中国药学杂志

No.	Angelicae Sinensis Radix	Astragali Radix	Combination
DBT01	ypDG-003	ypHQ-001	D03H01
DBT02	ypDG-004	ypHQ-002	D04H02
DBT03	ypDG-003	ypHQ-005	D03H05
DBT04	ypDG-001	ypHQ-003	D01H03
DBT05	ypDG-001	ypHQ-001	D01H01
DBT06	ypDG-003	ypHQ-004	D03H04
DBT07	ypDG-004	ypHQ-001	D04H01
DBT08	ypDG-004	ypHQ-005	D04H05
DBT09	ypDG-001	ypHQ-004	D01H04
DBT10	ypDG-001	ypHQ-002	D01H02
DBT11	ypDG-002	ypHQ-003	D02H03
DBT12	ypDG-002	ypHQ-002	D02H02
DBT13	ypDG-004	ypHQ-004	D04H04
DBT14	ypDG-002	ypHQ-001	D02H01
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No.	Angelicae Sinensis Radix	Astragali Radix	Combination
DBT01	ypDG-003	ypHQ-001	D03H01
DBT02	ypDG-004	ypHQ-002	D04H02
DBT03	ypDG-003	ypHQ-005	D03H05
DBT04	ypDG-001	ypHQ-003	D01H03
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t/h	Blank	S₁₈	S₉	S₆	S_4.5	S_3.5
26	1.11±0.09	1.05±0.08	1.20±0.04	1.31±0.06	1.39±0.07	1.39±0.08
28	1.09±0.05	0.95±0.03	1.11±0.03	1.27±0.07	1.39±0.05	1.37±0.06
30	1.05±0.06	0.93±0.03	1.00±0.01	1.15±0.08	1.21±0.05	1.31±0.14

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t/h	Blank	S_4.5	S₃	S_2.5	S
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28	0.24±0.10	0.46±0.14	0.52±0.07	0.57±0.15	0.84±0.24
30	0.23±0.10	0.41±0.12	0.49±0.08	0.54±0.13	0.82±0.23

t/h	Blank	S_4.5	S₃	S_2.5	S
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t/h	Blank	S₃₆	S₁₈	S₉	S_4.5	S_2.5
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t/h	Blank	S₃₆	S₁₈	S₉	S_4.5	S_2.5
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Sample	Stage	t/h	RSD/%
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		12.01-25.68	0.07-11.07
	Sample testing phase	26.25-38.08	0.10-7.87
		38.08-52.08	0.07-0.49
S₉	Cell stable phase	2.35-12.01	0.23-9.97
		12.01-25.68	0.07-8.32
	Sample testing phase	26.25-38.08	0.24-6.96
		38.08-52.08	0.16-1.08
S₁₈	Cell stable phase	2.35-12.01	0.11-8.96
		12.01-25.68	0.11-7.08
	Sample testing phase	26.25-38.08	0.24-7.97
		38.08-52.08	0.23-2.49

Sample	Stage	t/h	RSD/%
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S₁₈	Cell stable phase	2.35-12.01	0.11-8.96
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Sample	Stage	t/h	RSD/%
S_3.5	Cell stable phase	2.35-12.01	4.69-11.42
		12.01-25.68	3.43-6.21
	Sample testing phase	26.25-38.08	3.06-7.70
		38.08-52.08	5.76-10.42
S₉	Cell stable phase	2.35-12.01	5.87-11.24
		12.01-25.68	2.59-6.81
	Sample testing phase	26.25-38.08	0.70-10.25
		38.08-52.08	2.58-5.67
S₁₈	Cell stable phase	2.35-12.01	2.50-13.32
		12.01-25.68	5.45-13.10
	Sample testing phase	26.25-38.08	0.78-9.71
		38.08-52.08	1.09-6.01

Sample	Stage	t/h	RSD/%
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S₁₈	Cell stable phase	2.35-12.01	2.50-13.32
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No.	AUC	CI_max	t_max/h	t_1/2AUC/h
DBT01	62.05	1.67	30.75	29.12
DBT02	65.47	1.55	29.89	28.92
DBT03	60.69	1.44	29.39	28.79
DBT04	62.25	1.49	29.79	28.37
DBT05	59.08	1.46	29.62	28.41
DBT06	56.31	1.52	30.38	27.79
DBT07	64.17	1.49	29.85	29.30
DBT08	62.36	1.47	29.72	28.61
DBT09	57.93	1.37	29.29	28.27
DBT10	62.37	1.47	32.47	28.88
DBT11	55.63	1.38	29.15	27.50
DBT12	56.77	1.39	30.68	28.00
DBT13	62.74	1.51	31.97	29.29
DBT14	63.44	1.51	29.72	28.88
DBT15	60.92	1.52	30.55	29.35
Average	60.81	1.48	30.21	28.63
Stdev	3.01	0.07	0.95	0.57
RSD/%	4.95	5.05	3.16	1.98

No.	AUC	CI_max	t_max/h	t_1/2AUC/h
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RSD/%	4.95	5.05	3.16	1.98

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DBT02	99.641	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
DBT03	99.736	99.890	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
DBT04	99.763	99.921	99.955	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
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DBT06	99.721	99.291	99.646	99.582	99.839	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
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R	99.834	99.869	99.982	99.968	99.961	99.735	99.877	99.951	99.948	99.974	99.829	99.893	99.971	99.933	99.967	-

No.	DBT01	DBT02	DBT03	DBT04	DBT05	DBT06	DBT07	DBT08	DBT09	DBT10	DBT11	DBT12	DBT13	DBT14	DBT15	R
DBT01	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
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DBT04	99.763	99.921	99.955	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
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No.	AUC	CI_max	t_max/h	t_1/2AUC/h	f₂
DBT01	0.95	1.00	0.95	0.99	1.00
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DBT03	0.93	0.86	0.91	0.98	1.00
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DBT05	0.90	0.87	0.91	0.97	1.00
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DBT07	0.98	0.89	0.92	1.00	1.00
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DBT09	0.88	0.82	0.90	0.96	1.00
DBT10	0.95	0.88	1.00	0.98	1.00
DBT11	0.85	0.83	0.90	0.94	1.00
DBT12	0.87	0.83	0.94	0.95	1.00
DBT13	0.96	0.90	0.98	1.00	1.00
DBT14	0.97	0.90	0.92	0.98	1.00
DBT15	0.93	0.91	0.94	1.00	1.00

No.	AUC	CI_max	t_max/h	t_1/2AUC/h	f₂
DBT01	0.95	1.00	0.95	0.99	1.00
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DBT06	0.86	0.91	0.94	0.95	1.00
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DBT14	0.97	0.90	0.92	0.98	1.00
DBT15	0.93	0.91	0.94	1.00	1.00

基于DASS-RTCA法的经典名方当归补血汤质量一致性评价初步研究

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高武锋 ¹^,² , 张佳 ¹^,² , 卞海雯 ¹^,² , 江悦 ¹^,² , 亓雅丽 ¹^,² , 石德志 ¹^,³ , 毕蕾 ⁴ , 顾玲 ⁴ , 严国俊 ¹^,²^,³^,^*

中国药学杂志 | 论著 2024,59(12): 1110-1119

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中国药学杂志 | 论著 2024, 59(12): 1110-1119

基于DASS-RTCA法的经典名方当归补血汤质量一致性评价初步研究

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高武锋¹^,², 张佳¹^,², 卞海雯¹^,², 江悦¹^,², 亓雅丽¹^,², 石德志¹^,³, 毕蕾⁴, 顾玲⁴, 严国俊¹^,²^,³^,^*

作者信息

¹ 南京中医药大学药学院, 南京 210023

² 江苏省中医外用药开发与应用工程研究中心, 南京 210023

³ 江苏省经典名方工程研究中心, 南京 210023

⁴ 南京中医药大学中医学院·中西医结合学院, 南京 210023

高武锋,男,硕士研究生研究方向:中药药剂学

通讯作者:

*严国俊,男,博士,博士研究生导师研究方向:中药饮片及制剂品质传递过程的评价与控制 Tel:(025)85811517

Preliminary Study on the Quality Consistency Evaluation of the Classic Prescription Danggui Buxue Tang based on DASS-RTCA Method

Wufeng GAO¹^,², Jia ZHANG¹^,², Haiwen BIAN¹^,², Yue JIANG¹^,², Yali QI¹^,², Dezhi SHI¹^,³, Lei BI⁴, Ling GU⁴, Guojun YAN¹^,²^,³^,^*

Affiliations

¹ School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

² Jiangsu Provincial Engineering Research Center of Traditional Chinese Medicine External Medication Development and Application, Nanjing 210023, China

³ Jiangsu Provincial Engineering Research Center of Classical Formula, Nanjing 210023, China

⁴ School of Integrated Chinese and Western Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

出版时间: 2024-06-22 doi: 10.11669/cpj.2024.12.006

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摘要

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目的建立一种反映多批次中药复方制剂整体药效特征的质量一致性评价方法。方法以外翻肠囊模型建立药物吸收仿生系统(drug absorption simulating system,DASS)标准化吸收仿生系统模块,制备不同来源、批次的当归补血汤(Danggui buxue tang,DBT)肠吸收样品;借鉴生物药一致性评价思路,以实时细胞分析(real-time cell analysis,RTCA)建立细胞生物效应表征模块,监测15批DBT样品细胞反应曲线。结果联合DASS-RTCA法,对15批DBT样品时间剂量依赖性细胞反应曲线(time-dependent cell response patterns,TCRPs)的特征参数进行提取,各特征参数的相对标准偏差(RSD)均<5.1%,表明各批次DBT细胞效应表征差异较小,TCRPs图相似度高。通过相似度分析、聚类分析、雷达图等分析,均反映不同批次DBT的质量具有较高的一致性。结论联合DASS-RTCA法建立的质量一致性评价方法可反映制剂的整体质量,为中药批次间质量一致性评价提供新的思路和方法。

关键词

当归补血汤 / 药物吸收仿生系统 / 实时细胞分析 / 生物评价 / 一致性评价

Abstract

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OBJECTIVE To establish a quality consistency evaluation method reflecting the overall pharmacodynamic characteristics of multi-batch Chinese medicine compound preparations. METHODS Establish a drug absorption simulating system(DASS) standardized absorption biomimetic system module using a flipped intestinal sac model, and prepare intestinal absorption samples of Danggui buxue tang from different sources and batches; Drawing on the concept of consistency evaluation of biopharmaceuticals, a cell biological effect characterization module was established using Real-time cell analysis(RTCA) to monitor the cell response curves of 15 batches of Danggui buxue tang samples. RESULTS The combination of DASS-RTCA was used to extract the characteristic parameters of time-dependent cell response patterns (TCRPs) maps from 15 batches of Danggui buxue tang samples. The RSD of each characteristic parameter was less than 5.1%, indicating that the differences in cell effect characterization of Danggui buxue tang (DBT) were small and the similarity of TCRPs maps was high. Through similarity analysis, cluster analysis, radar chart analysis, etc., it is reflected that the quality of different batches of DBT has high consistency. CONCLUSION The quality consistency evaluation method established by DASS-RTCA can reflect the overall quality of the preparations and provide new ideas and methods for the evaluation of batch-to-batch quality consistency of traditional Chinese medicines.

Key words

Danggui buxue tang / drug absorption simulating system / real time cell analysis / biological evaluation / consistency evaluation

引用本文

高武锋, 张佳, 卞海雯, 江悦, 亓雅丽, 石德志, 毕蕾, 顾玲, 严国俊. 基于DASS-RTCA法的经典名方当归补血汤质量一致性评价初步研究. 中国药学杂志, 2024 , 59 (12) : 1110 -1119 . DOI: 10.11669/cpj.2024.12.006

Wufeng GAO, Jia ZHANG, Haiwen BIAN, Yue JIANG, Yali QI, Dezhi SHI, Lei BI, Ling GU, Guojun YAN. Preliminary Study on the Quality Consistency Evaluation of the Classic Prescription Danggui Buxue Tang based on DASS-RTCA Method[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (12) : 1110 -1119 . DOI: 10.11669/cpj.2024.12.006

正文

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当归补血汤(Danggui buxue tang,DBT)出自金代李东垣编撰的《内外伤辨惑论·暑伤胃气论》,由黄芪和当归两种中药组成,主治血虚阳浮发热证,肌热面红,烦渴欲饮,脉洪大而虚,重按无力^[1]。现代研究表明,DBT具有抗炎、抗肿瘤、治疗贫血、调节免疫功能、保护心脑血管系统等药理作用,其药效明确,化学成分清楚^[2-5]。目前,大多采用色谱指纹图谱及具体指标用于中药复方制剂的质量控制,考察制剂质量一致性。然而,中药复方通过多成分协同作用,发挥整体药效,选取的特定指标是否代表中药复方制剂质量的整体特征及药效,都存在不确定性。

药物吸收仿生系统(DASS)是目前较为常用的一种药物基于肠道吸收建立的体外仿生系统,减少了药物吸收的影响,常以Caco-2细胞、肠管或人工渗透膜为仿生介质模拟肠道黏膜分析药物在肠道的吸收特征,已用于中药单体、单味中药和中药复方制剂的有效成分吸收规律或相互作用研究^[6-8]。实时细胞电子分析(RTCA)技术是建立在阻抗基础上的瞬时细胞电感应连续记录系统。通过监测药物作用于细胞而产生的生理状态,记录细胞的动态变化过程(细胞增殖与分化、凋亡与衰老、黏附等多种细胞生理状态),并将阻抗值经软件处理转换成电信号细胞指数,从而描绘形成时间剂量依赖性细胞反应曲线(TCRPs),直观全面地表达药物对细胞的作用(促进或抑制),通过细胞指数的大小反映其对细胞作用的强弱^[9]。

基于上述,本研究以DBT为研究对象,从中医药理论的整体观念出发,将DBT经过DASS标准化吸收后,再以RTCA系统进行药液的细胞检测,将DASS与RTCA系统联合,建立细胞指数(cell index,CI)-给药时间(time,t)对应的细胞效应曲线,形成TCRPs,采用不同产地、不同批次饮片制备的DBT进行细胞生物表征确定方法的一致性,建立了体现DBT质量一致性的细胞生物评价方法,为中药经典名方制剂的科学评价提供一种新的思路和方法。

1 材料

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1.1 药材与试剂

黄芪5批药材购于甘肃岷县(3批)、山西五寨县(1批)、民乐县(1批),当归4批药材购于甘肃岷县(2批)、漳县(1批)、临潭县(1批),经南京中医药大学中药鉴定学教研室严辉教授鉴定分别为豆科植物蒙古黄芪[Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge. var. mongholicus(Bge.) Hsiao]的干燥根、伞形科植物当归[Angelica sinensis(Oliv.) Diels]的干燥根,并依据2020年版《中国药典》一部黄芪、当归项下规定检测,均符合要求。黄芪饮片(ypHQ-001~005)、当归饮片(ypDG-001~004)均依据前期建立的饮片炮制方法^[10]由实验室自制,饮片批号与上述药材相对应。DBT组合信息见表1。

磷酸二氢钾、氢氧化钠(分析纯);胎牛血清(南京森贝伽生物科技有限公司,批号BC20221108);MEMα基础培养基(南京翼飞雪生物科技有限公司,批号WH1021D041);RPMI Medium 1640培养基[赛默飞世尔生物化学制品(北京)有限公司,批号8122231];DMEM高糖培养基(上海源培生物科技股份有限公司,批号A211003);PBS(南京森贝伽生物科技有限公司,批号BC20220830);青链霉素混合溶液(100×)、胰酶细胞消化液(0.25%胰酶)(上海碧云天生物技术有限公司,批号092622221214;批号102022221108);无血清非程序冻存液(武汉普诺赛生命科技有限公司,批号WH06121D161)。

1.2 仪器

FA1104N万分之一电子分析天平(上海菁海仪器有限公司);X025-12DTD超声波清洗机(南京先欧仪器制造有限公司);Allegra X-30R高速冷冻离心机(美国贝克曼库尔特公司);MZY-U20V纯水仪(南京妙之仪电子科技有限公司);F2-Standard便携式pH计[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司];HJ-4A数显恒温磁力搅拌器(江苏金怡仪器科技有限公司);YSK-3AW医用分子筛制氧机(安徽皖舒医疗设备有限公司);TDZ4B-WS台式低速自动平衡离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司);DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);xCELLigence RTCA DPRTCA实时无标记细胞分析仪(杭州艾森生物有限公司)。

1.3 细胞与动物

小鼠骨髓基质细胞OP9(体积分数20%FBS的MEMα培养基培养),人脐静脉内皮细胞HUVEC(体积分数10%FBS的1640培养基培养),小鼠骨髓间充质干细胞BMSC(体积分数10%FBS的DMEM高糖培养基培养),均在37 ℃、体积分数5%CO₂饱和湿度环境下培养。3种细胞均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

SPF级雄性SD大鼠,体质量(220±10)g,南京市江宁区青龙山动物繁殖场,合格证号:SCXK(浙)2019-0002。实验经过南京中医药大学动物伦理审核通过,批准号202204A004。动物饲养环境:SPF级环境,温度22~24 ℃,相对湿度45%~55%,明暗交替12 h,实验期间动物自由摄食饮水。

2 方法

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2.1 溶液配置

2.1.1 人工肠液

取磷酸二氢钾6.8 g,加水500 mL溶解,用0.1 mol·L^-1氢氧化钠溶液调节pH至6.8。

2.1.2 DBT

参照《内外伤辨惑论》DBT原文记载,基于文献考证及前期研究基础,确定该方剂量为黄芪40 g、酒洗当归8 g。按处方比例称取当归(ypDG-001)、黄芪(ypHQ-001)饮片共48 g,置砂锅中,加水400 mL,武火煮沸后转文火煮至200 mL(生药量0.24 g·mL^-1),纱布滤过,放冷,备用。

2.2 DASS样品制备

依据前期建立的外翻肠囊模型^[10],自肠段放入含有供试药液(DBT)的自制试管中开始计时,于120 min从肠段中取出全部肠吸收液,离心,取上清液。精密吸取适量上清液,再用空白人工肠液稀释成不同质量浓度的供试样品,混匀,0.22 μm的微孔滤膜滤过,即得。将120 min DBT肠吸收液样品标记为S(sample),其对应的稀释样品标记为S_n(n为稀释倍数)。依据文献[11 -13]报道,结合前期研究基础,考虑各个细胞对药物的承受能力不一,故各细胞筛选过程将肠吸收液样品稀释成不同浓度梯度的样品。其中,用于骨髓基质细胞的样品分别为S₁₈、S₉、S₆、S_4.5、S_3.5、S₃、S_2.5,人脐静脉内皮细胞为S₄₅、S₉、S_4.5、S₃、S_2.5、S,骨髓间充质干细胞为S₃₆、S₁₈、S₉、S_4.5、S_2.5、S_1.5、S。

2.3 RTCA测定样品

测定样品作用于细胞的TCRPs,取正常培养的处于对数生长期的细胞,接种细胞密度为每1 mL 4×10⁴个,加入100 μL细胞悬液及50 μL对应的完全培养基于E-Plate 16孔板中,室温下放置30 min后放入RTCA中,平衡24 h,加入对应的供试样品溶液50 μL,放入RTCA中,检测72 h,测出各药液作用于细胞后所产生的TCRPs图,筛选出与DBT肠吸收液存在浓度依赖关系的细胞。RTCA测定不同批次样品作用于OP9的TCRPs方法一致,平衡24 h后,检测28 h。

3 结果

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3.1 细胞的筛选

3.1.1 RTCA测定样品作用于不同细胞的TCRPs

依据前期研究基础和文献[11 -13]报道,DBT具有补气生血、治疗贫血、改善血虚动物的造血功能等功效,具有影响骨髓有核细胞、造血干细胞集落水平效应,增加骨髓基质细胞数目、促进人脐静脉内皮细胞分裂增殖和骨髓间充质干细胞增殖的作用。因此,本研究以骨髓基质细胞、人脐静脉内皮细胞、骨髓间充质干细胞这3种细胞为研究对象,以CI值为指标,筛选与DBT肠吸收液存在浓度依赖关系的特定细胞。

采用SPSS 27.0软件对各细胞RTCA检测数据进行分析,并结合“Orgin 2023”软件进行绘图,结果见图1~3。

由图1~3可见,3种细胞在一定监测时间内对不同质量浓度的样品反应灵敏,给药后CI值均出现明显波动。给药初期,在一定浓度范围内,各细胞的CI值在不同质量浓度样品所对应的曲线呈现较好的分离,且样品稀释倍数越小,CI值越高,存在一定的浓度依赖性。根据CI值的变化可知,骨髓基质细胞与稀释3.5~18倍的肠吸收液样品存在浓度依赖关系,样品可监测时间范围为24~52 h;人脐静脉内皮细胞与稀释1~4.5倍的肠吸收液样品存在浓度依赖关系,样品可监测时间范围为24~52 h;骨髓间充质干细胞与稀释2.5~36倍的肠吸收液样品存在浓度依赖关系,样品可监测时间范围为24~32 h。

3.1.2 特定依赖性细胞的筛选

不同细胞对DBT肠吸收液的敏感度存在一定差异,选择各细胞浓度依赖范围内的3个相同检测时间点,针对不同浓度DBT肠吸收液作用于各个细胞的CI值进行比较。采用SPSS 27.0软件进行数据分析(表2~4),并用“Orgin 2023”软件进行绘图,结果见图4~6。

经综合分析比较,在不同时间点,样品浓度的变化对人脐静脉内皮细胞影响较小,组间差异不明显,而样品浓度的变化对骨髓基质细胞和骨髓间充质干细胞影响较明显,组间差异显著,加之骨髓基质细胞可检测时间(24~52 h)比骨髓间充质干细胞(24~32 h)较长,综合考虑后选择骨髓基质细胞用于细胞生物评价后续实验,样品范围为稀释倍数3.5~18的DBT肠吸收液,样品检测时间为24~52 h。

3.2 RTCA检测方法学考察

RTCA检测的细胞指数(CI)值是药物作用于细胞形成的生物电变化的定量表达,是一种间接检测指标,方法学考察目的主要涉及检测指标的精密度、重复性等。

3.2.1 精密度

分别加入供试样品S_3.5、S₉、S₁₈各50 μL,在RTCA仪器中进样6次,形成TCRPs图,计算3种样品在不同时间段CI值的RSD范围,结果见表5。

3.2.2 重复性

分别加入供试样品S_3.5、S₉、S₁₈各50 μL,每份样品平行6份,分别在RTCA仪器中进行监测,形成TCRPs图,计算出各6份平行样品在不同时间段CI值的RSD范围,结果见表6。

由表6可知,在52 h内,各6份平行样品检测得到的CI值RSD均<15%,表明该方法在52 h内重复性良好,符合RTCA的方法要求。

3.3 DBT质量一致性评价

由“3.1.2”项下可知,骨髓基质细胞与稀释倍数3.5~18倍的DBT肠吸收液样品存在明显的浓度依赖关系,选择范围内浓度居中的S₉样品作为一致性评价样品。同时提取曲线下面积(AUC)、最高细胞指数(CI_max)、最大细胞指数所对应的时间(t_max)、达到一半曲线面积所需要的时间(t_1/2AUC)、各TCRPs图之间的相似因子(f₂)等特征参数,结合聚类分析、雷达图等分析方法,进行多参数综合分析。

由表5可知,在52 h内,各样品连续6次检测得到的CI值RSD均<15%,表明该仪器52 h内精密度良好,符合RTCA的方法要求。

3.3.1 基于RTCA测定不同批次吸收样品的TCRPs

利用Excel软件中RANDBETWEEN函数生成随机数,将5批黄芪饮片、4批酒洗当归饮片的不同批次随机组合,制备出15批DBT,编号为DBT01~DBT15。将15批样品曲线数据导入“Origin 2023”软件,根据多批次样品曲线数据拟合生成平均趋势图(R),见图7。

3.3.2 各TCRPs图的特征参数

在15批以上DBT基准样品细胞效应表征的基础上,对AUC、CI_max、t_max、t_1/2AUC等特征参数的提取,确定特征参数的范围,见表7。结果表明,15批DBT的AUC范围为55.63~65.47,平均AUC为60.81,RSD为4.95%;CI_max范围为1.37~1.67,平均CI_max为1.48,RSD为5.05%;t_max范围为29.15~32.47 h,平均t_max为30.21 h,RSD为3.16%;t_1/2AUC范围为27.50~29.35 h,平均t_1/2AUC为28.63 h,RSD为1.98%。各特征参数的RSD均<5.1%,表明各批次DBT细胞效应表征差异较小,TCRPs图相似度高,各批次之间的差异性还需要结合其他手段加以分析。

3.3.3 各TCRPs图之间的相似度比较

采用非模型依赖法中的相似因子(f₂)法考察各批次TCRPs图的效应趋势是否一致,通过测定同一时间点2批次之间CI值计算f₂,若f₂≥50便可认为2批次DBT的细胞效应趋势一致。将15批DBT生成的平均趋势图(R)与各批次DBT的TCRPs数据导入“DDSolver 1.0”软件,根据公式1计算曲线间的f₂,以考察其相似性,结果见表8。

公式(1)f₂=50×lg

1 + 1 n ∑ i = 1 n (C I 1 - C I 2) 2 - 0.5 × 100

其中,CI₁和CI₂分别代表某一批次DBT和其他批次在某个时间t的细胞指数值,n为时间点的个数。由表8可知,15批DBT与R之间的f₂均>99.7,各批次样品TCRPs图之间的f₂也均>99.2,说明DBT的制备工艺稳定,品质相近,细胞效应表征也相近。f₂法具有自身便捷的优势,但单个指标考察中药品质的一致性仍存在一定的局限性,还需要在此基础上结合其他的指标综合分析把握细胞生物评价方法,更为全面地考察中药品质的变化。

3.3.4 聚类分析

通过聚类分析可以反映出不同样本间的相近程度,组间分类距离越大代表样本间的差异越明显,“距离”越小的个体(变量)越具有相似性。采用将15批DBT的AUC、CI_max、t_max、t_1/2AUC、各批次DBT的TCRPs图与平均趋势图(R)之间的f₂等各参数导入“Origin 2023”软件,通过计算不同类别数据点间的相似度进行层次聚类分析,结果见图8。

由图8可知,当距离在0.000 5~0.001 0时,15批DBT样品被分为3类,第一类为DBT02、DBT07、DBT14,第二类为DBT05、DBT09、DBT06、DBT12、DBT11,其余为第三类;当距离在0.001 0~0.002 0时,15批DBT样品被分为2类,第一类为DBT05、DBT09、DBT06、DBT12、DBT11,其余为第二类。表明不同配伍组合的DBT之间存在一定的差异,可能与环境、气候、产地等因素有关。但各批次差异较小,可大体聚为一类,可见不同批次DBT品质较为相似。

3.4 雷达图

雷达图是以从同一点开始的轴上表示的3个或更多个定量变量的二维图表的形式显示多变量数据的图形方法,可以将抽象的数据用图形表达出来,提取图形特征的同时,刻画数据样本的内部数据结构以及样本间的各种关系,形象的图形特征有利于视觉上的分类或聚类,可用来表达整体评价。根据公式2计算15批DBT的AUC、CI_max、t_max、t_1/2AUC、TCRPs曲线图与平均趋势图(R)的f₂等参数的相对值,结果见表9。

公式(2)相对值=

X i X m a x

其中,X_i是DBT的某一参数值,X_max是15批次DBT中对应参数的最大值。

将各批次参数的相对值导入“Origin 2023”软件绘制雷达图,见图9。通过TCRPs图各特征参数聚类分析可有效地对不同批DBT进行分类,从15批DBT的TCRPs图对应各特征参数相对值的雷达图可以看出,不同批次的DBT所呈现出的各参数相对值均>0.8,整体趋势大致一致,反映不同批次DBT的质量具有较高的一致性。其中,各批次f₂值最为接近,而CI_max值相对离散,结合聚类分析结果,可进一步推测CI_max对各批次分类影响较大,f₂影响较小。不同批次DBT的TCRPs图特征参数的具体数值大小存在差异,不同产地的药材在品质上存在差异,但并不明显,进而也证实了雷达图作为整体质量一致性评价的可行性。

4 讨论

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中药质量一致性一般从安全性和有效性两个角度出发。安全性评价主要从确保中药安全的角度出发,对中药农药残留、溶剂残留、重金属、微生物限度等进行监测和控制,上述评价指标已形成标准化,并广泛应用于中药质量评价;而有效性质量评价则侧重于保证中药品质与疗效的一致性,尚无统一的评价标准。中药成分较为复杂,其质量一致性尤其是多批次间质量一致性评价不能简单套用化学药的相关评价手段,需结合中药自身的特点,从整体的角度出发,建立与药效相关联的质量一致性评价方法,才能更好地保证中药疗效的一致性。

RTCA克服了传统方法中时间长、干扰多以及对细胞造成损伤等局限性,能够在较短的时间内检测到微孔中的大部分细胞,检测数据准确性高、重复性高,具有操作简单、无须标记、实时动态、无损伤的特点,可灵敏地反馈出细胞药理作用^[14-15]。目前,RTCA通过自带软件实时记录整个微孔板中细胞的活动状态,提供细胞动态信息及细胞效应图谱,对活细胞全程质量监控,不仅保证实验细胞质量,同时捕捉细胞瞬时及长时效反应特征,便于实验设计与优化^[16]。

基于外翻肠囊模型建立DASS,形成标准化吸收仿生系统模块,并与RTCA系统联合形成DASS-RTCA系统,针对DBT补血造血功能,筛选出的骨髓基质细胞对DBT肠吸收液反应敏感、与药物浓度梯度呈明显依赖且信号稳定,确定了DBT浓度依赖范围为稀释3.5~18倍的肠吸收液样品,确定了样品可监测时间范围为24~52 h。并针对骨髓基质细胞,选择浓度依赖范围内的3种DBT肠吸收液浓度样品进行RTCA方法学考察,为建立DBT生物评价方法提供参考。

中药临床应用多为复方,现行研究标准多不能反映中药复方整体质量^[17]。本研究采用不同产地、不同批次的饮片配伍制备多批次DBT并进行细胞生物表征,提取AUC、CI_max、t_max、t_1/2AUC、各TCRPs图之间的f₂等特征参数,结合多种分析方法进行综合处理,证明多批次DBT之间质量的一致性,初步建立DBT生物评价方法,既体现了DBT整体药效,又突破了复方制剂多以成分为指标的品质评价局限。中药复方因其功效具有多样性的特点,一般以临床常用治法开展研究,DBT临床常用于气血两虚型贫血症,现代药理研究也证明其具有明确的促进造血功效,本研究筛选出与该功效相关联的骨髓基质细胞,基于临床疗效对中药质量进行评价,从而反映中药功效这一关键质量属性,可作为中药质量评价的补充,为中药复方制剂的质量评价提供新的思路。

基金

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国家自然科学基金项目资助(82074004)
国家自然科学基金项目资助(81773910)

参考文献

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文献

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2024年第59卷第12期

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202

132

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doi: 10.11669/cpj.2024.12.006

接收时间：2024-02-26
首发时间：2025-11-25
出版时间：2024-06-22

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文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2024-02-26

基金

国家自然科学基金项目资助(82074004)

国家自然科学基金项目资助(81773910)

作者信息

¹ 南京中医药大学药学院, 南京 210023

² 江苏省中医外用药开发与应用工程研究中心, 南京 210023

³ 江苏省经典名方工程研究中心, 南京 210023

⁴ 南京中医药大学中医学院·中西医结合学院, 南京 210023

通讯作者:

*严国俊,男,博士,博士研究生导师研究方向:中药饮片及制剂品质传递过程的评价与控制 Tel:(025)85811517

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/zgyxzz/CN/10.11669/cpj.2024.12.006

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

No.	Angelicae Sinensis Radix	Astragali Radix	Combination
DBT01	ypDG-003	ypHQ-001	D03H01
DBT02	ypDG-004	ypHQ-002	D04H02
DBT03	ypDG-003	ypHQ-005	D03H05
DBT04	ypDG-001	ypHQ-003	D01H03
DBT05	ypDG-001	ypHQ-001	D01H01
DBT06	ypDG-003	ypHQ-004	D03H04
DBT07	ypDG-004	ypHQ-001	D04H01
DBT08	ypDG-004	ypHQ-005	D04H05
DBT09	ypDG-001	ypHQ-004	D01H04
DBT10	ypDG-001	ypHQ-002	D01H02
DBT11	ypDG-002	ypHQ-003	D02H03
DBT12	ypDG-002	ypHQ-002	D02H02
DBT13	ypDG-004	ypHQ-004	D04H04
DBT14	ypDG-002	ypHQ-001	D02H01
DBT15	ypDG-001	ypHQ-005	D01H05

No.

Angelicae Sinensis Radix

Astragali Radix

Combination

DBT01

ypDG-003

ypHQ-001

D03H01

DBT02

ypDG-004

ypHQ-002

D04H02

DBT03

ypDG-003

ypHQ-005

D03H05

DBT04

ypDG-001

ypHQ-003

D01H03

DBT05

ypDG-001

ypHQ-001

D01H01

DBT06

ypDG-003

ypHQ-004

D03H04

DBT07

ypDG-004

ypHQ-001

D04H01

DBT08

ypDG-004

ypHQ-005

D04H05

DBT09

ypDG-001

ypHQ-004

D01H04

DBT10

ypDG-001

ypHQ-002

D01H02

DBT11

ypDG-002

ypHQ-003

D02H03

DBT12

ypDG-002

ypHQ-002

D02H02

DBT13

ypDG-004

ypHQ-004

D04H04

DBT14

ypDG-002

ypHQ-001

D02H01

DBT15

ypDG-001

ypHQ-005

D01H05

t/h	Blank	S₁₈	S₉	S₆	S_4.5	S_3.5
26	1.11±0.09	1.05±0.08	1.20±0.04	1.31±0.06	1.39±0.07	1.39±0.08
28	1.09±0.05	0.95±0.03	1.11±0.03	1.27±0.07	1.39±0.05	1.37±0.06
30	1.05±0.06	0.93±0.03	1.00±0.01	1.15±0.08	1.21±0.05	1.31±0.14

t/h

Blank

S₁₈

S₉

S₆

S_4.5

S_3.5

1.11±0.09

1.05±0.08

1.20±0.04

1.31±0.06

1.39±0.07

1.39±0.08

1.09±0.05

0.95±0.03

1.11±0.03

1.27±0.07

1.39±0.05

1.37±0.06

1.05±0.06

0.93±0.03

1.00±0.01

1.15±0.08

1.21±0.05

1.31±0.14

t/h	Blank	S_4.5	S₃	S_2.5	S
26	0.31±0.11	0.47±0.15	0.52±0.09	0.57±0.14	0.88±0.25
28	0.24±0.10	0.46±0.14	0.52±0.07	0.57±0.15	0.84±0.24
30	0.23±0.10	0.41±0.12	0.49±0.08	0.54±0.13	0.82±0.23

t/h

Blank

S_4.5

S₃

S_2.5

0.31±0.11

0.47±0.15

0.52±0.09

0.57±0.14

0.88±0.25

0.24±0.10

0.46±0.14

0.52±0.07

0.57±0.15

0.84±0.24

0.23±0.10

0.41±0.12

0.49±0.08

0.54±0.13

0.82±0.23

t/h	Blank	S₃₆	S₁₈	S₉	S_4.5	S_2.5
26	0.16±0.06	0.25±0.07	0.28±0.06	0.34±0.04	0.37±0.06	0.54±0.04
28	0.17±0.06	0.22±0.09	0.29±0.08	0.34±0.06	0.38±0.06	0.55±0.04
30	0.23±0.07	0.19±0.09	0.25±0.08	0.30±0.04	0.32±0.06	0.46±0.04

t/h

Blank

S₃₆

S₁₈

S₉

S_4.5

S_2.5

0.16±0.06

0.25±0.07

0.28±0.06

0.34±0.04

0.37±0.06

0.54±0.04

0.17±0.06

0.22±0.09

0.29±0.08

0.34±0.06

0.38±0.06

0.55±0.04

0.23±0.07

0.19±0.09

0.25±0.08

0.30±0.04

0.32±0.06

0.46±0.04

Sample	Stage	t/h	RSD/%
S_3.5	Cell stable phase	2.35-12.01	0.09-9.41
		12.01-25.68	0.07-11.07
	Sample testing phase	26.25-38.08	0.10-7.87
		38.08-52.08	0.07-0.49
S₉	Cell stable phase	2.35-12.01	0.23-9.97
		12.01-25.68	0.07-8.32
	Sample testing phase	26.25-38.08	0.24-6.96
		38.08-52.08	0.16-1.08
S₁₈	Cell stable phase	2.35-12.01	0.11-8.96
		12.01-25.68	0.11-7.08
	Sample testing phase	26.25-38.08	0.24-7.97
		38.08-52.08	0.23-2.49

Sample

Stage

t/h

RSD/%

S_3.5

Cell stable phase

2.35-12.01

0.09-9.41

12.01-25.68

0.07-11.07

Sample testing phase

26.25-38.08

0.10-7.87

38.08-52.08

0.07-0.49

S₉

Cell stable phase

2.35-12.01

0.23-9.97

12.01-25.68

0.07-8.32

Sample testing phase

26.25-38.08

0.24-6.96

38.08-52.08

0.16-1.08

S₁₈

Cell stable phase

2.35-12.01

0.11-8.96

12.01-25.68

0.11-7.08

Sample testing phase

26.25-38.08

0.24-7.97

38.08-52.08

0.23-2.49

Sample	Stage	t/h	RSD/%
S_3.5	Cell stable phase	2.35-12.01	4.69-11.42
		12.01-25.68	3.43-6.21
	Sample testing phase	26.25-38.08	3.06-7.70
		38.08-52.08	5.76-10.42
S₉	Cell stable phase	2.35-12.01	5.87-11.24
		12.01-25.68	2.59-6.81
	Sample testing phase	26.25-38.08	0.70-10.25
		38.08-52.08	2.58-5.67
S₁₈	Cell stable phase	2.35-12.01	2.50-13.32
		12.01-25.68	5.45-13.10
	Sample testing phase	26.25-38.08	0.78-9.71
		38.08-52.08	1.09-6.01

Sample

Stage

t/h

RSD/%

S_3.5

Cell stable phase

2.35-12.01

4.69-11.42

12.01-25.68

3.43-6.21

Sample testing phase

26.25-38.08

3.06-7.70

38.08-52.08

5.76-10.42

S₉

Cell stable phase

2.35-12.01

5.87-11.24

12.01-25.68

2.59-6.81

Sample testing phase

26.25-38.08

0.70-10.25

38.08-52.08

2.58-5.67

S₁₈

Cell stable phase

2.35-12.01

2.50-13.32

12.01-25.68

5.45-13.10

Sample testing phase

26.25-38.08

0.78-9.71

38.08-52.08

1.09-6.01

No.	AUC	CI_max	t_max/h	t_1/2AUC/h
DBT01	62.05	1.67	30.75	29.12
DBT02	65.47	1.55	29.89	28.92
DBT03	60.69	1.44	29.39	28.79
DBT04	62.25	1.49	29.79	28.37
DBT05	59.08	1.46	29.62	28.41
DBT06	56.31	1.52	30.38	27.79
DBT07	64.17	1.49	29.85	29.30
DBT08	62.36	1.47	29.72	28.61
DBT09	57.93	1.37	29.29	28.27
DBT10	62.37	1.47	32.47	28.88
DBT11	55.63	1.38	29.15	27.50
DBT12	56.77	1.39	30.68	28.00
DBT13	62.74	1.51	31.97	29.29
DBT14	63.44	1.51	29.72	28.88
DBT15	60.92	1.52	30.55	29.35
Average	60.81	1.48	30.21	28.63
Stdev	3.01	0.07	0.95	0.57
RSD/%	4.95	5.05	3.16	1.98

No.

AUC

CI_max

t_max/h

t_1/2AUC/h

DBT01

62.05

1.67

30.75

29.12

DBT02

65.47

1.55

29.89

28.92

DBT03

60.69

1.44

29.39

28.79

DBT04

62.25

1.49

29.79

28.37

DBT05

59.08

1.46

29.62

28.41

DBT06

56.31

1.52

30.38

27.79

DBT07

64.17

1.49

29.85

29.30

DBT08

62.36

1.47

29.72

28.61

DBT09

57.93

1.37

29.29

28.27

DBT10

62.37

1.47

32.47

28.88

DBT11

55.63

1.38

29.15

27.50

DBT12

56.77

1.39

30.68

28.00

DBT13

62.74

1.51

31.97

29.29

DBT14

63.44

1.51

29.72

28.88

DBT15

60.92

1.52

30.55

29.35

Average

60.81

1.48

30.21

28.63

Stdev

3.01

0.07

0.95

0.57

RSD/%

4.95

5.05

3.16

1.98

No.	DBT01	DBT02	DBT03	DBT04	DBT05	DBT06	DBT07	DBT08	DBT09	DBT10	DBT11	DBT12	DBT13	DBT14	DBT15	R
DBT01	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
DBT02	99.641	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
DBT03	99.736	99.890	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
DBT04	99.763	99.921	99.955	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
DBT05	99.870	99.711	99.905	99.902	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
DBT06	99.721	99.291	99.646	99.582	99.839	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
DBT07	99.621	99.977	99.912	99.898	99.724	99.309	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
DBT08	99.691	99.938	99.956	99.960	99.846	99.536	99.947	-	-	-	-	-	-	-	-	-
DBT09	99.680	99.713	99.944	99.881	99.937	99.785	99.758	99.881	-	-	-	-	-	-	-	-
DBT10	99.839	99.916	99.960	99.970	99.915	99.594	99.912	99.935	99.872	-	-	-	-	-	-	-
DBT11	99.568	99.464	99.808	99.745	99.879	99.862	99.490	99.693	99.936	99.706	-	-	-	-	-	-
DBT12	99.747	99.542	99.841	99.800	99.960	99.904	99.573	99.751	99.946	99.802	99.955	-	-	-	-	-
DBT13	99.774	99.935	99.971	99.953	99.877	99.606	99.938	99.969	99.892	99.967	99.716	99.784	-	-	-	-
DBT14	99.696	99.979	99.950	99.970	99.812	99.428	99.969	99.967	99.819	99.959	99.614	99.681	99.959	-	-	-
DBT15	99.884	99.848	99.947	99.927	99.930	99.676	99.865	99.899	99.876	99.967	99.728	99.825	99.928	99.910	-	-
R	99.834	99.869	99.982	99.968	99.961	99.735	99.877	99.951	99.948	99.974	99.829	99.893	99.971	99.933	99.967	-

No.

DBT01

DBT02

DBT03

DBT04

DBT05

DBT06

DBT07

DBT08

DBT09

DBT10

DBT11

DBT12

DBT13

DBT14

DBT15

DBT01

DBT02

99.641

DBT03

99.736

99.890

DBT04

99.763

99.921

99.955

DBT05

99.870

99.711

99.905

99.902

DBT06

99.721

99.291

99.646

99.582

99.839

DBT07

99.621

99.977

99.912

99.898

99.724

99.309

DBT08

99.691

99.938

99.956

99.960

99.846

99.536

99.947

DBT09

99.680

99.713

99.944

99.881

99.937

99.785

99.758

99.881

DBT10

99.839

99.916

99.960

99.970

99.915

99.594

99.912

99.935

99.872

DBT11

99.568

99.464

99.808

99.745

99.879

99.862

99.490

99.693

99.936

99.706

DBT12

99.747

99.542

99.841

99.800

99.960

99.904

99.573

99.751

99.946

99.802

99.955

DBT13

99.774

99.935

99.971

99.953

99.877

99.606

99.938

99.969

99.892

99.967

99.716

99.784

DBT14

99.696

99.979

99.950

99.970

99.812

99.428

99.969

99.967

99.819

99.959

99.614

99.681

99.959

DBT15

99.884

99.848

99.947

99.927

99.930

99.676

99.865

99.899

99.876

99.967

99.728

99.825

99.928

99.910

99.834

99.869

99.982

99.968

99.961

99.735

99.877

99.951

99.948

99.974

99.829

99.893

99.971

99.933

99.967

No.	AUC	CI_max	t_max/h	t_1/2AUC/h	f₂
DBT01	0.95	1.00	0.95	0.99	1.00
DBT02	1.00	0.93	0.92	0.99	1.00
DBT03	0.93	0.86	0.91	0.98	1.00
DBT04	0.95	0.89	0.92	0.97	1.00
DBT05	0.90	0.87	0.91	0.97	1.00
DBT06	0.86	0.91	0.94	0.95	1.00
DBT07	0.98	0.89	0.92	1.00	1.00
DBT08	0.95	0.88	0.92	0.97	1.00
DBT09	0.88	0.82	0.90	0.96	1.00
DBT10	0.95	0.88	1.00	0.98	1.00
DBT11	0.85	0.83	0.90	0.94	1.00
DBT12	0.87	0.83	0.94	0.95	1.00
DBT13	0.96	0.90	0.98	1.00	1.00
DBT14	0.97	0.90	0.92	0.98	1.00
DBT15	0.93	0.91	0.94	1.00	1.00

No.

AUC

CI_max

t_max/h

t_1/2AUC/h

f₂

DBT01

0.95

1.00

0.95

0.99

1.00

DBT02

1.00

0.93

0.92

0.99

1.00

DBT03

0.93

0.86

0.91

0.98

1.00

DBT04

0.95

0.89

0.92

0.97

1.00

DBT05

0.90

0.87

0.91

0.97

1.00

DBT06

0.86

0.91

0.94

0.95

1.00

DBT07

0.98

0.89

0.92

1.00

DBT08

0.95

0.88

0.92

0.97

1.00

DBT09

0.88

0.82

0.90

0.96

1.00

DBT10

0.95

0.88

1.00

0.98

1.00

DBT11

0.85

0.83

0.90

0.94

1.00

DBT12

0.87

0.83

0.94

0.95

1.00

DBT13

0.96

0.90

0.98

1.00

DBT14

0.97

0.90

0.92

0.98

1.00

DBT15

0.93

0.91

0.94

1.00