中国药学杂志

Factor	Level
A:column temperature/℃	26	45
B:the elution gradient started with acetonitrile ratio/%	5	7
C:the elution gradient ended with acetonitrile ratio/%	45	55
D:time of elution/min	12	16
E: phosphoric acid volume in the 1 000 mL aqueous phase/μL	300	1 000

Factor	Level
A:column temperature/℃	26	45
B:the elution gradient started with acetonitrile ratio/%	5	7
C:the elution gradient ended with acetonitrile ratio/%	45	55
D:time of elution/min	12	16
E: phosphoric acid volume in the 1 000 mL aqueous phase/μL	300	1 000

Std.	No.	Column temperature/℃	The elution gradient started with acetonitrile ratio/%	The elution gradient ended with acetonitrile ratio/%	Time of elution/min	Phosphoric acid volume in the 1 000 mL aqueous phase/μL
4	1	45	7	45	12	1 000
8	2	45	7	55	12	300
13	3	26	5	55	16	1 000
11	4	26	7	45	16	1 000
9	5	26	5	45	16	300
3	6	26	7	45	12	300
2	7	45	5	45	12	300
10	8	45	5	45	16	1 000
5	9	26	5	55	12	300
15	10	26	7	55	16	300
12	11	45	7	45	16	300
6	12	45	5	55	12	1 000
14	13	45	5	55	16	300
16	14	45	7	55	16	1 000
7	15	26	7	55	12	1 000
1	16	26	5	45	12	1 000

Std.	No.	Column temperature/℃	The elution gradient started with acetonitrile ratio/%	The elution gradient ended with acetonitrile ratio/%	Time of elution/min	Phosphoric acid volume in the 1 000 mL aqueous phase/μL
4	1	45	7	45	12	1 000
8	2	45	7	55	12	300
13	3	26	5	55	16	1 000
11	4	26	7	45	16	1 000
9	5	26	5	45	16	300
3	6	26	7	45	12	300
2	7	45	5	45	12	300
10	8	45	5	45	16	1 000
5	9	26	5	55	12	300
15	10	26	7	55	16	300
12	11	45	7	45	16	300
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14	13	45	5	55	16	300
16	14	45	7	55	16	1 000
7	15	26	7	55	12	1 000
1	16	26	5	45	12	1 000

Peak number	Mode of ion	t_R/min	Molecular formula	M_r	m/z(Parent ion)	m/z(Fragment)
1	[M-H]^-	12.31	C₂₀H₂₀N₄O₃	364.153 0	363.146 7	230.094 5,102.033 7
2	[M-H]^-	13.08	C₂₁H₂₂N₄O₃	378.168 6	377.161 6	244.108 7,102.033 5
3	[M-H]^-	14.20	C₂₂H₂₄N₄O₃	392.184 3	391.177 9	258.124 5,102.033 8
4	[M-H]^-	18.71	C₂₁H₂₀N₄O₃	376.153 0	375.146 3	343.120 0,315.088 7

Peak number	Mode of ion	t_R/min	Molecular formula	M_r	m/z(Parent ion)	m/z(Fragment)
1	[M-H]^-	12.31	C₂₀H₂₀N₄O₃	364.153 0	363.146 7	230.094 5,102.033 7
2	[M-H]^-	13.08	C₂₁H₂₂N₄O₃	378.168 6	377.161 6	244.108 7,102.033 5
3	[M-H]^-	14.20	C₂₂H₂₄N₄O₃	392.184 3	391.177 9	258.124 5,102.033 8
4	[M-H]^-	18.71	C₂₁H₂₀N₄O₃	376.153 0	375.146 3	343.120 0,315.088 7

Std.	No.	R₁	R₂	T₁	N₁	t_R	R₃	T₂	N₂
4	1	3.328	4.408	0.796	30 360.5	7.779	1.772	1.050	73 050.9
8	2	3.151	4.075	0.880	46 671.1	7.967	1.543	0.882	73 257.9
13	3	3.654	3.984	0.735	33 982.0	8.842	2.794	1.057	71 223.2
11	4	3.853	4.344	0.715	23 810.6	8.997	13.660	1.092	65 899.9
9	5	3.528	4.375	0.922	39 141.4	10.5	1.307	1.311	72 864.5
3	6	3.109	4.031	0.939	35 876.0	8.774	15.051	1.370	63 765.4
2	7	3.310	4.290	0.901	51 439.9	9.031	1.691	1.022	79 511.9
10	8	3.840	4.988	0.712	35 283.3	9.247	28.248	0.969	78 843.3
5	9	2.673	3.458	0.919	44 899.5	8.445	8.174	1.073	73 041.9
15	10	3.332	4.178	0.941	35 254.4	9.058	1.241	1.368	63 111.0
12	11	3.947	5.329	0.871	37 467.8	9.719	22.890	1.060	70 160.2
6	12	3.106	3.952	0.786	44 215.5	7.658	1.795	0.948	79 935.6
14	13	3.534	4.602	0.883	49 896.9	9.422	2.719	0.978	79 838.1
16	14	3.489	4.649	0.751	29 302.7	8.011	10.858	1.040	75 764.1
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1	16	3.461	3.625	0.746	34 611.0	8.482	0.890	0.985	74 708.8

Std.	No.	R₁	R₂	T₁	N₁	t_R	R₃	T₂	N₂
4	1	3.328	4.408	0.796	30 360.5	7.779	1.772	1.050	73 050.9
8	2	3.151	4.075	0.880	46 671.1	7.967	1.543	0.882	73 257.9
13	3	3.654	3.984	0.735	33 982.0	8.842	2.794	1.057	71 223.2
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2	7	3.310	4.290	0.901	51 439.9	9.031	1.691	1.022	79 511.9
10	8	3.840	4.988	0.712	35 283.3	9.247	28.248	0.969	78 843.3
5	9	2.673	3.458	0.919	44 899.5	8.445	8.174	1.073	73 041.9
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12	11	3.947	5.329	0.871	37 467.8	9.719	22.890	1.060	70 160.2
6	12	3.106	3.952	0.786	44 215.5	7.658	1.795	0.948	79 935.6
14	13	3.534	4.602	0.883	49 896.9	9.422	2.719	0.978	79 838.1
16	14	3.489	4.649	0.751	29 302.7	8.011	10.858	1.040	75 764.1
7	15	3.201	3.437	0.764	31 432.0	7.516	2.331	0.940	67 837.1
1	16	3.461	3.625	0.746	34 611.0	8.482	0.890	0.985	74 708.8

Response	Source	df	Sum of squares	Mean square	F-value	P-value	Significance
R₁	Model	5	1.58	0.315 7	65.1	<0.000 1	Significant
	A	1	0.049 9	0.049 9	10.28	0.009 4
	C	1	0.312 6	0.312 6	64.45	<0.000 1
	D	1	0.920 9	0.920 9	189.9	<0.000 1
	E	1	0.113 4	0.113 4	23.39	0.000 7
	AE	1	0.181 7	0.181 7	37.47	0.000 1
R₂	Model	5	3.88	0.775 1	91.29	<0.000 1	Significant
	A	1	1.48	1.48	173.98	<0.000 1
	B	1	0.086 9	0.086 9	10.23	0.009 5
	C	1	0.583 3	0.583 3	68.7	<0.000 1
	D	1	1.67	1.67	196.89	<0.000 1
	E	1	0.056 4	0.056 4	6.65	0.027 5
T₁	Model	2	0.100 1	0.050 1	71.17	<0.000 1	Significant
	D	1	0.002 5	0.002 5	3.55	0.082 2
	E	1	0.097 6	0.097 6	138.79	<0.000 1
N₁	Model	5	883 365 992.330	176 673 198.466	67.51	<0.000 1	Significant
	A	1	130 136 126.876	130 136 126.876	49.73	<0.000 1
	B	1	250 385 913.538	250 385 913.538	95.68	<0.000 1
	C	1	47 830 582.497	47 830 582.497	18.28	0.001 6
	D	1	78 173 365.326	78 173 365.326	29.87	0.000 3
	E	1	376 840 004.093	376 840 004.093	144	<0.000 1
t_R	Model	5	9.76	1.95	135.49	<0.000 1	Significant
	A	1	0.198 0	0.198 0	13.74	0.004 1
	B	1	0.905 4	0.905 4	62.82	<0.000 1
	C	1	1.97	1.97	136.49	<0.000 1
	D	1	4.15	4.15	287.65	<0.000 1
	E	1	2.55	2.55	176.76	<0.000 1
R₃	Model	9	1 001.99	111.33	6.75	0.015 3	Significant
	A	1	42.48	42.48	2.57	0.159 8
	B	1	29.51	29.51	1.79	0.229 6
	C	1	182.62	182.62	11.07	0.015 9
	D	1	159.21	159.21	9.65	0.021 0
	E	1	3.74	3.74	0.226 5	0.650 9
	AD	1	266.98	266.98	16.18	0.006 9
	BE	1	63.76	63.76	3.86	0.969
	CD	1	115.2	115.2	6.98	0.384
	DE	1	138.49	138.49	8.39	0.027 4
T₂	Model	7	0.313 7	0.044 8	17.51	0.000 3	Significant
	A	1	0.097 0	0.097 0	37.93	0.000 3
	B	1	0.013 2	0.013 2	5.17	0.052 6
	C	1	0.020 5	0.020 5	8.01	0.022 1
	D	1	0.022 9	0.022 9	8.95	0.017 3
	E	1	0.060 3	0.060 3	23.58	0.001 3
	AE	1	0.077 7	0.077 7	30.38	0.000 6
	CD	1	0.021 9	0.021 9	8.58	0.019 0
N₂	Model	2	413 522 938.55	206 761 469.28	70.34	<0.000 1	Significant
	A	1	209 597 985.98	209 597 985.98	71.3	<0.000 1
	B	1	203 924 952.57	203 924 952.57	69.37	<0.000 1

Response	Source	df	Sum of squares	Mean square	F-value	P-value	Significance
R₁	Model	5	1.58	0.315 7	65.1	<0.000 1	Significant
	A	1	0.049 9	0.049 9	10.28	0.009 4
	C	1	0.312 6	0.312 6	64.45	<0.000 1
	D	1	0.920 9	0.920 9	189.9	<0.000 1
	E	1	0.113 4	0.113 4	23.39	0.000 7
	AE	1	0.181 7	0.181 7	37.47	0.000 1
R₂	Model	5	3.88	0.775 1	91.29	<0.000 1	Significant
	A	1	1.48	1.48	173.98	<0.000 1
	B	1	0.086 9	0.086 9	10.23	0.009 5
	C	1	0.583 3	0.583 3	68.7	<0.000 1
	D	1	1.67	1.67	196.89	<0.000 1
	E	1	0.056 4	0.056 4	6.65	0.027 5
T₁	Model	2	0.100 1	0.050 1	71.17	<0.000 1	Significant
	D	1	0.002 5	0.002 5	3.55	0.082 2
	E	1	0.097 6	0.097 6	138.79	<0.000 1
N₁	Model	5	883 365 992.330	176 673 198.466	67.51	<0.000 1	Significant
	A	1	130 136 126.876	130 136 126.876	49.73	<0.000 1
	B	1	250 385 913.538	250 385 913.538	95.68	<0.000 1
	C	1	47 830 582.497	47 830 582.497	18.28	0.001 6
	D	1	78 173 365.326	78 173 365.326	29.87	0.000 3
	E	1	376 840 004.093	376 840 004.093	144	<0.000 1
t_R	Model	5	9.76	1.95	135.49	<0.000 1	Significant
	A	1	0.198 0	0.198 0	13.74	0.004 1
	B	1	0.905 4	0.905 4	62.82	<0.000 1
	C	1	1.97	1.97	136.49	<0.000 1
	D	1	4.15	4.15	287.65	<0.000 1
	E	1	2.55	2.55	176.76	<0.000 1
R₃	Model	9	1 001.99	111.33	6.75	0.015 3	Significant
	A	1	42.48	42.48	2.57	0.159 8
	B	1	29.51	29.51	1.79	0.229 6
	C	1	182.62	182.62	11.07	0.015 9
	D	1	159.21	159.21	9.65	0.021 0
	E	1	3.74	3.74	0.226 5	0.650 9
	AD	1	266.98	266.98	16.18	0.006 9
	BE	1	63.76	63.76	3.86	0.969
	CD	1	115.2	115.2	6.98	0.384
	DE	1	138.49	138.49	8.39	0.027 4
T₂	Model	7	0.313 7	0.044 8	17.51	0.000 3	Significant
	A	1	0.097 0	0.097 0	37.93	0.000 3
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	CD	1	0.021 9	0.021 9	8.58	0.019 0
N₂	Model	2	413 522 938.55	206 761 469.28	70.34	<0.000 1	Significant
	A	1	209 597 985.98	209 597 985.98	71.3	<0.000 1
	B	1	203 924 952.57	203 924 952.57	69.37	<0.000 1

Limit/%	m(Added)/μg	m(Original)/μg	m(Measured)/μg	Recovery rate/%	RSD/%
80	8 000	10 000	17 884.65	98.56	0.55
	8 000	10 000	17 903.49	98.79
	8 000	10 000	17 937.26	99.22
100	10 000	10 000	19 931.56	99.32
	10 000	10 000	19 902.08	99.02
	10 000	10 000	19 832.98	98.33
120	12 000	10 000	21 881.18	99.01
	12 000	10 000	21 990.21	99.92
	12 000	10 000	21 778.47	98.15

Limit/%	m(Added)/μg	m(Original)/μg	m(Measured)/μg	Recovery rate/%	RSD/%
80	8 000	10 000	17 884.65	98.56	0.55
	8 000	10 000	17 903.49	98.79
	8 000	10 000	17 937.26	99.22
100	10 000	10 000	19 931.56	99.32
	10 000	10 000	19 902.08	99.02
	10 000	10 000	19 832.98	98.33
120	12 000	10 000	21 881.18	99.01
	12 000	10 000	21 990.21	99.92
	12 000	10 000	21 778.47	98.15

基于AQbD理念的非奈利酮HPLC分析方法的开发和验证

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杨越悦 ¹ , 李畅 ² , 韩峰 ³ , 黄朝强 ² , 何昱 ¹^,^*

中国药学杂志 | 论著 2025,60(10): 1077-1087

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中国药学杂志 | 论著 2025, 60(10): 1077-1087

基于AQbD理念的非奈利酮HPLC分析方法的开发和验证

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杨越悦¹, 李畅², 韩峰³, 黄朝强², 何昱¹^,^*

作者信息

¹ 浙江中医药大学药学院, 杭州 310053

² 浙江中医药大学基础医学院, 杭州 310053

³ 成都蜀西制药有限公司, 成都 611600

杨越悦,女,硕士研究生研究方向:药物分析与新药研发

通讯作者:

^*何昱,女,教授,博士生导师研究方向:药物分析与新药研发 Tel:(0571)61768145

Development and Validation of the HPLC Analysis Method for Finerenone Based on the AQbD Concept

Yueyue YANG¹, Chang LI², Feng HAN³, Chaoqiang HUANG², Yu HE¹^,^*

Affiliations

¹ School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

² School of Basic Medicine Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

³ Chengdu Shuxi Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu 611600, China

出版时间: 2025-05-01 doi: 10.11669/cpj.2025.10.011

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摘要

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目的基于分析方法质量源于设计(AQbD)的理念,开发并验证非奈利酮高效液相色谱(HPLC)分析方法。方法液质联用技术(LC-MS)鉴定非奈利酮原料药的杂质组分,而后通过析因设计(2^5-1)筛选并优化非奈利酮HPLC色谱条件,考察了洗脱梯度起始乙腈比例、洗脱梯度结束乙腈比例、洗脱时间、柱温和磷酸水溶液的浓度多个因素,评价关键质量属性(CMAs)与关键分析参数(CMPs)间的关系,生成方法可操作设计区域(MODR),最终进行方法学验证。结果分析得到每个CMPs对CMAs的影响程度,并从MODR中选择优化的色谱条件为柱温45 ℃,0.06%磷酸水,梯度洗脱初始为5%乙腈,结束为45%乙腈,运行16 min,所建立的非奈利酮分析方法的精密度、稳定性、线性关系以及加样回收结果良好。结论基于AQbD理念建立的色谱条件,可以实现非奈利酮与杂质良好分离,准确评估非奈利酮含量,有效控制药品质量。

关键词

分析方法质量源于设计 / 非奈利酮 / 析因设计 / 高效液相色谱法 / 方法可操作设计区域

Abstract

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OBJECTIVE To develop and validate an HPLC analytical method for finerenone, based on the concept of analytical quality by design (AQbD). METHODS LC-MS was used to identify the impurity fractions of finerenone API, and then the HPLC chromatographic conditions of finerenone were screened and optimized by analytical factorial design (2^5-1), which examined several factors, such as the acetonitrile proportion at the beginning of the elution gradient, the acetonitrile proportion at the end of the elution gradient, the elution time, the column temperature and the concentration of phosphoric acid aqueous solution, to evaluate the relationship between the critical method attributes (CMAs) and the critical method parameters (CMPs), and to generate the method operable design region (MODR), and finally perform methodological validation. RESULTS The effects of each CMPs on CMAs were analyzed, and the optimized chromatographic conditions from MODR were column temperature 45 ℃, 0.06% phosphoric acid water, gradient elution starting with 5% acetonitrile and ending with 45% acetonitrile, running for 16 min. The established finerenone analysis method had good precision, stability, linearity and sample recovery results. CONCLUSION The chromatographic conditions established based on the AQbD concept can achieve a good separation of finerenone from impurities, accurately evaluate the content of finerenone, and effectively control the quality of the drug.

Key words

analytical quality by design / finerenone / factorial design / high-performance liquid chromatography / method operable design region

引用本文

杨越悦, 李畅, 韩峰, 黄朝强, 何昱. 基于AQbD理念的非奈利酮HPLC分析方法的开发和验证. 中国药学杂志, 2025 , 60 (10) : 1077 -1087 . DOI: 10.11669/cpj.2025.10.011

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正文

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慢性肾脏病合并2型糖尿病患者群体庞大、病情复杂,且往往面临着心血管疾病风险增加以及肾脏功能进一步恶化等诸多严峻挑战^[1-3]。非奈利酮(finerenone)能够选择性地阻断盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor,MR),通过其独特的作用机制,发挥抗炎、抗纤维化作用,从而有效降低患者因肾脏疾病和糖尿病引发的心血管不良事件发生风险,延缓肾脏疾病的进展,为改善患者的预后提供了有效的治疗途径^[4-7]。非奈利酮是全球首个被批准用于治疗与2型糖尿病相关的慢性肾脏病的药物,于2021年先后在美国、欧盟、日本和中国等地获批上市,凭借其良好的临床疗效而备受关注^[8-10]。非奈利酮化学名称为(4S)-4-(4-氰基-2-甲氧基苯基)-5-乙氧基-2,8-二甲基-1,4-二氢-1,6-萘啶-3-甲酰胺,分子式为C₂₁H₂₂N₄O₃,相对分子质量为378.43^[11-12]。非奈利酮在合成过程以及储存过程中可能会产生有关物质,因此开发出一种准确耐用的分析方法用于测定非奈利酮及其相关物质尤为重要。目前尚无对非奈利酮及其有关物质进行高效液相色谱(HPLC)分析方法研究的相关文献,且没有基于实验设计(design of experiment,DOE)方法来研究非奈利酮的报道。

随着质量源于设计(quality by design,QbD)理念在分析方法构建中的应用,分析方法质量源于设计(analytical quality by design,AQbD)的概念逐渐形成^[13]。将 AQbD 用于液相分析方法构建可解决传统“试错法”开发策略中存在的研发周期长、方法适应性差以及多组分同时分析困难等诸多问题,全面、系统且深入地评估影响结果因素,快速开发出稳健且有调控空间的色谱方法^[13-15]。AQbD主要涵盖以下关键步骤:定义分析方法目标(ATP)、评估关键方法属性(CMAs)和关键方法参数(CMPs)、生成方法可操作设计区域(MODR)、制定方法控制策略等^[14-16]。采用AQbD开发液相方法时常使用DOE。其中析因设计是一种高效率的实验设计方法,可以通过较少的实验次数控制或消除其他因素对实验结果的干扰,分析各因素的交互作用,使分析结果更可靠和稳定,同时筛选出对实验结果有显著影响的因素^[17-18]。本实验首先通过液质联用技术确定非奈利酮中可能存在的杂质。而后基于AQbD理念,通过析因设计对非奈利酮的HPLC分析方法进行开发、优化和验证,考察流动相比例、柱温、磷酸溶液浓度、梯度洗脱条件等色谱参数,从而生成MODR,为非奈利酮的质量控制提供准确耐用的定量方法。

1 材料与仪器

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1.1 仪器

1260型HPLC仪,配G7111B型四元泵、G7129A型自动进样器、G7130A型柱温箱、G7117C型DAD检测器、Chemstation工作站系统(美国Agilent公司); U3000 UHPLC 系统、Q-Exactive 高分辨质谱仪(美国Thermo公司);MX205DU/A型十万分之一电子天平(上海Mettler Toledo公司);AL104型万分之一电子天平(上海Mettler Toledo公司);KQ5200B型超声仪(昆山市超声仪器有限公司);CASCADA Ⅲ.Ⅰ-10纯水仪[安维迪生命科学(浙江)有限公司]。

1.2 材料

非奈利酮原料药(苏州正济药业,批号:3A562312071W);非奈利酮片剂(拜耳医药保健有限公司,批号:BXK4KA1);非奈利酮(批号:1050477-31-0)、非奈利酮杂质1(批号:2640280-84-6)、非奈利酮杂质2(批号:2640280-85-7)和非奈利酮杂质3(批号:2640280-51-4)[优客嘉化(北京)化工科技有限公司];乙腈为色谱级(纯度>99%);磷酸(纯度>98%)、甲酸(纯度>98%)为分析纯;自制超纯水。

2 方法

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2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

分别取非奈利酮、杂质1、杂质2、杂质3对照品适量,精密称定,加体积分数70%乙腈超声溶解,转移至5 mL量瓶中定容,分别制成一定质量浓度的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备

取非奈利酮原料药10 mg,精密称定,加体积分数70%乙腈超声溶解,转移至25 mL量瓶中定容,溶液过0.22 μm滤膜,取续滤液即得供试品溶液。

2.2 液质条件

色谱条件:Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱(3.0 mm×150 mm,2.7 μm),柱温45 ℃,流动相为0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脱程序为0~2 min,5%B,2~16 min,5%~45%B,16~20 min,45%~90%B,20~28 min,90%B,流速0.4 mL·min^-1,进样量5 μL。

质谱条件:离子源为加热电喷雾离子源(HESI),正、负离子模式检测。质谱参数:扫描模式为Full MS/ddMS2;喷雾电压±2.5 kV;鞘气压344.7 kPa;辅助气压96.5 kPa;离子传输管温度300 ℃;辅助加热器温度500 ℃;扫描范围m/z 100~1 500,HCD碰撞能量为30 eV。仪器控制和数据采集使用Thermo Xcalibur 2.3.1。

2.3 HPLC色谱条件

Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱(3.0 mm×150 mm,2.7 μm);流动相为磷酸水(A)-乙腈(B),流速0.8 mL·min^-1,进样量5 μL,磷酸水浓度、柱温、梯度洗脱程序由析因设计确定。

2.4 ATP的确定

本研究分析方法的目标是准确、专属、定量测定非奈利酮原料及其片剂中非奈利酮含量,其线性Y轴截距项t检验概率P应>0.05,回收率均值在98.00%~102.00%,相对标准偏差(RSD)<2.00%,日内精密度RSD<2.00%,中间精密度仪器间、分析日期间无显著差异,分析方法具有较大的操作设计空间。

2.5 CMAs的确定和CMPs的选择

为实现ATP,需考察CMAs(诸如分离度、对称性、理论板数等)。本研究的CMAs为非奈利酮与杂质1和杂质2之间的分离度,以及杂质3与前峰的分离度,分别记为分离度1(R₁)、分离度2(R₂)、分离度3(R₃)表示。对非奈利酮的理论板数(N₁)、对称因子(T₁)和保留时间(t_R)以及杂质3的理论板数(N₂)和对称因子(T₂)也作为CMAs。对影响CMAs的CMPs在风险评估基础上选择了柱温(A)、洗脱梯度起始乙腈比例(B)、洗脱梯度结束乙腈比例(C)、洗脱时间(D)、磷酸水浓度(E)为CMPs。在预实验基础上确定了各因子水平,采用2^5-1的析因设计评估每个CMPs对CMAs的影响程度,各因素及相应水平见表1。Design-Expert^®(软件版本12)生成16次实验(表2)。对测量的响应R₁、R₂、R₃、N₁、T₁、t_R、N₂、T₂进行线性回归和方程拟合,确定该设计模型拟合程度,以评估每种因子对非奈利酮色谱属性的影响,从而分析生成MODR。

2.6 HPLC方法验证

2.6.1 线性关系考察

取非奈利酮对照品适量,精密称定,加体积分数70%乙腈超声溶解,转移至5 mL量瓶中定容,即得质量浓度为600 μg·mL^-1的非奈利酮对照品母液。精密吸取非奈利酮对照品母液,用体积分数70%乙腈分别稀释成18、36、72、150、300、600 μg·mL^-1的非奈利酮对照品溶液,进样测定,以非奈利酮对照品溶液的质量浓度为横坐标X,峰面积为纵坐标Y,绘制标准曲线,得到回归方程和相关系数。

2.6.2 加样回收率实验

取非奈利酮原料药10 mg,精密称定,加体积分数70%乙腈超声溶解,转移至25 mL量瓶中定容,按照0.8∶1、1∶1、1.2∶1的比例加入非奈利酮对照品制备成样品溶液,每组3份,进样测定并计算加样回收率。

2.6.3 精密度实验

日内精密度实验:取非奈利酮对照品适量,精密称定,加体积分数70%乙腈超声溶解,转移至25 mL量瓶中定容,即得质量浓度为72.00 μg·mL^-1的对照品溶液,连续进样6次,计算非奈利酮峰面积的RSD。

中间精密度实验:按照加样回收实验中1∶1的比例配制样品溶液。由操作人员在不同时间采用不同仪器(Agilent 1260型和Thermo U3000型高效液相色谱仪)对非奈利酮含量进行检测,以此考察随机变动因素对精密度的影响。

2.6.4 稳定性实验

将非奈利酮原料药供试品溶液,在室温条件下放置0、2、4、8、12、24 h后,按确定的色谱条件测定,考察供试品溶液的稳定性,计算非奈利酮峰面积的RSD。

2.6.5 检测限和定量限

检测限(limit of detection,LOD)和定量限(limit of quantitation,LOQ)常用的测量方法有直观法、信噪比法和线性法。其中线性法相较于直观法和信噪比法,避免了人为选择噪声部分导致结果偏差的可能性,同时考虑了多次进样分析之间的差异,结果更为可靠。LOD和LOQ的计算公式见公式1~2。

公式(1)LOD=3.3δ/S

公式(2)LOQ=10δ/S

式中,δ表示截距的标准偏差,S表示标准曲线的斜率,由回归分析得到的标准曲线确定^[19-21]。

3 结果

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3.1 预实验及HPLC分析

在前期开展的预实验阶段,通过HPLC-DAD检测器对非奈利酮及其相关杂质的紫外吸收光谱予以测定。经检测发现各成分的紫外吸收差异并不显著,均在251 nm波长附近有最大吸收。

鉴于分离度、峰形以及系统压力等关键要素,经过严谨的评估与分析,最终选定流速为0.8 mL·min^-1,此流速能够在确保良好分离效果与峰形的同时,可使系统压力维持在合理范围,为实验的精准性与可靠性提供有力保障。

考虑到非奈利酮样品采用乙腈作为溶解溶剂,为最大程度维持样品在整个色谱分析系统中处于稳定的溶剂环境,避免因溶剂转换而引发诸如样品析出,峰形改变或保留时间波动等不良现象,故而流动相选择乙腈。

在色谱柱的筛选过程中,针对Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱(3.0 mm×150 mm,2.7 μm)和Bridge RP色谱柱(3.0 mm×150 mm,3.5 μm)的分离效能进行了比较研究,结果表明Agilent InfinityLab Poroshell 120 EC-C₁₈色谱柱(3.0 mm×150 mm,2.7 μm)在分离效果、峰形以及理论板数等方面较优,所以本研究选择此色谱柱进行后续的研究。

3.2 非奈利酮片与原料药杂质相似性分析

取非奈利酮片和非奈利酮原料药10 mg,加体积分数70%乙腈溶解,定容摇匀。分别进样记录色谱图,见图1。根据图谱分析可知,非奈利酮片与非奈利酮原料药中存在的杂质具有相似性,因此后续实验可以采用非奈利酮原料药代替非奈利酮片进行后续研究。

3.3 液质联用分析非奈利酮的杂质组成

液质联用技术(LC-MS)在正、负离子模式下对非奈利酮片的化学成分进行检测,得到(+)ESI-MS和(-)ESI-MS的质谱总离子流图,见图2。根据得到的化合物一级、二级质谱数据的质谱碎片离子信息等初步进行定性分析,并结合对照品比对,最终确定出非奈利酮原料药中3个杂质成分,见表3和图3。在本次研究中分析得到在负离子模式下杂质4的母离子为:265.147 9,目前所获取的数据不足以支持对其化学结构的准确判定。

3.4 析因设计筛选色谱系统方法参数

为找出各因子对各响应值的影响显著性,利用Design-Expert^®软件对五因素两水平析因设计(2^5-1)的实验结果(表4)进行回归分析,分别剔除不显著的项,得到8个拟合的多项式方程,模型的概率值P均<0.05,调整r²>0.9。

对响应R₁、R₂、T₁、N₁、t_R、R₃、T₂和N₂进行Pareto图及多变量回归分析,结果显示柱温对R₁、R₂、N₁、t_R、T₂和N₂具有显著性影响;洗脱梯度起始乙腈比例对R₂、N₁、t_R、R₃、T₂和N₂具有显著性影响;洗脱梯度结束乙腈比例对R₁、R₂、N₁和t_R具有显著性影响;洗脱时间对R₁、R₂、N₁、t_R、R₃和T₂具有显著性影响;磷酸水浓度对R₁、R₂、T₁、N₁、t_R和T₂具有显著性影响,两因素交互作用结果显示,各因素之间具有一定的交互作用(图4)。实验数据均为正态分布。表5总结了8个回归模型的显著性测试结果。

8个多项式模型分别表示如下:

R₁=2.020 93+0.026 710A-0.027 954C+0.119 955D+0.001 378E-0.000 032AE

R₂=2.412 41+0.031 983A+0.073 679B-0.038 187C+0.161 617D-0.000 170E

T₁=1.061 44-0.006 244D-0.000 223E

N₁=58 001.673 22+300.203 22A-3 955.896 81B+345.798 29C-1 105.196 29D-13.865 98E

t_R=11.242 72-0.011 711A-0.237 875B-0.070 125C+0.254 500D-0.001 140E

R₃=-61.091 40-2.838 43A+5.065 39B+3.080 84C+4.629 11D-0.023 239E+0.214 996AD-0.005 704BE-0.268 323CD+0.004 203DE

T₂=4.473 17-0.021 822A+0.028 754B-0.059 003C-0.166 244D-0.000 920E+0.000 021AE+0.003 703CD

N₂=80 571.180 82+380.986 82A-3 570.057 36B

依据上述析因实验结果,设置R₁、R₂、R₃>2,1.2>T₁、T₂>0.8,N₁>23 810,N₂>63 111,10.5 min>t_R,搜索同时满足以上目标的色谱方法参数变量范围,绘制MODR。固定2个CMPs的值,通过分析3个CMPs创建MODR,如图5中黄色区域为稳健区,灰色为风险区。其中当柱温从26 ℃升高到45 ℃时,MODR的范围逐渐变大;而洗脱梯度结束乙腈比例以及梯度洗脱时间的改变不会对MODR的范围造成较大影响,随着洗脱梯度结束乙腈比例的变大,MODR的范围随之增大再缩小;MODR的范围随着洗脱时间的变长逐渐减小。

在MODR范围内,选取了MODR内区域点1以及边缘点2。对MODE内区域点1(A: 45 ℃,B:5%,C:45%,D: 16 min,E: 600 μL)和边缘点2(A: 35 ℃,B:5%,C:55%,D: 14 min,E: 600 μL)进行验证,获得的CMAs的结果为R₁、R₂、R₃>2,1.2>T₁、T₂>0.8,N₁>23 810,N₂>63111,10.5 min>t_R,全部达标,表明所建立的MODR较为可靠。最终选择区域点1作为优化方法:色谱条件为柱温45 ℃,0.06%磷酸为A相,乙腈为B相,梯度洗脱初始为5%乙腈,结束为45%乙腈,运行16 min,初始5%运行2 min,梯度洗脱程序:0~2 min,5%B;2~16 min,5%~45%B;16~17 min,45%~90%B;17~22 min,90%B;22~23 min,90%~5%B;23~28 min,5%B,分析得到的非奈利酮色谱图见图6。

3.5 HPLC方法学考察

3.5.1 线性关系考察

进样6个质量浓度的非奈利酮对照品溶液,以质量浓度为横坐标X,非奈利酮峰面积为纵坐标Y,绘制标准曲线,得到回归方程为Y=21.004X-9.909 8,r²=1.000,线性Y轴截距项t检验概率P>0.05,表明非奈利酮质量浓度在18.00~600.00 μg·mL^-1与峰面积的线性关系良好。

3.5.2 加样回收率实验

加样回收实验结果见表6。结果显示,加样回收率在98.15%~99.92%,RSD为0.55%,符合方法学验证要求,表明该方法准确度良好。

3.5.3 精密度实验

日内精密度实验结果显示,非奈利酮峰面积的RSD为0.17%(n=6),表明仪器精密度良好。

中间精密度实验结果非奈利酮仪器间回收率均值为100.75%,RSD为0.19%,日期间回收率均值为100.75%,RSD为0.63%。数据经分析仪器间无差异,但日期间有较小差异。

3.5.4 稳定性实验

稳定性实验结果显示,非奈利酮峰面积的RSD为0.47%,表明所配溶液在24 h内稳定性良好。

3.5.5 检测限和定量限

根据线性实验结果分析可得,δ为7.016,S为21.004。计算可得LOD为1.10 μg·mL^-1,LOQ为3.34 μg·mL^-1。

4 讨论

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本研究采用液质联用技术对非奈利酮及其杂质进行检测,从而确保药物的疗效及安全性。根据分析结果,预测了各杂质HPLC保留行为,因杂质均含有较多极性基团,极性较强,结构与非奈利酮相似,开发HPLC方法时调整水相的比例优化分离度,并选择梯度洗脱以实现更高效的分离。通过LC-MS确定出非奈利酮中的3个杂质成分,对非奈利酮的质量控制和安全评估具有重要意义。但是根据目前的数据不足以对未知杂质4的化学结构进行准确判定。针对这一问题,可考虑调整色谱参数和结合其他分析技术,如核磁共振、红外光谱等,以获取更全面的结构信息。

基于AQbD理念开发并验证非奈利酮的HPLC分析方法,鉴于本研究涉及的参数较多,选用析因设计(2^5-1)来对非奈利酮的HPLC方法开发中的各类参数进行优化。该实验设计可以大幅减少实验次数,快速筛选出对响应变量有显著影响的关键因素,了解各因素之间的交互作用及它们对最终分析结果的影响,从而有针对性地对这些参数进行优化调整,以达到最佳的分析效果^[22-23]。本研究以非奈利酮主峰R₁、R₂、N₁、T₁和t_R,杂质3的R₃、N₂和T₂为CMAs,通过析因设计建立CMAs和CMPs之间的多项式方程,获得MODR,从中选择优化的色谱条件为柱温45 ℃,流动相为0.06%磷酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脱程序为:0~2 min,5%B;2~16 min,5%~45%B;16~17 min,45%~90%B;17~22 min,90%B;22~23 min,90%~5%B;23~28 min,5%B,并对其进行了方法学的验证。在MODR内,能够保证非奈利酮与杂质之间得到有效分离和准确分析,提高了分析方法的可靠性、稳定性和可重复性。但是在开发非奈利酮HPLC分析方法过程中仍存在一定的局限性,对于流速、色谱柱等因素仅开展了前期的预实验考察,并未深入评估其对分析结果可能产生的影响。此外,由于有关物质峰面积较小,暂无法对其进行准确定量,后续可考虑在现有方法的基础上结合其他检测方法,以提高定量准确性。AQbD理念成功应用于在非奈利酮分析方法开发中,无疑为其相关研究及生产过程提供了可靠的分析手段,保障非奈利酮生产质量,为药物分析方法的构建和优化提供新的思路。

基金

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浙江省“尖兵”“领雁”研发攻关计划资助(2025C02192)

参考文献

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2025年第60卷第10期

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文章信息

doi: 10.11669/cpj.2025.10.011

接收时间：2024-12-26
首发时间：2025-11-09
出版时间：2025-05-01

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作者

出版历史

收稿日期：2024-12-26

基金

浙江省“尖兵”“领雁”研发攻关计划资助(2025C02192)

作者信息

¹ 浙江中医药大学药学院, 杭州 310053

² 浙江中医药大学基础医学院, 杭州 310053

³ 成都蜀西制药有限公司, 成都 611600

通讯作者:

^*何昱,女,教授,博士生导师研究方向:药物分析与新药研发 Tel:(0571)61768145

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/zgyxzz/CN/10.11669/cpj.2025.10.011

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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EndNote
RefWorks
TxT

Factor	Level
A:column temperature/℃	26	45
B:the elution gradient started with acetonitrile ratio/%	5	7
C:the elution gradient ended with acetonitrile ratio/%	45	55
D:time of elution/min	12	16
E: phosphoric acid volume in the 1 000 mL aqueous phase/μL	300	1 000

Factor

Level

-1

A:column temperature/℃

B:the elution gradient started with acetonitrile ratio/%

C:the elution gradient ended with acetonitrile ratio/%

D:time of elution/min

E: phosphoric acid volume in the 1 000 mL aqueous phase/μL

300

1 000

Std.	No.	Column temperature/℃	The elution gradient started with acetonitrile ratio/%	The elution gradient ended with acetonitrile ratio/%	Time of elution/min	Phosphoric acid volume in the 1 000 mL aqueous phase/μL
4	1	45	7	45	12	1 000
8	2	45	7	55	12	300
13	3	26	5	55	16	1 000
11	4	26	7	45	16	1 000
9	5	26	5	45	16	300
3	6	26	7	45	12	300
2	7	45	5	45	12	300
10	8	45	5	45	16	1 000
5	9	26	5	55	12	300
15	10	26	7	55	16	300
12	11	45	7	45	16	300
6	12	45	5	55	12	1 000
14	13	45	5	55	16	300
16	14	45	7	55	16	1 000
7	15	26	7	55	12	1 000
1	16	26	5	45	12	1 000

Std.

No.

Column
temperature/℃

The elution gradient started
with acetonitrile ratio/%

The elution gradient ended
with acetonitrile ratio/%

Time of
elution/min

Phosphoric acid volume
in the 1 000 mL aqueous phase/μL

1 000

300

1 000

300

1 000

300

1 000

300

1 000

Peak number	Mode of ion	t_R/min	Molecular formula	M_r	m/z(Parent ion)	m/z(Fragment)
1	[M-H]^-	12.31	C₂₀H₂₀N₄O₃	364.153 0	363.146 7	230.094 5,102.033 7
2	[M-H]^-	13.08	C₂₁H₂₂N₄O₃	378.168 6	377.161 6	244.108 7,102.033 5
3	[M-H]^-	14.20	C₂₂H₂₄N₄O₃	392.184 3	391.177 9	258.124 5,102.033 8
4	[M-H]^-	18.71	C₂₁H₂₀N₄O₃	376.153 0	375.146 3	343.120 0,315.088 7

Peak number

Mode of ion

t_R/min

Molecular formula

M_r

m/z(Parent ion)

m/z(Fragment)

[M-H]^-

12.31

C₂₀H₂₀N₄O₃

364.153 0

363.146 7

230.094 5,102.033 7

[M-H]^-

13.08

C₂₁H₂₂N₄O₃

378.168 6

377.161 6

244.108 7,102.033 5

[M-H]^-

14.20

C₂₂H₂₄N₄O₃

392.184 3

391.177 9

258.124 5,102.033 8

[M-H]^-

18.71

C₂₁H₂₀N₄O₃

376.153 0

375.146 3

343.120 0,315.088 7

Std.	No.	R₁	R₂	T₁	N₁	t_R	R₃	T₂	N₂
4	1	3.328	4.408	0.796	30 360.5	7.779	1.772	1.050	73 050.9
8	2	3.151	4.075	0.880	46 671.1	7.967	1.543	0.882	73 257.9
13	3	3.654	3.984	0.735	33 982.0	8.842	2.794	1.057	71 223.2
11	4	3.853	4.344	0.715	23 810.6	8.997	13.660	1.092	65 899.9
9	5	3.528	4.375	0.922	39 141.4	10.5	1.307	1.311	72 864.5
3	6	3.109	4.031	0.939	35 876.0	8.774	15.051	1.370	63 765.4
2	7	3.310	4.290	0.901	51 439.9	9.031	1.691	1.022	79 511.9
10	8	3.840	4.988	0.712	35 283.3	9.247	28.248	0.969	78 843.3
5	9	2.673	3.458	0.919	44 899.5	8.445	8.174	1.073	73 041.9
15	10	3.332	4.178	0.941	35 254.4	9.058	1.241	1.368	63 111.0
12	11	3.947	5.329	0.871	37 467.8	9.719	22.890	1.060	70 160.2
6	12	3.106	3.952	0.786	44 215.5	7.658	1.795	0.948	79 935.6
14	13	3.534	4.602	0.883	49 896.9	9.422	2.719	0.978	79 838.1
16	14	3.489	4.649	0.751	29 302.7	8.011	10.858	1.040	75 764.1
7	15	3.201	3.437	0.764	31 432.0	7.516	2.331	0.940	67 837.1
1	16	3.461	3.625	0.746	34 611.0	8.482	0.890	0.985	74 708.8

Std.

No.

R₁

R₂

T₁

N₁

t_R

R₃

T₂

N₂

3.328

4.408

0.796

30 360.5

7.779

1.772

1.050

73 050.9

3.151

4.075

0.880

46 671.1

7.967

1.543

0.882

73 257.9

3.654

3.984

0.735

33 982.0

8.842

2.794

1.057

71 223.2

3.853

4.344

0.715

23 810.6

8.997

13.660

1.092

65 899.9

3.528

4.375

0.922

39 141.4

10.5

1.307

1.311

72 864.5

3.109

4.031

0.939

35 876.0

8.774

15.051

1.370

63 765.4

3.310

4.290

0.901

51 439.9

9.031

1.691

1.022

79 511.9

3.840

4.988

0.712

35 283.3

9.247

28.248

0.969

78 843.3

2.673

3.458

0.919

44 899.5

8.445

8.174

1.073

73 041.9

3.332

4.178

0.941

35 254.4

9.058

1.241

1.368

63 111.0

3.947

5.329

0.871

37 467.8

9.719

22.890

1.060

70 160.2

3.106

3.952

0.786

44 215.5

7.658

1.795

0.948

79 935.6

3.534

4.602

0.883

49 896.9

9.422

2.719

0.978

79 838.1

3.489

4.649

0.751

29 302.7

8.011

10.858

1.040

75 764.1

3.201

3.437

0.764

31 432.0

7.516

2.331

0.940

67 837.1

3.461

3.625

0.746

34 611.0

8.482

0.890

0.985

74 708.8

Response	Source	df	Sum of squares	Mean square	F-value	P-value	Significance
R₁	Model	5	1.58	0.315 7	65.1	<0.000 1	Significant
	A	1	0.049 9	0.049 9	10.28	0.009 4
	C	1	0.312 6	0.312 6	64.45	<0.000 1
	D	1	0.920 9	0.920 9	189.9	<0.000 1
	E	1	0.113 4	0.113 4	23.39	0.000 7
	AE	1	0.181 7	0.181 7	37.47	0.000 1
R₂	Model	5	3.88	0.775 1	91.29	<0.000 1	Significant
	A	1	1.48	1.48	173.98	<0.000 1
	B	1	0.086 9	0.086 9	10.23	0.009 5
	C	1	0.583 3	0.583 3	68.7	<0.000 1
	D	1	1.67	1.67	196.89	<0.000 1
	E	1	0.056 4	0.056 4	6.65	0.027 5
T₁	Model	2	0.100 1	0.050 1	71.17	<0.000 1	Significant
	D	1	0.002 5	0.002 5	3.55	0.082 2
	E	1	0.097 6	0.097 6	138.79	<0.000 1
N₁	Model	5	883 365 992.330	176 673 198.466	67.51	<0.000 1	Significant
	A	1	130 136 126.876	130 136 126.876	49.73	<0.000 1
	B	1	250 385 913.538	250 385 913.538	95.68	<0.000 1
	C	1	47 830 582.497	47 830 582.497	18.28	0.001 6
	D	1	78 173 365.326	78 173 365.326	29.87	0.000 3
	E	1	376 840 004.093	376 840 004.093	144	<0.000 1
t_R	Model	5	9.76	1.95	135.49	<0.000 1	Significant
	A	1	0.198 0	0.198 0	13.74	0.004 1
	B	1	0.905 4	0.905 4	62.82	<0.000 1
	C	1	1.97	1.97	136.49	<0.000 1
	D	1	4.15	4.15	287.65	<0.000 1
	E	1	2.55	2.55	176.76	<0.000 1
R₃	Model	9	1 001.99	111.33	6.75	0.015 3	Significant
	A	1	42.48	42.48	2.57	0.159 8
	B	1	29.51	29.51	1.79	0.229 6
	C	1	182.62	182.62	11.07	0.015 9
	D	1	159.21	159.21	9.65	0.021 0
	E	1	3.74	3.74	0.226 5	0.650 9
	AD	1	266.98	266.98	16.18	0.006 9
	BE	1	63.76	63.76	3.86	0.969
	CD	1	115.2	115.2	6.98	0.384
	DE	1	138.49	138.49	8.39	0.027 4
T₂	Model	7	0.313 7	0.044 8	17.51	0.000 3	Significant
	A	1	0.097 0	0.097 0	37.93	0.000 3
	B	1	0.013 2	0.013 2	5.17	0.052 6
	C	1	0.020 5	0.020 5	8.01	0.022 1
	D	1	0.022 9	0.022 9	8.95	0.017 3
	E	1	0.060 3	0.060 3	23.58	0.001 3
	AE	1	0.077 7	0.077 7	30.38	0.000 6
	CD	1	0.021 9	0.021 9	8.58	0.019 0
N₂	Model	2	413 522 938.55	206 761 469.28	70.34	<0.000 1	Significant
	A	1	209 597 985.98	209 597 985.98	71.3	<0.000 1
	B	1	203 924 952.57	203 924 952.57	69.37	<0.000 1

Response

Source

Sum of squares

Mean square

F-value

P-value

Significance

R₁

Model

1.58

0.315 7

65.1

<0.000 1

Significant

0.049 9

10.28

0.009 4

0.312 6

64.45

<0.000 1

0.920 9

189.9

<0.000 1

0.113 4

23.39

0.000 7

0.181 7

37.47

0.000 1

R₂

Model

3.88

0.775 1

91.29

<0.000 1

Significant

1.48

173.98

<0.000 1

0.086 9

10.23

0.009 5

0.583 3

68.7

<0.000 1

1.67

196.89

<0.000 1

0.056 4

6.65

0.027 5

T₁

Model

0.100 1

0.050 1

71.17

<0.000 1

Significant

0.002 5

3.55

0.082 2

0.097 6

138.79

<0.000 1

N₁

Model

883 365 992.330

176 673 198.466

67.51

<0.000 1

Significant

130 136 126.876

49.73

<0.000 1

250 385 913.538

95.68

<0.000 1

47 830 582.497

18.28

0.001 6

78 173 365.326

29.87

0.000 3

376 840 004.093

144

<0.000 1

t_R

Model

9.76

1.95

135.49

<0.000 1

Significant

0.198 0

13.74

0.004 1

0.905 4

62.82

<0.000 1

1.97

136.49

<0.000 1

4.15

287.65

<0.000 1

2.55

176.76

<0.000 1

R₃

Model

1 001.99

111.33

6.75

0.015 3

Significant

42.48

2.57

0.159 8

29.51

1.79

0.229 6

182.62

11.07

0.015 9

159.21

9.65

0.021 0

3.74

0.226 5

0.650 9

266.98

16.18

0.006 9

63.76

3.86

0.969

115.2

6.98

0.384

138.49

8.39

0.027 4

T₂

Model

0.313 7

0.044 8

17.51

0.000 3

Significant

0.097 0

37.93

0.000 3

0.013 2

5.17

0.052 6

0.020 5

8.01

0.022 1

0.022 9

8.95

0.017 3

0.060 3

23.58

0.001 3

0.077 7

30.38

0.000 6

0.021 9

8.58

0.019 0

N₂

Model

413 522 938.55

206 761 469.28

70.34

<0.000 1

Significant

209 597 985.98

71.3

<0.000 1

203 924 952.57

69.37

<0.000 1

Limit/%	m(Added)/μg	m(Original)/μg	m(Measured)/μg	Recovery rate/%	RSD/%
80	8 000	10 000	17 884.65	98.56	0.55
	8 000	10 000	17 903.49	98.79
	8 000	10 000	17 937.26	99.22
100	10 000	10 000	19 931.56	99.32
	10 000	10 000	19 902.08	99.02
	10 000	10 000	19 832.98	98.33
120	12 000	10 000	21 881.18	99.01
	12 000	10 000	21 990.21	99.92
	12 000	10 000	21 778.47	98.15

Limit/%

m(Added)/μg

m(Original)/μg

m(Measured)/μg

Recovery rate/%

RSD/%

8 000

10 000

17 884.65

98.56

0.55

8 000

10 000

17 903.49

98.79

8 000

10 000

17 937.26

99.22

100

10 000

19 931.56

99.32

10 000

19 902.08

99.02

10 000

19 832.98

98.33

120

12 000

10 000

21 881.18

99.01

12 000

10 000

21 990.21

99.92

12 000

10 000

21 778.47

98.15