中国药学杂志

Compound	Substituent R	IC₅₀/μmol·L^-1
4a		>50
4b		21.27±0.87
4c		13.68±0.35
4d		9.41±0.27
4e		2.30±0.34
4f		18.03±0.56
4g		20.62±1.56
4h		19.06±1.23
4i		20.18±0.33
4j		10.29±0.36
4k		7.76±0.44
4l		4.14±0.23
4m		23.93±0.34
4n		19.30±1.34
4o		25.50±0.76
4p		12.62±0.78
Cisplatin		9.62±0.28

Compound	Substituent R	IC₅₀/μmol·L^-1
4a		>50
4b		21.27±0.87
4c		13.68±0.35
4d		9.41±0.27
4e		2.30±0.34
4f		18.03±0.56
4g		20.62±1.56
4h		19.06±1.23
4i		20.18±0.33
4j		10.29±0.36
4k		7.76±0.44
4l		4.14±0.23
4m		23.93±0.34
4n		19.30±1.34
4o		25.50±0.76
4p		12.62±0.78
Cisplatin		9.62±0.28

N'-取代-4-{3-(喹啉-6-基)脲基}苯甲酰肼衍生物的合成及活性研究

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谢育乐 ¹ , 杨伊静 ² , 赵胜贤 ³ , 胡鸿雨 ¹^,^*

中国药学杂志 | 论著 2024,59(3): 227-234

收起

中国药学杂志 | 论著 2024, 59(3): 227-234

N'-取代-4-{3-(喹啉-6-基)脲基}苯甲酰肼衍生物的合成及活性研究

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谢育乐¹, 杨伊静², 赵胜贤³, 胡鸿雨¹^,^*

作者信息

¹ 浙江师范大学行知学院, 浙江兰溪 321100

² 厦门大学药学院, 福建厦门 361102

³ 宁波大学科学技术学院, 浙江慈溪 315302

谢育乐,女,学士研究方向:新药研发

通讯作者:

*胡鸿雨,男,博士,副教授研究方向:肿瘤药物设计合成及活性筛选 Tel:(0579)82291190

Synthesis and Activity of N'-Substitute-4-{3-(Quinoline-6-yl) Urea} Benzoyl Hydrazide Derivatives

XIE Yule¹, YANG Yijing², ZHAO Shengxian³, HU Hongyu¹^,^*

Affiliations

¹ Xingzhi College, Zhejiang Normal University, Lanxi 321100, China

² School of Pharmaceutical Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China

³ College of Science and Technology, Ningbo University, Cixi 315302, China

出版时间: 2024-02-08 doi: 10.11669/cpj.2024.03.005

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摘要

收起

目的设计合成N'-取代-4-{3-(喹啉-6-基)脲基}苯甲酰肼衍生物,并对其抗乳腺癌活性进行研究。方法 6-氨基喹啉为起始原料,通过3步反应合成了一系列目标化合物4a~4p,并通过¹H NMR、¹³C NMR和HRMS对所有目标化合物进行了结构确证。采用MTT法检测了合成化合物对于乳腺癌细胞的抑制作用。结果表明目标化合物对于乳腺癌细胞的生长具有一定的抑制活性,其中化合物4e活性最优,表现出明显的抑制作用,抑制乳腺癌细胞系MCF-7的IC₅₀为(2.30±0.34) μmol·L^-1,且4e对正常乳腺上皮细胞的毒性较小(IC₅₀>100 μmol·L^-1),优于阳性药Cisplatin。此外4e能够明显上调孤儿核受体Nur77的蛋白表达水平,并且能够使MCF-7出现S期阻滞。结论该系列化合物具有较好的抗乳腺癌的活性,有进一步研究的价值。

关键词

苯甲酰肼衍生物 / 细胞增殖 / 乳腺癌细胞 / 孤儿核受体Nur77 / S期阻滞

Abstract

收起

OBJECTIVE To design and synthesize N-substituted methylene-3-(4-(pyridin-3-yl)pyrimidin-2-yl)amino)benzohydrazide derivatives, and evaluate their anticancer activities. OBJECTIVE Using 3-aminobenzoic acid ethyl ester as the starting reagent, a series of target compounds 4a-4p were synthesized in a 4-step reaction, and all of the target compounds were structurally characterized by ¹H-NMR, ¹³C-NMR and HRMS. MTT assay was used to detect the inhibitory effect of synthetic compounds on breast cancer cells. RESULTS It's showed that the target compounds had certain inhibitory activity on the growth of breast cancer cells, among which compound 4e was the best one, showing obvious inhibitory effect on breast cancer cells. The IC₅₀ value of breast cancer cell line MCF-7 was (2.30±0.34)μmol·L^-1, and the toxicity of 4e to normal mammary epithelial cells was low(IC₅₀>100 μmol·L^-1). Thus, 4e is better than the positive drug cisplatin. In addition, 4e could significantly up-regulate the protein expression level of Nur77 and induce the S-phase arrest of MCF-7. CONCLUSION This series of compounds have good anti-cancer activity and are of interest for further study.

Key words

benzoylhydrazine derivatives / cell proliferation / breast cancer / Nur77 / S-phase arrest

引用本文

谢育乐, 杨伊静, 赵胜贤, 胡鸿雨. N'-取代-4-{3-(喹啉-6-基)脲基}苯甲酰肼衍生物的合成及活性研究. 中国药学杂志, 2024 , 59 (3) : 227 -234 . DOI: 10.11669/cpj.2024.03.005

XIE Yule, YANG Yijing, ZHAO Shengxian, HU Hongyu. Synthesis and Activity of N'-Substitute-4-{3-(Quinoline-6-yl) Urea} Benzoyl Hydrazide Derivatives[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (3) : 227 -234 . DOI: 10.11669/cpj.2024.03.005

正文

收起

乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。尽管近几年在诊断和治疗方面取得了进展,它仍然是第二大常见的癌症死亡原因,在我国其发病率位居女性恶性肿瘤的首位,且逐年上升^[1]。化疗是完善的乳腺癌治疗策略之一,然而,耐药性是其治疗失败和相关死亡的主要原因。因此,开发新型的乳腺癌治疗策略及靶向性药物具有重要的临床意义。孤儿核受体Nur77属于类固醇/甲状腺激素受体超家族的成员,其内源性配体至今尚未被发现,因此被称为孤儿核受体^[2]。作为立早基因的产物,Nur77能够以细胞特异的方式被各种刺激如血清、生长因子、放疗、化疗或促凋亡药物等诱导,从而调控细胞生存、自噬和死亡^[3-4]。许多研究表明,Nur77与许多肿瘤的发生和发展密切相关。相较于正常乳腺上皮细胞,Nur77在乳腺癌细胞中表达量更低,并且随着乳腺癌病程的恶化,其表达量会进一步降低。有研究表明,在细胞内过表达Nur77可抑制乳腺癌细胞的增殖^[5]。因此,将Nur77作为药物靶点进行深入研究,可以为临床上治疗乳腺癌提供新的视角。

本研究采用分子杂合技术,将不同生物活性分子中的药效基团拼接,产生具有潜在的高活性、低毒性和多重作用机理的杂合分子。喹啉类化合物是一类具有广泛生理活性的含氮杂环化合物,广泛应用在医药领域,具有包括杀菌、抗肿瘤、抗病毒、消炎及增强机体免疫等多种作用^[6-8]。酰肼类化合物具有如抗病毒^[9]、抗肿瘤^[10]、抗炎^[11]等广泛的生物活性。实验室前期设计的靶标化合物4-PQBH能够与Nur77的LBD结构域结合,诱导HCC细胞发生内质网应激与空泡化,进而引起细胞凋亡发挥抗癌作用^[12];另一个靶标化合物7s能够与Nur77-LBD区域的LEU175形成氢键,上调Nur77的蛋白水平,诱导H460细胞凋亡^[13]。本研究在前期的工作基础上,利用分子杂合方法和生物电子等排体设计思路,保留了先导化合物4-PQBH抗癌活性必须的喹啉、苯甲酰肼和7s的脲药效基团,然后对保留的这两个药效片段进行分子杂合,设计合成了一系列新型的靶标化合物(图1)。以期获得具有更强抗乳腺癌活性的新型喹啉脲基苯甲酰肼衍生物小分子。目标化合物4a~4p的合成路线见图2。

1 材料与方法

收起

1.1 主要药品与试剂

原料购自上海泰坦科技股份有限公司,所用试剂均为分析纯,溶剂未经处理直接使用。薄层层析硅胶(青岛海洋化工厂);MTT粉末(ST1537),细胞周期检测试剂盒(C1052)(碧云天);Nur77抗体(12235-1-AP,proteintech)、GAPDH抗体(60004-1-Ig,proteintech)。

1.2 仪器

WRS-1B数字熔点仪,Bruker Avance 600型核磁共振波谱仪(DMSO-d₆或CDCl₃为溶剂,TMS为内标),Agilent 6230质谱仪,Attune NxT超高速流式细胞仪,Thermo Scientific^® Multiskan^® FC 酶标仪化学发光成像仪(美国Biorad公司)。

2 实验方法与结果

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2.1 中间体4-[3-(喹啉-6-基)脲基]苯甲酸乙酯合成(2)

参考文献[14]方法, 在25 mL干燥单口瓶中加入6-氨基喹啉(1.44 g, 0.01 mol), 15 mL乙醇, 4-异氰酸苯甲酸乙酯(1.91 g, 0.01 mol), 在搅拌状态下升温至70~80 ℃, 反应2 h, TLC检测反应已结束, 停止反应。反应液冷却至室温, 抽滤, 乙醇洗滤饼, 烘干得白色固体产物4-[3-(喹啉-6-基)脲基]苯甲酸乙酯3.0 g, 收率89.5%。m.p.180.1~180.4 ℃;¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆)δ:9.25(s, 1H), 9.18(s, 1H), 8.76(d, J=4.0 Hz, 1H), 8.28(d, J=8.1 Hz, 1H), 8.21(d, J=1.6 Hz, 1H), 7.97(d, J=9.0 Hz, 1H), 7.92(d, J=8.5 Hz, 2H), 7.72(dd, J=1.8, 9.0 Hz, 1H), 7.64(d, J=8.5 Hz, 2H), 7.48(dd, J=4.1, 8.2 Hz, 1H), 4.29(q, J=6.9 Hz, 2H), 1.32(t, J=7.0 Hz, 3H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆)δ:168.7, 152.7, 144.6, 137.8, 135.7, 130.9, 130.1, 129.0, 123.5, 123.4, 122.8, 122.3, 118.9, 117.9, 113.9, 60.8, 14.7; HRMS(ESI) m/z: 336.133 8[M+H]⁺, 理论值:336.134 3[M+H]⁺。

2.2 中间体4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼的合成(3)

参考文献[15]方法, 在50 mL干燥单口瓶中加入4-[3-(喹啉-6-基)脲基]苯甲酸乙酯(3.35 g, 0.01 mol), 30 mL乙醇, 水合肼85%(10 g, 0.20 mol), 在搅拌状态下升温至70~80 ℃, 反应12 h, TLC检测反应已结束, 停止反应。反应液冷却至室温, 抽滤, 乙醇洗滤饼, 烘干得白色固体产物4-[3-(喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼2.60 g, 收率80.7%。m.p. 201.1~202.4 ℃;¹H-NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ:9.65(brs, 1H), 9.15(s, 1H), 9.07(s, 1H), 8.76(d, J=2.8Hz, 1H), 8.27(d, J=8.1 Hz, 1H), 8.20(d, J=2.00 Hz, 1H), 7.96(d, J=9.0 Hz, 1H), 7.80(d, J=8.5 Hz, 2H), 7.71(dd, J=2.0, 9.07 Hz, 1H), 7.56(d, J=8.5Hz, 2H), 7.48(dd, J=4.1, 8.2 Hz, 1H), 4.44(brs, 2H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆) δ:166.1, 152.8, 149.0, 144.7, 142.6, 137.9, 135.6, 130.0, 129.0, 128.4, 127.0, 123.5, 122.2, 117.8, 113.7;HRMS(ESI) m/z: 322.128 9[M+H]⁺, 理论值:322.129 9[M+H]⁺。

2.3 N-取代-4-[3-(喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼衍生物的制备

参考文献[16-17]方法, 在干燥的反应瓶中, 先依次加入不同的醛(0.001 mol)、 4-[3-(喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼(0.322 g, 0.001 mol)、乙醇(10 mL), 再在搅拌状态升温至回流反应。TLC检测反应已完全, 停止反应。过滤, 乙醇洗涤滤饼, 烘干得N-取代-4-[3-(喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼衍生物, 收率75%~85%。

N'-亚丁基4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4a:白色固体, 收率75.1%, m.p. 198~200 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.39(s, 1H), 9.76(s, 1H), 9.74(s, 1H), 8.75(dd, J=1.3, 3.8Hz, 1H), 8.27(d, J=8.0 Hz, 1H), 8.25(d, J=1.8 Hz, 1H), 7.97(d, J=9.1Hz, 1H), 7.85(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.76(d, J=2.2 Hz, 1H), 7.75(d, J=1.8 Hz, 1H), 7.65(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.47(dd, J=4.2, 8.2 Hz, 1H), 2.29~2.18(m, 2H), 1.57~1.45(m, 2H), 0.93(t, J=7.3 Hz, 3H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆)δ:162.9, 153.0, 152.1, 148.8, 144.6, 143.4, 138.2, 135.7, 129.9, 129.1, 129.0, 126.8, 123.5, 122.2, 117.7, 113.6, 34.4, 20.0, 14.1;HRMS(ESI) m/z: 376.177 0[M+H]⁺, 理论值:376.176 8 [M+H]⁺。

N'-3-甲基亚苄基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4b:白色固体, 收率80.0%, m.p. 233~234 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.78(brs, 1H), 9.99(s, 1H), 9.78(brs, 1H), 9.04~8.98(m, 1H), 8.85(d, J=8.0 Hz, 1H), 8.52(d, J=1.8 Hz, 1H), 8.43(s, 1H), 8.15(d, J=9.1 Hz, 1H), 7.99(dd, J=2.2, 9.1 Hz, 1H), 7.93(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.85(dd, J=4.7, 8.4 Hz, 1H), 7.69(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.55(brs, 1H), 7.50(d, J=7.3 Hz, 1H), 7.34(t, J=7.5 Hz, 1H), 7.24(d, J=7.3 Hz, 1H), 2.35(s, 3H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆) δ:163.1, 159.8, 159.6, 152.8, 147.7, 145.0, 143.3, 142.2, 140.0, 138.5, 134.9, 131.1, 129.9, 129.2, 129.2, 127.7, 127.0, 126.6, 124.9, 122.5, 117.9, 113.6, 21.4; HRMS(ESI) m/z: 424.175 9 [M+H]⁺, 理论值:424.176 8 [M+H]⁺。

N'-4-甲氧基亚苄基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4c:白色固体, 收率78.3%, m.p. 225~226 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.66 (s, 1H), 9.60 (d, J=11.0 Hz, 2H), 8.76 (d, J=2.9 Hz, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.30 (d, J=8.07 Hz, 1H), 8.26 (d, J=1.83 Hz, 1H), 7.98 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.91 (d, J=8.4 Hz, 2H), 7.76 (dd, J=2.0, 9.0 Hz, 1H), 7.70~7.65 (m, 4H), 7.49 (dd, J=4.0, 8.0 Hz, 1H), 7.03 (d, J=8.4 Hz, 2H), 3.81 (s, 3H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆)δ:162.9, 161.2, 152.9, 148.8, 147.6, 144.4, 143.5, 138.2, 135.9, 129.8, 129.1, 129.1, 127.5, 126.9, 123.6, 122.2, 118.5, 117.8, 114.8, 113.7, 55.8;HRMS(ESI) m/z: 440.170 0 [M+H]⁺, 理论值:440.171 7 [M+H]⁺。

N'-4-氯亚苄基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4d:白色固体, 收率80.9%, m.p. 260~261 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.86(brs, 1H), 9.53(s, 1H), 9.52(brs, 1H), 8.78(d, J=2.9 Hz, 1H), 8.46(brs, 1H), 8.32(d, J=8.0 Hz, 1H), 8.27(d, J=1.8 Hz, 1H), 7.99(d, J=9.1 Hz, 1H), 7.92(d, J=8.0 Hz, 2H), 7.79~7.73(m, 3H), 7.68(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.57~7.44(m, 3H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆):δ 163.1, 152.9, 149.3, 148.6, 146.3, 144.1, 143.6, 142.6, 141.1, 138.2, 136.2, 134.8, 133.9, 129.6, 129.4, 129.2, 129.1, 126.7, 123.8, 122.2, 117.8, 113.7;HRMS(ESI)m/z:444.116 1[M+H]⁺, 理论值:444.117 0[M+H]⁺。

N'-3-氯亚苄基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4e:白色固体, 收率83.5%, m.p. 255~257 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.92(brs, 1H), 9.29(brs, 2H), 8.81~8.72(m, 1H), 8.45(brs, 1H), 8.28(d, J=8.0 Hz, 1H), 8.23(d, J=1.5 Hz, 1H), 7.97(d, J=9.2 Hz, 1H), 7.93(d, J=8.0 Hz, 2H), 7.79(brs, 1H), 7.74(dd, J=1.8, 9.1 Hz, 1H), 7.71~7.64(m, 3H), 7.53~7.44(m, 3H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆)δ:163.2, 152.8, 149.0, 145.9, 144.7, 143.5, 137.9, 137.2, 135.6, 134.1, 132.1, 131.2, 130.0, 129.3, 129.0, 127.4, 126.6, 126.2, 123.5, 122.2, 117.8, 113.8; HRMS(ESI) m/z: 444.116 1 [M+H]⁺, 理论值:444.122 2 [M+H]⁺。

N'-3, 5-甲基亚苄基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4f:白色固体, 收率78.1%, m.p. 225~227 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.82(brs, 1H), 9.75(brs, 1H), 9.60(brs, 1H), 8.95(d, J=3.6 Hz, 1H), 8.70(d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.43(d, J = 1.8 Hz, 1H), 8.39(brs, 1H), 8.10(d, J=8.8 Hz, 1H), 7.92(d, J=8.8Hz, 3H), 7.75(dd, J=4.5, 8.2Hz, 1H), 7.68(d, J=8.4 Hz, 2H), 6.88(brs, 2H), 6.57(brs, 1H), 3.79(s, 6H); ¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆)δ:163.2, 161.1, 152.8, 147.7, 146.0, 143.4, 140.5, 139.5, 136.9, 129.6, 129.2, 126.9, 126.1, 125.9, 122.4, 117.9, 113.7, 105.2, 102.6, 55.8; HRMS(ESI) m/z: 438.1922 [M+H]⁺, 理论值:438.192 5 [M+H]⁺。

N'-3, 5-甲氧基亚苄基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4g:白色固体, 收率85.0%, m.p. 223~225 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:10.75(s, 1H), 9.07(s, 1H), 8.54(s, 1H), 7.72~7.69(m, 2H), 7.64(d, J=8.8 Hz, 2H), 7.56(s, 1H), 7.22(d, J=8.6 Hz, 1H), 7.02(dd, J=1.8, 8.6 Hz, 1H), 6.03(d, J=1.5 Hz, 1H), 11.82 (brs, 1H), 9.75 (brs, 1H), 9.60 (brs, 1H), 8.95 (d, J=3.67 Hz, 1H), 8.70 (d, J=8.07 Hz, 1H), 8.43 (d, J=1.83 Hz, 1H), 8.39 (brs, 1H), 8.10 (d, J=8.8 Hz, 1H), 7.92 (d, J=8.8 Hz, 3H), 7.75 (dd, J=4.6, 8.2 Hz, 1H), 7.68 (d, J=8.4 Hz, 2H), 6.88 (brs, 2H), 6.57 (brs, 1H), 3.79 (s, 6H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆)δ:163.2, 161.1, 152.8, 147.7, 146.0, 143.4, 140.5, 139.5, 136.9, 129.6, 129.2, 126.9, 126.1, 125.9, 122.4, 117.9, 113.7, 105.2, 102.6, 55.8; HRMS(ESI) m/z: 470.180 6 [M+H]⁺, 理论值:470.182 3[M+H]⁺。

N'-3, 4-甲氧基亚苄基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4h:白色固体, 收率75.0%, m.p. 221~222 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.68(brs, 1H), 9.92(brs, 1H), 9.72(brs, 1H), 9.01(d, J=4.0 Hz, 1H), 8.83(d, J=8.4 Hz, 1H), 8.50(d, J=1.8 Hz, 1H), 8.40(s, 1H), 8.14(d, J=9.1 Hz, 1H), 7.98(dd, J=2.2, 9.1 Hz, 1H), 7.92(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.83(dd, J=4.9, 8.2 Hz, 1H), 7.68(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.35(s, 1H), 7.20(d, J=8.0 Hz, 1H), 7.03(d, J=8.4 Hz, 1H), 3.83(s, 3H), 3.81(s, 3H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆)δ:162.9, 159.5, 152.8, 151.1, 149.5, 148.0, 145.3, 143.2, 141.9, 139.9, 129.8, 129.1, 127.6, 127.2, 126.5, 125.2, 122.5, 122.3, 117.9, 113.6, 111.9, 108.6, 56.0, 55.9;HRMS(ESI) m/z: 470.182 3[M+H]⁺, 理论值:470.180 6[M+H]⁺。

N'-2-羟基-4-甲氧基亚苄基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4i:白色固体, 收率76.6%, m.p. 204~206 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.95(brs, 1H), 11.75(s, 1H), 9.48(brs, 2H), 8.76(brs, 1H), 8.56(brs, 1H), 8.29(d, J=6.4 Hz, 1H), 8.24(brs, 1H), 7.97(d, J=8.4 Hz, 1H), 7.93(d, J=7.3 Hz, 2H), 7.75(d, J=8.0 Hz, 1H), 7.68(d, J=7.7 Hz, 2H), 7.48(brs, 1H), 7.42(d, J=5.6 Hz, 1H), 6.57~6.46(m, 2H), 3.79(brs, 3H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆)δ:162.6, 162.4, 159.9, 152.9, 148.9, 148.8, 144.6, 143.6, 138.0, 135.7, 131.7, 130.0, 129.2, 129.1, 126.2, 123.5, 122.2, 117.8, 113.7, 112.3, 106.9, 101.7, 55.8; HRMS(ESI) m/z: 456.162 0 [M+H]⁺, 理论值:456.166 6[M+H]⁺。

N'-2, 4-二氟亚苄基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4j:白色固体, 收率78.2%, m.p. 270~271 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.91(brs, 1H), 9.23(brs, 2H), 8.76(d, J=2.9 Hz, 1H), 8.65(brs, 1H), 8.27(d, J=8.0 Hz, 1H), 8.22(d, J=1.1 Hz, 1H), 8.00(d, J=7.3 Hz, 1H), 7.97(d, J=9.1 Hz, 1H), 7.93(d, J=8.0 Hz, 2H), 7.73(d, J=7.3 Hz, 1H), 7.66(d, J=8.0 Hz, 2H), 7.47(dd, J=4.0, 8.0 Hz, 1H), 7.36(t, J=9.1 Hz, 1H), 7.21(t, J=7.7 Hz, 1H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆): δ 163.0, 160.5, 152.8, 149.0, 144.7, 143.5, 139.5, 137.9, 135.6, 130.0, 129.3, 129.0, 128.3(dd, J=3.0, 9.0Hz), 126.5, 123.5, 122.2, 119.3(dd, J=3.0, 9.0Hz), 117.8, 113.8(dd, J =4.5, 22.5Hz), 113.1, 104.9(t, J =27.0Hz); HRMS(ESI) m/z: 446.138 5 [M+H]⁺, 理论值:446.142 3[M+H]⁺。

N'-2, 4-二氯亚苄基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4k:白色固体, 收率80.5%, m.p. 281~283 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:12.06(brs, 1H), 9.68(s, 1H), 9.52(s, 1H), 8.97(dd, J=1.5, 4.7 Hz, 1H), 8.82(brs, 1H), 8.75(d, J=8.0 Hz, 1H), 8.45(d, J=2.2 Hz, 1H), 8.12(d, J=8.9 Hz, 1H), 8.04(d, J=8.0 Hz, 1H), 7.94(dd, J=2.0, 9.0 Hz, 3H), 7.79(dd, J=4.7, 8.4 Hz, 1H), 7.73(d, J=2.0 Hz, 1H), 7.68(d, J=8.8 Hz, 2H), 7.56~7.50(m, 1H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆):δ 163.1, 159.7, 159.5, 152.8, 145.3, 143.6, 142.4, 141.9, 139.9, 135.4, 134.2, 131.3, 129.8, 129.3, 128.5, 126.6, 126.5, 125.2, 122.5, 117.9, 117.7, 113.6;HRMS(ESI) m/z: 478.081 8[M+H]⁺, 理论值:478.083 2[M+H]⁺。

N'-2, 5-二氯亚苄基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4l:白色固体, 收率85.0%, m.p. 289~291 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:12.13(brs, 1H), 9.88(s, 1H), 9.70(brs, 1H), 8.99(dd, J=1.2, 4.7 Hz, 1H), 8.86~8.74(m, 2H), 8.48(d, J=2.2 Hz, 1H), 8.13(d, J=9.1 Hz, 1H), 7.99~7.90(m, 4H), 7.83(dd, J=4.8, 8.3 Hz, 1H), 7.68(d, J=8.8 Hz, 2H), 7.56(d, J=8.6 Hz, 1H), 7.49(dd, J=2.5, 8.6 Hz, 1H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆): δ 163.2, 159.9, 152.8, 145.0, 143.6, 142.0, 142.0, 140.0, 133.9, 132.7, 132.1, 132.0, 131.2, 129.8, 129.3, 126.6, 126.2, 124.8, 122.5, 117.9, 115.8, 113.6;HRMS(ESI) m/z: 478.081 8 [M+H]⁺, 理论值:478.083 2 [M+H]⁺。

N'-呋喃-2-亚甲基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4m:白色固体, 收率80.3%, m.p. 243~244 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.77(brs, 1H), 9.56(brs, 2H), 8.75(d, J=2.5Hz, 1H), 8.37(brs, 1H), 8.27(d, J=8.0 Hz, 1H), 8.23(d, J=1.8 Hz, 1H), 7.97(d, J=8.8 Hz, 1H), 7.91(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.85(s, 1H), 7.75(dd, J=2.0, 8.9 Hz, 1H), 7.66(d, J=8.4 Hz, 2H), 7.47(dd, J=4.2, 8.2 Hz, 1H), 6.93(brs, 1H), 6.64(brs, 1H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆)δ:163.0, 152.9, 150.0, 148.9, 145.5, 144.7, 143.5, 138.0, 137.5, 135.6, 130.0, 129.2, 129.1, 126.6, 123.4, 122.2, 117.7, 113.7, 113.6, 112.7; HRMS(ESI) m/z: 400.137 4 [M+H]⁺, 理论值400.140 4 [M+H]⁺。

N'-噻吩-2-亚甲基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4n:白色固体, 收率80.3%, m.p. 259~260 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:11.75(s, 1H), 9.19(s, 2H), 8.76(dd, J=1.1, 4.0Hz, 1H), 8.69(s, 1H), 8.28(d, J=7.7 Hz, 1H), 8.23(d, J=2.2 Hz, 1H), 7.98(d, J=8.8 Hz, 1H), 7.91(d, J=8.8 Hz, 2H), 7.73(dd, J=2.3, 8.9 Hz, 1H), 7.66(d, J=8.8 Hz, 3H), 7.50~7.44(m, 2H), 7.20~7.09(m, 1H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆)δ:162.9, 152.8, 149.0, 146.5, 144.7, 143.4, 142.8, 139.8, 137.9, 135.6, 131.2, 130.0, 129.2, 129.0, 128.3, 126.8, 123.5, 122.2, 117.9, 113.8; HRMS(ESI) m/z: 416.116 8 [M+H]⁺, 理论值416.117 6 [M+H]⁺。

喹啉-4-基亚甲基-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4o:白色固体, 收率83.4%, m.p. 265~267 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆):δ 12.17(brs, 1H), 9.40(brs, 1H), 9.39(s, 1H), 9.12(brs, 1H), 9.00(d, J=4.2 Hz, 1H), 8.78(d, J=2.3 Hz, 2H), 8.32(d, J=7.8 Hz, 1H), 8.25(d, J=2.2 Hz, 1H), 8.12(d, J=8.4 Hz, 1H), 7.99(d, J=8.8 Hz, 3H), 7.88~7.82(m, 2H), 7.77(dd, J=2.3, 9.1Hz, 2H), 7.71(d, J=8.6 Hz, 2H), 7.50(dd, J=4.1, 8.1 Hz, 1H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆): δ 1163.2, 152.9, 150.8, 148.7, 148.7, 144.7, 144.1, 143.8, 138.1, 136.2, 135.7, 130.2, 130.1, 129.6, 129.4, 129.1, 128.1, 126.3, 125.2, 124.8, 123.8, 122.3, 120.3, 117.9, 113.8; HRMS(ESI)m/z: 461.174 9 [M+H]⁺, 理论值461.172 1 [M+H]⁺。

N'-(2-氯喹啉-3-基亚甲基)-4-[(3-喹啉-6-基)脲基]苯甲酰肼4p:白色固体, 收率78.9%, m.p. 248~250 ℃, ¹H-NMR(600 MHz, DMSO-d₆)δ:12.20(brs, 1H), 9.46(d, J=12.1 Hz, 2H), 8.95(d, J=13.9 Hz, 2H), 8.76(d, J=2.5 Hz, 1H), 8.28(d, J=8.0 Hz, 1H), 8.25~8.18(m, 2H), 7.98(t, J=8.0 Hz, 4H), 7.85(t, J=7.5 Hz, 1H), 7.75(dd, J=2.0, 8.9 Hz, 1H), 7.72~7.66(m, 3H), 7.47(dd, J=4.0, 8.0 Hz, 1H)。¹³C-NMR(150 MHz, DMSO-d₆)δ:152.9, 149.0, 148.9, 147.5, 144.7, 142.6, 138.0, 136.0, 135.6, 132.2, 130.0, 129.4, 129.4, 129.0, 128.3, 128.1, 127.4, 126.8, 126.3, 123.5, 122.2, 117.8, 113.8; HRMS(ESI) m/z: 495.127 9 [M+H]⁺, 理论值495.133 1 [M+H]⁺。

2.4 体外抗肿瘤活性测试

采用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)法测定了4a~4p对MCF-7肿瘤细胞的体外抗肿瘤活性。取处于对数生长期的状态良好的细胞一瓶,加入质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化液消化,使贴壁细胞脱落,计数,制成每毫升2~4×10⁴个细胞的悬液。接种于96孔板上,180 μL每孔,置恒温CO₂培养箱中培养24 h。换液,加入受试化合物的DMSO溶液,每孔20 μL,再加入含体积分数为10%的血清培养液80 μL,培养48 h。将MTT加入96孔板中,每孔20 μL,培养箱中反应4 h。吸去上清液,加入DMSO,每孔150 μL,平板摇床上振摇5 min。用酶联免疫检测仪在波长为570 nm处测定每孔的光密度值(OD值),并计算对细胞增殖的抑制率(见公式1)。

公式(1)

抑制率 % = [（阴性对照组 O D 值 − 受试物组 O D 值）／阴性对照组 O D 值］ × 100 %

计算不同浓度下的抑制率,再以此求出各样品的IC₅₀值。

2.5 免疫印迹法检测化合物对细胞蛋白表达水平的影响

吸去待检测细胞培养基,用PBS 润洗后即可裂解收样。取预冷的RIPA裂解液加入100×Cocktail 蛋白酶抑制剂、100×磷酸酶抑制剂,将裂解液覆盖细胞,冰上裂解20 min 后刮取细胞收集裂解液于标记好的1.5 mL EP 管中,4 ℃,12 000 r·min^-1,离心15 min。收集离心后的上清到新的1.5 mL EP 管中,加入5×Loading buffer后以金属浴加热10 min 将样品变性,冷却后可直接SDS-PAGE 电泳。电泳结束后取出蛋白胶,按照滤纸、凝胶、PVDF膜的顺序放置,排出气泡,固定三明治夹,加入冰盒并补足电转液进行转膜。电转结束后,用镊子小心从三明治夹中取出PVDF 膜,放入5%脱脂牛奶中室温封闭2 h。封闭结束后用TBST 室温洗膜3次,按照实验需要切下条带放入对应的一抗中4 ℃过夜孵育或者室孵育温1.5 h。回收一抗,将条带用TBST 室温洗涤3 次,加入相应二抗,室温孵育1~2 h。倒去二抗,将孵育完毕的条带室温TBST 洗涤3 次,于化学发光成像仪上显影。

2.6 细胞周期检测试剂盒检测化合物对细胞周期的影响

收集细胞培养液备用。用胰酶消化细胞,之后加入前面收集的细胞培养液,吹打下所有的贴壁细胞,再次收集到离心管内。1 000 g左右离心3~5 min,小心吸除上清,加入约1 mL冰浴预冷的PBS以重悬细胞,再次离心沉淀细胞,小心吸除上清。加入1 mL冰浴预冷70%乙醇,轻轻吹打混匀,4 ℃固定过夜。1 000 g左右离心3~5 min沉淀细胞,小心吸除上清,加入约1 mL冰浴预冷的PBS,重悬细胞。再次离心沉淀细胞,小心吸除上清,后每管细胞样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液(每0.5 mL加入25 μL碘化丙啶染色液(20×)和10 μL RNase A(50×)),缓慢并充分重悬细胞沉淀,37 ℃避光温浴30 min。随后可以4 ℃或冰浴避光存放。染色完成后宜在24 h内完成流式检测,最好能在当日完成流式检测。流式检测和分析:用流式细胞仪在激发波长488 nm波长处检测红色荧光,同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

3 结果与讨论

收起

目标化合物的合成以6-氨基喹啉为起始原料,通过3步反应合成了一系列化合物4a~4p,并通过¹H-NMR、¹³C-NMR和HRMS对所有目标化合物进行了结构确证。采用溴化噻唑蓝四氮唑(MTT)比色法,以MCF-7肿瘤细胞模型,对合成的16个目标化合物4a~4p进行体外抗肿瘤活性评价,活性测试结果列于表1。结果表明,取代基为烷基的抑制活性明显低于芳香基。芳香基不同取代对MCF-7抑制活性有较大影响。在苯环的一取代中(4b~4e),3-氯取代(4e)>4-氯取代(4d)>4-甲氧基取代(4c)>3-甲基取代;在苯环的二取代中(4f~4l),3,6-二氯取代(4l)>4,6-二氯取代(4k)>4,6-二氟取代(4j)>3,5-二甲基取代(4f)>3,4-二甲氧基取代(4h)>2-羟基-4-甲氧基取代(4i)>3,5-二甲氧基取代(4g);在其他杂环代中(4m~4p),2-氯-3-取代喹啉(4p)>噻吩取代(4n)>呋喃取代(4m)>4-喹啉取代(4o)。其中4e和4l效果最好,尤其化合物4e其IC₅₀值为(2.30±0.34)μmol·L^-1。此外,4e对正常乳腺上皮细胞的毒性均较小(IC₅₀>100 μmol·L^-1)。

Western blot实验结果表明,用4e、 4l处理MCF-7细胞4 h后,随着时间推移,与对照组相比,它们可以逐步上调细胞内Nur77蛋白表达水平(图3),并且可以看出4e对于细胞内Nur77蛋白表达的上调作用更为明显。表明4e能显著上调细胞内Nur77水平,而其生物学功能与之相关。周期检测试剂盒检测的实验结果表明,用4e(3 μmol·L^-1)处理 MCF-7细胞24 h后,与对照组相比,处于S期的细胞有着明显增加(图4)。显示细胞发生S期阻滞,则有可能是DNA复制过程中出现了损伤,或者是相关细胞周期蛋白的合成或降解出现问题,从而使得肿瘤细胞无法顺利从S期过渡到G2期。具体的机制则需要进一步研究。

4 结论

收起

通过分子杂合和片段替换策略,合成了16个新的N'-取代-4-{3-(喹啉-6-基)脲基}苯甲酰肼衍生物4a~4p,其结构经¹H-NMR,¹³C-NMR 和HR-MS表征。进一步评估了化合物对乳腺癌细胞的生长抑制作用,其中化合物4e活性最优,且优于阳性药Cisplatin。4e能显著抑制乳腺癌细胞的增殖,并引起乳腺癌细胞出现S期阻滞,其机制可能是通过上调细胞内Nur77蛋白的表达水平。在未来的工作中将会对4e进行进一步研究。

基金

收起

国家级大学生创新创业训练计划项目资助(202113276001)
金华市公益性技术应用研究项目资助(2022-4-031)
宁波市重点公益性科技计划项目资助(2023S015)

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收起

文献

收起

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2024年第59卷第3期

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doi: 10.11669/cpj.2024.03.005

接收时间：2023-05-17
首发时间：2025-11-13
出版时间：2024-02-08

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作者

出版历史

收稿日期：2023-05-17

基金

国家级大学生创新创业训练计划项目资助(202113276001)

金华市公益性技术应用研究项目资助(2022-4-031)

宁波市重点公益性科技计划项目资助(2023S015)

作者信息

¹ 浙江师范大学行知学院, 浙江兰溪 321100

² 厦门大学药学院, 福建厦门 361102

³ 宁波大学科学技术学院, 浙江慈溪 315302

通讯作者:

*胡鸿雨,男,博士,副教授研究方向:肿瘤药物设计合成及活性筛选 Tel:(0579)82291190

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/zgyxzz/CN/10.11669/cpj.2024.03.005

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Compound	Substituent R	IC₅₀/μmol·L^-1
Compound	Substituent R	MCF-7
4a		>50
4b		21.27±0.87
4c		13.68±0.35
4d		9.41±0.27
4e		2.30±0.34
4f		18.03±0.56
4g		20.62±1.56
4h		19.06±1.23
4i		20.18±0.33
4j		10.29±0.36
4k		7.76±0.44
4l		4.14±0.23
4m		23.93±0.34
4n		19.30±1.34
4o		25.50±0.76
4p		12.62±0.78
Cisplatin		9.62±0.28