中国药学杂志

Compound	IC₅₀/μmol·L^-1	Compound	IC₅₀/μmol·L^-1
7a	15.35±0.23	7b	21.24±0.34
7c	10.11±0.12	7d	12.10±0.45
7e	14.56±0.20	7f	17.23±0.11
7g	8.45±0.07	7h	8.09±0.37
7i	7.35±0.11	7j	9.76±0.20
7k	13.18±0.47	7l	2.26±0.04
7m	24.16±0.14	3b^[23]	7.99±0.66

Compound	IC₅₀/μmol·L^-1	Compound	IC₅₀/μmol·L^-1
7a	15.35±0.23	7b	21.24±0.34
7c	10.11±0.12	7d	12.10±0.45
7e	14.56±0.20	7f	17.23±0.11
7g	8.45±0.07	7h	8.09±0.37
7i	7.35±0.11	7j	9.76±0.20
7k	13.18±0.47	7l	2.26±0.04
7m	24.16±0.14	3b^[23]	7.99±0.66

1-[2-(金刚烷-1-基)-1H-吲哚-5-基]-3-取代硫脲衍生物作为CDK9抑制剂的设计合成及抗胃癌活性研究

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于明月 ¹^,² , 刘俊华 ¹ , 张浩凡 ³ , 朱德胜 ⁴^,^* , 黄建刚 ¹ , 胡鸿雨 ¹^,^*

中国药学杂志 | 论著 2024,59(21): 2003-2010

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中国药学杂志 | 论著 2024, 59(21): 2003-2010

1-[2-(金刚烷-1-基)-1H-吲哚-5-基]-3-取代硫脲衍生物作为CDK9抑制剂的设计合成及抗胃癌活性研究

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于明月¹^,², 刘俊华¹, 张浩凡³, 朱德胜⁴^,^*, 黄建刚¹, 胡鸿雨¹^,^*

作者信息

¹ 浙江师范大学行知学院, 浙江兰溪 321100

² 宜春学院化学与生物工程学院, 江西宜春 336000

³ 厦门大学药学院, 福建厦门361102

⁴ 金华中心医院, 浙江金华 321000

于明月,女,本科研究方向:新药研发

通讯作者:

^* 朱德胜,男,博士研究生研究方向:泌尿系肿瘤的基础研究与外科临床治疗 Tel:(0579)82553226;

胡鸿雨,男,博士,副教授研究方向:肿瘤药物设计合成及活性筛选 Tel:(0579)82291190

Design, Synthesis and Anti-Gastric Cancer Activity of 1-(2-adamantan-1-yl-1H-indole-5-yl)-3-Substituted Thiourea Derivatives as CDK9 Inhibitors

Mingyue YU¹^,², Junhua LIU¹, Haofan ZHANG³, Desheng ZHU⁴^,^*, Jiangang HUANG¹, Hongyu HU¹^,^*

Affiliations

¹ Xingzhi College, Zhejiang Normal University, Lanxi, 321100, China

² College of Chemistry and Bioengineering, Yichun University, Yichun 336000, China

³ School of Pharmaceutical Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China

⁴ Jinhua Municipal Central Hospital, Jinhua 321000, China

出版时间: 2024-11-08 doi: 10.11669/cpj.2024.21.003

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摘要

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目的设计合成新型的细胞周期蛋白依赖性激酶9(CDK9)抑制剂1-[2-(金刚烷-1-基)-1H-吲哚-5-基]-3-取代硫脲衍生物,并对其抗胃癌的活性进行研究。方法金刚烷甲酰氯为起始原料,通过6步反应合成了一系列目标化合物7a~7m,并通过¹H-NMR、¹³C-NMR和HRMS对所有目标化合物进行了结构鉴定。用噻唑蓝(MTT)法检测了合成化合物对于胃癌细胞生长的抑制作用,用二磷酸腺苷-人乙二醛酶(ADP-Glo)激酶测定法检测了合成化合物对CDK9激酶活性影响,并用免疫印迹法检测活性化合物对于下游信号的调控作用。结果表明目标化合物对于胃癌细胞的生长具有一定的抑制活性,其中化合物7l活性最优,其对胃癌细胞系(SGC-7901)的IC₅₀值为(2.26±0.04)μmol·L^-1,且7l对正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)的毒性较小(IC₅₀>100 μmol·L^-1)。在体外酶活性实验中, 7l在1 μmol·L^-1作用下,CDK9激酶活性为(21.67±1.47)%,且在胃癌细胞中7l呈浓度依赖性地抑制CDK9下游蛋白p-ser2的表达。最后,通过分子对接可知7l能稳定地结合在CDK9的活性位点并具有很高的结合亲和力。。结论设计合成的目标化合物是潜在的CDK9抑制剂,具有较好的抗胃癌的活性,有进一步研究的意义。

关键词

金刚烷衍生物 / 吲哚 / 细胞周期依赖性蛋白激酶9 / 胃癌

Abstract

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OBJECTIVE To design and synthesize novel CDK9 inhibitors 1-(2-adamantan-1-yl-1H-indole-5-yl)-3-substituted thiourea derivatives and study their anti-gastric cancer activities. METHODS A series of target compounds 7a-7m were synthesized from adamantan formyl chloride by 6-step reactions. The structures of the target compounds were identified by ¹H-NMR, ¹³C-NMR, and HRMS. MTT assay was used to detect the inhibitory effect of synthetic compounds on the growth of gastric cancer cells, ADP-Glo kinase assay was used to detect the effect of synthetic compounds on CDK9 kinase activity and Western blot assay was used to detect the regulatory effect of hit compound on downstream signaling pathways. RESULTS The target compounds had certain inhibitory activity on the growth of gastric cancer cells, among which compound 7l had the best activity on the gastric cancer cell line (SGC-7901) with IC₅₀ value of (2.26±0.04) μmol·L^-1, and 7l had little toxicity on normal gastric epithelial cells (IC₅₀ >100 μmol·L^-1). In addition, 7l showed specific inhibitory effect on CDK9 kinase activity in vitro. Upon 1 μmol·L^-1 7l treatment, CDK9 kinase activity was only (21.67±1.47)%, and in gastric cancer cells 7l inhibited CDK9 downstream protein p-ser2 expression in a concentration-dependent manner. Finally, molecular docking study showed that 7l could stably bind to the active site of CDK9 and had a high binding affinity. CONCLUSION This series of compounds have good anti-gastric cancer activity and are worth of further study.

Key words

adamantan derivatives / indole / CDK9 / gastric cancer

引用本文

于明月, 刘俊华, 张浩凡, 朱德胜, 黄建刚, 胡鸿雨. 1-[2-(金刚烷-1-基)-1H-吲哚-5-基]-3-取代硫脲衍生物作为CDK9抑制剂的设计合成及抗胃癌活性研究. 中国药学杂志, 2024 , 59 (21) : 2003 -2010 . DOI: 10.11669/cpj.2024.21.003

Mingyue YU, Junhua LIU, Haofan ZHANG, Desheng ZHU, Jiangang HUANG, Hongyu HU. Design, Synthesis and Anti-Gastric Cancer Activity of 1-(2-adamantan-1-yl-1H-indole-5-yl)-3-Substituted Thiourea Derivatives as CDK9 Inhibitors[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (21) : 2003 -2010 . DOI: 10.11669/cpj.2024.21.003

正文

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胃癌是世界上最常见的癌症之一,是世界上第三大癌症死亡原因^[1]。中老年患者是胃癌的高发人群,胃癌一经发现时常处于晚期,患者的5年生存率往往不足30%^[2-3]。因此,了解胃癌的发生和发展,并可能发现新的诊断和预后的生物标志物,对改善胃癌患者的临床结果至关重要。临床上,胃癌的治疗方法通常以手术治疗为主,药物治疗为辅^[4]。尽管化疗能够在一定程度上延长胃癌患者生存期,但传统的化疗药物存在特异性差,毒副作用大,易导致耐药等问题,严重影响了胃癌患者的治疗效果和生存。因此,寻找针对胃癌的具有良好疗效的药物十分重要^[5]。

周期蛋白依赖性激酶(CDKs)是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶, 在细胞周期进程或转录调节中起着重要的作用^[6-9]。最近的研究表明,CDKs在多种癌症中过表达,并最终导致细胞增殖失控和耐药^[10]。细胞周期蛋白依赖性激酶9(CDK9)是周期蛋白依赖性激酶中重要的一员,在稳定RNA转录延伸方面起着重要的作用。CDK9和细胞周期蛋白T共同构成正转录延伸因子b复合物,通过RNA聚合酶Ⅱ(RNAPII)的磷酸化促进转录延伸^[11-12]。最近的研究表明,CDK9在宫颈癌、前列腺癌、肺癌等多种人类癌症中发挥关键作用^[13-18]。双荧光素酶报告基因实验表明,miR-613通过下调CDK9基因抑制胃癌细胞的转移和进展^[19]。因此,通过靶向CDK9从而干预胃癌的发展发生过程具有一定的治疗前景。

分子杂合技术是药物设计与开发领域中常用的结构修饰策略,将不同生物活性分子中的药效基团拼接,可能产生具有潜在的高活性、低毒性和多重作用机制的杂合分子。吲哚类化合物是一类重要的杂环化合物,广泛存在于自然界中,吲哚类化合物选择性强和毒副作用小等特点已经凸显出其在抗肿瘤化合物中的重要作用^[20]。金刚烷及其衍生物,具有强的脂溶性,能够很好地使药物进入细胞内发挥作用^[21],还具有抗病毒、抗炎等活性^[22]。

本研究在前期的工作基础上, 利用分子杂合方法和片段替换策略,保留了前期发现的CDK9抑制剂3b中必须的吲哚环^[23]和AHPN的金刚烷的药效基团进行分子杂合,设计合成了一系列新型的靶标化合物(图1),以期获得比3b活性更优具CDK9抑制剂1-[2-(金刚烷-1-基)-1H-吲哚-5-基]-3-取代硫脲衍生物。其目标化合物 7a~7m的合成路线见图2。

1 仪器与试剂

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1.1 主要药品与试剂

噻唑蓝(MTT)粉末(ST1537,法国碧云天生物技术有限公司),p-ser2(13499S,美国Cell Signaling Technology公司),β-actin (81115-1-RR,美国Proteintech Group公司),SGC-7901(法国碧云天生物技术有限公司),CP-H048(中国普诺赛生命科技有限公司),人胃黏膜上皮细胞GES-1(武汉尚恩生物技术有限公司),CDK9/Cyclin T1激酶复合物,激酶底物由厦门大学药学院馈赠,ADP-GloTM激酶检测试剂盒(V910,美国Promega公司)。

1.2 主要仪器

WRS-1B数字熔点仪,Bruker Avance 600型核磁共振波谱仪(DMSO-d₆或CDCl₃为溶剂,TMS为内标)、Agilent 6230质谱仪、酶标仪(美国Thermo公司);化学发光成像仪(美国Bio-Rad公司),Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)。

2 实验方法

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目标化合物的合成过程以金刚烷甲酰氯和邻甲基苯胺为原料反应,得到化合物2-甲基金刚烷酰苯胺(化合物2),再与正丁基锂反应得到合成得到2-金刚烷-1H-吲哚(化合物3)。化合物3硝化得到2-金刚烷-5-硝基-1H-吲哚(化合物4),化合物4还原得2-金刚烷-5-氨基-1H-吲哚(化合物5)。化合物5与固体光气得2-金刚烷-5-异氰酸-1H-吲哚(化合物6)。化合物6和不同的硫代异氰酸反应得到目标化合物7a~7m,合成路线见图2。其结构经¹H-NMR,¹³C-NMR 和HR-MS表征。

2.1 中间体2-甲基金刚烷酰苯胺合成(2)

在50 mL干燥单口瓶中依次加入甲苯(10 mL),1-金刚烷甲酰氯(0.99 g,5 mmol),2-甲基苯胺(0.54 g,5 mmol),碳酸钾(0.69 g,5 mmol)搅拌升温至80 ℃,TLC检测反应进程。反应结束,冷却抽滤,水洗,烘干得白色固体产物粗品并用乙醇重结晶,得2-甲基金刚烷酰苯胺1.17 g,收率87%。¹H-NMR(600 MHz, CDCl₃) δ:7.88(d, J=8.1 Hz, 1H), 7.24~7.18(m, 2H), 7.17(d, J=7.5 Hz, 1H), 7.05(dt, J=1.1, 7.4 Hz, 1H), 2.26(s, 3H), 2.11(brs, 3H), 1.99(d, J=2.6 Hz, 6H), 1.77(m, 6H)。

2.2 中间体2-金刚烷-1H-吲哚的合成(3)

参考文献[24]方法在干燥的25 mL三口瓶中,分别加入2'-甲基金刚烷酰苯胺(0.285 g,10 mmol),15 mL四氢呋喃溶剂,降温到0~5 ℃,在氮气保护下滴加正丁基锂(2 mL)。TLC检测反应,反应结束。用体积分数5%稀盐酸调pH值至7.0~7.5,分液,有机相用无水硫酸钠干燥后,过滤,减压浓缩得到的粗产物用柱层析分离(洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=10∶1)得2-金刚烷吲哚0.166 g,收率66.1%。¹H-NMR(600 MHz, CDCl₃) δ:7.30(d, J=7.9 Hz, 1H), 7.18(dd, J=0.5, 8.1 Hz, 1H), 6.88(dt, J=1.1, 7.5 Hz, 1H), 6.83~6.77(m, 1H), 5.98(d, J=0.6 Hz, 1H), 1.97(d, J=2.6 Hz, 3H), 1.93(d, J=2.9 Hz, 6H), 1.73(brs, 6H)。

2.3 中间体2-金刚烷-5-硝基-1H-吲哚的合成(4)

参考文献[25]在25 mL三口瓶中,0 ℃下加入2-金刚烷-1H-吲哚(0.25 g,10 mmol)和浓硫酸(0.8 mL),再滴加硝酸钠(0.085 g,10 mmol)的硫酸(0.8 mL)溶液,滴加结束后,保温反应1~2 h,TLC检测,反应结束。加入大量的冰水,析出黄色固体,过滤,水洗,干燥。粗产物用柱层析分离(洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯=5∶1)得黄色固体产物2-金刚烷基-5-硝基-1H-吲哚0.24 g,收率82.8%。¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.65(brs, 1H), 8.44(d, J=2.2 Hz, 1H), 7.93(dd, J=2.2, 9.0 Hz, 1H), 7.44(d, J=8.8 Hz, 1H), 6.38(d, J=1.5 Hz, 1H), 2.07(brs, 3H), 1.98(brs, 6H), 1.81~1.67(m, 6H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆) δ:154.0, 140.8, 139.9, 127.7, 116.9, 116.3, 111.4, 98.2, 41.9, 36.6, 34.1, 28.2;ESI-HRMS(+):m/z:C₁₈H₂₁N₂

O 2 +

[M+H]⁺297.159 9,理论值:297.159 8。

2.4 中间体2-金刚烷-5-氨基-1H-吲哚的合成(5)

在250 mL三口瓶中,依次加入乙醇(100 mL),乙酸(10 mL),水(20 mL),铁粉(8.62 g,0.15 mol);升温至75 ℃,分批加2-金刚烷基-5-硝基-1H-吲哚(11.4 g,0.038 mol),结束后保温反应2 h,TLC检测反应。结束后反应液热过滤,滤液冷却后减压浓缩除去溶剂;在加入80 mL水后,再在搅拌下加入80 mL乙酸乙酯,并用碳酸氢钠调pH值为7~8;分液,有机相用无水硫酸钠干燥,抽滤,柱层析分离(石油醚-乙酸乙酯=21)得红色固体产物2-金刚烷-5-氨基-1H-吲哚6.90 g,收率67.0%。¹H-NMR(600 MHz,CDCl₃) δ:7.80(brs,1H),7.10(d,J=8.4 Hz,1H),6.86(d,J=2.2 Hz,1H),6.57(dd,J=2.2,8.4 Hz,1H),6.05(dd,J=0.7,2.2 Hz,1H),3.65~3.23(m,2H),2.09(brs,3H),1.96(d,J=2.38 Hz,6H),1.78(q,J=12.2 Hz,6H)。¹³C-NMR(150 MHz,CDCl₃) δ:149.9,139.3,130.3,129.4,111.6,110.8,105.3,95.5,42.6,36.8,33.7,28.5;ESI-HRMS(+):m/z:C₁₈H₂₃

N 2 +

[M+H]⁺267.185 8 [M+H]⁺,理论值:267.185 6。

2.5 中间体2-金刚烷-5-硫代异氰酸-1H-吲哚的合成(6)

在干燥的100 mL的三口瓶,依次加入2-金刚烷-5-氨基-1H-吲哚(4.10 g,15.5 mmol)的甲苯溶液(20 mL),三乙胺(3 mL)。再缓慢滴加CS₂(3.50 g,46.5 mmol)。室温反应8 h,过滤,干燥后溶于二氯甲烷(30 mL)后,滴加三光气(5.0 g,17 mmol),温度在0~5 ℃,反应2 h后,TLC检测,反应结束,用柱层析分离(石油醚-乙酸乙酯=10∶1)得白色固体产物2-金刚烷基-5-硫代异氰酸-1H-吲哚2.89 g,收率64.0%。¹H-NMR(600 MHz, CDCl₃) δ:7.40(d, J=1.8 Hz, 1H), 7.23(d, J=8.4 Hz, 1H, ), 6.98(dd, J=2.0, 8.4 Hz, 1H), 6.20(d, J=1.5 Hz, 1H), 2.14~2.08(m, 3H), 1.99~1.94(m, 6H), 1.85~1.74(m, 6H)。¹³C-NMR(150 MHz, CDCl₃) δ:151.4, 134.1, 131.8, 128.7, 122.6, 119.0, 117.3, 111.2, 96.8, 42.5, 36.7, 33.9, 28.4; ESI-HRMS(+):m/z:C₁₉H₂₁N₂S⁺[M+H]⁺ 309.142 2,理论值:309.142 0。

2.6 1-(2-(金刚烷-1-基)-1H-吲哚-5-基)-3-取代硫脲合成(7a~7m)

在25 mL的反应瓶中,加入2-金刚烷基-5-硫代异氰酸-1H-吲哚(0.145 g,5 mmol),甲苯(10 mL),取代胺(5 mmol),升温至80 ℃,TLC检测反应。冷却,过滤,干燥得白色固体产物,收率70.0%~88.6%。

7a:白色固体,收率70.1%,纯度93.5%,m.p. 198~200 ℃, ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ:10.92(s, 1H), 9.25(brs, 1H), 7.27(dd, J=3.2, 4.95 Hz, 2H), 6.83(dd, J=1.7 8.5 Hz, 1H), 6.08(d, J=1.71 Hz, 1H), 3.47~3.40(m, 2H), 2.06(brs, 3H), 1.96(d, J=1.96 Hz, 6H), 1.76(br, 6H), 1.54~1.41(m, 2H), 1.32~1.19(m, 6H), 0.87(t, J=6.79 Hz, 3H)。¹³C-NMR(100 MHz, DMSO-d₆) δ: 181.0, 152.5, 151.1, 135.3, 134.6, 128.4, 116.8, 111.5, 95.8, 44.5, 42.2, 36.8, 33.9, 31.5, 29.1, 28.3, 26.5, 22.5, 14.4;ESI-HRMS(+):m/z:C₂₅H₃₆N₃S⁺[M+H]⁺410.262 5, 理论值:410.262 4。

7b:白色固体, 收率78.4%, 纯度90.5%, m.p. 201~203 ℃, ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ:10.90(s, 1H), 9.21(s, 1H), 7.32(s, 1H), 7.25(d, J=8.44 Hz, 1H), 6.96(brs, 1H), 6.87(dd, J=1.7, 8.4 Hz, 1H), 6.07(d, J=1.3 Hz, 1H), 2.06(brs, 3H), 1.96(brs, 6H), 1.89~1.83(m, 2H), 1.80~1.71(m, 6H), 1.64(d, J=12.6 Hz, 2H), 1.54(d, J=12.7 Hz, 1H), 1.32~1.04(m, 5H)。¹³C-NMR(100 MHz, DMSO-d₆) δ:180.0, 151.0, 134.4, 130.1, 128.3, 118.8, 116.4, 111.3, 95.7, 52.9, 42.2, 36.8, 33.9, 32.4, 28.4, 25.6, 25.1; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₅H₃₄N₃S⁺[M+H]⁺ 408.246 9, 理论值:408.246 8。

7c:白色固体, 收率80.1%, 纯度94.6%, m.p. 221~223 ℃, ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ:10.91(s, 1H), 9.66(s, 1H), 9.35(brs, 1H), 7.50(d, J=7.8 Hz, 2H), 7.42(s, 1H), 7.33~7.25(m, 3H), 7.13~7.07(m, 1H), 6.98(dd, J=1.8, 8.5Hz, 1H), 6.10(d, J=1.6Hz, 1H), 2.07(brs, 3H), 1.97(s, 6H), 1.84~1.66(m, 6H)。¹³C-NMR(100 MHz, DMSO-d₆) δ:180.4, 151.0, 140.3, 134.5, 130.5, 128.7, 128.3, 124.6, 124.3, 119.0, 116.6, 111.1, 95.8, 42.3, 36.8, 33.9, 28.4; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₅H₂₈N₃S⁺[M+H]⁺ 402.199 9, 理论值:402.199 8。

7d:白色固体, 收率78.8%, 纯度90.9%, m.p. 225~226 ℃, ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ:10.91(s, 1H), 9.54(s, 1H), 8.87(brs, 1H), 7.42(d, J=1.5 Hz, 1H), 7.30~7.24(m, 2H), 7.22(dd, J=1.5, 6.9 Hz, 1H), 7.19~7.09(m, 2H), 6.98(dd, J=1.9, 8.5 Hz, 1H), 6.10(d, J=1.7 Hz, 1H), 2.24(s, 3H), 2.07(brs, 3H), 1.97(d, J=2.0 Hz, 6H), 1.82~1.72(m, 6H)。¹³C-NMR(100 MHz, DMSO-d₆) δ:181.1, 151.0, 138.8, 135.3, 134.6, 130.6, 128.7, 128.3, 126.6, 126.3, 119.2, 116.9, 111.2, 95.8, 42.3, 36.8, 33.9, 28.4, 18.4; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₆H₃₀N₃S⁺[M+H]⁺416.215 2 [M+H]⁺, 理论值:416.215 5。

7e:白色固体, 收率75.6%, 纯度94.0%, m.p. 234~236 ℃, ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ:10.91(s, 1H), 9.62(s, 1H), 9.27(brs, 1H), 7.41(s, 1H), 7.32~7.24(m, 3H), 7.19(t, J=8.1 Hz, 1H), 6.97(dd, J=1.8, 8.5 Hz, 1H), 6.92(d, J=7.5 Hz, 1H), 6.09(d, J=1.5 Hz, 1H), 2.28(s, 3H), 2.07(brs, 3H), 1.97(brs, 6H), 1.83~1.63(m, 6H)。¹³C-NMR(100MHz, DMSO-d₆) δ:180.3, 151.0, 140.2, 137.9, 134.5, 130.5, 128.5, 128.2, 125.3, 124.9, 121.5, 119.1, 116.6, 111.1, 95.8, 42.3, 36.8, 33.9, 28.4, 21.5; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₆H₃₀N₃S⁺[M+H]⁺416.215 0, 理论值:416.215 5。

7f:白色固体, 收率79.5%, 纯度95.1%, m.p. 227~228 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆) δ:10.92(brs, 1H), 9.59(brs, 1H), 9.26(brs, 1H), 7.41(s, 1H), 7.35(d, J=8.0 Hz, 2H), 7.27(d, J=8.4 Hz, 1H), 7.11(d, J=8.0 Hz, 2H), 6.97(d, J=7.7 Hz, 1H), 6.09(s, 1H), 2.28(s, 3H), 2.07(brs, 3H), 1.97(brs, 6H), 1.81~1.70(m, 6H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆) δ:180.4, 151.0, 137.7, 134.5, 133.8, 130.5, 129.1, 128.2, 124.6, 119.1, 116.6, 111.1, 95.7, 42.3, 36.8, 33.9, 28.4, 21.0; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₆H₃₀N₃S⁺[M+H]⁺ 416.215 1, 理论值:416.215 5。

7g:白色固体, 收率80.1%, 纯度94.0%, m.p. 244~246 ℃, ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ:10.90(s, 1H), 9.50(s, 1H), 9.14(brs, 1H), 7.41(d, J=0.9 Hz, 1H), 7.33(d, J=8.9 Hz, 2H), 7.27(d, J=8.4 Hz, 1H), 6.97(dd, J=1.8, 8.5 Hz, 1H), 6.88(d, J=8.9 Hz, 2H), 6.09(d, J=1.5 Hz, 1H), 3.74(s, 3H), 2.07(brs, 3H), 1.97(brs, 6H), 1.82~1.71(m, 6H)。¹³C-NMR(100 MHz, DMSO-d₆) δ:180.7, 156.8, 151.0, 134.5, 133.1, 130.5, 128.3, 126.7, 119.1, 116.7, 113.9, 111.1, 95.7, 55.7, 42.3, 36.8, 33.9, 28.4; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₆H₃₀N₃S⁺[M+H]⁺ 432.210 6, 理论值:432.210 4。

7h:白色固体, 收率73.1%, 纯度96.8%, m.p. 208~210 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆) δ:10.93(s, 1H), 9.70(brs, 1H), 9.31(brs, 1H), 7.46(dd, J=5.1, 8.6 Hz, 2H), 7.40(s, 1H), 7.27(d, J=8.6 Hz, 1H), 7.14(t, J=8.8 Hz, 2H), 6.96(dd, J=1.4, 8.5 Hz, 1H), 6.09(d, J=1.5 Hz, 1H), 2.07(brs, 3H), 1.97(brs, 6H), 1.80~1.72(m, 6H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆) δ:180.7, 159.5(d, J=238.5 Hz), 151.0, 136.7, 134.6, 130.3, 128.3, 126.9, 119.0, 116.6, 115.2(d, J=21.0 Hz), 111.2, 95.8, 42.2, 36.8, 33.9, 28.4; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₅H₂₇FN₃S⁺[M+H]⁺ 420.190 4, 理论值:420.190 4。

7i:白色固体, 收率79.1%, 纯度97.6%, m.p. 245~246 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆) δ:10.94(brs, 1H), 9.78(brs, 1H), 9.44(brs, 1H), 7.52(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.41(brs, 1H), 7.35(d, J=8.8 Hz, 2H), 7.27(d, J=8.4 Hz, 1H), 6.96(d, J=8.0 Hz, 1H), 6.09(s, 1H), 2.07(brs, 3H), 1.97(brs, 6H), 1.81~1.72(m, 6H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆) δ:180.4, 151.1, 139.4, 134.6, 128.7, 128.4, 128.2, 126.0, 125.8, 119.0, 116.6, 111.2, 95.8, 42.2, 36.8, 33.9, 28.4; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₅H₂₇ClN₃S⁺ [M+H]⁺ 436.160 5, 理论值:436.160 9。

7j:白色固体, 收率82.3%, 纯度97.1%, m.p. 218~220 ℃, ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ:10.93(s, 1H), 9.95(s, 1H), 9.71(brs, 1H), 7.78(d, J=8.4Hz, 2H), 7.65(d, J=8.6 Hz, 2H), 7.43(s, 1H), 7.28(d, J=8.4 Hz, 1H), 6.99(dd, J=1.7, 8.5 Hz, 1H), 6.10(d, J=1.5Hz, 1H), 2.07(brs, 3H), 1.97(d, J=2.0 Hz, 6H), 1.82~1.69(m, 6H)。¹³C-NMR(100 MHz, DMSO-d₆) δ:180.3, 151.1, 144.3, 134.6, 130.3, 128.3, 125.7, 123.5, 118.8, 116.5, 111.2, 95.8, 42.2, 36.8, 33.9, 28.4; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₆H₂₇F₃N₃S⁺ [M+H]⁺ 470.187 2, 理论值:470.187 2。

7k:白色固体, 收率 88.6%, 纯度96.2%, m.p. 242~243 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆) δ:10.78~10.94(m, 1H), 9.42(brs, 1H), 8.77(brs, 1H), 7.40(s, 1H), 7.26(d, J=8.4 Hz, 1H), 7.10(d, J=7.8 Hz, 1H), 7.01(s, 1H), 6.98~6.92(m, 2H), 6.14~5.94(m, 1H), 2.25(s, 3H), 2.19(s, 3H), 2.05(brs, 3H), 1.96(brs, 6H), 1.82~1.70(m, 6H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆) δ:151.0, 135.8, 135.1, 134.6, 131.2, 129.4, 128.7, 128.6, 128.3, 126.9, 119.2, 116.9, 95.8, 42.3, 36.8, 33.9, 28.4, 21.0, 18.3; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₇H₃₂N₃S⁺ [M+H]⁺ 430.231 0, 理论值:430.231 1。

7l:白色固体, 收率72.8%, 纯度97.1%, m.p. 228~230 ℃, ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆)δ:10.94(s, 1H), 9.85(brs, 1H), 8.96(brs, 1H), 7.52(d, J=6.7 Hz, 1H), 7.42(s, 1H), 7.31~7.23(m, 2H), 7.07~7.01(m, 1H), 6.97(dd, J=1.8, 8.5Hz, 1H), 6.11(d, J=1.6 Hz, 1H), 2.07(brs, 3H), 1.97(d, J=2.2 Hz, 6H), 1.83~1.69(m, 6H)。¹³C-NMR(100 MHz, DMSO-d₆) δ:181.6, 161.7, 156.2, 151.1(d, J=25.0 Hz), 134.7, 131.0, 130.2(d, J=25.0 Hz), 129.4, 128.7, 128.3, 124.9, 119.0, 116.8, 111.3, 111.1, 104.5, 95.8, 42.2, 36.8, 33.9, 28.4; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₅H₂₆F₂N₃S⁺ [M+H]⁺ 438.181 2, 理论值:438.181 0。

7m:白色固体, 收率74.1%, 纯度97.6%, m.p. 256~258 ℃, ¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ:10.92(s, 1H), 9.66(brs, 1H), 9.44(brs, 1H), 7.97(dd, J=7.9, 15.3 Hz, 2H), 7.86~7.79(m, 1H), 7.63~7.43(m, 5H), 7.30(d, J=8.4 Hz, 1H), 7.06(dd, J=1.9, 8.5Hz, 1H), 6.11(d, J=1.6 Hz, 1H), 2.07(brs, 3H), 1.98(brs, 6H), 1.82~1.70(m, 6H)。¹³C-NMR(100 MHz, DMSO-d₆) δ:182.1, 151.0, 136.2, 134.6, 134.3, 130.7, 128.5, 128.3, 126.9, 126.5, 126.4, 126.0, 123.7, 119.4, 117.1, 111.2, 95.8, 42.3, 36.8, 33.9, 28.4; ESI-HRMS(+):m/z:C₂₉H₃₀N₃S⁺[M+H]⁺ 452.214 9,理论值:452.215 5。

2.7 MTT法检测细胞的存活率

采用MTT法测定了7a~7m对胃癌细胞系(SGC-7901)和正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)体外抗肿瘤活性。取处于对数生长期的状态良好的细胞一瓶,加入质量分数0.25%的胰蛋白酶消化液消化,使贴壁细胞脱落,计数,制成每毫升2×10⁴~4×10⁴个细胞的悬液。接种于96孔板上,每孔180 μL,置恒温CO₂培养箱中培养24 h。换液,加入受试化合物的DMSO溶液,每孔20 μL,再加入体积分数10%的血清培养液80 μL,培养48 h。将MTT加入96孔板中,每孔20 μL,培养箱中反应4 h。吸去上清液,加入DMSO,每孔150 μL,平板摇床上振摇5 min。用酶联免疫检测仪在波长为570 nm处测定每孔的光密度值(OD值),并按照公式1计算对细胞增殖的抑制率。

公式(1)抑制率%=[(阴性对照组OD值-受试物组OD值)/阴性对照组OD值]×100%

计算不同浓度下的抑制率,再以此求出各样品的IC₅₀值。

2.8 CDK9激酶活性检测

本实验使用ADP-Glo激酶测定法,测试化合物对CDK9激酶活性影响。取4 μL CDK9/Cyclin T1激酶复合物(3 ng·μL^-1),5 μL激酶底物(0.2 μg·μL^-1),10 μmol·L^-1三磷酸腺苷(ATP)和终浓度1 μmol·L^-1的化合物添加至384孔板中,37 ℃孵育20 min后室温静置10 min。然后,将等体积的ADP-Glo试剂添加到每个孔中,室温静置30 min后将10 μL激酶检测试剂添加到孔中,室温静置 30 min使用多功能酶标仪检测。

2.9 蛋白免疫印迹法(Western Blot,WB)

细胞接种于6孔板中,24 h后加入不同浓度的化合物7l,24 h后,吸去培养基,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗3次,加入1×Loading Buffer,金属浴10 min,离心,然后在Tris-甘氨酸缓冲液中电泳。电泳完毕,进行电转移,使蛋白转到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,封闭1 h后加入一抗孵育过夜;孵育之后的膜用三乙醇胺缓冲盐水(TBST)溶液摇洗3次,之后加入对应的二抗,室温孵育1 h后显影。

2.10 分子对接

本研究采用分子对接方法进一步探索了化合物7l与CDK9的相互作用模式。首先,用于分子对接的CDK9/cyclinT1晶体复合物(PDB ID: 7NWK)从PDB数据库(https://www.rcsb.org/structure/7NWK)下载得到,该晶体分辨率为2.81 Å。由于从晶体数据库下载得到的蛋白结构没有氢原子,不含电荷信息,部分氨基酸残基或者loop环缺失,所以需要对其进行结构准备。使用Schrödinger软件(V 2023-1)的Protein Preparation Wizard模块以默认参数设置对CDK9蛋白结构进行去除水分子和溶剂分子,添加氢原子,分配电荷,补全缺失的氨基酸残基,改变残基的质子化状态,优化蛋白的氢键网络以及使用OPLS4力场对蛋白结构进行能量最小化等处理。使用Schrödinger的LigPrep(LigPrep,Schrödinger,LLC,New York,NY,2023)工具对7l在OPLS4力场下以默认参数进行结构准备,包括加氢、加电荷以及在pH值为7.0±2.0状态下生成可能的质子化状态等。然后利用Schrödinger软件的Ligand Docking模块将准备好的7l分子对接到CDK9的ATP活性位点。对接盒子的中心位于原晶体配体的质心,对接精度采用高精度的XP方法(extra precision),其余参数为软件默认设置。最后使用Schrödinger的MMGBSA模块计算了7l和CDK9复合物的结合能。Schrödinger的Maestro(Version 12.5)程序用于晶体结构和对接结果分析的主要可视化工具。分子对接结果用PyMol(The PyMOL Molecular Graphics System,Version 2.5.4 Schrödinger,LLC.)进行渲染和展示。

3 结果与讨论

收起

3.1 化合物构效讨论

采用MTT法检测了合成的化合物对于胃癌细胞SGC-7901体外活性测试结果见表1。分别考察了当R基为烷基、环烷基、六元取代芳基、芳稠环时,化合物对SGC-7901抑制活性的影响。根据表1,当R为己基、环己基、苯基、奈基时,7c>(苯基)>7a(己基)>7b(环己基)>7m(奈基); 在苯环的一取代中(7d~7j),4-氯取代(7i)>4-氟取代(7h)>4-甲氧基取代(7g)>4-三氟甲基取代(7j)>2-甲基取代(7d)>3-甲基取代(7e)>4-甲基取代(7f);在苯环的二取代中(7k~7l),2,4-二氯取代(7l)>2,4-二甲基取代(7k)。其中7l效果最好,其IC₅₀值为(2.26±0.04)μmol·L^-1。此外,7l对正常胃黏膜上皮细胞(GES-1)的IC₅₀为(103.24±0.67)μmol·L^-1。

3.2 化合物对CDK9激酶活性影响

采用ADP-Glo激酶测定法,测试1 μmol·L^-1化合物对CDK9激酶活性影响,结果见图3,先导化合物3b展现出CDK9激酶抑制活性,在1 μmol·L^-1作用浓度下,CDK9激酶活性为(29.68±1.10),合成的化合物钟7i,7j,7l影响CDK9激酶活性(CDK9/Cyclin T1 kinase activity<50%),分别为(7i:39.00±3.29,7j:49.17±1.18,7l:21.67±1.47),与MTT结果一致,7l影响CDK9激酶活性最为明显,且与先导化合物3b相比,7l抑制CDK9激酶活性更为显著,提示7l为潜在的CDK9抑制剂,可作为候选药物进行活性验证。

3.3 WB检测化合物对细胞蛋白表达水平的影响

体外抗肿瘤细胞毒活性及其他生物活性初步评估显示:测试化合物中,化合物7l具有相对较佳的抗肿瘤活性,因此对化合物7l做进一步的生物活性测试。以不同浓度的7l对SGC-7901处理24 h,随后用WB检测对CDK9的调控情况。CDK9下游底物丝氨酸二号位(p-ser2)的表达与转录活性有关,由图可以看出,7l可以浓度依赖性地引起p-ser2表达降低,表明CDK9可能是7l的潜在靶点(图4)。

3.4 7l与CDK9结合模式分析

本研究进一步使用分子对接方法预测了7l和CDK9的结合模式。分子对接显示,化合物7l可以结合在 CDK9的ATP活性口袋中,7l的三维结构可以很好地契合在CDK9的活性口袋,见图5A。从图5B可以看出,化合物7l的吲哚环母核和硫脲键能够稳定地与CDK9的关键残基形成相互作用,吲哚环母核N原子上的氢作为氢键供体可以和CDK9铰链区的GLU107的羰基氧原子形成很强的氢键相互作用,其键长为1.80 Å,说明了化合物7l的母核能很好地锚定在CDK9活性位点的铰链区。除此之外,7l硫脲键上的氢原子供体提供了更多的与CDK9活性位点氨基酸残基产生相互作用的可能性,对接结果显示硫脲键上的氢原子作为氢键供体与CDK9的GLY28也形成了距离为2.20 Å的氢键相互作用。此外,采用MMGB-SA方法计算了7l与CDK9的结合自由能为-158.01 kJ·mol^-1,进一步说明了7l与CDK9有很高的结合亲和力。

通过分子杂合策略,合成了13个新的1-[2-(金刚烷-1-基)-1H-吲哚-5-基]-3-取代硫脲衍生物7a~7m,其结构经¹H-NMR,¹³C-NMR 和HR-MS表征。采用MTT法检测了合成化合物对于胃癌细胞生长的抑制作用,其中化合物7l活性最优,且7l对正常胃上皮细胞的毒性较小。使用体外激酶实验检测了化合物抑制CDK9激酶活性,相比于先导化合物3b,7l展现出较强的CDK9激酶抑制活性,且7l以浓度依赖的方式抑制胃癌细胞CDK9下游蛋白p-ser2的表达。最后分子对接表明化合物7l能稳定地结合在CDK9的活性位点并具有很高的结合亲和力。在未来的工作中,将会对7l进行进一步研究。

基金

收起

浙江省公益基金项目(LGF22H300015)
金华市重点研发项目(2021-3-150)
金华市重点研发项目(2023-3-082)

参考文献

收起

文献

收起

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2024年第59卷第21期

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doi: 10.11669/cpj.2024.21.003

接收时间：2024-04-25
首发时间：2025-11-16
出版时间：2024-11-08

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收稿日期：2024-04-25

基金

浙江省公益基金项目(LGF22H300015)

金华市重点研发项目(2021-3-150)

金华市重点研发项目(2023-3-082)

作者信息

¹ 浙江师范大学行知学院, 浙江兰溪 321100

² 宜春学院化学与生物工程学院, 江西宜春 336000

³ 厦门大学药学院, 福建厦门361102

⁴ 金华中心医院, 浙江金华 321000

通讯作者:

^* 朱德胜,男,博士研究生研究方向:泌尿系肿瘤的基础研究与外科临床治疗 Tel:(0579)82553226;

胡鸿雨,男,博士,副教授研究方向:肿瘤药物设计合成及活性筛选 Tel:(0579)82291190

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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