中国药学杂志

Sample No.	Collection time	Processing method	Specification grades	Sample No.	Collection time	Processing method	Specification grades
S1	2020-11	sulphur-free	selected first	S15	2020-11	sulfur fumigation	unified goods
S2	2020-11	sulphur-free	selected third	S16	2020-11	sulfur fumigation	unified goods
S3	2020-11	sulphur-free	selected first	S17	2020-11	sulphur-free	selected second
S4	2020-11	sulphur-free	selected first	S18	2020-11	sulphur-free	unified goods
S5	2020-11	sulphur-free	selected first	S19	2020-11	sulphur-free	selected second
S6	2020-11	sulphur-free	selected second	S20	2021-11	sulphur-free	selected second
S7	2020-11	sulphur-free	selected first	S21	2021-11	sulphur-free	selected second
S8	2020-11	sulphur-free	selected first	S22	2021-11	sulphur-free	selected first
S9	2021-11	sulphur-free	selected third	S23	2021-11	sulphur-free	selected first
S10	2021-11	sulphur-free	selected third	S24	2021-11	sulphur-free	selected second
S11	2021-11	sulphur-free	selected third	S25	2021-11	sulphur-free	unified goods
S12	2021-11	sulphur-free	selected third	S26	2021-11	sulphur-free	unified goods
S13	2021-11	sulphur-free	selected second	S27	2021-11	sulphur-free	selected first
S14	2021-11	sulphur-free	selected third	S28	2021-11	sulphur-free	selected third

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S1	2020-11	sulphur-free	selected first	S15	2020-11	sulfur fumigation	unified goods
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Sample No.	Similarity	Sample No.	Similarity
S1	0.989	S15	0.913
S2	0.994	S16	0.910
S3	0.986	S17	0.993
S4	0.978	S18	0.993
S5	0.990	S19	0.997
S6	0.997	S20	0.976
S7	0.966	S21	0.990
S8	0.988	S22	0.973
S9	0.995	S23	0.974
S10	0.963	S24	0.997
S11	0.976	S25	0.969
S12	0.988	S26	0.985
S13	0.994	S27	0.996
S14	0.988	S28	0.986

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Peak No.	Formula	Molecular ion peak	Observe mass(m/z)	δ /×10^-6	Predicted compounds	MS/MS fragments (m/z)	References
1	C₇H₁₂O₆	[M-H]^-	191.055 97	-0.8	Quinic acid	173[M-H-H₂O]^-;127[M-H-H₂O-CO₂-2H]^-	[14]
2	C₁₄H₁₄O₄	[M+H]⁺	247.096 4	-0.4	Dihydrooroselol	175[M+H-H₂O-C₄H₆]⁺;147[M+H-H₂O-C₄H₆-CO]⁺;131[M+H-H₂O- CH₄-C₂H₂-2CO]⁺	[15]
3¹⁾	C₁₆H₁₆O₆	[M+H]⁺	305.102 21	0.8	Oxypeucedanin hydrate	203[M+H-C₅H₁₀O₂]⁺	[15]
4¹⁾	C₁₇H₁₈O₇	[M+H]⁺	335.112 46	-0.2	Byakangelicin	233[M+H-C₅H₁₀O₂]⁺;231[M+H-C₅H₁₀O₂-2H]⁺;215[M+H-C₅H₁₀O₂-H₂O]⁺	[16]
5	C₁₂H₈O₄	[M+H]⁺	217.049 75	1	Xanthotoxin	161[M+H-CO-C₂H₄]⁺;145[M+H-CO-C₂H₄-O]⁺	[15]
6¹⁾	C₁₂H₈O₄	[M+H]⁺	217.049 72	0.9	Bergapten	145[M+H-C₂H₄-CO₂]⁺	[15]
7¹⁾	C₁₃H₁₀O₅	[M+H]⁺	247.060 27	0.7	Isopimpinellin	217[M+H-CO-2H]⁺	[15]
8¹⁾	C₁₆H₁₄O₅	[M+H]⁺	287.091 56	0.6	Oxypeucedanin	203[M+H-C₅H₈O]⁺;159[M+H-C₅H₈O-CO₂]⁺;131[M+H-C₅H₈O-CO₂-CO]⁺	[13,17]
9¹⁾	C₁₆H₁₄O₄	[M+H]⁺	271.096 79	1.1	Imperatorin	203[M+H-C₅H₈]⁺;185[M+H-C₅H₈-H₂O]⁺	[17]
10	C₁₇H₁₆O₅	[M+H]⁺	301.107 3	0.8	Phellopterin	233[M+H-C₅H₈]⁺;217[M+H-C₅H₈-O]⁺;215[M+H-C₅H₈-H₂O]⁺	[15,17]
11	C₁₇H₁₆O₅	[M+H]⁺	301.107 41	1.2	Cnidilin	233[M+H-C₅H₈]⁺;217[M+H-C₅H₈-O]⁺	[17]
12¹⁾	C₁₆H₁₄O₄	[M+H]⁺	271.096 74	0.9	Isoimperatorin	203[M+H-C₅H₈]⁺	[15,17]
13	C₁₇H₂₂O	[M+H]⁺	243.174 11	-1	Falcarinolone	171[M+H-C₅H₁₂]⁺;115[M+H-C₅H₁₂-C₃H₄O]⁺;91[M+H-C₅H₁₂-C₃H₄O- CH₂]⁺	[18]

Peak No.	Formula	Molecular ion peak	Observe mass(m/z)	δ /×10^-6	Predicted compounds	MS/MS fragments (m/z)	References
1	C₇H₁₂O₆	[M-H]^-	191.055 97	-0.8	Quinic acid	173[M-H-H₂O]^-;127[M-H-H₂O-CO₂-2H]^-	[14]
2	C₁₄H₁₄O₄	[M+H]⁺	247.096 4	-0.4	Dihydrooroselol	175[M+H-H₂O-C₄H₆]⁺;147[M+H-H₂O-C₄H₆-CO]⁺;131[M+H-H₂O- CH₄-C₂H₂-2CO]⁺	[15]
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7¹⁾	C₁₃H₁₀O₅	[M+H]⁺	247.060 27	0.7	Isopimpinellin	217[M+H-CO-2H]⁺	[15]
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1	0.879	10	8	0.968	1
2	0.909	8	9	0.941	5
3	0.899	9	10	0.962	2
4	0.912	6	11	0.827	12
5	0.714	13	12	0.957	3
6	0.909	7	13	0.956	4
7	0.861	11

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7	0.861	11

祁白芷UPLC指纹图谱的建立及其抗氧化谱效关系研究

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段天华 , 徐荣荣 , 李蕊 , 张泽昭 , 姜晓娅 , 刘思琪 , 刘宸男 , 王鑫国 ^* , 冯薇 ^*

中国药学杂志 | 论著 2024,59(10): 896-903

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中国药学杂志 | 论著 2024, 59(10): 896-903

祁白芷UPLC指纹图谱的建立及其抗氧化谱效关系研究

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段天华, 徐荣荣, 李蕊, 张泽昭, 姜晓娅, 刘思琪, 刘宸男, 王鑫国^*, 冯薇^*

作者信息

河北中医药大学药学院,河北省中药配方颗粒技术创新中心, 中药材品质评价与标准化河北省工程研究中心, 石家庄 050091

段天华,女,硕士研究方向:中药药效物质基础

通讯作者:

*冯薇,女,博士,教授研究方向:中药药效物质基础 Tel:(0311)85216828;

王鑫国,男,学士,教授研究方向:中药药效物质基础 Tel:(0311)89926208

Establishment of UPLC Fingerprint and Effects of Antioxidant Related to Its Spectrum Study of Angelica dahurica cv. Qibaizhi

Tianhua DUAN, Rongrong XU, Rui LI, Zezhao ZHANG, Xiaoya JIANG, Siqi LIU, Chennan LIU, Xinguo WANG^*, Wei FENG^*

Affiliations

Hebei Traditional Chinese Medicine Formula Granule Engineering and Technology Innovate Center, Quality Evaluation and Standardization Hebei Province Engineering Research Center of Traditional Chinese Medicine, School of Pharmaceutical Sciences, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050091, China

出版时间: 2024-05-22 doi: 10.11669/cpj.2024.10.006

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摘要

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目的建立祁白芷超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱,采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)对共有峰进行成分鉴定,测定各批次祁白芷抗氧化活性,并探讨祁白芷的化学成分与抗氧化活性的谱效关系。方法采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》建立28批祁白芷的指纹图谱,确认共有峰并进行相似度评价,并对共有峰进行UPLC-Q-TOF-MS分析。以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率为抗氧化指标,测定其抗氧化活性。采用灰色关联度和偏最小二乘回归分析祁白芷共有峰与抗氧化活性的谱效关系。结果建立了28批祁白芷药材的指纹图谱,其相似度为0.910~0.997。聚类分析可将不同加工方式的祁白芷分为熏硫和无硫两大类,当平方欧氏距离为 10 时,可将无硫祁白芷进一步分为两类,与商品规格等级分类相符。其共标定13个共有峰,利用对照品对比和UPLC-Q-TOF-MS解析指认出共有峰分别为奎宁酸、二氢山芹醇、水合氧化前胡素、白当归素、花椒毒素、佛手柑内酯、异茴芹内酯、氧化前胡素、欧前胡素、珊瑚菜素、8-氧甲基异欧前胡内酯、异欧前胡素、镰叶芹酮。通过清除DPPH自由基实验发现,28批祁白芷均有抗氧化能力,谱效分析结果显示,奎宁酸、佛手柑内酯、氧化前胡素、珊瑚菜素、异欧前胡素、镰叶芹酮等与抗氧化能力呈正相关。结论本研究建立了基于化学成分和抗氧化活性的祁白芷质量评价模式,为阐明祁白芷药材中抗氧化活性成分及质量控制提供参考。

关键词

祁白芷 / 超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱 / 指纹图谱 / 抗氧化 / 谱效关系

Abstract

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OBJECTIVE To establish UPLC fingerprint of Angelica dahurica cv. Qibaizhi, identify the compounds of common peaks by UPLC-Q-TOF-MS technology, determine antioxidant activity of each batch and study the relationship between effects of antioxidant and spectrum of Angelica dahurica cv.Qibaizhi. METHODS The fingerprint of 28 batches of Angelica dahurica cv. Qibaizhi was established by the Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint (2012 edition), and the common peaks were identified and evaluated for similarity, and the common peaks were analyzed by UPLC-Q-TOF-MS. The free radical scavenging rate of 1, 1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine (DPPH) was used as antioxidant index to determine its antioxidant activity. Grey correlation degree and partial least squares regression were used to analyze the spectral effect relationship between chemical constituents and antioxidant activities of Angelica dahurica cv. Qibaizhi. RESULTS The fingerprints of 28 batches of Radix Angelica were established, the similarity was 0.910-0.997. By cluster analysis, the different processing methods can be divided into two categories: sulfur fumigation and sulphur-free. When the square Euclidean distance is 10, the sulphur-free Angelica dahurica cv. Qibaizhi can be further divided into two categories, which is consistent with the classification of commodity specifications. A total of 13 common peaks were identified. The common peaks were identified by comparison of standards and UPLC-Q-TOF-MS analysis as quinic acid, dihydrooroselol, oxypeucedanin hydrate, byakangelicin, xanthotoxin, bergapten, isopimpinellin, oxypeucedanin, imperatorin, phellopterin, cnidilin, isoimperatorin and falcarinolone. By scavenging DPPH free radicals, it was found that 28 batches of Angelica dahurica cv. Qibaizhi had antioxidant capacity. The spectral analysis results showed that the antioxidant capacity was positively related to quinic acid, bergapten, oxypeucedanin, phellopterin, isoimperatorin and falcarinolone. CONCLUSION In this study, a quality evaluation model of Angelica dahurica cv. Qibaizhi based on chemical composition and activity is established, which provides a reference for elucidating the antioxidant active ingredients and quality control in Angelica dahurica cv.Qibaizhi.

Key words

Angelica dahurica cv. Qibaizhi / UPLC-Q-TOF-MS / fingerprint / antioxidant / spectrum-effect relationship

引用本文

段天华, 徐荣荣, 李蕊, 张泽昭, 姜晓娅, 刘思琪, 刘宸男, 王鑫国, 冯薇. 祁白芷UPLC指纹图谱的建立及其抗氧化谱效关系研究. 中国药学杂志, 2024 , 59 (10) : 896 -903 . DOI: 10.11669/cpj.2024.10.006

Tianhua DUAN, Rongrong XU, Rui LI, Zezhao ZHANG, Xiaoya JIANG, Siqi LIU, Chennan LIU, Xinguo WANG, Wei FENG. Establishment of UPLC Fingerprint and Effects of Antioxidant Related to Its Spectrum Study of Angelica dahurica cv. Qibaizhi[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (10) : 896 -903 . DOI: 10.11669/cpj.2024.10.006

正文

收起

祁白芷,为伞形科植物祁白芷[Angelica dahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f.]的干燥根^[1],是河北安国道地药材,为八大祁药之一。祁白芷为市场上主流白芷品种之一,因其产量大且质量较优,被国内医药界熟知^[2-3]。本品作为白芷入药,具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的功效^[1],并能长肌肤、润颜色^[4]。有研究表明,白芷能有效改善原发性痛经、延缓衰老和美白的作用机制可能与抗氧化活性有关^[4-6]。目前,祁白芷的研究主要集中在脂溶性成分和挥发油的定性分析^[7-8]及对欧前胡素这单一指标成分的含量测定^[9],针对祁白芷的多成分含量测定和谱效关系的研究未见报道。中药成分多样、作用机制复杂,单一指标难以全面反映药材质量。中药指纹图谱具有整体性和模糊性,可从整体上对中药材进行评价,能够全面评价中药的药效物质基础,现已被广泛用于评价和控制中药材品质^[10]。与高效液相色谱(HPLC)相比,超高效液相色谱(UPLC)具有更高的灵敏度和分离度,可提高分析效率,减少溶剂消耗,已广泛应用于中药物质基础的研究^[11]。谱效关系是中药药效物质基础的研究模式之一,运用统计学的手段将指纹图谱技术和药效评价系统相结合,可进一步明确其药效物质基础,评价中药质量^[12]。

本研究采用UPLC建立了祁白芷的指纹图谱,并结合聚类分析对祁白芷进行了质量评价,同时利用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)和对照品比对,对共有峰进行了鉴定,利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)法检测体外抗氧化能力。通过谱效关系,初步揭示祁白芷抗氧化能力的活性物质,为祁白芷的质量控制及开发研究提供理论支持。

1 仪器与试药

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H-Class型超高效液相色谱仪(美国Waters公司);Triple-TOF^TM 6600⁺型四极杆串联飞行时间高分辨质谱仪(美国AB SCIEX公司): Analyst TF 1.8.1数据采集软件、PeakView 1.2数据处理软件;YB-150型多功能粉碎机(永康市速锋工贸有限公司);CPA225D型电子天平、BSA224S-CW型电子天平(德国赛多利斯有限公司);KQ-250E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);H2050R型高速离心机(湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司);ELx800型酶标仪(美国Bio-Tek公司);总抗氧化能力(DPPH法)试剂盒(苏州科铭生物技术有限公司)。

对照品水合氧化前胡素(批号DSTDS012301)、异茴芹内酯(批号DST210426-189)、氧化前胡素(批号DSTDY018401,≥98%)(成都乐美天医药科技有限公司);白当归素(批号MUST-21111103)、佛手柑内酯(批号MUST-21122413)(成都曼斯特生物科技有限公司);欧前胡素(批号CHB201201)(成都克洛玛生物科技有限公司);异欧前胡素(批号BWC9004-2016)(北京世纪奥科生物技术有限公司)。甲酸、乙腈为色谱纯,其他试剂均为分析纯,实验用水为超纯水由Milipore超纯水系统制备。

白芷药材从河北安国药材市场购买,产地均为河北安国,经候芳洁副教授鉴定为伞形科植物白芷[Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth. et Hook. f.]的干燥根。其中,S1~S14和S17~S28加工方式为无硫晒干,S15和S16加工方式为熏硫。熏硫为产地药农加工,熏硫方法为:燃硫磺熏硫,切片,晾干。其中S15与S17、S16与S18分别为同一批药材的无硫晒干和熏硫样品。28批祁白芷药材的详细信息见表1。

2 方法与结果

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2.1 祁白芷指纹图谱的建立

2.1.1 色谱条件

菲罗门 Titank C₁₈色谱柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm),流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸溶液(B)梯度洗脱(0~6 min,13%~14%A;6~13.5 min,14%~15.5%A;13.5~20 min,15.5%~28%A;20~26 min,28%~28.4%A;26~33.5 min,28.4%~29.5%A;33.5~35 min,29.5%~37%A;35~39.5 min,37%~45%A;39.5~41.5 min,45%~47.3%A;41.5~44 min,47.3%~53%A;44~54 min,53%~60%A;54~55 min,60%~78%A;55~63 min,78%~90%A;63~65 min,90%~13%A),流速0.3 mL·min^-1,柱温35 ℃,进样量0.8 μL。分时段波长如下:330 nm(0~19 min),267 nm(19~30 min),248 nm(30~43 min),267 nm(43~52 min),254 nm(52~65 min)。

2.1.2 对照品溶液制备

分别精密称取水合氧化前胡素、白当归素、佛手柑内酯、异茴芹内酯、氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素对照品适量,加甲醇溶解,制成单一对照品储备液。精密量取上述各对照品储备液适量,加甲醇稀释,制成质量浓度分别为68.72、26.71、15.80、5.18、164.25、129.41、54.13 μg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备

取白芷粉末(过60目筛)2.0 g,精密称定,置50 mL锥形瓶中,加入20 mL体积分数70%的甲醇,称定重量,超声处理(功率250 W,频率40 kHz)75 min,静置至室温,再称定质量,用体积分数70%甲醇补足减失的质量,摇匀,用0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.2 指纹图谱方法学考察

2.2.1 精密度试验

取S10号白芷粉末,按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次,以9号峰(欧前胡素)为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间的相对标准偏差(RSD)为0.01%~0.91%,相对峰面积的RSD分别为0.65%、2.17%、0.84%、1.44%、0.93%、1.01%、0.84%、0.58%、0.16%、0.31%、1.45%、1.26%,均小于2.17%,表明仪器精密度良好。

2.2.2 重复性试验

取S10号白芷粉末,按“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液6份,按“2.1.1”项下色谱条件测定,以9号峰(欧前胡素)为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间的RSD为0.01%~0.13%,相对峰面积的RSD分别为0.60%、2.53%、0.45%、1.42%、1.39%、0.98%、0.92%、0.54%、0.41%、1.01%、0.51%、3.00%,均小于3.0%,表明该方法重复性良好。

2.2.3 稳定性试验

取S10号白芷粉末,按“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液,分别在0,2,4,8,12,24 h按“2.1.1”项下色谱条件测定,以9号峰(欧前胡素)为参照峰,计算各共有峰的相对保留时间的RSD为0.01%~0.33%,相对峰面积的RSD分别为1.81%、1.68%、0.69%、2.32%、1.06%、0.13%、2.17%、2.70%、0.24%、0.70%、0.25%、2.66%,均小于2.70%,表明24 h内供试品溶液的成分稳定。

2.3 对照指纹图谱的生成与相似度分析

相似度评价:取28批白芷样品适量按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件依次进样,记录色谱图。将28批药材样品的UPLC图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》软件,设定S10为参照色谱图,选取时间窗格宽度0.1 min,通过中位数生成对照指纹图谱,运用多点校正对Mark色谱峰进行匹配,计算相似度。结果表明,除S15、S16的相似度为0.913、0.910外,其余批次样品与对照指纹图谱的相似度均大于0.960,见表2,说明熏硫对白芷药材质量影响较大,未熏硫样品相似度较高,化学成分相似,质量较稳定。共标定13个共有峰,见图1。对照指纹图谱见图2A,混合对照品溶液见图2B。

2.4 聚类分析

将28批白芷样品的13个共有峰的峰面积导入SPSS 26.0,采用组间联接系统聚类法,在平方欧氏距离为15时,28批白芷样品聚为两大类,S15和S16聚为一类,其他批次聚为另一类。其中S15和S16均为熏硫祁白芷,与相似度结果一致。在平方欧氏距离为10时,28批白芷样品聚为三大类,S15和S16聚为一类,S1、S3~S8、S13、S17、S19~S24、S27聚为第二类,其余批次聚为第三类。其中,第二类中峰8(氧化前胡素)的面积占共有峰总面积的35%以上,第三类中峰8(氧化前胡素)的面积占共有峰总面积的35%以下,表明峰8(氧化前胡素)的峰面积占比会对祁白芷的质量造成影响。28批祁白芷的聚类分析树状图见图3。

2.5 指纹图谱中共有峰的鉴定

2.5.1 色谱条件

离子模式:分别在正、负离子模式下分析检测样品。

仪器参数优化后设置如下:离子源(正离子模式):电喷雾离子源(ESI);雾化电压(ISVF):+5 500 V;雾化温度(TEM):500 ℃;解簇电压(DP):+80 V;碰撞能量(CE):+45 eV;雾化气压力(Gas 1,N₂)、辅助气压力(Gas 2,N₂)、气帘气压力(Cur,N₂)分别为:0.34、0.38、0.24 MPa;高分辨质谱扫描质量范围设置为m/z 100~1 200,累积时间:250 ms;碎片离子扫描质量范围设置为50~1 200,累积时间:100 ms。碰撞能量扩展(CES):20 eV。信息依赖获取(IDA)方式开启。

离子源(负离子模式):ESI;ISVF:-4 500 V;TEM:500 ℃;DP:-80 V;CE:-45 eV;Gas 1、Gas 2、Cur分别为:0.34、0.38、0.24 MPa;其余各时间等参数同正离子模式保持一致。

2.5.2 共有峰鉴定

按“2.1.3”制备供试品溶液、“2.1.1”项下液相条件和“2.5.1”项下色谱条件下获得祁白芷的正、负离子流图,通过采用PeakView 1.2软件中“XIC Manager”功能进行数据分析,通过比对精确相对分子质量和特征碎片离子,鉴定出祁白芷指纹图谱中共有峰的结构^[13-18],结果见表3。

白芷的主要化学成分为香豆素类,共有峰的质谱鉴定以峰8(氧化前胡素)为例,在正离子模式下,其准分子离子峰为m/z 287.09156[M+H]⁺,质谱裂解过程中容易丢失C₅H₈O支链生成丰度最高的m/z 287.09156[M+H-C₅H₈O]⁺碎片离子,连续丢失CO₂和CO,生成碎片离子m/z 159[M+H-C₅H₈O-CO₂]⁺和m/z 131[M+H-C₅H₈O-CO₂-CO]⁺,根据裂解方式及对照品比对,推断峰8为氧化前胡素,其二级质谱和裂解过程见图4^[13,17]。

2.6 抗氧化作用考察

DPPH自由基清除率:取上述“2.1.3”项下供试品溶液20 μL至EP管中,加入380 μL的DPPH试剂,充分混匀,室温避光孵育20 min,取200 μL置96孔板中,即得样品溶液。平行试验重复3次。取20 μL体积分数70%甲醇至EP管中,加入380 μL的DPPH试剂,充分混匀,室温避光孵育20 min,取200 μL置96孔板中,即得空白溶液。酶标仪515 nm下测定吸光度值。祁白芷的总抗氧化能力以自由基清除率表示见公式1:

公式(1)DPPH自由基清除率(%)=[(A_空白-A_测定)÷A_空白]×100%

抗氧化活性结果见图5,28批祁白芷均有抗氧化能力,且存在个体差异。除熏硫样品外,其他批次祁白芷DPPH自由基清除率均大于50%,且S15和S16分别为样品S17和S18加工硫熏制得,更直观表明祁白芷熏硫会导致抗氧化作用降低。

2.7 灰色关联度分析

参考Li等^[19]的灰色关联分析方法,对原始数据进行无量纲化处理,采用初值法,以各批祁白芷药材UPLC指纹图谱共有峰峰面积数据为比较序列,抗氧化活性为参考序列,计算灰色关联系数(r)。

通过r可初步确定所对应的化学成分与抗氧化活性之间的联系。r越大,说明化学成分与抗氧化作用的关联越大,反之则表示关联越小。

关联度计算结果见表4,从关联度结果可知,祁白芷抗氧化作用受多种成分共同作用,各峰所代表的化学成分对其抗氧化活性的影响程度有所区别,其中8号峰(氧化前胡素)的影响最大,而5号峰(花椒毒素)对抗氧化活性的关联度较小。

2.8 小二乘回归分析(PLS)

以各批祁白芷药材UPLC指纹图谱共有峰峰面积数据为自变量x,以祁白芷提取物抗氧化能力为因变量y,导入SIMCA 14.1软件作PLS模型拟合,得到回归方程y=0.314 13x₁+0.022 416x₂+0.034 834x₃+0.054 768x₄-0.033 943x₅+0.065 228x₆-0.113 8x₇+0.250 067x₈+0.021 421 8x₉+0.121 58x₁₀-0.038 039 4x₁₁+0.131 583x₁₂+0.179 624x₁₃,其中回归系数代表各自变量对总抗氧化能力的贡献大小,回归系数越大,对药效贡献越大。在回归方程中,系数为正值表明自变量与抗氧化能力呈正相关,系数为负值表明自变量与抗氧化能力呈负相关。回归系数见图6。根据结果可知,峰1、2、3、4、6、8、9、10、12、13与药效呈正相关,贡献度依次为1>8>13>12>10>6>4>3>2>9;峰5、7、11与药效呈负相关,贡献度依次为7>11>5。

在偏最小二乘回归分析中,变量重要性(VIP值)越大,自变量x的解释能力越强。结果显示,峰1、6、8、10、12、13的VIP值大于1,依次为1>8>13>10>12>6。模型诊断参数为:R²X=0.926,R²Y=0.979,Q²=0.972,说明该回归模型拟合解释能力以及模型预测能力均较强,变量重要性分析结果见图7。

3 讨论

收起

实验前期考察了提取溶剂(体积分数70%、85%、100%甲醇),提取时间(45、60、75 min),料液体积比(1∶5、1∶10、1∶20)对供试品溶液提取效果的影响,通过对比各样品色谱峰的数量和面积,最终确定白芷的最优提取工艺为:甲醇体积分数为70%、料液比1∶10、提取时间为75 min。采用二极管阵列检测器(PDA检测器),对祁白芷药材供试品溶液在210~400 nm范围内进行全波长扫描,结果显示,检测波长为330 nm(0~19 min),267 nm(19~30 min),248 nm(30~43 min),267 nm(43~52 min),254 nm(52~65 min)时,色谱图出峰较多,待测成分的响应值较大。中药指纹图谱是一种可以全面反映中药化学成分种类和数量的定性分析方法,目前采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》中的相似度算法进行相似度计算。然而,此算法对化学成分的含量并不敏感,不能反映中药在含量上的变化情况。因此,相似度高仅表示不同批次的样品在成分上相似,而不能表明各成分含量相近^[20-21]。在指纹图谱相似度评价中,有两批祁白芷样品指纹图谱相似度较低,分别为熏硫白芷S15(0.913)和S16(0.910),化学成分含量差异可能是造成相似度较低的原因。与其他批次相比,S15和S16的峰1(奎宁酸)和峰8(氧化前胡素)峰面积较小。采用聚类分析,在平方欧氏距离为15时,28批祁白芷聚为熏硫(S15、S16)和无硫两大类;平方欧氏距离为10时,将无硫祁白芷分为两类,一类为选货一等品和二等品(S1、S3~S8、S13、S17、S19~S24、S27),另一类为选货三等品和统货,此聚类结果与祁白芷商品规格等级划分吻合,表明祁白芷商品规格等级划分与峰8(氧化前胡素)的峰面积占比有关,后续会将祁白芷的化学成分信息与此分类依据进行深入分析。其中,S15和S16的抗氧化能力显著降低,可见祁白芷的抗氧化性与其聚类分析结果有一定的相关性。熏硫祁白芷(S15、S16)与同批次无硫祁白芷(S17、S18)相比,峰1(奎宁酸)峰面积分别下降89.51%、83.35%,峰8(氧化前胡素)峰面积分别下降50.27%、28.88%,抗氧化能力下降44.27%、49.79%。由此可见,熏硫直接影响峰1(奎宁酸)、峰8(氧化前胡素)的含量,峰1(奎宁酸)、峰8(氧化前胡素)可能为祁白芷抗氧化活性的物质基础,佐证了上述灰色关联度和偏最小二乘回归的分析结果。

灰色关联度分析常被用来考察系统动态发展过程中的关联密切程度,若两者动态变化基本相似,则关联度大;若两者动态变化相异,则关联度小^[22]。指纹图谱13个共有峰与抗氧化活性的关联度均大于0.700,说明13个共有峰的峰面积与抗氧化活性的动态变化相似,表明祁白芷的抗氧化活性是多种成分共同作用的结果。灰色关联度虽然能识别出与抗氧化活性关联度较高的共有峰,但不能判定各共有峰对抗氧化活性是促进还是抑制作用。偏最小二乘法结合了主成分分析、典型相关分析和多元线性回归分析,是建立自变量和因变量线性回归模型的统计方法,其回归系数的正负能够反映与抗氧化活性为正相关或负相关^[23],实验结果表明,峰1(奎宁酸)、峰2(二氢山芹醇)、峰3(水合氧化前胡素)、峰4(白当归素)、峰6(佛手柑内酯)、峰8(氧化前胡素)、峰9(欧前胡素)、峰10(珊瑚菜素)、峰12(异欧前胡素)、峰13(镰叶芹酮)与药效呈正相关。综合以上2种统计模型,以灰色关联度>0.7,VIP>1且回归系数为正值为筛选条件^[22],可推测峰1(奎宁酸)、峰6(佛手柑内酯)、峰8(氧化前胡素)、峰10(珊瑚菜素)、峰12(异欧前胡素)、峰13(镰叶芹酮)是祁白芷发挥抗氧化活性主要成分。

氧化应激是机体众多疾病发生发展的基础,指非正常生理状态下,氧自由基的产生大于清除,造成氧化系统失衡,从而导致细胞或组织损伤的一种状态^[24]。现代药理研究表明,白芷可以用来改善糖尿病溃疡和急性肝损伤等疾病产生的氧化应激反应^[25-27]。本研究通过建立祁白芷指纹图谱及测定其抗氧化活性,将祁白芷中的化学成分与抗氧化活性联系起来,结果显示,奎宁酸^[28]、佛手柑内酯^[29]、氧化前胡素^[30]、珊瑚菜素^[31]、异欧前胡素^[32]、镰叶芹酮等成分含量越高,祁白芷抗氧化活性越强,抗氧化应激的作用越好。

基金

收起

国家自然科学基金项目资助(82104358)
河北省省级科技计划项目资助(21372503D)
河北省省级科技计划项目资助(23372502D)
河北省自然科学基金面上项目资助(H2021423066)
大学生创新创业计划项目资助(202214432020)
大学生创新创业计划项目资助(202314432017)

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文献

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2024年第59卷第10期

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doi: 10.11669/cpj.2024.10.006

接收时间：2023-09-09
首发时间：2025-11-25
出版时间：2024-05-22

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收稿日期：2023-09-09

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河北省自然科学基金面上项目资助(H2021423066)

大学生创新创业计划项目资助(202214432020)

大学生创新创业计划项目资助(202314432017)

作者信息

河北中医药大学药学院,河北省中药配方颗粒技术创新中心, 中药材品质评价与标准化河北省工程研究中心, 石家庄 050091

通讯作者:

*冯薇,女,博士,教授研究方向:中药药效物质基础 Tel:(0311)85216828;

王鑫国,男,学士,教授研究方向:中药药效物质基础 Tel:(0311)89926208

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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Sample No.	Collection time	Processing method	Specification grades	Sample No.	Collection time	Processing method	Specification grades
S1	2020-11	sulphur-free	selected first	S15	2020-11	sulfur fumigation	unified goods
S2	2020-11	sulphur-free	selected third	S16	2020-11	sulfur fumigation	unified goods
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S11	2021-11	sulphur-free	selected third	S25	2021-11	sulphur-free	unified goods
S12	2021-11	sulphur-free	selected third	S26	2021-11	sulphur-free	unified goods
S13	2021-11	sulphur-free	selected second	S27	2021-11	sulphur-free	selected first
S14	2021-11	sulphur-free	selected third	S28	2021-11	sulphur-free	selected third

Sample No.

Collection time

Processing method

Specification grades

Sample No.

Collection time

Processing method

Specification grades

2020-11

sulphur-free

selected first

S15

2020-11

sulfur fumigation

unified goods

2020-11

sulphur-free

selected third

S16

2020-11

sulfur fumigation

unified goods

2020-11

sulphur-free

selected first

S17

2020-11

sulphur-free

selected second

2020-11

sulphur-free

selected first

S18

2020-11

sulphur-free

unified goods

2020-11

sulphur-free

selected first

S19

2020-11

sulphur-free

selected second

2020-11

sulphur-free

selected second

S20

2021-11

sulphur-free

selected second

2020-11

sulphur-free

selected first

S21

2021-11

sulphur-free

selected second

2020-11

sulphur-free

selected first

S22

2021-11

sulphur-free

selected first

2021-11

sulphur-free

selected third

S23

2021-11

sulphur-free

selected first

S10

2021-11

sulphur-free

selected third

S24

2021-11

sulphur-free

selected second

S11

2021-11

sulphur-free

selected third

S25

2021-11

sulphur-free

unified goods

S12

2021-11

sulphur-free

selected third

S26

2021-11

sulphur-free

unified goods

S13

2021-11

sulphur-free

selected second

S27

2021-11

sulphur-free

selected first

S14

2021-11

sulphur-free

selected third

S28

2021-11

sulphur-free

selected third

Sample No.	Similarity	Sample No.	Similarity
S1	0.989	S15	0.913
S2	0.994	S16	0.910
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Sample No.

Similarity

Sample No.

Similarity

0.989

S15

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S13

0.994

S27

0.996

S14

0.988

S28

0.986

Peak No.	Formula	Molecular ion peak	Observe mass(m/z)	δ /×10^-6	Predicted compounds	MS/MS fragments (m/z)	References
1	C₇H₁₂O₆	[M-H]^-	191.055 97	-0.8	Quinic acid	173[M-H-H₂O]^-;127[M-H-H₂O-CO₂-2H]^-	[14]
2	C₁₄H₁₄O₄	[M+H]⁺	247.096 4	-0.4	Dihydrooroselol	175[M+H-H₂O-C₄H₆]⁺;147[M+H-H₂O-C₄H₆-CO]⁺;131[M+H-H₂O- CH₄-C₂H₂-2CO]⁺	[15]
3¹⁾	C₁₆H₁₆O₆	[M+H]⁺	305.102 21	0.8	Oxypeucedanin hydrate	203[M+H-C₅H₁₀O₂]⁺	[15]
4¹⁾	C₁₇H₁₈O₇	[M+H]⁺	335.112 46	-0.2	Byakangelicin	233[M+H-C₅H₁₀O₂]⁺;231[M+H-C₅H₁₀O₂-2H]⁺;215[M+H-C₅H₁₀O₂-H₂O]⁺	[16]
5	C₁₂H₈O₄	[M+H]⁺	217.049 75	1	Xanthotoxin	161[M+H-CO-C₂H₄]⁺;145[M+H-CO-C₂H₄-O]⁺	[15]
6¹⁾	C₁₂H₈O₄	[M+H]⁺	217.049 72	0.9	Bergapten	145[M+H-C₂H₄-CO₂]⁺	[15]
7¹⁾	C₁₃H₁₀O₅	[M+H]⁺	247.060 27	0.7	Isopimpinellin	217[M+H-CO-2H]⁺	[15]
8¹⁾	C₁₆H₁₄O₅	[M+H]⁺	287.091 56	0.6	Oxypeucedanin	203[M+H-C₅H₈O]⁺;159[M+H-C₅H₈O-CO₂]⁺;131[M+H-C₅H₈O-CO₂-CO]⁺	[13,17]
9¹⁾	C₁₆H₁₄O₄	[M+H]⁺	271.096 79	1.1	Imperatorin	203[M+H-C₅H₈]⁺;185[M+H-C₅H₈-H₂O]⁺	[17]
10	C₁₇H₁₆O₅	[M+H]⁺	301.107 3	0.8	Phellopterin	233[M+H-C₅H₈]⁺;217[M+H-C₅H₈-O]⁺;215[M+H-C₅H₈-H₂O]⁺	[15,17]
11	C₁₇H₁₆O₅	[M+H]⁺	301.107 41	1.2	Cnidilin	233[M+H-C₅H₈]⁺;217[M+H-C₅H₈-O]⁺	[17]
12¹⁾	C₁₆H₁₄O₄	[M+H]⁺	271.096 74	0.9	Isoimperatorin	203[M+H-C₅H₈]⁺	[15,17]
13	C₁₇H₂₂O	[M+H]⁺	243.174 11	-1	Falcarinolone	171[M+H-C₅H₁₂]⁺;115[M+H-C₅H₁₂-C₃H₄O]⁺;91[M+H-C₅H₁₂-C₃H₄O- CH₂]⁺	[18]

Peak
No.

Formula

Molecular
ion peak

Observe
mass(m/z)

δ
/×10^-6

Predicted
compounds

MS/MS fragments
(m/z)

References

C₇H₁₂O₆

[M-H]^-

191.055 97

-0.8

Quinic acid

173[M-H-H₂O]^-;127[M-H-H₂O-CO₂-2H]^-

[14]

C₁₄H₁₄O₄

[M+H]⁺

247.096 4

-0.4

Dihydrooroselol

175[M+H-H₂O-C₄H₆]⁺;147[M+H-H₂O-C₄H₆-CO]⁺;131[M+H-H₂O-
CH₄-C₂H₂-2CO]⁺

[15]

3¹⁾

C₁₆H₁₆O₆

[M+H]⁺

305.102 21

0.8

Oxypeucedanin hydrate

203[M+H-C₅H₁₀O₂]⁺

[15]

4¹⁾

C₁₇H₁₈O₇

[M+H]⁺

335.112 46

-0.2

Byakangelicin

233[M+H-C₅H₁₀O₂]⁺;231[M+H-C₅H₁₀O₂-2H]⁺;215[M+H-C₅H₁₀O₂-H₂O]⁺

[16]

C₁₂H₈O₄

[M+H]⁺

217.049 75

Xanthotoxin

161[M+H-CO-C₂H₄]⁺;145[M+H-CO-C₂H₄-O]⁺

[15]

6¹⁾

C₁₂H₈O₄

[M+H]⁺

217.049 72

0.9

Bergapten

145[M+H-C₂H₄-CO₂]⁺

[15]

7¹⁾

C₁₃H₁₀O₅

[M+H]⁺

247.060 27

0.7

Isopimpinellin

217[M+H-CO-2H]⁺

[15]

8¹⁾

C₁₆H₁₄O₅

[M+H]⁺

287.091 56

0.6

Oxypeucedanin

203[M+H-C₅H₈O]⁺;159[M+H-C₅H₈O-CO₂]⁺;131[M+H-C₅H₈O-CO₂-CO]⁺

[13,17]

9¹⁾

C₁₆H₁₄O₄

[M+H]⁺

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1.1

Imperatorin

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[17]

C₁₇H₁₆O₅

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Phellopterin

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[15,17]

C₁₇H₁₆O₅

[M+H]⁺

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1.2

Cnidilin

233[M+H-C₅H₈]⁺;217[M+H-C₅H₈-O]⁺

[17]

12¹⁾

C₁₆H₁₄O₄

[M+H]⁺

271.096 74

0.9

Isoimperatorin

203[M+H-C₅H₈]⁺

[15,17]

C₁₇H₂₂O

[M+H]⁺

243.174 11

-1

Falcarinolone

171[M+H-C₅H₁₂]⁺;115[M+H-C₅H₁₂-C₃H₄O]⁺;91[M+H-C₅H₁₂-C₃H₄O-
CH₂]⁺

[18]

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