中国药学杂志

Analytes	ρ(Spiked) /ng·mL^-1	Intra-day (n=6)	Inter-day (n=18)
Cinnamic acid	3.0	3.1	±0.2	4.9	103.6	3.2	±0.2	7.2	105.6
	6.0	6.1	±0.4	6.5	102.1	6.0	±0.4	6.9	99.3
	60.0	57.2	±5.6	9.8	95.3	60.5	±6.32	10.5	100.8
	450.0	410.8	±16.0	3.9	91.3	452.5	±40.5	9.0	100.6
Vanillic acid	1.0	1.1	±0.1	8.6	106.4	1.1	±0.1	6.1	106.7
	2.0	2.0	±0.1	6.0	101.4	2.1	±0.1	6.7	104.0
	20.0	20.1	±1.6	7.8	100.3	20.7	±1.6	7.8	103.4
	150.0	144.1	±3.3	2.3	96.1	158.3	±11.7	7.4	105.5
3,3'-O-dimethylellagic acid	1.0	1.1	±0.2	14.2	105.4	1.1	±0.1	11.4	106.3
	2.0	1.9	±0.2	11.3	97.0	2.0	±0.2	8.3	97.3
	20.0	22.0	±1.0	4.5	87.9	21.6	±1.2	5.7	86.4
	150.0	135.3	±3.6	2.7	90.2	143.9	±15.0	10.4	95.9

Analytes	ρ(Spiked) /ng·mL^-1	Intra-day (n=6)	Inter-day (n=18)
Cinnamic acid	3.0	3.1	±0.2	4.9	103.6	3.2	±0.2	7.2	105.6
	6.0	6.1	±0.4	6.5	102.1	6.0	±0.4	6.9	99.3
	60.0	57.2	±5.6	9.8	95.3	60.5	±6.32	10.5	100.8
	450.0	410.8	±16.0	3.9	91.3	452.5	±40.5	9.0	100.6
Vanillic acid	1.0	1.1	±0.1	8.6	106.4	1.1	±0.1	6.1	106.7
	2.0	2.0	±0.1	6.0	101.4	2.1	±0.1	6.7	104.0
	20.0	20.1	±1.6	7.8	100.3	20.7	±1.6	7.8	103.4
	150.0	144.1	±3.3	2.3	96.1	158.3	±11.7	7.4	105.5
3,3'-O-dimethylellagic acid	1.0	1.1	±0.2	14.2	105.4	1.1	±0.1	11.4	106.3
	2.0	1.9	±0.2	11.3	97.0	2.0	±0.2	8.3	97.3
	20.0	22.0	±1.0	4.5	87.9	21.6	±1.2	5.7	86.4
	150.0	135.3	±3.6	2.7	90.2	143.9	±15.0	10.4	95.9

Compound	ρ(Spiked) /ng·mL^-1	Matrix effect /%	Recovery /%
Cinnamic acid	6.0	85.8	±8.1	84.0	±8.8
	450.0	90.8	±2.3	94.1	±7.4
Vanillic acid	2.0	82.7	±11.4	63.4	±5.4
	150.0	91.0	±4.1	79.9	±5.9
3,3'-O-dimethylellagic acid	2.0	122.0	±15.2	78.9	±9.1
	150.0	115.5	±5.0	92.0	±4.9

Compound	ρ(Spiked) /ng·mL^-1	Matrix effect /%	Recovery /%
Cinnamic acid	6.0	85.8	±8.1	84.0	±8.8
	450.0	90.8	±2.3	94.1	±7.4
Vanillic acid	2.0	82.7	±11.4	63.4	±5.4
	150.0	91.0	±4.1	79.9	±5.9
3,3'-O-dimethylellagic acid	2.0	122.0	±15.2	78.9	±9.1
	150.0	115.5	±5.0	92.0	±4.9

Analytes	ρ(Spiked) /ng·mL^-1	Room (25 ℃) 1 h	Autosampler (6 ℃) 24 h	Freeze/thaw 2 times	Long-term 30 d
Cinnamic acid	6.0	6.2	±0.3	3.4	6.5	±0.2	8.8	5.9	±0.6	-2.5	6.2	±0.2	2.9
	60.0	62.8	±2.9	4.6	62.8	±4.3	4.7	56.0	±4.5	-6.8	62.1	±1.3	3.5
	450.0	495.5	±13.0	10.1	444.0	±29.1	-1.4	412.2	±18.7	-8.4	449.5	±10.2	-0.1
Vanillic acid	2.0	2.1	±0.2	3.8	2.1	±0.1	5.4	2.0	±0.2	1.9	2.1	±0.1	3.1
	20.0	21.3	±0.9	6.3	20.2	±1.2	0.8	19.9	±1.2	-0.3	20.9	±0.4	4.3
	150.0	163.0	±8.5	8.7	144.7	±6.2	-3.6	144.0	±4.0	-4.0	155.0	±1.8	3.3
3,3'-O-dimethylellagic acid	2.0	1.8	±0.1	-8.2	2.2	±0.1	10.1	2.1	±0.2	7.0	2.0	±0.1	1.5
	20.0	18.7	±0.8	-6.5	21.2	±1.3	5.9	21.8	±0.9	8.8	20.9	±0.5	4.5
	150.0	145.5	±13.6	-3.0	141.7	±8.7	-5.5	143.9	±9.0	-4.1	141.2	±5.9	-5.9

Analytes	ρ(Spiked) /ng·mL^-1	Room (25 ℃) 1 h	Autosampler (6 ℃) 24 h	Freeze/thaw 2 times	Long-term 30 d
Cinnamic acid	6.0	6.2	±0.3	3.4	6.5	±0.2	8.8	5.9	±0.6	-2.5	6.2	±0.2	2.9
	60.0	62.8	±2.9	4.6	62.8	±4.3	4.7	56.0	±4.5	-6.8	62.1	±1.3	3.5
	450.0	495.5	±13.0	10.1	444.0	±29.1	-1.4	412.2	±18.7	-8.4	449.5	±10.2	-0.1
Vanillic acid	2.0	2.1	±0.2	3.8	2.1	±0.1	5.4	2.0	±0.2	1.9	2.1	±0.1	3.1
	20.0	21.3	±0.9	6.3	20.2	±1.2	0.8	19.9	±1.2	-0.3	20.9	±0.4	4.3
	150.0	163.0	±8.5	8.7	144.7	±6.2	-3.6	144.0	±4.0	-4.0	155.0	±1.8	3.3
3,3'-O-dimethylellagic acid	2.0	1.8	±0.1	-8.2	2.2	±0.1	10.1	2.1	±0.2	7.0	2.0	±0.1	1.5
	20.0	18.7	±0.8	-6.5	21.2	±1.3	5.9	21.8	±0.9	8.8	20.9	±0.5	4.5
	150.0	145.5	±13.6	-3.0	141.7	±8.7	-5.5	143.9	±9.0	-4.1	141.2	±5.9	-5.9

Analytes	Parameters	ASBX(0.54 g·kg^-1)	ASBX(1.08 g·kg^-1)	ASBX(2.16 g·kg^-1)
Cinnamic acid	t_1/2/h	0.79	±0.48	2.04	±0.75	1.79	±0.48
	t_max/h	0.40	±0.14	0.22	±0.07	0.30	±0.11
	ρ_max/ng·mL^-1	279.70	±113.86	302.88	±113.79	283.65	±175.59
	AUC_0-t/ng·h·mL^-1	337.31	±117.47	459.98	±154.3	507.45	±315.70
	AUC_0-∞/ng·h·mL^-1	351.83	±115.01	479.1	±157.62	537.96	±324.86
	MRT_0-∞/h	1.26	±0.70	3.00	±1.06	2.67	±0.76
Vanillic acid	t_1/2/h	0.53	±0.69	0.37	±0.11	0.65	±0.44
	t_max/h	0.08	±0	0.08	±0.00	0.08	±0.00
	ρ_max/ng·mL^-1	16.42	±5.07	36.68	±40.30	43.33	±18.70
	AUC_0-t/ng·h·mL^-1	6.87	±3.73	10.53	±7.49	17.44	±8.63
	AUC_0-∞/ng·h·mL^-1	7.20	±3.77	10.83	±7.49	18.82	±8.92
	MRT_0-∞/h	0.76	±0.86	0.48	±0.15	0.92	±0.58
3,3'-O-dimethylellagic acid	t_1/2/h	4.26	±1.95	9.58	±4.72	6.88	±2.29
	t_max/h	5.40	±1.67	7.00	±1.41	8.20	±1.10
	ρ_max/ng·mL^-1	2.81	±2.75	4.98	±1.82	7.20	±1.54
	AUC_0-t/ng·h·mL^-1	23.15	±25.79	65.32	±38.89	102.21	±26.35
	AUC_0-∞/ng·h·mL^-1	29.27	±28.51	91.76	±18.45	119.64	±38.75
	MRT_0-∞/h	8.90	±2.90	16.74	±6.92	13.30	±3.42

Analytes	Parameters	ASBX(0.54 g·kg^-1)	ASBX(1.08 g·kg^-1)	ASBX(2.16 g·kg^-1)
Cinnamic acid	t_1/2/h	0.79	±0.48	2.04	±0.75	1.79	±0.48
	t_max/h	0.40	±0.14	0.22	±0.07	0.30	±0.11
	ρ_max/ng·mL^-1	279.70	±113.86	302.88	±113.79	283.65	±175.59
	AUC_0-t/ng·h·mL^-1	337.31	±117.47	459.98	±154.3	507.45	±315.70
	AUC_0-∞/ng·h·mL^-1	351.83	±115.01	479.1	±157.62	537.96	±324.86
	MRT_0-∞/h	1.26	±0.70	3.00	±1.06	2.67	±0.76
Vanillic acid	t_1/2/h	0.53	±0.69	0.37	±0.11	0.65	±0.44
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	MRT_0-∞/h	0.76	±0.86	0.48	±0.15	0.92	±0.58
3,3'-O-dimethylellagic acid	t_1/2/h	4.26	±1.95	9.58	±4.72	6.88	±2.29
	t_max/h	5.40	±1.67	7.00	±1.41	8.20	±1.10
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	AUC_0-∞/ng·h·mL^-1	29.27	±28.51	91.76	±18.45	119.64	±38.75
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Analytes	PK parameters	r²	P value	Slope(95% CI)	Conclusion¹⁾
Cinnamic acid	ρ_max	0.004	0.83	-0.04 (-0.47-0.38)	No clear correlation with dose
	AUC_0-∞	0.087	0.29	0.23 (-0.21-0.67)	Positive correlation with dose. Nonlinear correlation
Vanillic acid	ρ_max	0.317	0.03	0.67 (0.08-1.26)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship
	AUC_0-∞	0.290	0.04	0.65 (0.04-1.27)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship
3,3'-O-dimethylellagic acid	ρ_max	0.425	0.01	1.03 (0.31-1.75)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship
	AUC_0-∞	0.471	0.00	1.45 (0.53-2.36)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship

Analytes	PK parameters	r²	P value	Slope(95% CI)	Conclusion¹⁾
Cinnamic acid	ρ_max	0.004	0.83	-0.04 (-0.47-0.38)	No clear correlation with dose
	AUC_0-∞	0.087	0.29	0.23 (-0.21-0.67)	Positive correlation with dose. Nonlinear correlation
Vanillic acid	ρ_max	0.317	0.03	0.67 (0.08-1.26)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship
	AUC_0-∞	0.290	0.04	0.65 (0.04-1.27)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship
3,3'-O-dimethylellagic acid	ρ_max	0.425	0.01	1.03 (0.31-1.75)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship
	AUC_0-∞	0.471	0.00	1.45 (0.53-2.36)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship

LC-MS/MS同时测定大鼠血浆中安神补心六味丸的3种有机酸类成分及药动学研究

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王翼遥 ¹ , 黄鹤 ² , 高云航 ¹ , 宋玲 ¹ , 李晗 ¹ , 王慧颖 ¹ , 彭博 ¹ , 侯红平 ¹ , 叶祖光 ¹ , 陈俊苗 ³ , 张广平 ¹^,^* , 陈腾飞 ¹^,^*

中国药学杂志 | 论著 2024,59(17): 1620-1628

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中国药学杂志 | 论著 2024, 59(17): 1620-1628

LC-MS/MS同时测定大鼠血浆中安神补心六味丸的3种有机酸类成分及药动学研究

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王翼遥¹, 黄鹤², 高云航¹, 宋玲¹, 李晗¹, 王慧颖¹, 彭博¹, 侯红平¹, 叶祖光¹, 陈俊苗³, 张广平¹^,^*, 陈腾飞¹^,^*

作者信息

¹ 中国中医科学院中药研究所, 北京 100700

² 辽宁师范大学, 辽宁大连 116000

³ 上海爱博才思分析仪器贸易有限公司北京分公司, 北京 100010

王翼遥,女,硕士研究生研究方向:中药药理毒理

通讯作者:

^* 张广平,男,博士,研究员研究方向:中药药理毒理 Tel:(010)64031832;

陈腾飞,男,博士,副研究员研究方向:中药药动学 Tel:(010)64031832

Simultaneous Determination of Three Organic Acids of Anshen Buxin Liuwei Pills in Rat Plasma Using LC-MS/MS and Pharmacokinetic Study

Yiyao WANG¹, He HUANG², Yunhang GAO¹, Ling SONG¹, Han LI¹, Huiying WANG¹, Bo PENG¹, Hongping HOU¹, Zuguang YE¹, Junmiao CHEN³, Guangping ZHANG¹^,^*, Tengfei CHEN¹^,^*

Affiliations

¹ Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

² Liaoning Normal University, Dalian 116000, China

³ Beijing Application Center, SCIEX China, Beijing 100010, China

出版时间: 2024-09-08 doi: 10.11669/cpj.2024.17.009

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摘要

收起

目的建立大鼠血浆中肉桂酸(cinnamic acid,CA)、香草酸(vanillic acid,VA)和3,3'-O-二甲基鞣花酸(3,3'-O-dimethylellagic acid,DMA)浓度测定的液相色谱-串联质谱联用(LC-MS/MS)分析方法,研究给药不同剂量安神补心六味丸(Anshen Buxin Liuwei Pills,ASBX)后3种成分的药动学过程及量暴关系。方法雄性SD大鼠灌胃给药不同剂量ASBX后采集不同时间点血浆并采用蛋白沉淀法处理,采用LC-MS/MS法测定血浆中CA、VA和DMA的浓度,用MaS Studio软件计算药动学参数,采用置信区间法分析给药剂量和系统暴露水平的相关性。结果在线性范围内3种化合物线性关系良好,该方法专属性、精密度与准确度、回收率、基质效应和稳定性均满足生物样品的测定要求。大鼠单次灌胃给药ASBX后,CA、VA和DMA的t_max分别为0.22~0.40、0.08和5.40~8.20 h,t_1/2分别为在0.79~2.04、0.37~0.65和4.26~9.58 h,ρ_max分别为279.70~302.88、16.42~43.33、2.81~7.20 ng·mL^-1,AUC_0-∞分别为351.83~537.96、7.20~18.82、29.27~119.64 ng·h·mL^-1。随着给药剂量的增加,VA和DMA在大鼠体内的ρ_max和AUC,以及CA的AUC均与剂量呈正相关,但是CA的ρ_max则与剂量无明确相关性。结论该分析方法快速、灵敏、准确,适合大鼠灌胃给药ASBX后的药动学研究,为其药效物质基础研究和临床安全有效用药提供了参考。

关键词

安神补心六味丸 / 药动学 / 液相色谱-串联质谱联用 / 肉桂酸 / 香草酸 / 3,3'-O-二甲基鞣花酸

Abstract

收起

OBJECTIVE To establish a liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method for determination of cinnamic acid (CA), vanillic acid (VA) and 3,3'-O-dimethylellagic acid (DMA) concentrations in rat plasma and evaluate the pharmacokinetics and the correlations between dose and systemic exposure levels of CA, VA and DMA in rats after single dose administration of Anshen Buxin Liuwei Pills (ASBX). METHODS Blood was collected from male SD rats at different time points after different dose administration. The plasma was processed by protein precipitation method. The concentrations of CA, VA and DMA in plasma were determined by LC-MS/MS method. Pharmacokinetic parameters were calculated with MaS Studio software. The correlations between dose and systemic exposure level were analyzed by confidence interval method. RESULTS The linear relationship of the calibration curves of the three compounds were good within the tested ranges, and the specificity, precision and accuracy, recovery, matrix effect and stability of the method all met the requirements for biological sample assay. After single intragastric administration of ASBX, the t_max of CA, VA and DMA were 0.22-0.40, 0.08 and 5.40-8.20 h, the t_1/2 were 0.79-2.04, 0.37-0.65 and 4.26-9.58 h, the ρ_max were 279.70-302.88, 16.42-43.33, and 2.81-7.20 ng·mL^-1, and the AUC_0-∞ were 351.83-537.96, 7.20-18.82, and 29.27-119.64 ng·h·mL^-1, respectively. The results of confidence interval analysis showed that the ρ_max and AUC of VA and DMA, and AUC of CA were positively correlated with dose, but the ρ_max of CA was not clearly correlated with dose. CONCLUSION The LC-MS/MS analysis method is proved to be rapid, sensitive, and accurate, so it can be applied to the pharmacokinetic study of ASBX after intragastric administration in rats. This sdtudy provides a reference for future research on the pharmacodynamic material basis and safe and effective clinical use of ASBX.

Key words

Anshen Buxin Liuwei Pills / pharmacokinetics / LC-MS/MS / cinnamic acid / vanillic acid / 3,3'-O-dimethylellagic acid

引用本文

王翼遥, 黄鹤, 高云航, 宋玲, 李晗, 王慧颖, 彭博, 侯红平, 叶祖光, 陈俊苗, 张广平, 陈腾飞. LC-MS/MS同时测定大鼠血浆中安神补心六味丸的3种有机酸类成分及药动学研究. 中国药学杂志, 2024 , 59 (17) : 1620 -1628 . DOI: 10.11669/cpj.2024.17.009

Yiyao WANG, He HUANG, Yunhang GAO, Ling SONG, Han LI, Huiying WANG, Bo PENG, Hongping HOU, Zuguang YE, Junmiao CHEN, Guangping ZHANG, Tengfei CHEN. Simultaneous Determination of Three Organic Acids of Anshen Buxin Liuwei Pills in Rat Plasma Using LC-MS/MS and Pharmacokinetic Study[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (17) : 1620 -1628 . DOI: 10.11669/cpj.2024.17.009

正文

收起

安神补心六味丸(Anshen Buxin Liuwei Pills,ASBX)(吉如和-6)是蒙医药经典复方制剂,由牛心、木香、肉豆蔻、丁香、枫香脂、广枣等6味药材组成,具祛“赫依”、镇静、养血安神之功效,临床上多用于治疗冠心病、心绞痛、心律失常等^[1-3],也可用于治疗肝郁气滞所致的心烦、焦虑、失眠、健忘等^[4-5]。方中牛心为主药,补心、止痛;广枣强心、镇静;肉豆蔻镇心赫依;丁香抑制主脉“赫依”;枫香脂燥希拉乌素、止痛;佐木香调理赫依血不和^[6]。研究表明,有机酸类对大鼠心肌缺血再灌注损伤具有保护作用^[7-8],而ASBX中含有包括肉桂酸(cinnamic acid,CA)、香草酸(vanillic acid,VA)和3,3'-O-二甲基鞣花酸(3,3'-O-dimethylellagic acid,DMA)等在内的多种有机酸类化合物^[9]。有研究显示,CA预处理后能够减少大鼠的心肌缺血再灌注损伤,起到保护心肌功能的作用^[10-11],VA具有较强的抗氧化活性,可通过减少丙二醛含量和增强超氧化物歧化酶、过氧化氢酶等内源性抗氧化酶的作用,发挥保护心肌的作用^[12-13]。DMA具有一定的抗氧化性,文献[14]通过DPPH自由基和CCl₄诱导的脂质过氧化实验发现DMA通过发挥其抗氧化性而起到保护肝脏的作用。因此,有必要对给药ASBX后血浆中3种有机酸进行定量研究,为ASBX的药效物质研究提供数据支撑。

中药药动学研究在中药研究与开发过程中发挥着连接化学、药理和临床等学科的作用,是研究中药体内多组分、多靶点药效物质基础和安全性等研究的重要环节^[15-18]。目前对ASBX的药动学研究主要涉及单体成分给药后,或者含有某味药材的其他复方制剂给药后动物体内的药动学研究^[19-21],未见有给药ASBX后相关成分在动物体内药动学研究的报道。给药剂量和系统暴露水平相关性研究可以反映发挥药效或者引起毒副作用的药物成分与给药剂量之间的关系,为中药安全、有效用药提供指导^[22-23]。本课题组从6只给药ASBX后大鼠的血清中共鉴定到17种共有成分,其中包括CA、VA和DMA等有机酸,以及其他5种不同类型的成分能够进行定量分析,考虑到各成分的化学性质不同,本实验采用高效液相串联质谱(HPLC-MS/MS)建立了同时测定大鼠血浆中CA、VA和DMA的方法,对不同剂量灌胃给药ASBX后大鼠血浆中3种成分的浓度进行分析,获得了单次不同剂量给药后的药动学特征,并分析了给药剂量和系统暴露水平的相关性,为蒙药ASBX的物质基础研究,以及临床安全有效用药提供数据支撑。

1 材料

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1.1 药物与试剂

CA(批号:110786-201604)、VA(批号:110776-201503)、内标氯霉素(批号:130555-201704)购于中国食品药品检定研究院;DMA(批号:C11271271)购于上海麦克林生化科技有限公司。以上化合物的纯度均大于98%。ASBX(批号:190722,CA、VA和DMA的浓度分别为598、51、18 μg·g^-1)由内蒙古奥特奇蒙药股份有限公司提供。甲醇,乙腈,甲酸和丙酮均为色谱纯;娃哈哈饮用纯净水购于中国杭州娃哈哈集团有限公司,分析物和内标的结构见图1。

1.2 仪器

Qtrap 5500超高灵敏度三重四极杆串联线性离子阱液质联用系统,包括ExionLC AC液相色谱仪和Qtrap 5500质谱仪,系统工作软件为Analyst 1.7(美国SCIEX公司);Centrifuge 5254R离心机(德国Eppendorf公司);Vortex-genie2 G560E 漩涡仪(美国Scientific Industries公司);RVC 2-18 CDplus 真空浓缩仪(德国Christ公司);MS105DU十万分之一电子天平(德国Mettler-Toledo公司)。

1.3 动物

SPF级SD大鼠,雄性,体质量160~220 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证号SCXK(京)2016-0006。动物实验经中国中医科学院中药研究所动物伦理委员会批准(2020B044)。实验动物饲养于中国中医科学院中药研究所动物房,许可证号SYXK(京)2019-0003,饲养条件为温度(23±1) ℃,相对湿度(50±15)%,12 h昼夜交替,正常饮食饮水,适应性饲养至少5 d,给药前禁食12 h以上。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱为岛津Shim-pack Velox SP-C₁₈(2.1 mm×100 mm,2.7 μm);流动相为0.05%甲酸水(A)-甲醇(B)体系,梯度洗脱(0~0.5 min,20%B;0.5~2.0 min,20%~98%B;2.0~2.5 min,98%B;2.5~2.6 min,98%~20%B;2.6~5.0 min,20%B);流速0.3 mL·min^-1;柱温40 ℃;进样体积5 μL;自动进样器温度6 ℃。

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源(ESI),负离子模式,源参数为:喷雾电压-4 500 V;气帘气(CUR,N₂)压力为241.33 kPa;碰撞气(CAD)为Medium;辅助气1(GS1,N₂)和辅助气2(GS2,N₂)压力均为310.28 kPa;辅助气加热温度(TEM)500 ℃。采用多反应监测(MRM)模式,CA、VA、DMA和内标氯霉素的定量分析离子对(m/z)分别为147.1→103.1、167.1→152.0、329.1→314.0、321.1→152.1,碰撞能分别为-15.0、-19.0、-24.0、-24.0 eV,去簇电压分别为-72.0、-60.0、-44.0、-148.0 V。分析物和内标的二级质谱图见图2。

2 方法与结果

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2.1 混合标准曲线工作溶液配制

称取CA、VA和DMA对照品适量,分别置于10 mL量瓶中,加甲醇超声溶解后定容,摇匀后取该母液适量,分别用甲醇稀释成质量浓度均为1 mg·mL^-1的对照品储备液。取一定量的各化合物储备液,混合后加甲醇配制成CA、VA和DMA质量浓度分别为30、10和10 μg·mL^-1的混合标准溶液(MIX0),用甲醇按一定比例将MIXO稀释成CA浓度为6 000、4 500、3 000、600、300、60、30 ng·mL^-1,VA和DMA质量浓度为2 000、1 500、1 000、200、100、20、10 ng·mL^-1的系列混合标准曲线工作溶液,-80 ℃冰箱冷冻保存。

2.2 混合质控工作溶液和定量下限工作溶液配制

另用甲醇稀释MIX0,得CA质量浓度为4 500、600、60 ng·mL^-1,VA和DMA质量浓度为1 500、200、20 ng·mL^-1的高、中、低浓度混合质控(quality control,QC)工作溶液;以及CA质量浓度为30 ng·mL^-1,VA和DMA质量浓度为10 ng·mL^-1的混合定量下限(lower limit of quantitation,LLOQ)工作溶液,-80 ℃冰箱冷冻保存。

2.3 内标溶液配制

精密称取氯霉素适量,置于10 mL量瓶中,加甲醇超声溶解后定容至刻度,摇匀后取该母液适量,用甲醇稀释成氯霉素质量浓度为1 mg·mL^-1的内标储备液。用丙酮将内标储备液稀释成氯霉素质量浓度为10 ng·mL^-1的内标溶液,-80 ℃冰箱冷冻保存。

2.4 样品处理

取血浆样品50 μL,加入内标溶液(氯霉素质量浓度为10 ng·mL^-1)400 μL,涡旋1 min,超声1 min,4 ℃、14 000 r·min^-1离心5 min,取上清400 μL,47 ℃、1 700 r·min^-1减压浓缩至干燥,加入甲醇50 μL,涡旋1 min,超声1 min,4 ℃、14 000 r·min^-1离心5 min,取上清5 μL进样分析。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性

取大鼠空白血浆50 μL加入丙酮400 μL,之后按“2.3”项下继续处理并进行分析。取混合标曲溶液的血浆、给药ASBX(2.16 g·kg^-1)后5 min的大鼠血浆各50 μL,按“2.4”项下处理后进样分析。血浆中内源性物质对各待测物和内标均无干扰,血浆样品中CA、VA、DMA和内标氯霉素的保留时间分别为4.00、3.43、4.01和3.71 min,代表性样品色谱图见图3。

2.5.2 标准曲线、定量下限及残留效应

取“2.1”项下系列混合标准曲线工作溶液和“2.2”项下混合LLOQ工作溶液各10 μL,各加入大鼠空白血浆90 μL,涡旋混匀,得CA质量浓度为3、6、30、60、300、450、600 ng·mL^-1,VA和DMA质量浓度为1、2、10、20、100、150、200 ng·mL^-1的混合标准曲线血浆样品和CA质量浓度为3 ng·mL^-1,VA和DMA质量浓度为1 ng·mL^-1的混合LLOQ血浆样品,之后各取50 μL,按“2.4”项下进行样品处理并分析。以待测物与内标的峰面积比值为纵坐标,待测物浓度为横坐标,采用加权(1/X²)最小二乘法进行线性回归分析,VA和DMA的标准曲线回归方程为:Y=0.000 698X+0.008 13(r=0.994 4),Y=0.001 12X+0.004 18(r=0.995 3),Y=0.043 2X+0.048 6(r=0.998 7),说明血浆样品中肉桂酸在3~600 ng·mL^-1,VA和DMA在1~200 ng·mL^-1内线性关系良好,可用于血浆样品中3种待测物的浓度分析。定量下限为3、1、1 ng·mL^-1,信噪比(S/N)均≥10,精密度相对标准偏差(RSD)≤20%,准确度在80%~120%以内,结果见表1。运行完定量上限样品后测定空白血浆样品,空白血浆样品中3种待测物和内标的保留时间处均未发现有干扰峰,说明该方法无残留效应。

2.5.3 精密度与准确度

取“2.2”项下低、中、高浓度混合QC工作溶液各10 μL,加入大鼠空白血浆90 μL,涡旋混匀,得CA质量浓度为6、60、450 ng·mL^-1,VA和DMA质量浓度为2、20、150 ng·mL^-1的混合质控样品,之后各取50 μL,按“2.4”项下进行样品处理并分析,每个批次每个质控样品6个重复样,连续测定3 d。3个化合物的批内精密度RSD在2.3%~14.2%,准确度在87.9%~106.4%,批间精密度RSD在5.7%~11.4%,准确度在86.4%~106.7%,结果见表1。

2.5.4 基质效应与提取回收率

取娃哈哈纯净水50 μL,按“2.4”项下方法加入内标溶液并浓缩干燥,之后加入100 μL对应浓度的低、高浓度QC溶液复溶,处理后取上清进样分析,测得待测物的峰面积为A(每个浓度平行6份);取6个不同来源大鼠空白血浆各50 μL,同法浓缩干燥、复溶并进样分析,测得待测物的峰面积为B;取6个不同来源大鼠空白血浆,按“2.5.3”项下方法制备低、高浓度的质控样品,按“2.4”项下方法进行处理并分析,测得待测物的峰面积为C。B与A的比值为基质效应,C与B的比值为提取回收率。3个待测物的基质效应在85.8%~122.0%,提取回收率在63.4%~94.1%,结果见表2。

2.5.5 稳定性

选择低、中、高3个浓度的混合QC工作溶液,按“2.5.3”项下方法制备相应浓度的QC样品,考察各浓度QC样品在不同工作条件下稳定性:室温(25 ℃)放置1 h、自动进样器(6 ℃)放置24 h、-80 ℃→室温冻融循环2次、-80 ℃冰箱放置30 d。QC样品中化合物浓度变化不超过标示浓度的15%,稳定性实验结果见表3。

2.6 大鼠体内药动学研究

大鼠按体质量随机分为3组,包括ASBX低(0.54 g·kg^-1)、中(1.08 g·kg^-1)和高(2.16 g·kg^-1)剂量组,每组5只雄性大鼠。称取ASBX适量,加入适量0.5% CMC-Na,超声溶解,配制成质量浓度分别为0.054、0.108、0.216 g·mL^-1的ASBX药液,按10 mL·kg^-1灌胃给药,各组分别在给药前(0 min)、给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、3、5、7、9、11和24 h后,大鼠在麻醉状态下眼眶静脉丛采血约150 μL,置1.5 mL肝素抗凝的离心管中,于4 ℃,10 000 r·min^-1离心2 min,转移血浆,-80 ℃冰箱冷冻保存。

采用已建立的LC-MS/MS分析方法对血浆样品进行定量分析,以血药浓度为纵坐标,时间为横坐标,获得ASBX各给药组大鼠血浆中3种主要成分的平均血药浓度-时间曲线。采用MaS Studio 1.5.2.14软件非房室模型计算CA、VA、DMA在大鼠体内的等药动学参数,应用Microsoft Excel处理数据,实验数据用平均值±标准差(

$\stackrel{-}{x}$

±s)表示。

大鼠单次给药不同剂量的ASBX后,CA、VA、DMA均在5 min吸收入血。CA达峰迅速,平均达峰时间(t_max)在0.22~0.40 h之间,VA达峰最快t_max为0.08 h,DMA达峰较慢,t_max在5.40~8.20 h之间;CA的平均半衰期(t_1/2)在0.79~2.04 h之间,平均滞留时间(MRT)在1.26~3.00 h之间,VA的t_1/2在0.37~0.65 h之间,MRT在0.48~0.92 h之间,DMA的t_1/2在4.26~9.58 h之间,MRT在8.90~16.74 h之间。

CA在大鼠体内的暴露水平最高,低、中、高剂量给药后其在体内的平均峰浓度(ρ_max)分别为(279.70±113.86) (302.88±113.79)(283.65±175.59) ng·mL^-1,平均曲线下面积(AUC_0-∞)分别为(351.83±115.01) (479.1±157.62) (537.96±324.86) ng·h·mL^-1,VA在大鼠体内的暴露水平低于CA,其ρ_max分别为(16.42±5.07) (36.68±40.30) (43.33±18.70) ng·mL^-1,AUC_0-∞分别为(7.20±3.77) (10.83±7.49) (18.82±8.92) ng·h·mL^-1,DMA在大鼠体内的暴露水平最低,其ρ_max分别为(2.81±2.75) (4.98±1.82) (7.20±1.54) ng·mL^-1,AUC_0-∞分别为(29.27±28.51)、(91.76±18.45) (119.64±38.75) ng·h·mL^-1。药动学参数见表4,平均血药浓度-时间曲线图见图4。

采用置信区间法^[24-25]对3个化合物的系统暴露水平(ρ_max和AUC)与剂量进行相关性分析,结果见表5,拟合曲线见图5。CA的ρ_max与剂量之间无明确相关性,AUC_0-∞与剂量呈正相关,为非线性相关;VA的ρ_max与剂量成正相关,为非线性相关,AUC_0-∞与剂量成正相关,但是线性关系不确定;DMA的ρ_max与剂量成正相关,为非线性相关,AUC_0-∞与剂量成正相关,但是线性关系不确定。

3 讨论

收起

本研究开展前采用高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(HPLC-Q-TOF-MS/MS)技术解析了给药ASBX后大鼠血清中的化学成分,血清样品中共鉴定到109个药物成分,其中17种成分为6只给药大鼠血清中的共有成分。之后通过药动学预实验发现临床等效剂量给药后,大鼠血浆中能够定量的成分包括CA、VA和DMA等有机酸,以及其他5种不同类型的成分,考虑到各成分的化学性质不同,本课题组开发了不同的LC-MS/MS分析方法。

本研究建立了同时测定大鼠血浆中CA、VA和DMA等有机酸的LC-MS/MS方法。采用此方法分析了不同剂量灌胃给药ASBX后大鼠血浆中3种成分的浓度,系统考察了3种成分的药动学特征,明确了给药剂量和3种成分系统暴露水平的相关性,为蒙药ASBX药效物质基础的研究提供了参考。但是ASBX作为一个复方,组成复杂,还需要在后续研究中对其他成分(类型)的药动学特征进行考察。

血浆样品中有机酸类的处理方法有液-液萃取法和蛋白沉淀法等^[26-27]。本研究比较了甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等不同蛋白沉淀试剂和萃取试剂,结果发现采用丙酮进行蛋白沉淀时3种成分的提取回收率均为最高。

ASBX每日临床最大服用生药量6 g,按成人平均体质量60 kg计算,为0.1 g·kg^-1,按体表面积换算成大鼠等效剂量(生药量)为0.54 g·kg^-1。药动学研究结果表明,低、中、高剂量给药ASBX后,CA、VA和DMA在体内的ρ_max,以及肉桂酸AUC的高低与ASBX中3种成分的含量高低保持一致,而VA和DMA的AUC则与二者的含量呈现出相反的结果,可能是由于二者的结构存在差异(VA为小分子的酚酸类化合物,DMA为多酚二内酯类化合物)而引起了大鼠体内代谢的不同。

大鼠灌胃给药ASBX后CA的t_max比文献[28-29]报道的长,而t_1/2则基本一致,而复方给药后与单独灌胃CA^[30]的t_max和t_1/2均有所差异说明复方中的其他成分对CA的吸收和代谢均产生了不同程度的影响。VA在大鼠体内吸收最快(t_max为5 min),而且代谢也较快,与文献[31-32]报道的(t_1/2在3.74~8.89 h之间,MRT在3.15~4.45 h之间)有差别,可能是在ASBX处方中存在药物之间的相互作用,加快了VA在大鼠体内的吸收和代谢。目前暂无DMA药动学方面的相关报道,本研究的结果显示其吸收(t_max在5.40~8.20 h)和代谢(t_1/2在4.26~9.58 h之间, MRT在8.90~16.74 h之间)均较慢,是否会引起体内蓄积需要进一步的实验验证。

给药剂量和系统暴露水平相关性研究结果表明,随着ASBX给药剂量的增加,VA和DMA在大鼠体内的ρ_max和AUC,以及CA的AUC均随着剂量的增加而增加,但是CA的ρ_max并未呈现出增加的趋势,可能是由于当药物浓度达到某一限度时,体内的代谢酶或者载体的运输能力会达到饱和,从而表现出不同给药剂量下吸收相同的结果^[33]。

基金

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国家重点研发计划项目资助(2018YFC1708200)
国家重点研发计划项目资助(2018YFC1708204)
内蒙古自治区科技重大专项资助(2019ZD004)

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文献

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2024年第59卷第17期

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doi: 10.11669/cpj.2024.17.009

接收时间：2023-07-05
首发时间：2025-12-30
出版时间：2024-09-08

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作者

出版历史

收稿日期：2023-07-05

基金

国家重点研发计划项目资助(2018YFC1708200)

国家重点研发计划项目资助(2018YFC1708204)

内蒙古自治区科技重大专项资助(2019ZD004)

作者信息

¹ 中国中医科学院中药研究所, 北京 100700

² 辽宁师范大学, 辽宁大连 116000

³ 上海爱博才思分析仪器贸易有限公司北京分公司, 北京 100010

通讯作者:

^* 张广平,男,博士,研究员研究方向:中药药理毒理 Tel:(010)64031832;

陈腾飞,男,博士,副研究员研究方向:中药药动学 Tel:(010)64031832

参考文献

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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RefWorks
TxT

Analytes	ρ(Spiked) /ng·mL^-1	Intra-day (n=6)	Inter-day (n=18)
Cinnamic acid	3.0	3.1	±0.2	4.9	103.6	3.2	±0.2	7.2	105.6
	6.0	6.1	±0.4	6.5	102.1	6.0	±0.4	6.9	99.3
	60.0	57.2	±5.6	9.8	95.3	60.5	±6.32	10.5	100.8
	450.0	410.8	±16.0	3.9	91.3	452.5	±40.5	9.0	100.6
Vanillic acid	1.0	1.1	±0.1	8.6	106.4	1.1	±0.1	6.1	106.7
	2.0	2.0	±0.1	6.0	101.4	2.1	±0.1	6.7	104.0
	20.0	20.1	±1.6	7.8	100.3	20.7	±1.6	7.8	103.4
	150.0	144.1	±3.3	2.3	96.1	158.3	±11.7	7.4	105.5
3,3'-O-dimethylellagic acid	1.0	1.1	±0.2	14.2	105.4	1.1	±0.1	11.4	106.3
	2.0	1.9	±0.2	11.3	97.0	2.0	±0.2	8.3	97.3
	20.0	22.0	±1.0	4.5	87.9	21.6	±1.2	5.7	86.4
	150.0	135.3	±3.6	2.7	90.2	143.9	±15.0	10.4	95.9

Analytes

ρ(Spiked)
/ng·mL^-1

Intra-day (n=6)

Inter-day (n=18)

ρ(Measured)
/ng·mL^-1

RSD
/%

RE
/%

ρ(Measured)
/ng·mL^-1

RSD
/%

RE
/%

Cinnamic acid

3.0

3.1

±0.2

4.9

103.6

3.2

±0.2

7.2

105.6

6.0

6.1

±0.4

6.5

102.1

6.0

±0.4

6.9

99.3

60.0

57.2

±5.6

9.8

95.3

60.5

±6.32

10.5

100.8

450.0

410.8

±16.0

3.9

91.3

452.5

±40.5

9.0

100.6

Vanillic acid

1.0

1.1

±0.1

8.6

106.4

1.1

±0.1

6.1

106.7

2.0

±0.1

6.0

101.4

2.1

±0.1

6.7

104.0

20.0

20.1

±1.6

7.8

100.3

20.7

±1.6

7.8

103.4

150.0

144.1

±3.3

2.3

96.1

158.3

±11.7

7.4

105.5

3,3'-O-dimethylellagic acid

1.0

1.1

±0.2

14.2

105.4

1.1

±0.1

11.4

106.3

2.0

1.9

±0.2

11.3

97.0

2.0

±0.2

8.3

97.3

20.0

22.0

±1.0

4.5

87.9

21.6

±1.2

5.7

86.4

150.0

135.3

±3.6

2.7

90.2

143.9

±15.0

10.4

95.9

Compound	ρ(Spiked) /ng·mL^-1	Matrix effect /%	Recovery /%
Cinnamic acid	6.0	85.8	±8.1	84.0	±8.8
	450.0	90.8	±2.3	94.1	±7.4
Vanillic acid	2.0	82.7	±11.4	63.4	±5.4
	150.0	91.0	±4.1	79.9	±5.9
3,3'-O-dimethylellagic acid	2.0	122.0	±15.2	78.9	±9.1
	150.0	115.5	±5.0	92.0	±4.9

Compound

ρ(Spiked)
/ng·mL^-1

Matrix effect
/%

Recovery
/%

Cinnamic acid

6.0

85.8

±8.1

84.0

±8.8

450.0

90.8

±2.3

94.1

±7.4

Vanillic acid

2.0

82.7

±11.4

63.4

±5.4

150.0

91.0

±4.1

79.9

±5.9

3,3'-O-dimethylellagic acid

2.0

122.0

±15.2

78.9

±9.1

150.0

115.5

±5.0

92.0

±4.9

Analytes	ρ(Spiked) /ng·mL^-1	Room (25 ℃) 1 h	Autosampler (6 ℃) 24 h	Freeze/thaw 2 times	Long-term 30 d
Cinnamic acid	6.0	6.2	±0.3	3.4	6.5	±0.2	8.8	5.9	±0.6	-2.5	6.2	±0.2	2.9
	60.0	62.8	±2.9	4.6	62.8	±4.3	4.7	56.0	±4.5	-6.8	62.1	±1.3	3.5
	450.0	495.5	±13.0	10.1	444.0	±29.1	-1.4	412.2	±18.7	-8.4	449.5	±10.2	-0.1
Vanillic acid	2.0	2.1	±0.2	3.8	2.1	±0.1	5.4	2.0	±0.2	1.9	2.1	±0.1	3.1
	20.0	21.3	±0.9	6.3	20.2	±1.2	0.8	19.9	±1.2	-0.3	20.9	±0.4	4.3
	150.0	163.0	±8.5	8.7	144.7	±6.2	-3.6	144.0	±4.0	-4.0	155.0	±1.8	3.3
3,3'-O-dimethylellagic acid	2.0	1.8	±0.1	-8.2	2.2	±0.1	10.1	2.1	±0.2	7.0	2.0	±0.1	1.5
	20.0	18.7	±0.8	-6.5	21.2	±1.3	5.9	21.8	±0.9	8.8	20.9	±0.5	4.5
	150.0	145.5	±13.6	-3.0	141.7	±8.7	-5.5	143.9	±9.0	-4.1	141.2	±5.9	-5.9

Analytes

ρ(Spiked)
/ng·mL^-1

Room (25 ℃) 1 h

Autosampler (6 ℃) 24 h

Freeze/thaw 2 times

Long-term 30 d

ρ(Measured)
/ng·mL^-1

Bias
/%

ρ(Measured)
/ng·mL^-1

Bias
/%

ρ(Measured)
/ng·mL^-1

Bias
/%

ρ(Measured)
/ng·mL^-1

Bias
/%

Cinnamic acid

6.0

6.2

±0.3

3.4

6.5

±0.2

8.8

5.9

±0.6

-2.5

6.2

±0.2

2.9

60.0

62.8

±2.9

4.6

62.8

±4.3

4.7

56.0

±4.5

-6.8

62.1

±1.3

3.5

450.0

495.5

±13.0

10.1

444.0

±29.1

-1.4

412.2

±18.7

-8.4

449.5

±10.2

-0.1

Vanillic acid

2.0

2.1

±0.2

3.8

2.1

±0.1

5.4

2.0

±0.2

1.9

2.1

±0.1

3.1

20.0

21.3

±0.9

6.3

20.2

±1.2

0.8

19.9

±1.2

-0.3

20.9

±0.4

4.3

150.0

163.0

±8.5

8.7

144.7

±6.2

-3.6

144.0

±4.0

-4.0

155.0

±1.8

3.3

3,3'-O-dimethylellagic acid

2.0

1.8

±0.1

-8.2

2.2

±0.1

10.1

2.1

±0.2

7.0

2.0

±0.1

1.5

20.0

18.7

±0.8

-6.5

21.2

±1.3

5.9

21.8

±0.9

8.8

20.9

±0.5

4.5

150.0

145.5

±13.6

-3.0

141.7

±8.7

-5.5

143.9

±9.0

-4.1

141.2

±5.9

-5.9

Analytes	Parameters	ASBX(0.54 g·kg^-1)	ASBX(1.08 g·kg^-1)	ASBX(2.16 g·kg^-1)
Cinnamic acid	t_1/2/h	0.79	±0.48	2.04	±0.75	1.79	±0.48
	t_max/h	0.40	±0.14	0.22	±0.07	0.30	±0.11
	ρ_max/ng·mL^-1	279.70	±113.86	302.88	±113.79	283.65	±175.59
	AUC_0-t/ng·h·mL^-1	337.31	±117.47	459.98	±154.3	507.45	±315.70
	AUC_0-∞/ng·h·mL^-1	351.83	±115.01	479.1	±157.62	537.96	±324.86
	MRT_0-∞/h	1.26	±0.70	3.00	±1.06	2.67	±0.76
Vanillic acid	t_1/2/h	0.53	±0.69	0.37	±0.11	0.65	±0.44
	t_max/h	0.08	±0	0.08	±0.00	0.08	±0.00
	ρ_max/ng·mL^-1	16.42	±5.07	36.68	±40.30	43.33	±18.70
	AUC_0-t/ng·h·mL^-1	6.87	±3.73	10.53	±7.49	17.44	±8.63
	AUC_0-∞/ng·h·mL^-1	7.20	±3.77	10.83	±7.49	18.82	±8.92
	MRT_0-∞/h	0.76	±0.86	0.48	±0.15	0.92	±0.58
3,3'-O-dimethylellagic acid	t_1/2/h	4.26	±1.95	9.58	±4.72	6.88	±2.29
	t_max/h	5.40	±1.67	7.00	±1.41	8.20	±1.10
	ρ_max/ng·mL^-1	2.81	±2.75	4.98	±1.82	7.20	±1.54
	AUC_0-t/ng·h·mL^-1	23.15	±25.79	65.32	±38.89	102.21	±26.35
	AUC_0-∞/ng·h·mL^-1	29.27	±28.51	91.76	±18.45	119.64	±38.75
	MRT_0-∞/h	8.90	±2.90	16.74	±6.92	13.30	±3.42

Analytes

Parameters

ASBX(0.54 g·kg^-1)

ASBX(1.08 g·kg^-1)

ASBX(2.16 g·kg^-1)

Cinnamic acid

t_1/2/h

0.79

±0.48

2.04

±0.75

1.79

±0.48

t_max/h

0.40

±0.14

0.22

±0.07

0.30

±0.11

ρ_max/ng·mL^-1

279.70

±113.86

302.88

±113.79

283.65

±175.59

AUC_0-t/ng·h·mL^-1

337.31

±117.47

459.98

±154.3

507.45

±315.70

AUC_0-∞/ng·h·mL^-1

351.83

±115.01

479.1

±157.62

537.96

±324.86

MRT_0-∞/h

1.26

±0.70

3.00

±1.06

2.67

±0.76

Vanillic acid

t_1/2/h

0.53

±0.69

0.37

±0.11

0.65

±0.44

t_max/h

0.08

±0

0.08

±0.00

0.08

±0.00

ρ_max/ng·mL^-1

16.42

±5.07

36.68

±40.30

43.33

±18.70

AUC_0-t/ng·h·mL^-1

6.87

±3.73

10.53

±7.49

17.44

±8.63

AUC_0-∞/ng·h·mL^-1

7.20

±3.77

10.83

±7.49

18.82

±8.92

MRT_0-∞/h

0.76

±0.86

0.48

±0.15

0.92

±0.58

3,3'-O-dimethylellagic acid

t_1/2/h

4.26

±1.95

9.58

±4.72

6.88

±2.29

t_max/h

5.40

±1.67

7.00

±1.41

8.20

±1.10

ρ_max/ng·mL^-1

2.81

±2.75

4.98

±1.82

7.20

±1.54

AUC_0-t/ng·h·mL^-1

23.15

±25.79

65.32

±38.89

102.21

±26.35

AUC_0-∞/ng·h·mL^-1

29.27

±28.51

91.76

±18.45

119.64

±38.75

MRT_0-∞/h

8.90

±2.90

16.74

±6.92

13.30

±3.42

Analytes	PK parameters	r²	P value	Slope(95% CI)	Conclusion¹⁾
Cinnamic acid	ρ_max	0.004	0.83	-0.04 (-0.47-0.38)	No clear correlation with dose
	AUC_0-∞	0.087	0.29	0.23 (-0.21-0.67)	Positive correlation with dose. Nonlinear correlation
Vanillic acid	ρ_max	0.317	0.03	0.67 (0.08-1.26)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship
	AUC_0-∞	0.290	0.04	0.65 (0.04-1.27)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship
3,3'-O-dimethylellagic acid	ρ_max	0.425	0.01	1.03 (0.31-1.75)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship
	AUC_0-∞	0.471	0.00	1.45 (0.53-2.36)	Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship

Analytes

PK parameters

r²

P value

Slope(95% CI)

Conclusion¹⁾

Cinnamic acid

ρ_max

0.004

0.83

-0.04 (-0.47-0.38)

No clear correlation with dose

AUC_0-∞

0.087

0.29

0.23 (-0.21-0.67)

Positive correlation with dose. Nonlinear correlation

Vanillic acid

ρ_max

0.317

0.03

0.67 (0.08-1.26)

Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship

AUC_0-∞

0.290

0.04

0.65 (0.04-1.27)

Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship

3,3'-O-dimethylellagic acid

ρ_max

0.425

0.01

1.03 (0.31-1.75)

Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship

AUC_0-∞

0.471

0.00

1.45 (0.53-2.36)

Positive correlation with dose. Uncertainty of linear relationship