用。ACA(5、10和20 μg·mL^-1)在体外可有效抑制LPS和Nigericin诱导的IL-1β(图5D)、IL-6(图5E)和IL-18(图5F)的释放,其抑制作用与NLRP3炎症小体激活的特异性抑制剂MCC950 (5 μmol·L^-1)的抑制作用相当。这些结果表明,ACA可能有效的抑制NLRP3炎症小体的激活,从而抑制多种炎症因子的释放。

2.5 ACA抑制小鼠NLRP3 caspase-1和IL-1β的激活

蛋白表达结果显示模型组激活后的Caspase-1和IL-1β表达水平显著升高(图6A)。而SASP和ACA显著抑制了Caspase-1(图6B)和IL-1β(图6C)的表达水平。这些结果表明,ACA可以有效抑制DSS处理的小鼠NLRP3炎症小体的激活,从而抑制多种炎症因子的释放而发挥抗UC的作用。

3 讨论

收起

生物碱是附子的主要化学成分之一,是其发挥疗效的主要活性成分^[13]。许多含有ACA的中药制剂如参附注射液、右归丸和小金胶囊等已被广泛用于治疗多种人体疾病^[10-11]。而抗炎和补阳作用可能是ACA的两个重要药理学特性。迄今为止,研究人员已从附子中分离出一系列生物碱,并初步确定了其心脏保护、镇痛、抗炎、抗肿瘤和抗氧化等药理活性^[13]。然而,ACA化学成分的不确定性和复杂性在一定程度上限制了其进一步开发和临床应用^[9,14,18-19]。本研究利用改进的生物碱提取工艺,从制附子中提取得到ACA并初步鉴定出多种单体生物碱成分,与已经报道的结果基本一致^[13]。另外,本研究首次证实ACA通过改善DSS所致的小鼠多种疾病指标来发挥抗UC的作用,可能与其抗炎活性作用有关。本研究扩大了ACA在抗炎领域的应用范围,并表明ACA可能适应于治疗UC等肠道炎症性疾病。

然而,在小鼠结肠中是哪种信号通路的改变导致炎症因子分泌的抑制仍不清楚。NLRP3炎症小体是由NOD样受体、衔接分子ASC和效应分子pro-caspase-1形成的最重要的炎症相关复合物之一。活化的caspase-1导致IL-1β的成熟和分泌,从而诱导与炎症相关的几种生物学效应,包括IL-18等的成熟和分泌^[20]。本研究发现ACA和NLRP3抑制剂MCC950可抑制LPS和Nigericin诱导的THP-1细胞中IL-1β、IL-6和IL-18的分泌水平。同时,ACA显著降低DSS诱导的UC小鼠的IL-1β、IL-6和IL-18水平。表明抑制炎症因子的分泌和NLRP3炎症小体的激活可能是ACA抗UC作用的机制之一。ACA可能通过抑制NLRP3发挥抑制caspase-1和IL-1β等的激活,最终抑制IL-1β和IL-18的分泌而发挥抗UC的作用。

综上所述,本研究对制附子中提取得到的ACA进行了主要组成成分指认,发现其含有多种附子中特有的生物碱成分。同时,本研究首次在DSS诱导的小鼠体内证实了ACA具有与SASP类似的抗UC活性,包括改善体重减轻、疾病指数升高、结肠缩短、病理损伤和肠黏膜完整性等,可能与其抑制NLRP3的激活进而抑制IL-1β、IL-6和IL-18等多种炎症因子的分泌有关。本研究扩大了ACA在抗炎领域的应用范围,ACA可能具有治疗UC和其他肠道炎症性疾病的潜力。

基金

收起

浙江省自然科学基金项目资助(LTGY24H030001)
浙江省自然科学基金项目资助(LQ24H280005)
浙江省自然科学基金项目资助(LQ24H280006)
浙江省自然科学基金项目资助(LQ23H280019)

参考文献

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文献

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2024年第59卷第17期

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doi: 10.11669/cpj.2024.17.004

接收时间：2024-05-10
首发时间：2025-12-30
出版时间：2024-09-08

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收稿日期：2024-05-10

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浙江省自然科学基金项目资助(LTGY24H030001)

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浙江省自然科学基金项目资助(LQ24H280006)

浙江省自然科学基金项目资助(LQ23H280019)

作者信息

^b 浙江大学医学院附属第一医院, 动物实验中心, 杭州 310003

^c 浙江大学医学院附属第一医院, 乳腺外科, 杭州 310003

通讯作者:

^* 胡兴江,男,硕士,主任药师,硕士生导师研究方向:中药活性成分筛选及其作用机制研究 Tel:(0571)87236537

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Compound	Molecular formula	Parent(m/z)	Fragment(m/z)	Cone voltage/V	Collision energy/V
Songorine	C₂₂H₃₁NO₃	358.2	340.3	16	15
16β-Hydroxycardiopetaline	C₂₁H₃₃NO₄	364.2	346.3	34	20
Karakoline	C₂₂H₃₅NO₄	378.3	360.3	45	20
Chuan-wu-base A	C₂₃H₃₇NO₅	408.3	390.3	27	15
Senbusine A	C₂₃H₃₇NO₆	424.3	356.2	30	30
Talatizamine	C₂₄H₃₉NO₅	422.3	390.3	28	20
Neoline	C₂₄H₃₉NO₆	438.3	420.3	34	20
Fuziline	C₂₄H₃₉NO₇	454.3	436.3	40	20
Benzoyldeoxyaconine	C₃₂H₄₅NO₉	588.3	105.1	56	45
10-OH-benzoylmesaconine	C₃₁H₄₃NO₁₁	606.3	542.2	30	30
Monoacetyltalatizamine	C₂₆H₄₁NO₆	464.3	432.3	28	15
Benzoyl-8-OH-mesaconine	C₃₁H₄₃NO₁₀	590.3	105.1	52	45
10-OH-mesaconitine	C₃₃H₄₅NO₁₂	648.3	105.1	52	50
Benzoylhypaconine	C₃₁H₄₃NO₉	574.3	478.2	30	30
Hypaconitine	C₃₃H₄₅NO₁₀	616.3	105.1	45	45
Mesaconitine	C₃₃H₄₅NO₁₁	632.3	572.3	60	20
Aconitine	C₃₄H₄₇NO₁₁	646.3	105.1	40	45
10-Hydroxy aconitine	C₃₄H₄₇NO₁₂	662.3	105.1	60	40
Benzoyl-8-OCH₃-mesaconine	C₃₂H₄₅NO₁₀	604.3	105.1	56	60
3-Deoxyaconitine	C₃₄H₄₇NO₁₀	630.3	570.3	58	15

Compound

Molecular formula

Parent(m/z)

Fragment(m/z)

Cone voltage/V

Collision energy/V

Songorine

C₂₂H₃₁NO₃

358.2

340.3

16β-Hydroxycardiopetaline

C₂₁H₃₃NO₄

364.2

346.3

Karakoline

C₂₂H₃₅NO₄

378.3

360.3

Chuan-wu-base A

C₂₃H₃₇NO₅

408.3

390.3

Senbusine A

C₂₃H₃₇NO₆

424.3

356.2

Talatizamine

C₂₄H₃₉NO₅

422.3

390.3

Neoline

C₂₄H₃₉NO₆

438.3

420.3

Fuziline

C₂₄H₃₉NO₇

454.3

436.3

Benzoyldeoxyaconine

C₃₂H₄₅NO₉

588.3

105.1

10-OH-benzoylmesaconine

C₃₁H₄₃NO₁₁

606.3

542.2

Monoacetyltalatizamine

C₂₆H₄₁NO₆

464.3

432.3

Benzoyl-8-OH-mesaconine

C₃₁H₄₃NO₁₀

590.3

105.1

10-OH-mesaconitine

C₃₃H₄₅NO₁₂

648.3

105.1

Benzoylhypaconine

C₃₁H₄₃NO₉

574.3

478.2

Hypaconitine

C₃₃H₄₅NO₁₀

616.3

105.1

Mesaconitine

C₃₃H₄₅NO₁₁

632.3

572.3

Aconitine

C₃₄H₄₇NO₁₁

646.3

105.1

10-Hydroxy aconitine

C₃₄H₄₇NO₁₂

662.3

105.1

Benzoyl-8-OCH₃-mesaconine

C₃₂H₄₅NO₁₀

604.3

105.1

3-Deoxyaconitine

C₃₄H₄₇NO₁₀

630.3

570.3

DAI score	Weight loss /%	Stool consistency	Occult/gross bleeding
0	None	Normal	Normal
1	1~5
2	5~10	Loose stools	Hemoccult positive
3	10~20
4	>20	Diarrhea	Gross bleeding

DAI
score

Weight loss
/%

Stool
consistency

Occult/gross
bleeding

None

Normal

1~5

5~10

Loose stools

Hemoccult positive

10~20

>20

Diarrhea

Gross bleeding

Score	Extent of Inflammation	Infiltration neutrophils+ lympho-histiocytes	Extent of crypt damage	Sub-mucosal oedema	Loss of goblet cells	Reactive epithelialhyperplasia
0	None	None	None	None	None	None
1	Mucosa	Focal	Basal one third	Focal	Focal	Focal
2	Mucosa+submucosa	Multifocal	Basal two third	Multifocal	Multifocal	Multifocal
3	Mucosa+submucosa+muscle layer	Diffuse	Entire crypt damage	Diffuse	Diffuse	Diffuse
4	Transmural	-	Crypt damage + ulceration	-	-	-

Score

Extent of
Inflammation

Infiltration neutrophils+
lympho-histiocytes

Extent of crypt
damage

Sub-mucosal
oedema

Loss of goblet
cells

Reactive
epithelialhyperplasia

None

Mucosa

Focal

Basal one third

Focal

Mucosa+submucosa

Multifocal

Basal two third

Multifocal

Mucosa+submucosa+muscle layer

Diffuse

Entire crypt damage

Diffuse

Transmural

Crypt damage + ulceration

Peak number	Names	Abbreviations of names	t_R /min	Chemical formula
1	Senbusine A	SA	3.79	C₂₃H₃₇NO₆
2	16β-Hydroxycardiopetaline	16-OH-CPTL	4.37	C₂₁H₃₃NO₄
3	Karakoline	KCL	5.17	C₂₂H₃₅NO₄
4	Isotalatizidine	ITZD	5.39	C₂₃H₃₇NO₅
5	Songorine	SGR	6.06	C₂₂H₃₁NO₃
6	Fuziline	FZL	8.92	C₂₄H₃₉NO₇
7	Neoline	NOL	10.04	C₂₄H₃₉NO₆
8	Talatizamine	TLSM	13.35	C₂₄H₃₉NO₅
9	Monoacetyltalatizamine	Ac-TLSM	15.2	C₂₆H₄₁NO₆
10	Benzoyl-8-OH-mesaconine	BMA	16.31	C₃₁H₄₃NO₁₀
11	Benzoyl-8-OCH₃-mesaconine	8-MeO-BMA	16.74	C₃₂H₄₅NO₁₀
12	10-OH-aconitine	10-OH-MA	17.3	C₃₄H₄₇NO₁₂
13	Hypoaconitine	HA	17.84	C₃₃H₄₅NO₁₀

Peak
number

Names

Abbreviations
of names

t_R
/min

Chemical
formula

Senbusine A

3.79

C₂₃H₃₇NO₆

16β-Hydroxycardiopetaline

16-OH-CPTL

4.37

C₂₁H₃₃NO₄

Karakoline

KCL

5.17

C₂₂H₃₅NO₄

Isotalatizidine

ITZD

5.39

C₂₃H₃₇NO₅

Songorine

SGR

6.06

C₂₂H₃₁NO₃

Fuziline

FZL

8.92

C₂₄H₃₉NO₇

Neoline

NOL

10.04

C₂₄H₃₉NO₆

Talatizamine

TLSM

13.35

C₂₄H₃₉NO₅

Monoacetyltalatizamine

Ac-TLSM

15.2

C₂₆H₄₁NO₆

Benzoyl-8-OH-mesaconine

BMA

16.31

C₃₁H₄₃NO₁₀

Benzoyl-8-OCH₃-mesaconine

8-MeO-BMA

16.74

C₃₂H₄₅NO₁₀

10-OH-aconitine

10-OH-MA

17.3

C₃₄H₄₇NO₁₂

Hypoaconitine

17.84

C₃₃H₄₅NO₁₀