中国药学杂志

No.	Place of China(in Chinese)	No.	Place of China(in Chinese)
Y1	Yunnan Yuxi(云南玉溪)	Y7	Guangdong Guangzhou(广东广州)
Y2	Yunnan Yuxi(云南玉溪)	Y8	Hainan Ledong(海南乐东)
Y3	Yunnan Yuxi(云南玉溪)	Y9	Guangdong Guangzhou(广东广州)
Y4	Guangxi Nanning(广西南宁)	Y10	Yunnan Chuxiong(云南楚雄)
Y5	Yunnan Kunming(云南昆明)	Y11	Yunnan Chuxiong(云南楚雄)
Y6	Guangdong Guangzhou(广东广州)	Y12	Guangdong Guangzhou(广东广州)

No.	Place of China(in Chinese)	No.	Place of China(in Chinese)
Y1	Yunnan Yuxi(云南玉溪)	Y7	Guangdong Guangzhou(广东广州)
Y2	Yunnan Yuxi(云南玉溪)	Y8	Hainan Ledong(海南乐东)
Y3	Yunnan Yuxi(云南玉溪)	Y9	Guangdong Guangzhou(广东广州)
Y4	Guangxi Nanning(广西南宁)	Y10	Yunnan Chuxiong(云南楚雄)
Y5	Yunnan Kunming(云南昆明)	Y11	Yunnan Chuxiong(云南楚雄)
Y6	Guangdong Guangzhou(广东广州)	Y12	Guangdong Guangzhou(广东广州)

Herb No.	Scavenging rate/%		Petal No.	Scavenging rate/%		Calyx No.	Scavenging rate/%		Stamen No.	Scavenging rate/%
Y1	98.83	85.12	B1	85.52	65.92	E1	98.30	82.57	R1	89.71	94.19
Y2	100.42	79.40	B2	79.46	57.05	E2	97.60	83.30	R2	87.45	90.35
Y3	99.89	87.74	B3	94.25	76.50	E3	96.41	84.45	R3	84.90	90.66
Y4	99.58	89.29	B4	83.73	69.87	E4	91.52	85.91	R4	84.71	90.66
Y5	99.15	88.10	B5	96.43	85.58	E5	87.03	84.86	R5	87.65	95.85
Y6	96.50	94.64	B6	86.61	73.50	E6	84.33	83.19	R6	88.04	94.50
Y7	72.43	38.21	B7	77.68	48.50	E7	61.88	47.39	R7	76.96	92.22
Y8	99.47	88.10	B8	94.25	78.10	E8	86.43	81.94	R8	80.10	95.12
Y9	99.26	89.29	B9	95.44	81.84	E9	87.03	86.85	R9	89.61	94.40
Y10	99.26	90.00	B10	94.74	75.53	E10	87.62	80.90	R10	80.69	85.37
Y11	91.52	71.07	B11	82.04	66.24	E11	71.46	69.83	R11	85.69	95.54
Y12	79.85	61.07	B12	79.17	65.92	E12	74.15	94.05	R12	88.73	93.88
Average	94.68	80.17	Average	87.44	70.38	Average	85.31	80.44	Average	85.35	92.73

Herb No.	Scavenging rate/%		Petal No.	Scavenging rate/%		Calyx No.	Scavenging rate/%		Stamen No.	Scavenging rate/%
Y1	98.83	85.12	B1	85.52	65.92	E1	98.30	82.57	R1	89.71	94.19
Y2	100.42	79.40	B2	79.46	57.05	E2	97.60	83.30	R2	87.45	90.35
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Y4	99.58	89.29	B4	83.73	69.87	E4	91.52	85.91	R4	84.71	90.66
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No.	Similarity	No.	Similarity	No.	Similarity	No.	Similarity
Y1	0.995	B1	0.998	E1	0.999	R1	0.996
Y2	0.987	B2	0.999	E2	1.000	R2	0.994
Y3	0.984	B3	0.998	E3	0.999	R3	0.988
Y4	0.971	B4	1.000	E4	0.997	R4	0.998
Y5	0.995	B5	1.000	E5	1.000	R5	0.999
Y6	0.914	B6	0.997	E6	0.998	R6	0.986
Y7	0.854	B7	0.834	E7	0.947	R7	0.976
Y8	0.992	B8	1.000	E8	1.000	R8	0.994
Y9	0.980	B9	0.997	E9	0.998	R9	0.995
Y10	0.954	B10	0.996	E10	0.996	R10	0.921
Y11	0.896	B11	0.999	E11	0.997	R11	0.992
Y12	0.734	B12	1.000	E12	0.996	R12	0.998
M1	1.000	M2	1.000	M3	1.000	M4	1.000

No.	Similarity	No.	Similarity	No.	Similarity	No.	Similarity
Y1	0.995	B1	0.998	E1	0.999	R1	0.996
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M1	1.000	M2	1.000	M3	1.000	M4	1.000

Peak number	Herb	Petal	Calyx	Stamen
Protocatechuic acid	0.78	3	0.94	2	0.93	2	0.70	5
Neochlorogenic acid	0.76	4	0.87	6	0.90	4	0.66	7
Mangiferin	0.65	8	0.89	5	0.91	3	0.56	8
Vicenin Ⅱ	0.83	1	0.77	7	0.88	7	0.82	1
Vitexin	0.82	2	0.74	8	0.73	8	0.78	2
Rutin	0.71	5	0.94	3	0.93	1	0.74	4
Isoquercetin	0.71	6	0.96	1	0.89	6	0.75	3
Quercetin	0.66	7	0.89	4	0.89	5	0.68	6

Peak number	Herb	Petal	Calyx	Stamen
Protocatechuic acid	0.78	3	0.94	2	0.93	2	0.70	5
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Peak number	Herb	Petal	Calyx	Stamen
Protocatechuic acid	0.74	3	0.93	3	0.93	2	0.72	5
Neochlorogenic acid	0.70	6	0.88	5	0.91	3	0.67	6
Mangiferin	0.63	8	0.88	6	0.91	4	0.57	8
Vicenin Ⅱ	0.80	1	0.77	7	0.88	7	0.81	1
Vitexin	0.79	2	0.74	8	0.72	8	0.76	3
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Peak number	Herb	Petal	Calyx	Stamen
Protocatechuic acid	0.74	3	0.93	3	0.93	2	0.72	5
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Peak number	Herb	Petal	Calyx	Stamen
Protocatechuic acid	0.401	0.330	-0.548	-0.469	-0.140	-0.175	-0.088	0.153
Neochlorogenic acid	-0.280	-0.309	0.356	0.352	0.259	0.280	-0.348	-0.529
Mangiferin	0.705¹⁾	0.372	0.155	0.148	0.811¹⁾	0.326	0.520	0.284
Vicenin Ⅱ	0.502	0.415	-0.039	-0.047	-0.382	-0.312	0.617²⁾	0.127
Vitexin	0.717³⁾	0.093	-0.626³⁾	-0.536	0.759³⁾	0.285	0.268	-0.219
Rutin	0.628⁴⁾	0.098	0.236	0.120	0.578⁴⁾	0.599⁴⁾	0.341	0.192
Isoquercetin	0.222	0.067	0.401	0.305	0.128	-0.062	0.313	0.164
Quercetin	0.498	-0.126	0.366	0.240	0.309	0.137	0.619⁵⁾	0.128

Peak number	Herb	Petal	Calyx	Stamen
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Neochlorogenic acid	-0.280	-0.309	0.356	0.352	0.259	0.280	-0.348	-0.529
Mangiferin	0.705¹⁾	0.372	0.155	0.148	0.811¹⁾	0.326	0.520	0.284
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Vitexin	0.717³⁾	0.093	-0.626³⁾	-0.536	0.759³⁾	0.285	0.268	-0.219
Rutin	0.628⁴⁾	0.098	0.236	0.120	0.578⁴⁾	0.599⁴⁾	0.341	0.192
Isoquercetin	0.222	0.067	0.401	0.305	0.128	-0.062	0.313	0.164
Quercetin	0.498	-0.126	0.366	0.240	0.309	0.137	0.619⁵⁾	0.128

Category	Scavenging rate of ABTS
Herb	M_herb=0.875+0.116S_mangiferin
Petal	M_petal=0.875+0.125S_mangiferin
Calyx	M_calyx=0.861+0.234S_mangiferin-0.102S_{vicenin Ⅱ}
Stamen	M_stamen=0.933+0.060S_mangiferin

Category	Scavenging rate of ABTS
Herb	M_herb=0.875+0.116S_mangiferin
Petal	M_petal=0.875+0.125S_mangiferin
Calyx	M_calyx=0.861+0.234S_mangiferin-0.102S_{vicenin Ⅱ}
Stamen	M_stamen=0.933+0.060S_mangiferin

Category	Scavenging rate of DPPH
Herb	N_herb=0.304+0.159S_mangiferin+0.363S_{protocatechuic acid}+0.168S_isoquercetin
Petal	N_petal=0.519+0.227S_mangiferin+0.254S_{protocatechuic acid}
Calyx	N_Calyx=0.656+0.181S_Mangiferin+0.363S_{neochlorogenic acid}
Stamen	(The significance of DPPH free radical clearance and the common peak-to peek area of stamen fingerprint did not meet the requirement)

Category	Scavenging rate of DPPH
Herb	N_herb=0.304+0.159S_mangiferin+0.363S_{protocatechuic acid}+0.168S_isoquercetin
Petal	N_petal=0.519+0.227S_mangiferin+0.254S_{protocatechuic acid}
Calyx	N_Calyx=0.656+0.181S_Mangiferin+0.363S_{neochlorogenic acid}
Stamen	(The significance of DPPH free radical clearance and the common peak-to peek area of stamen fingerprint did not meet the requirement)

木棉花不同部位UPLC指纹图谱建立及抗氧化谱效关系研究

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余欣彤 , 曹嵌 , 张兰兰 , 汪凯东 , 陈灶树 , 潘玲 , 张正 ^*

中国药学杂志 | 论著 2024,59(22): 2132-2139

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中国药学杂志 | 论著 2024, 59(22): 2132-2139

木棉花不同部位UPLC指纹图谱建立及抗氧化谱效关系研究

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余欣彤, 曹嵌, 张兰兰, 汪凯东, 陈灶树, 潘玲, 张正^*

作者信息

广东一方制药有限公司, 广东省中药配方颗粒企业重点实验室, 广东佛山 528244

余欣彤,女,本科,初级中药师研究方向:中药制剂工艺研究

通讯作者:

^* 张正,男,硕士,副主任中药师研究方向:中药制剂工艺与质量控制研究 Tel:(0757)85128602

Establishment of UPLC Fingerprint of Different Parts of Gossampim Flos and Study on Spectrum Effect Relationship

Xintong YU, Qian CAO, Lanlan ZHANG, Kaidong WANG, Zaoshu CHEN, Ling PAN, Zheng ZHANG^*

Affiliations

Guangdong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula Granule, Guangdong Yi Fang Pharmaceutical Co., Ltd., Foshan 528244, China

出版时间: 2024-11-22 doi: 10.11669/cpj.2024.22.005

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摘要

收起

目的比较木棉花不同部位水提取物抗氧化活性并建立超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱,研究谱效关系,揭示其抗氧化活性质量标志物。方法以2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)与1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基(DPPH)自由基清除率为指标,采用UPLC法建立12批木棉花不同部位(花瓣、花萼、雄蕊)指纹图谱,进行相似度分析,结合灰色关联度分析(GRA)、斯皮尔曼(Spearman)分析、逐步回归分析、偏最小二乘回归(PLSR)分析对抗氧化谱效关系进行研究。结果 12批木棉花不同部位水提取物指纹图谱共标定并指认8个色谱峰。芒果苷、槲皮苷、芦丁、牡荆苷等化合物为木棉花药材及其不同部位抗氧化活性的主要有效成分。。结论木棉花药材及其不同部位抗氧化活性是多组分共同联合效应的结果,本研究可为木棉花药材及其不同部位抗氧化活性物质基础及质量控制提供参考。

关键词

木棉花 / 抗氧化 / 指纹图谱 / 2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐 / 1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基 / 谱效关系

Abstract

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OBJECTIVE To determine the antioxidant activities of Gossampim Flos waterextracts,establish UPLC fingerprints and study the spectral effect relationship. METHODS Based on the scavenging rates of 2, 2-diazo-di (3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonic acid) diamiammonium salt (ABTS) and 1, 1-diphenyl-2-picrohydrazyl radical (DPPH), the fingerprint of different parts (petal, calyx and stamen) of 12 batches of Gossampim Flos were established by UPLC method, and similarity analysis were carried out. Grey correlation analysis (GRA), Spearman analysis, stepwise regression analysis and partial least squares regression(PLSR) analysis were used to study the relationship between antioxidant spectrum effect. RESULTS Eight chromatographic peaks were identified by fingerprint identification of water extracts from different parts of 12 batches of Gossampim Flos. Mangiferin, quercetin, rutin, vitexin and other compounds were the main active components of Gossampim Flos and its different parts for antioxidant activities. CONCLUSION The antioxidant activity of Gossampim Flos and its different parts are the result of the combined effect of multiple components. This study can provide a comprehensive reference for the basis and quality control of antioxidant active substances of Gossampim Flos and its different parts.

Key words

Gossampim Flos / antioxidant / fingerprint / 2, 2-diazo-di (3-ethyl-benzothiazol-6-sulfonic acid) diamiammonium salt / 1, 1-diphenyl-2-picrohydrazine radical / spectral effect relationship

引用本文

余欣彤, 曹嵌, 张兰兰, 汪凯东, 陈灶树, 潘玲, 张正. 木棉花不同部位UPLC指纹图谱建立及抗氧化谱效关系研究. 中国药学杂志, 2024 , 59 (22) : 2132 -2139 . DOI: 10.11669/cpj.2024.22.005

Xintong YU, Qian CAO, Lanlan ZHANG, Kaidong WANG, Zaoshu CHEN, Ling PAN, Zheng ZHANG. Establishment of UPLC Fingerprint of Different Parts of Gossampim Flos and Study on Spectrum Effect Relationship[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (22) : 2132 -2139 . DOI: 10.11669/cpj.2024.22.005

正文

收起

木棉花为木棉科植物木棉[Gossampinus malabarica (DC.) Merr.]的干燥花,是常用的药食同源中药之一,具有清热、利湿、解毒、止血、祛风的功效^[1]。研究表明,木棉花的化学成分主要包括黄酮类、苯丙素类及酚酸类等成分,具有显著的抗氧化、抗菌抗炎、抗癌、保肝、心脏保护等作用^[2]。目前木棉花的抗氧化研究仅限于黄酮类成分的提取工艺及木棉花不同部位(花和树皮)总黄酮抗氧化性研究,未见木棉花及其不同部位(花瓣、花萼、雄蕊)的抗氧化谱效关系研究^[3]。

氧化反应是诱导癌症、衰老等多种疾病的主要起因,黄酮类化合物作为一类良好的天然抗氧化剂,可有效克服自由基对机体细胞的氧化攻击^[4]。目前可通过体外测定自由基清除率评价抗氧化活性,根据褪色程度与其被清除程度(即吸光度的改变)成定量关系,从而进行抗氧化活性的评价。2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)在氧化剂的作用下氧化成绿色的阳离子自由基,加入抗氧剂后会抑制其生成,溶液颜色变浅^[5]。1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基(DPPH)是一种稳定的氮中心自由基,当自由基与抗氧剂提供的电子配对结合,可使DPPH试剂的特征紫红色消失^[6]。由于指纹图谱所体现的化学成分并不全是活性成分,基于前期研究成果^[7],建立木棉花及其不同部位超高效液相色谱(UPLC)指纹图谱,并将指纹图谱与清除ABTS自由基和DPPH自由基的活性相联系,采用灰色关联度分析、斯皮尔曼分析、逐步回归分析、偏最小二乘回归分析,整合分析共有峰与其抗氧化活性的相关性,构建谱效关系,旨在筛选木棉花不同部位抗氧化能力的物质基础,为建立与抗氧化活性结合的质量控制提供依据。

1 材料

收起

1.1 仪器

Agilent 1290型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);UV-2600i型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);Milli-Q Direct型超纯水系统(德国Merck公司);XP26型百万分之一天平、ME204E型万分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司);TC-15套式恒温器(海宁市新华医疗器械厂);111B型二两装高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司)。

1.2 试剂与药物

原儿茶酸(批号:110809-201906,纯度为97.7%)、芒果苷(批号:1111607-201704,纯度为98.1%)、牡荆苷(批号:111687-201704,纯度为94.9%)、芦丁(批号:100080-20201,纯度为92.2%)、槲皮苷(批号:111538-202007,纯度为93.5%)、异槲皮苷(批号:111809-201804,纯度为97.2%)(中国食品药品检定研究院);新绿原酸(批号:wkq19021413,纯度为99.9%)、维采宁Ⅱ(批号:wkq0001217,纯度为≥98%)(四川省维克奇生物科技有限公司);DPPH、ABTS自由基清除能力试剂盒(苏州格锐思生物科技有限公司);其他试剂均为分析纯,水为超纯水。12批木棉花来自4个不同产地,经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定为木棉科植物木棉[Gossampinus malabarica (DC.) Merr.],符合《中国药典》2020年版一部木棉花项下要求,信息见表1。将12批木棉花药材的花瓣、花萼、雄蕊分离,得木棉花花瓣(编号:B1~B12)、花萼(编号:E1~E12)、雄蕊(编号:R1~R12)。

2 方法与结果

收起

2.1 木棉花水提取物抗氧化活性的测定

2.1.1 工作液的制备

分别取ABTS储备液和K₂S₂O₈储备液各1 mL置50 mL棕色量瓶中,混合均匀,避光放置12 h,得ABTS基液,临用前用无水乙醇稀释至刻度,得ABTS工作液。称取DPPH约2 mg,精密称定,置50 mL棕色量瓶中,加无水乙醇溶解并定容至刻度,得DPPH工作液。

2.1.2 对照溶液的制备

称取Vc对照品适量,精密称定,置100 mL量瓶中,加体积分数70%乙醇溶解并定容至刻度,制成质量浓度为0.301 mg·mL^-1的Vc储备液。精密吸取Vc储备液适量,用体积分数70%乙醇稀释成质量浓度分别为0.024、0.060、0.096、0.120、0.180、0.240、0.300 mg·mL^-1的Vc对照溶液。

2.1.3 ABTS自由基清除率的测定

测定管:50 μL各部位供试品溶液+950 μL ABTS工作液;对照管:50 μL各部位供试品溶液+950 μL无水乙醇;空白管:50 μL无水乙醇+950 μL ABTS工作液。将上述样品混匀,室温(25 ℃)避光静置6 min,于734 nm波长处测定吸光度,分别记为A_测定、A_对照和A_空白。ABTS自由基清除率按公式1计算:

公式(1)ABTS自由基清除率(%)=(A_空白-A_测定-A_对照)/A_空白×100%^[8]

2.1.4 DPPH自由基清除率的测定

测定管:400 μL各部位供试品溶液+600 μL DPPH工作液;对照管:400 μL各部位供试品溶液+600 μL体积分数80%甲醇;空白管:400 μL体积分数80%甲醇+600 μL DPPH工作液。将上述样品混匀,室温(25 ℃)避光静置30 min,12 000 r·min^-1离心5 min,于517 nm波长处测定吸光度,分别记为A_测定、A_对照和A_空白。DPPH自由基清除率按公式2计算:

公式(2)DPPH自由基清除率(%)=(A_空白-A_测定-A_对照)/A_空白×100%^[8]

2.2 12批木棉花及其不同部位抗氧化活性的测定

按“2.1”项下方法对12批木棉花药材及其不同部位的水提取物进行ABTS、DPPH清除能力的测定,结果见表2;采用GraphPad Prism 8.0软件对表2进行单因素方差分析,结果见图1。木棉花药材及不同部位清除ABTS自由基的能力强弱依次为药材>花瓣>花萼≈雄蕊,与药材相比,花萼与雄蕊具有显著性差异(P<0.05)。清除DPPH自由基能力强弱依次为雄蕊>药材≈花萼>花瓣,与雄蕊相比,花瓣具有极显著差异(P<0.01),药材具有显著性差异(P<0.05)。

2.3 UPLC指纹图谱的建立^[7-10]

2.3.1 色谱条件

色谱柱为ACQUITY HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸(B),梯度洗脱(0~5 min,5%→10%A;5~7 min,10%→13%A;7~9 min,13%A;9~15 min,13%→22%A;15~20 min,22%A;20~30 min,22%→5%A);检测波长为257 nm;流速为0.3 mL·min^-1;柱温为30 ℃;进样量为1 μL。

2.3.2 对照品溶液的制备

分别取原儿茶酸、新绿原酸、芒果苷、维采宁Ⅱ、牡荆苷、芦丁、异槲皮苷、槲皮苷对照品适量,精密称定,加体积分数50%甲醇制成质量浓度分别为0.107、0.050、0.077、0.043、0.026、0.038、0.040、0.114 mg·mL^-1的混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备

取不同批次木棉花药材及其不同部位(过三号筛)约1 g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加水50 mL,称定质量,加热回流30 min,放冷,再称定质量,用水补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验

取同一木棉花药材(Y1)供试品溶液,按“2.3.1”项下色谱条件连续进样6次,以3号芒果苷色谱峰为参照峰(S),计算得共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.17%~0.53%和1.50%~1.87%,表明该方法精密度良好。

2.4.2 重复性实验

精密称取同一木棉花药材(Y1),按“2.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液,按“2.3.1”项下色谱条件进样测定,以3号芒果苷色谱峰为参照峰(S),计算得共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.88%~1.05%和1.01%~2.66%,表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性实验

取同一木棉花药材(Y1)供试品溶液,分别于制备后0、2、4、6、8、12、24 h,按“2.3.1”项下色谱条件进样测定,以3号芒果苷色谱峰为参照峰(S),计算得共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD范围分别为0.81%~1.27%和2.07%~3.45%,表明供试品溶液在24 h内具有较好的稳定性。

2.4.4 指纹图谱的建立及相似度评价

将12批木棉花药材及其不同部位按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液,按“2.3.1”项下色谱条件进样测定,记录其色谱图,导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》,进行多点校正、自动匹配,中位数法生成叠加指纹图谱及对照指纹图谱,见图2~3。与对照品进行比对,指认出1号峰为原儿茶酸,2号峰为新绿原酸,3号峰为芒果苷,4号峰为维采宁Ⅱ,5号峰为牡荆苷,6号峰为芦丁,7号峰为异槲皮苷,8号峰为槲皮苷。其中部分批次花瓣部位丢失4号及5号峰,雄蕊部位丢失5号及7号峰。以不同部位的对照指纹图谱为参照图谱,相似度分析结果见表3。12批木棉花药材相似度为0.734~0.995,花瓣相似度为0.834~1.000,花萼相似度为0.947~1.000,雄蕊相似度为0.921~0.999,表明不同批次木棉花及其不同部位的化学成分相似,质量较为稳定。

2.5 谱效关系研究

2.5.1 灰色关联度分析

灰色关联度分析中主要包括定义参考序列和比较序列,归一化处理原始数据,计算关联系数和灰色关联度,根据各因素之间关联的大小进行排序分析,从而确定各共有峰对药效贡献的大小^[11-12]。本实验中将木棉花抗氧化活性作为母序列,指纹图谱共有峰峰面积作为子序列,采用均值法对数据进行归一化处理,计算其关联度,得到各共有峰对抗氧化活性的贡献高低,结果见表4~5。关联度值越大,表明该化学成分与抗氧化活性之间的关联越大,反之则表示关联越小。木棉花药材及其不同部位的抗氧化活性存在一定差异,抗氧化能力贡献最大的色谱峰分别为:维采宁Ⅱ(药材)、异槲皮苷(花瓣)、芦丁(花萼)、维采宁Ⅱ(雄蕊),故可初步将这些化合物作为其抗氧化指纹图谱药效控制点。

2.5.2 斯皮尔曼分析

采用SPSS 26.0软件,经正态性检验,本实验中数据为非正态分布,故对抗氧化活性指标与12批木棉药材及其不同部位的色谱峰进行斯皮尔曼分析,结果见表6;采用Origin 2018软件并绘制可视化热图,见图4。在ABTS自由基清除率分析中,芦丁与木棉花药材及花萼呈显著正相关(P<0.05),芒果苷、牡荆苷与木棉花药材及花萼呈极显著正相关(P<0.01),牡荆苷与花瓣呈显著负相关(P<0.05),维采宁Ⅱ、槲皮苷与雄蕊呈显著正相关(P<0.05)。

2.5.3 逐步回归分析

以ABTS自由基清除率(M)、DPPH自由基清除率(N)和色谱峰面积(S)为因变量和自变量,采用SPSS 26.0软件进行逐步回归分析^[13],得到回归模型,见表7~8。回归模型均具有极显著差异(P<0.05),表明木棉花药材及其不同部位的指纹图谱峰与其抗氧化活性之间存在显著的线性关系,可用其指纹图谱色谱峰峰面积预测ABTS自由基清除率和DPPH自由基清除率。

2.5.4 偏最小二乘回归分析

分别以12批木棉花及其不同部位的ABTS自由基清除率、DPPH自由基清除率作为因变量,指纹图谱共有峰峰面积作为自变量,采用SMICA-P 14.0软件进行偏最小二乘法分析,得到自由基清除率与共有峰峰面积的标准化回归系数和变量投影重要性系数,见图5~6。回归系数的正负表示自变量与因变量具有正相关或负相关关系,而变量重要性投影值(VIP)值表示自变量对因变量贡献的大小,当VIP>1表明该自变量对因变量的解释能力越强,对模型具有显著的贡献^[14-15]。由VIP值结果可知,以ABTS或DPPH自由基清除率为指标时,芒果苷、槲皮苷、芦丁、牡荆苷为药材主要药效峰,维采宁Ⅱ、牡荆苷为花瓣主要药效峰,芒果苷、牡荆苷、槲皮苷为花萼主要药效峰;以ABTS自由基清除率为指标时,芒果苷、维采宁Ⅱ、牡荆苷、芦丁、槲皮苷为雄蕊主要药效峰;以DPPH自由基清除率为指标时,原儿茶酸、新绿原酸、芒果苷、槲皮苷为雄蕊主要药效峰。由标准化回归系数结果可知,与木棉花药材及花瓣ABTS或DPPH自由基清除率呈负相关(回归系数<0)的色谱峰分别为新绿原酸、原儿茶酸、维采宁Ⅱ、牡荆苷;与花萼ABTS自由基清除率呈负相关(回归系数<0)的色谱峰分别为原儿茶酸、维采宁Ⅱ;与雄蕊ABTS或DPPH自由基清除率呈负相关(回归系数<0)的色谱峰分别为新绿原酸、牡荆苷、芦丁、异槲皮苷。

3 讨论

收起

中药具有多成分、多靶点等特性,在疾病治疗过程中,其功效主要取决于多种成分的共同作用^[16]。为阐明中药质量与其疗效的关系,本实验建立了木棉花UPLC指纹图谱。基于前期研究成果^[5],对指纹图谱的色谱条件进行优化,同时优化供试品溶液的制备方法,考察提取方式(回流、超声)、提取时间(30、60 min)对提取效果的影响。结果显示,超声提取时部分活性成分未能彻底提取出来,提取30 min的提取效果与提取60 min的无明显差异,故本实验采用“2.3.3”项下供试品溶液制备方法。

本实验对12批木棉花药材及其不同部位水提取物的抗氧化活性进行测定,结果显示,清除ABTS、DPPH自由基能力强弱分别为药材>花瓣>花萼≈雄蕊、雄蕊>药材≈花萼>花瓣。近年来,谱效学成为一个研究热点,其将中药指纹图谱与药效学相结合,探讨中药成分含量与药效的相关性,对木棉花药材的有效开发和利用具有一定的参考意义。灰色关联度分析结果显示,抗氧化能力贡献最大的色谱峰分别为:维采宁Ⅱ(药材)、异槲皮苷(花瓣)、芦丁(花萼)、维采宁Ⅱ(雄蕊)。但关联度值均为正值,只能反映与药效相关性的大小,无法分析与药效呈负相关的成分,同时无法显示各成分的显著性^[17]。斯皮尔曼分析与逐步回归分析结果显示,木棉花药材及其不同部位的指纹图谱色谱峰(芦丁、牡荆苷、芒果苷等)与其抗氧化活性之间存在显著的线性关系(P<0.05)。偏最小二乘回归分析结果显示,芒果苷、槲皮苷、芦丁、牡荆苷等化合物为木棉花药材及其不同部位抗氧化活性的主要有效成分。联合上述几种分析,每种方法得到的相关性结果并不完全一致,但每种方法之间相互补充相互验证,综合3种方法可知,木棉花及其不用部位的抗氧化作用是多组分共同发挥作用的结果^[9]。

基金

收起

中华人民共和国工信部2022年产业技术基础公共服务平台项目(2022-230-221)
佛山市南海区重点领域科技攻关专项资助(南科﹝2023﹞20号-18)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

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2024年第59卷第22期

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172

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doi: 10.11669/cpj.2024.22.005

接收时间：2024-05-09
首发时间：2025-11-16
出版时间：2024-11-22

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收稿日期：2024-05-09

基金

中华人民共和国工信部2022年产业技术基础公共服务平台项目(2022-230-221)

佛山市南海区重点领域科技攻关专项资助(南科﹝2023﹞20号-18)

作者信息

广东一方制药有限公司, 广东省中药配方颗粒企业重点实验室, 广东佛山 528244

通讯作者:

^* 张正,男,硕士,副主任中药师研究方向:中药制剂工艺与质量控制研究 Tel:(0757)85128602

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

No.	Place of China(in Chinese)	No.	Place of China(in Chinese)
Y1	Yunnan Yuxi(云南玉溪)	Y7	Guangdong Guangzhou(广东广州)
Y2	Yunnan Yuxi(云南玉溪)	Y8	Hainan Ledong(海南乐东)
Y3	Yunnan Yuxi(云南玉溪)	Y9	Guangdong Guangzhou(广东广州)
Y4	Guangxi Nanning(广西南宁)	Y10	Yunnan Chuxiong(云南楚雄)
Y5	Yunnan Kunming(云南昆明)	Y11	Yunnan Chuxiong(云南楚雄)
Y6	Guangdong Guangzhou(广东广州)	Y12	Guangdong Guangzhou(广东广州)

No.

Place of China(in Chinese)

No.

Place of China(in Chinese)

Yunnan Yuxi(云南玉溪)

Guangdong Guangzhou(广东广州)

Yunnan Yuxi(云南玉溪)

Hainan Ledong(海南乐东)

Yunnan Yuxi(云南玉溪)

Guangdong Guangzhou(广东广州)

Guangxi Nanning(广西南宁)

Y10

Yunnan Chuxiong(云南楚雄)

Yunnan Kunming(云南昆明)

Y11

Yunnan Chuxiong(云南楚雄)

Guangdong Guangzhou(广东广州)

Y12

Guangdong Guangzhou(广东广州)

Herb No.	Scavenging rate/%		Petal No.	Scavenging rate/%		Calyx No.	Scavenging rate/%		Stamen No.	Scavenging rate/%
Y1	98.83	85.12	B1	85.52	65.92	E1	98.30	82.57	R1	89.71	94.19
Y2	100.42	79.40	B2	79.46	57.05	E2	97.60	83.30	R2	87.45	90.35
Y3	99.89	87.74	B3	94.25	76.50	E3	96.41	84.45	R3	84.90	90.66
Y4	99.58	89.29	B4	83.73	69.87	E4	91.52	85.91	R4	84.71	90.66
Y5	99.15	88.10	B5	96.43	85.58	E5	87.03	84.86	R5	87.65	95.85
Y6	96.50	94.64	B6	86.61	73.50	E6	84.33	83.19	R6	88.04	94.50
Y7	72.43	38.21	B7	77.68	48.50	E7	61.88	47.39	R7	76.96	92.22
Y8	99.47	88.10	B8	94.25	78.10	E8	86.43	81.94	R8	80.10	95.12
Y9	99.26	89.29	B9	95.44	81.84	E9	87.03	86.85	R9	89.61	94.40
Y10	99.26	90.00	B10	94.74	75.53	E10	87.62	80.90	R10	80.69	85.37
Y11	91.52	71.07	B11	82.04	66.24	E11	71.46	69.83	R11	85.69	95.54
Y12	79.85	61.07	B12	79.17	65.92	E12	74.15	94.05	R12	88.73	93.88
Average	94.68	80.17	Average	87.44	70.38	Average	85.31	80.44	Average	85.35	92.73

Herb
No.

Scavenging rate/%

Petal
No.

Scavenging rate/%

Calyx
No.

Scavenging rate/%

Stamen
No.

Scavenging rate/%

ABTS

DPPH

ABTS

DPPH

ABTS

DPPH

ABTS

DPPH

98.83

85.12

85.52

65.92

98.30

82.57

89.71

94.19

100.42

79.40

79.46

57.05

97.60

83.30

87.45

90.35

99.89

87.74

94.25

76.50

96.41

84.45

84.90

90.66

99.58

89.29

83.73

69.87

91.52

85.91

84.71

90.66

99.15

88.10

96.43

85.58

87.03

84.86

87.65

95.85

96.50

94.64

86.61

73.50

84.33

83.19

88.04

94.50

72.43

38.21

77.68

48.50

61.88

47.39

76.96

92.22

99.47

88.10

94.25

78.10

86.43

81.94

80.10

95.12

99.26

89.29

95.44

81.84

87.03

86.85

89.61

94.40

Y10

99.26

90.00

B10

94.74

75.53

E10

87.62

80.90

R10

80.69

85.37

Y11

91.52

71.07

B11

82.04

66.24

E11

71.46

69.83

R11

85.69

95.54

Y12

79.85

61.07

B12

79.17

65.92

E12

74.15

94.05

R12

88.73

93.88

Average

94.68

80.17

Average

87.44

70.38

Average

85.31

80.44

Average

85.35

92.73

No.	Similarity	No.	Similarity	No.	Similarity	No.	Similarity
Y1	0.995	B1	0.998	E1	0.999	R1	0.996
Y2	0.987	B2	0.999	E2	1.000	R2	0.994
Y3	0.984	B3	0.998	E3	0.999	R3	0.988
Y4	0.971	B4	1.000	E4	0.997	R4	0.998
Y5	0.995	B5	1.000	E5	1.000	R5	0.999
Y6	0.914	B6	0.997	E6	0.998	R6	0.986
Y7	0.854	B7	0.834	E7	0.947	R7	0.976
Y8	0.992	B8	1.000	E8	1.000	R8	0.994
Y9	0.980	B9	0.997	E9	0.998	R9	0.995
Y10	0.954	B10	0.996	E10	0.996	R10	0.921
Y11	0.896	B11	0.999	E11	0.997	R11	0.992
Y12	0.734	B12	1.000	E12	0.996	R12	0.998
M1	1.000	M2	1.000	M3	1.000	M4	1.000

No.

Similarity

No.

Similarity

No.

Similarity

No.

Similarity

0.995

0.998

0.999

0.996

0.987

0.999

1.000

0.994

0.984

0.998

0.999

0.988

0.971

1.000

0.997

0.998

0.995

1.000

0.999

0.914

0.997

0.998

0.986

0.854

0.834

0.947

0.976

0.992

1.000

0.994

0.980

0.997

0.998

0.995

Y10

0.954

B10

0.996

E10

0.996

R10

0.921

Y11

0.896

B11

0.999

E11

0.997

R11

0.992

Y12

0.734

B12

1.000

E12

0.996

R12

0.998

1.000

Peak number	Herb	Petal	Calyx	Stamen
Protocatechuic acid	0.78	3	0.94	2	0.93	2	0.70	5
Neochlorogenic acid	0.76	4	0.87	6	0.90	4	0.66	7
Mangiferin	0.65	8	0.89	5	0.91	3	0.56	8
Vicenin Ⅱ	0.83	1	0.77	7	0.88	7	0.82	1
Vitexin	0.82	2	0.74	8	0.73	8	0.78	2
Rutin	0.71	5	0.94	3	0.93	1	0.74	4
Isoquercetin	0.71	6	0.96	1	0.89	6	0.75	3
Quercetin	0.66	7	0.89	4	0.89	5	0.68	6

Peak
number

Herb

Petal

Calyx

Stamen

Relevancy

Ranking

Relevancy

Ranking

Relevancy

Ranking

Relevancy

Ranking

Protocatechuic acid

0.78

0.94

0.93

0.70

Neochlorogenic acid

0.76

0.87

0.90

0.66

Mangiferin

0.65

0.89

0.91

0.56

Vicenin Ⅱ

0.83

0.77

0.88

0.82

Vitexin

0.82

0.74

0.73

0.78

Rutin

0.71

0.94

0.93

0.74

Isoquercetin

0.71

0.96

0.89

0.75

Quercetin

0.66

0.89

0.68

Peak number	Herb	Petal	Calyx	Stamen
Protocatechuic acid	0.74	3	0.93	3	0.93	2	0.72	5
Neochlorogenic acid	0.70	6	0.88	5	0.91	3	0.67	6
Mangiferin	0.63	8	0.88	6	0.91	4	0.57	8
Vicenin Ⅱ	0.80	1	0.77	7	0.88	7	0.81	1
Vitexin	0.79	2	0.74	8	0.72	8	0.76	3
Rutin	0.73	4	0.93	2	0.94	1	0.74	4
Isoquercetin	0.71	5	0.96	1	0.89	5	0.76	2
Quercetin	0.64	7	0.89	4	0.89	6	0.67	7

Peak
number

Herb

Petal

Calyx

Stamen

Relevancy

Ranking

Relevancy

Ranking

Relevancy

Ranking

Relevancy

Ranking

Protocatechuic acid

0.74

0.93

0.72

Neochlorogenic acid

0.70

0.88

0.91

0.67

Mangiferin

0.63

0.88

0.91

0.57

Vicenin Ⅱ

0.80

0.77

0.88

0.81

Vitexin

0.79

0.74

0.72

0.76

Rutin

0.73

0.93

0.94

0.74

Isoquercetin

0.71

0.96

0.89

0.76

Quercetin

0.64

0.89

0.67

Peak number	Herb	Petal	Calyx	Stamen
Protocatechuic acid	0.401	0.330	-0.548	-0.469	-0.140	-0.175	-0.088	0.153
Neochlorogenic acid	-0.280	-0.309	0.356	0.352	0.259	0.280	-0.348	-0.529
Mangiferin	0.705¹⁾	0.372	0.155	0.148	0.811¹⁾	0.326	0.520	0.284
Vicenin Ⅱ	0.502	0.415	-0.039	-0.047	-0.382	-0.312	0.617²⁾	0.127
Vitexin	0.717³⁾	0.093	-0.626³⁾	-0.536	0.759³⁾	0.285	0.268	-0.219
Rutin	0.628⁴⁾	0.098	0.236	0.120	0.578⁴⁾	0.599⁴⁾	0.341	0.192
Isoquercetin	0.222	0.067	0.401	0.305	0.128	-0.062	0.313	0.164
Quercetin	0.498	-0.126	0.366	0.240	0.309	0.137	0.619⁵⁾	0.128

Peak
number

Herb

Petal

Calyx

Stamen

ABTS

DPPH

ABTS

DPPH

ABTS

DPPH

ABTS

DPPH

Protocatechuic acid

0.401

0.330

-0.548

-0.469

-0.140

-0.175

-0.088

0.153

Neochlorogenic acid

-0.280

-0.309

0.356

0.352

0.259

0.280

-0.348

-0.529

Mangiferin

0.705¹⁾

0.372

0.155

0.148

0.811¹⁾

0.326

0.520

0.284

Vicenin Ⅱ

0.502

0.415

-0.039

-0.047

-0.382

-0.312

0.617²⁾

0.127

Vitexin

0.717³⁾

0.093

-0.626³⁾

-0.536

0.759³⁾

0.285

0.268

-0.219

Rutin

0.628⁴⁾

0.098

0.236

0.120

0.578⁴⁾

0.599⁴⁾

0.341

0.192

Isoquercetin

0.222

0.067

0.401

0.305

0.128

-0.062

0.313

0.164

Quercetin

0.498

-0.126

0.366

0.240

0.309

0.137

0.619⁵⁾

0.128