中国药学杂志

Antibodies	IC₅₀/ng·mL^-1	Activity /%
9MW3311-S1	26.73	29.44	91
9MW3311-S2	27.73	29.69	93
9MW3311-S3	28.80	26.67	108

Antibodies	IC₅₀/ng·mL^-1	Activity /%
9MW3311-S1	26.73	29.44	91
9MW3311-S2	27.73	29.69	93
9MW3311-S3	28.80	26.67	108

Antibodies	KD/mol·L^-1
9MW3311-Ref	7.297×10^-7	1.128×10^-4	1.154×10^-4	3.889×10^-5
9MW3311-S1	6.214×10^-7	1.507×10^-4	2.450×10^-4	4.268×10^-5
9MW3311-S2	9.339×10^-7	1.405×10^-4	1.138×10^-4	3.397×10^-5
9MW3311-S3	7.719×10^-7	1.383×10^-4	1.596×10^-4	3.520×10^-5

Antibodies	KD/mol·L^-1
9MW3311-Ref	7.297×10^-7	1.128×10^-4	1.154×10^-4	3.889×10^-5
9MW3311-S1	6.214×10^-7	1.507×10^-4	2.450×10^-4	4.268×10^-5
9MW3311-S2	9.339×10^-7	1.405×10^-4	1.138×10^-4	3.397×10^-5
9MW3311-S3	7.719×10^-7	1.383×10^-4	1.596×10^-4	3.520×10^-5

Antigen	Antibodies	KD/mol·L^-1
	9MW3311-Ref	1.241×10^-6
FcRn	9MW3311-S1	1.152×10^-6
	9MW3311-S2	1.277×10^-6
	9MW3311-S3	1.338×10^-6

Antigen	Antibodies	KD/mol·L^-1
	9MW3311-Ref	1.241×10^-6
FcRn	9MW3311-S1	1.152×10^-6
	9MW3311-S2	1.277×10^-6
	9MW3311-S3	1.338×10^-6

新型冠状病毒中和抗体生物学活性的测定

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俞小娟 ¹ , 王安 ² , 陈奔 ² , 蒋雯 ² , 李纲 ² , 王荣娟 ² , 张姣 ² , 王文波 ¹ , 段茂芹 ¹ , 于传飞 ¹^,^* , 王兰 ¹^,^*

中国药学杂志 | 论著 2024,59(4): 353-362

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中国药学杂志 | 论著 2024, 59(4): 353-362

新型冠状病毒中和抗体生物学活性的测定

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俞小娟¹, 王安², 陈奔², 蒋雯², 李纲², 王荣娟², 张姣², 王文波¹, 段茂芹¹, 于传飞¹^,^*, 王兰¹^,^*

作者信息

¹ 中国食品药品检定研究院,国家卫生健康委员会生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室, 国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室, 北京 102629

² 迈威(上海)生物科技股份有限公司, 上海 201210

俞小娟,女,博士,副研究员,研究方向:治疗型生物制品的质量控制;

王安,女,硕士研究生研究方向:单抗研发及质量控制。

通讯作者:

*于传飞,男,博士,研究员研究方向:治疗型生物制品的质量控制 Tel:(010)53852159;

王兰,女,博士,研究员研究方向:治疗型生物制品的质量控制 Tel:(010)53852159

Assay of Biological Activity of anti-SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies

YU Xiaojuan¹, WANG An², CHEN Ben², JIANG Wen², LI Gang², WANG Rongjuan², ZHANG Jiao², WANG Wenbo¹, DUAN Maoqin¹, YU Chuanfei¹^,^*, WANG Lan¹^,^*

Affiliations

¹ NHC Key Laboratory of Research on Quality and Standardization of Biotech Products, NMPA Key Laboratory for Quality Research and Evaluation of Biological Products,National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629, China

² Mabwell (Shanghai) Bioscience Co., Ltd., Shanghai 201210, China

出版时间: 2024-02-22 doi: 10.11669/cpj.2024.04.009

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摘要

收起

目的开发针对新型冠状病毒中和抗体生物学活性及免疫学特性分析的方法。方法使用生物膜层干涉法(biolayer interferometry,BLI)分析9MW3311中和抗体Fab和S1-RBD的亲和力常数;分别使用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)和流式细胞分选法评价中和抗体结合片段(antibody binding fragment,Fab端)和S蛋白的相对结合活性和对ACE2的阻断结合活性;使用假病毒体系评价中和抗体的体外细胞学活性;使用表面等离子共振法(surface plasmon resonance,SPR)测定抗体Fc段与Fcγ和FcRn受体的亲和力常数;使用ELISA法测定抗体Fc段和C1q受体的结合活性;采用PBMC法确定中和抗体的体依赖细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、补体(First subcomponent of the C1 complex)介导的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity,CDC);使用假病毒系统评价中和抗体的依赖性感染增强作用(antibody-dependent enhancement,ADE)效应。结果 3批9MW3311中和抗体和参比品与S1-RBD的亲和力常数KD(mol·L^-1)值分别为1.15×10^-9,1.01×10^-9,1.15×10^-9和9.45×10^-10;ELISA和FACS分别测得3批中和抗体相对参比品的结合活性为101%、96%、100%及98%、113%、108%;ELISA和FACS分别测得3批中和抗体相对参比品对ACE2的阻断活性为100%、95%、91%及94%、101%、94%;3批中和抗体相对参比品对假病毒的中和活性分别91%、93%、108%;3批9MW3311中和抗体和参比品分别与FcγR和FcRn均有同等水平的亲和力;9MW3311无ADCC和CDC活性;LALA突变的中和抗体可有效避免ADE效应。结论初步建立了新型冠状病毒中和抗体生物学活性及免疫学特性分析的方法,可用于该类型制品的常规质量控制和放行。

关键词

新型冠状病毒 / 中和抗体 / 生物学活性 / 免疫学特性

Abstract

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OBJECTIVE To develop the methods for biological activity assay and immunological characteristics analysis of anti-SARS-CoV-2 neutralizing antibodies. METHODS The binding affinity of 9MW3311 Fab and S1-RBD were analyzed by biolayer interferometry. Enzyme linked immunosorbent assay (ELSA) and fluorescence activated cell sorter (FACS) were used to evaluate the relative binding activity to S protein and blocking activity to angiotensin converting enzyme 2(ACE2) of 9MW3311 antigenbinding fragments (Fab). In vitro cytological activity of neutralizing antibody was evaluated by pseudovirus system. The binding affinities of neutralizing antibody Fc with Fc receptor (Fcγ) and Fc receptor neonatal (FcRn) receptor were determined by surface plasmon resonance (SPR). The binding activity of Fc and complement component 1 (C1q) receptor was determined by ELISA. The antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(ADCC) and complement dependent cytotoxicity(CDC) of neutralizing antibodies were determined by peripheral blood mononuclear cell (PBMC) method. The antibody-dependent enhancement (ADE) effect was evaluated using pseudovirus system. RESULTS The affinity constants (KD) of 9MW3311 and reference to S1-RBD were 1.15×10^-9, 1.01×10^-9, 1.15×10^-9 and 9.45×10^-10, respectively. ELISA and FACS showed that the binding activities of neutralizing antibodies were 101%, 96%, 100% and 98%, 113%, 108%, respectively. ELISA and FACS showed that the blocking activities of neutralizing antibodies against ACE2 were 100%, 95%, 91% and 94%, 101%, 94%, respectively. The neutralizing activities of the three batches of neutralizing antibodies against pseudovirus were 91%, 93% and 108%, respectively. The three batches of 9MW3311 and reference showed the same affinity constants (KD) with Fcγ and FcRn. 9MW3311 showed no ADCC and CDC activity. L234A/L235A (LALA) mutant of 9MW3311 could effectively avoid ADE effect. CONCLUSION The methods for analysis of the biological activity and immunological characteristics of anti-SARS-CoV-2 neutralizing antibodies are preliminarily established and can be used for routine quality control and release.

Key words

COVID-19 / neutralizing antibody / biological activity / immunological characteristic

引用本文

俞小娟, 王安, 陈奔, 蒋雯, 李纲, 王荣娟, 张姣, 王文波, 段茂芹, 于传飞, 王兰. 新型冠状病毒中和抗体生物学活性的测定. 中国药学杂志, 2024 , 59 (4) : 353 -362 . DOI: 10.11669/cpj.2024.04.009

YU Xiaojuan, WANG An, CHEN Ben, JIANG Wen, LI Gang, WANG Rongjuan, ZHANG Jiao, WANG Wenbo, DUAN Maoqin, YU Chuanfei, WANG Lan. Assay of Biological Activity of anti-SARS-CoV-2 Neutralizing Antibodies[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (4) : 353 -362 . DOI: 10.11669/cpj.2024.04.009

正文

收起

新型冠状病毒感染(corona virus disease 2019,COVID-19)是由新型冠状病毒SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus-2)引起的全球暴发性传染病^[1],严重危害人类的生命安全,对世界上多数国家的经济造成了破坏性影响。虽然全球的疫苗接种剂次已达77亿^[2],但并未能阻止病毒的感染和传播。目前的药物治疗主要是对症治疗,包括抗病毒治疗、免疫治疗及中药治疗等,虽然能够改善症状甚至治愈出院,但并无法彻底清除病毒,仍未有特效药批准上市,因此亟需针对该病毒的特效药来阻止这场让全人类陷入困境的恶性病毒^[3]。

SARS-CoV-2通过表面刺突蛋白(spike, S)N端S1亚基上的受体结合区域(receptor binding domain,RBD)与受体血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme2,ACE2)结合,并入侵宿主细胞,从而感染人体^[4-6],因此S蛋白是诸多小分子药物、中和抗体药物^[7-9]重要的开发靶点。以S蛋白为靶点的新型冠状病毒中和抗体可通过两种机制直接或间接的对抗病毒感染,直接机制即抗体Fab端的功能,通过Fab可变区与S蛋白的结合,竞争性抑制S蛋白与受体ACE2的结合,从而阻止病毒对宿主细胞的感染;间接机制依赖于抗体的Fc端,发挥功能需要中和抗体Fc端与人体免疫系统的成分相结合,如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)、补体C1q(first subcomponent of the C1 complex)介导相关的细胞毒性作用(complement dependent cytotoxicity,CDC)等^[10]。因此,中和抗体的活性评价包含与Fab段功能相关的结合活性、对受体ACE2的阻断活性、细胞学活性以及与Fc段功能相关的ADCC活性和CDC活性等。

中和抗体Fc段与新生儿受体(neonatal Fc receptor, FcRn)的相互作用与血清中抗体的半衰期密切相关^[11]。此外,抗体依赖性感染增强作用(antibody-dependent enhancement, ADE)最早在登革热和黄热病毒中被发现,在急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndromes coronavirus, SARS-CoV)和中东呼吸综合征(middle east respiratory syndrome coronavirus, MERS-CoV)两种冠状病毒中同样存在,指抗体与病毒结合后,增强病毒感染的过程,因此在新型冠状病毒的疫苗开发和抗体药物的开发时,同样需要考虑半衰期和ADE效应^[12],研究表明,在抗体的Fc段引入LALA突变,即将Fc重链242位和243位的亮氨酸突变为丙氨酸(L234A/L235A)可减弱ADE效应(图1)^[13-15]。

基于此,为了加快推进新型冠状病毒中和抗体的审评审批和上市,本研究参照药品审评中心《新型冠状病毒中和抗体类药物申报临床药学研究与技术资料要求指导原则》,开发了针对新型冠状病毒中和抗体生物学活性的分析方法,分别对中和抗体的Fab段及Fc段功能进行了分析,并对ADE效应进行了评价。

1 材料与设备

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1.1 主要试剂

新型冠状病毒中和抗体及参比品:重组全人源抗新型冠状病毒单克隆抗体(分子代号:9MW3311)及参比品由迈威(上海)生物科技股份有限公司提供;带抗体可结晶片段(fragment crystallizable,Fc)标签的ACE2(human ACE2-hFc),带多组氨酸标签(histidine,His)及抗体可结晶片段Fc标签的重组S1-RBD蛋白(S1-RBD-His、S1-RBD-mFc)由迈威(上海)生物科技股份有限公司提供;辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的羊抗人抗体(immunoglobulin,IgG)(美国Thermo公司);HRP标记的鼠抗His抗体(康为世纪生物科技股份有限公司);异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的羊抗鼠抗体(美国Sigma公司);带红(橙)色荧光蛋白标签标记的人ACE2蛋白(Human ACE2-OFP tag)(北京义翘神州科技股份有限公司);人肝癌细胞Huh-7(中国食品药品检定研究院留存);新型冠状病毒假病毒颗粒(北京天坛药物);荧光素酶检测试剂盒(美国PerKinelmer公司);CM5芯片(美国GE Healthcare公司);FcγR及FcRn(Sino Biological公司);C1q蛋白(美国Quidel公司);HRP标记的C1q抗体(英国Abcam公司);人Expi293细胞;人乳腺癌细胞SK-BR-3; 淋巴瘤细胞Raji(中国上海科学院细胞库);SARS-CoV-2 Spike基因表达质粒(北京义翘神州科技股份有限公司);Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST(日本DOJINDO公司);正常人血清补体(美国Quidel公司);刃天青(Resazurin)细胞活性检测染料(苏州瑞安生物科技有限公司)。

1.2 仪器设备

OcterRED96 Fortebio(美国PALL公司);SpectraMaxM2多功能酶标仪及SOFTMAX软件(美国Molecular Devices公司);B49009AD CytoFLEX流式细胞仪(美国Beckman Coulter公司);T200 Biacore(美国GE Healthcare公司)。

2 方法

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2.1 生物膜层干涉法(biolayer interferometry, BLI)

测定新型冠状病毒中和抗体9MW3311 Fab与S1-RBD的亲和力:将抗人IgG 捕获生物传感器(Anti-Human Fc Capture,AHS)浸润于测定缓冲液(1×PBS)中平衡10 min,供试品用1×PBS稀释至工作浓度(4 μg·mL^-1)备用,重组S1-RBD-His蛋白用1×PBS分别稀释至工作浓度(90,30,15,7.5 nmol·L^-1)备用。设置测定程序,将AHC生物传感器浸入200 μL稀释后的抗体样品溶液中进行孵育,然后将AHC生物传感器转移至实验缓冲液(1×PBS)中平衡240 s。进一步将AHC生物传感器与稀释至工作浓度的S1-RBD-His进行结合反应,结合时间300 s,之后将AHC生物传感器转移至1×PBS缓冲液中,进行解离反应,时间为300 s。

2.2 酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)

2.2.1 与S1-RBD的相对结合活性

将S1-RBD-His抗原用碳酸钠缓冲溶液(pH 9.5)稀释至600 ng·mL^-1,每孔加入100 μL至酶标板中,2~8 ℃包被18 h。室温封闭120 min后,每孔加入100 μL系列稀释的样品,25 ℃孵育60 min。洗板后每孔加入100 μL辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的羊抗人Fc二抗(1∶10 000倍稀释),25 ℃孵育60 min,洗板,加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine,TMB)底物,以450 nm为检测波长,650 nm为参比波长双波长测定吸光度值。以抗体浓度为X轴,对应的吸光值为Y轴,选用四参数方程对样品的结合活性进行分析。

2.2.2 对ACE2的阻断活性

将Human ACE2-hFc用碳酸钠缓冲溶液(pH 9.5)稀释至2 μg·mL^-1,每孔加入100 μL至酶标板中,2~8 ℃包被18 h。室温封闭120 min后,100 μL 每孔加入系列稀释的样品与200 ng·mL^-1的S1-RBD-His等体积混合后的样品(室温下600 r·min^-1,混匀5 min),25 ℃孵育60 min。洗板后每孔加入100 μL HRP标记的鼠抗His二抗(1∶5 000倍稀释),25 ℃孵育60 min,洗板后加入TMB底物,检测波长、读数方式与数据处理方式同“2.2.1”项,以分析新型冠状病毒中和抗体9MW3311 Fab对ACE2的阻断活性。

2.2.3 与C1q的结合活性

将抗体用碳酸钠缓冲溶液(pH 9.5)进行梯度稀释,获得8个不同浓度的抗体(45~0.1 μg·mL^-1),每孔加入100 μL至酶标板中,2~8 ℃包被18 h。室温封闭120 min后,100 μL 每孔加入C1q蛋白,25 ℃孵育120 min。洗板后每孔加入100 μL HRP标记的抗C1q二抗,25 ℃孵育60 min,洗板后加入TMB底物,检测波长、读数方式与数据处理方式同“2.2.1”项,以分析样品与C1q受体的结合活性。

2.3 流式细胞分选法(fluorescence activated cell sorting, FACS)

2.3.1 与S1-RBD的相对结合活性

将含有全长SARS-CoV-2 Spike基因的表达质粒,通过转染试剂293fectin转入HEK293细胞中,培养24~48 h。室温封闭30 min后,每管加入200 μL系列1∶3稀释的样品,放置于冰上孵育60 min。清洗细胞后每孔加入100 μL FITC标记的羊抗人二抗(1∶200倍稀释)放置于冰上孵育45 min,清洗细胞,以200 μL PBS溶液重悬,用流式细胞仪进行分析。以抗体浓度为X轴,对应的相应信号值为Y轴,选用四参数方程对样品的相对结合活性进行分析,以抗体浓度的Log值为横坐标X,信号响应应值RLU为纵坐标Y,使用SOFTMAX软件进行四参数曲线拟合分析,拟合方程为Y=D+(A-D)/{1+(X/C)^B},其中A是上渐近线处的最小响应,D是下渐近线处的最大响应、B是上和下渐近线之间浓度响应曲线的斜率,系数C是半最大效应浓度(concentration for 50% of maximal effect,EC₅₀)。

2.3.2 对ACE2的阻断活性

将含有全长human ACE2基因的表达质粒(带有OFP tag),通过转染试剂293fectin,转入HEK293细胞中,培养24~48 h。室温封闭30 min后,每管加入200 μL系列1∶3稀释的样品与0.8 μg·mL^-1的S1-RBD-mFc等体积混合孵育后的供试品(室温孵育60 min),放置于冰上孵育60 min。清洗细胞后每孔加入100 mL FITC标记的羊抗鼠二抗(1∶200倍稀释)放置于冰上孵育45 min,清洗细胞,以200 μL PBS溶液重悬,用流式细胞仪进行分析。数据处理方法同“2.3.1”。

2.4 假病毒中和法

用DMEM完全培养基(10% FBS,25 mmol·L^-1 HEPES缓冲液,1%青链霉素双抗)将COVID-19假病毒颗粒稀释至1.0×10⁴~2×10⁴ TCID₅₀·mL^-1(500~1 000 TCID₅₀每孔),每孔加入50 μL至酶标板中,然后每孔加入100 μL系列稀释的样品与假病毒进行中和反应,37 ℃,5% CO₂培养箱孵育60 min。设置不加病毒组为阴性对照细胞对照孔(CC)值,不加供试品组为阳性对照病毒对照孔(VC)值。在上述中和后的板内,每孔加入100 μL的(密度为2×10⁵·mL^-1)Huh 7细胞,置于37 ℃,5% CO₂培养箱中孵育20~28 h。取出细胞培养板,每孔弃150 μL细胞培养上清,每孔加入100 μL的荧光素酶底物,避光反应2 min,吹打混匀后每孔吸取150 μL反应液至白板中,置于酶标仪中采集化学发光信号。采用公式1计算中和抑制率。

公式(1)$ \text { 中和抑制率（％）}=[1 \text {－（样品孔荧光均值－CC 荧光均值）／（VC 荧光均值－CC 荧光均值）}] \times 100 \%$

以供试品工作浓度为X轴,中和抑制率为Y轴,选用四参数方程对供试品的假病毒中和活性进行分析。

2.5 表面等离子共振法(surface plasmon resonance,SPR)

测定新型冠状病毒中和抗体与FcγR/FcRn的亲和力:用醋酸钠(pH 4.5)将抗His抗体稀释至20 μg·mL^-1偶联至CM5芯片上,用乙醇胺(1 M,pH 8.5)注射420 s封闭剩余的活化位点。用HBS-EP+(pH7.4)将FcγRI/CD64稀释至0.4 μg·mL^-1,以10 μL·min^-1的流速分别将上述受体捕获于CM5芯片中,流经不同浓度的抗体,以30 μL·min^-1的流速,注入芯片1、2通道,设置结合时间30 s,解离时间60 s;用HBS-EP+(pH 7.4)将FcγRIIb/CD32b 及FcγRIIa/CD32a稀释至0.8 μg·mL^-1,以10 μL·min^-1的流速分别将上述受体捕获于CM5芯片中,流经不同浓度的抗体,以30 μL·min^-1的流速,注入芯片1、2通道,设置结合时间60 s,解离时间60 s;用HBS-EP+(pH 6.0)将FcRn稀释至0.2 μg·mL^-1,以10 μL·min^-1的流速分别将上述受体捕获于CM5芯片中,流经不同浓度的抗体,以30 μL·min^-1的流速,注入芯片1、2通道,设置结合时间60 s,解离时间45 s。最后均使用pH1.5的甘氨酸对芯片再生,再生时间30 s,流速30 μL·min^-1。仪器设定温度为25 ℃。

2.6 抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)

将含有全长SARS-CoV-2 Spike基因的表达质粒,通过转染试剂TA-293 Transfection Reagent,转入Expi293细胞中,125-130 rpm振摇培养40~48 h,作为靶细胞;以SK-BR-3细胞,Herceptin抗体作为系统阳性对照。将靶细胞稀释至2×10⁵·mL^-1,然后在96孔细胞培养板中每孔加入25 μL细胞,50 μL梯度稀释的供试品,37 ℃孵育30 min,再加入25 μL的效应细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),密度为5×10⁶·mL^-1),37 ℃孵育4 h,取出细胞培养板,每孔加入100 μL LD底物,室温反应30 min,每孔加入50 μL的终止液,以490 nm为检测波长测定吸光度值。以公式2计算细胞裂解率。

公式(2)$细胞裂解率 (\%)=\left[\left(\mathrm{OD}_{\mathrm{ER}}-\mathrm{OD}_{(\mathrm{T}+\mathrm{E}) \mathrm{SR}}\right) /(\right. \left.\left.\mathrm{OD}_{\text {TMR }}-\mathrm{OD}_{\text {TSR }}\right)\right] \times 100 \%$

ER:效应细胞背景对照;(T+E)SR:效应细胞+靶细胞背景对照;TMR:靶细胞裂解对照(100%裂解);TSR:靶细胞背景对照。

以抗体浓度为X轴,对应的细胞裂解率为Y轴,选用四参数方程对供试品的ADCC效应进行分析。

2.7 补体依赖的细胞毒性作用(CDC)

每孔加入50 μL的24%人血清补体,37 ℃孵育2 h。取出细胞培养板,每孔加入15 μL 的Resazurin细胞活性检测染料, 37 ℃孵育16~20 h,以530 nm为激发波长,590 nm为发射波长测定荧光值。以不加抗体及补体组的荧光读值为阴性对照(E),以细胞加补体组的荧光读值为自发杀伤对照组(S),供试品荧光读值为M,以公式3计算CDC。

公式(3)$ \mathrm{CDC}(\%)=(\mathrm{E}-\mathrm{S}) /(\mathrm{M}-\mathrm{S}) \times 100 \%$

以抗体浓度为X轴,对应的CDC %为Y轴,选用四参数方程对供试品的CDC效应进行分析。

2.8 ADE效应评价

将假病毒颗粒稀释至1.0×10⁴~2×10⁴ TCID₅₀·mL^-1(500~1 000 TCID₅₀每孔),加入25 μL至细胞培养板中,然后每孔加入25 μL系列稀释的样品与假病毒进行中和反应,37 ℃,体积分数5% CO₂培养箱孵育60 min。设置VC和CC,其中VC加入25 μL假病毒溶液和25 μL完全培养基,CC加入50 μL完全培养基。在上述中和后的板内,每孔加入50 μL的 Raji细胞(密度为2×10⁶个·mL^-1),置于37 ℃,体积分数5% CO₂培养箱中孵育20~28 h。取出细胞培养板,每孔加入100 μL的荧光素酶底物,避光反应2 min,置于酶标仪中采集化学发光信号。以供试品工作浓度为X轴,化学荧光响应信号为Y轴,对供试品的ADE效应进行分析。

3 结果

收起

3.1 9MW3311 Fab与S1-RBD的结合动力学及亲和常数

使用BLI法测定9MW3311及其参比品与S1-RBD的亲和力,使用1∶1的动力学模型,对曲线进行拟合分析,结果表明(图2),9MW3311中和抗体与S1-RBD的结合属于快结合慢解离的方式,亲和能力较强,KD值均在nmol·L^-1水平,且3批9MW3311和参比品与S1-RBD抗原的亲和力水平基本保持一致。

3.2 9MW3311与S1-RBD及S蛋白的相对结合活性

3.2.1 ELISA法

使用ELISA法测定9MW3311及其参比品与S1-RBD在蛋白水平的相对结合活性,结果表明(图3),3批9MW3311及参比品与S1-RBD的结合呈典型的“S”型曲线,EC₅₀值分别为:10.2、10.1、10.6、10.8 ng·mL^-1,与参比品相比较,3批9MW3311的相对结合活性高度一致,分别为101%,96%及100%。

3.2.2 流式细胞法

使用流式细胞法测定9MW3311及其参比品与S蛋白在细胞水平的相对结合活性,结果表明(图4),9MW3311及其参比品与正常的HEK-293细胞不结合(图4B),而能与表面瞬时表达S蛋白的HEK-293细胞特异性结合(图4A),EC₅₀值分别为387、393、343、360 ng·mL^-1。且与参比品相比,3批9MW3311与S蛋白在细胞水平的结合活性高度一致,分别是98%,113%及108%。

3.3 9MW3311阻断S1-RBD与ACE2结合的活性

3.3.1 ELISA法

使用ELISA法测定9MW3311及其参比品阻断S1-RBD与ACE2的结合活性,结果表明(图5A),9MW3311抗体可以有效阻断S1-RBD抗原与ACE2受体的相对结合活性,且呈剂量依赖趋势,量效曲线符合倒“S”型,IC₅₀值分别为:262、263、275、288 ng·mL^-1,且3批9MW3311与参比品的阻断结合活性高度一致,分别为100%,95%和91%。

3.3.2 FACS法

使用FACS法测定9MW3311及其参比品在细胞水平阻断S1-RBD与ACE2的结合活性,结果表明(图5B),9MW3311抗体可以特异性阻断S1-RBD抗原与表达在HEK-293细胞表面的人ACE2受体的相对结合活性,而阴性对照则无阻断活性。IC₅₀值分别为428、457、422、453 ng·mL^-1。且3批9MW3311的阻断结合活性与参比品高度一致,分别为94%,101%及94%。

3.4 9MW3311在假病毒水平的体外细胞学活性

使用SARS-CoV-2假病毒系统检测9MW3311及其参比品的体外中和活性,结果表明(表1,图6),3批9MW3311及其参比品对假病毒均有较高的中和活性,且中和活性高度一致,分别为91%,93%及108%。

3.5 9MW3311抗体Fc与FcγR的亲和能力

使用Biacore法检测3批9MW3311及参比品与FcγRⅠ/CD64,FcγRⅡa/CD32a,FcγRⅡb/CD32b,FcγRⅢa/CD16a亲和力结果表明(表2),3批9MW3311与各Fcγ受体亲和力水平一致。

3.6 9MW3311抗体Fc 与FcRn的亲和能力

使用Biacore法检测3批9MW3311及参比品与FcRn亲和力结果表明(表3),3批9MW3311与FcRn亲和力水平一致。

3.7 9MW3311抗体Fc端与C1q的结合活性

使用ELISA法检测3批9MW3311及参比品与C1q受体的结合活性,结果表明(图7),3批9MW3311及参比品与C1q受体都有较高的结合活性,EC₅₀值分别为:3 862、3 868、4 010、3 729 ng·mL^-1,且与参比品相比,3批9MW3311与C1q受体的结合活性高度相似,分别为100%,96%及104%。

3.8 9MW3311单抗的ADCC与CDC效应评价

以瞬转SARS-CoV-2 S蛋白全长基因的Expi293细胞作为靶细胞,采用PBMC法评价9MW3311单抗的ADCC效应;以混合健康人血清(pooled normal human serum,PNHS or NHS)作为血清补体成分的来源,评价9MW3311中和抗体的CDC效应。结果表明,与Herceptin阳性对照相比^[16],9MW3311中和抗体均无明显的ADCC(图8A)及CDC(图8B)效应。

3.9 MW3311单抗的ADE效应评价

参照对野生型的9MW3311单抗做了LALA突变(即重链242位和243位的亮氨酸L突变为丙氨酸A),以Raji细胞作为靶细胞,利用假病毒系统评估9MW3311野生型中和抗体和LALA突变型中和抗体的ADE效应,结果表明(图9),9MW3311野生型中和抗体在Raji细胞表面观察到在一定范围内有ADE效应的产生,LALA突变后的中和抗体可有效避免ADE效应。

4 讨论

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自COVID-19疫情暴发以来,国内多支科研团队及制药企业积极合作应对,充分利用之前SARS-CoV和MERS-CoV两种冠状病毒的研究基础,开发具有完全自主知识产权的特效药,迅速抢占COVID-19防治的最高阵地。这对我国疫情防控与治疗病症起到积极且重大的作用,同时,也为全球COVID-19 的防治提供中国技术、中国方案,彰显了我国在新冠病毒防治中的积极姿态、先进技术,表现出负责任大国的应有作为,得到了世界人民的尊重与认可。作为最有希望的特效药之一,中和抗体药物也在新冠病毒防治中备受瞩目。目前,我国在该领域的研发和上市速度处于世界前列。

生物学活性和免疫学特性作为中和抗体的关键质量属性,直接反映中和抗体的有效性。本文从结合动力学、相对结合活性、ACE2相对阻断活性及体外细胞学活性等4个方面对新型冠状病毒中和抗体Fab段的功能进行了分析研究。其中,采用BLI法测定中和抗体与抗原的结合动力学和亲和常数,该方法高效、敏感、可操作性强。分别采用ELISA法和FACS法测定中和抗体的相对结合活性,ELISA法中,包被刺突蛋白受体结合区域蛋白片段作为抗原,用间接法检测不同浓度供试品与抗原的结合能力,通过参比品和样品IC₅₀值的比值,从蛋白层面反映中和抗体和抗原的结合活性;FACS中,通过将S蛋白瞬时表达在HEK-293细胞膜表面,可以得到更接近天然构象的S跨膜蛋白,检测中和抗体与瞬时表达S蛋白的HEK-293细胞的结合活性,从细胞水平反映中和抗体的结合活性,在结果处理时,均使用 SpectraMax 四参数软件进行拟合,进一步保证了结果的客观性和准确性。同样,使用ELISA法和FACS法测定ACE2相对阻断活性,ELISA法中在酶标板上包被ACE2受体,再梯度稀释样品,将不同浓度的样品与一定量的S蛋白RBD等体积混合后,再通过竞争ELISA法检测不同浓度的混合后样品分别与ACE2受体结合的能力;FACS法中分析中和抗体对表达在HEK-293细胞表面的人ACE2与S蛋白RBD结合的阻断活性。采用中检院自建的假病毒体系测定新型冠状病毒中和抗体的生物学活性^[17-18],Huh-7(人肝癌细胞系,可通过体外接种成功分离野生型SARS-CoV-2病毒株)^[19],模拟中和抗体阻断病毒感染宿主细胞的过程,该方法已用于新冠疫苗的放行检验,稳定性好,可靠性高。

从Fc与Fcγ受体、FcRn、C1q受体的亲和力方面评价Fc段的免疫学特性,并测定中和抗体的ADCC和CDC效应。采用SPR法测定Fc与FcγRⅠ、FcγRⅡa、FcγRⅡb、FcγRⅢa受体、FcRn的亲和能力,将抗HIS抗体偶联在芯片表面,捕获FcγRⅠ、FcγRⅡa、FcγRⅡb、FcγRⅢa、FcRn分别作为配体,以中和抗体为分析物,检测其亲和能力。采用ELISA法测定Fc与C1q的亲和能力。以瞬转COVID-19 S蛋白全长基因的Expi293细胞作为靶细胞,分别以赫赛汀ADCC和利妥昔CDC^[20-21]为阳性对照,建立测定中和抗体的ADCC和CDC效应的评价方法,采用PBMC法评价ADCC效应,以PNHS or NHS作为血清补体成分的来源,评价CDC效应,结果表明该中和抗体无明显的ADCC与CDC效应。

以Raji细胞作为靶细胞,利用假病毒系统建立了新型冠状病毒中和抗体ADE效应评价方法,并采用该方法分别对同一个中和抗体野生型和LALA突变体进行了评价,结果表明在一定范围内野生型中和抗体有ADE效应的产生,而LALA突变后的抗体分子则无ADE效应,后续将进行该方法的完善和验证,有望开发为平台方法,用于新型冠状病毒中和抗体及疫苗开发中ADE效应的评价。

本文使用多种方法从不同层面分别对新型冠状病毒中和抗体的生物学活性和免疫学特性进行了评价,并对ADE效应建立了灵敏、高效的评价方法,为突发状况下新型冠状病毒疫情防控提供了用药储备的技术支持,也为其他组合抗体的生物学和免疫学特性评价,质量控制和放行提供了参考。

基金

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国家自然科学基金项目资助(21702007)
国家重点研发计划项目资助(2021YFF0600804)

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文献

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2024年第59卷第4期

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doi: 10.11669/cpj.2024.04.009

接收时间：2023-01-30
首发时间：2025-11-13
出版时间：2024-02-22

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收稿日期：2023-01-30

基金

国家自然科学基金项目资助(21702007)

国家重点研发计划项目资助(2021YFF0600804)

作者信息

² 迈威(上海)生物科技股份有限公司, 上海 201210

通讯作者:

*于传飞,男,博士,研究员研究方向:治疗型生物制品的质量控制 Tel:(010)53852159;

王兰,女,博士,研究员研究方向:治疗型生物制品的质量控制 Tel:(010)53852159

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Antibodies	IC₅₀/ng·mL^-1		Activity /%
Antibodies	9MW3311-Reference	Drug substance	Activity /%
9MW3311-S1	26.73	29.44	91
9MW3311-S2	27.73	29.69	93
9MW3311-S3	28.80	26.67	108

Antibodies	KD/mol·L^-1
Antibodies	FcγRⅠ	FcγRⅡa	FcγRⅡb	FcγRⅢa
9MW3311-Ref	7.297×10^-7	1.128×10^-4	1.154×10^-4	3.889×10^-5
9MW3311-S1	6.214×10^-7	1.507×10^-4	2.450×10^-4	4.268×10^-5
9MW3311-S2	9.339×10^-7	1.405×10^-4	1.138×10^-4	3.397×10^-5
9MW3311-S3	7.719×10^-7	1.383×10^-4	1.596×10^-4	3.520×10^-5