中国药学杂志

黄芪甲苷抑制缺锌诱导的线粒体自噬发挥心肌保护作用

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黄璐瑶 ¹ , 王冰玉 ² , 邢博翰 ¹ , 贺永贵 ³ , 郑桓 ¹ , 张国彬 ¹ , 习瑾昆 ¹^,^*

中国药学杂志 | 论著 2025,60(10): 1039-1049

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中国药学杂志 | 论著 2025, 60(10): 1039-1049

黄芪甲苷抑制缺锌诱导的线粒体自噬发挥心肌保护作用

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黄璐瑶¹, 王冰玉², 邢博翰¹, 贺永贵³, 郑桓¹, 张国彬¹, 习瑾昆¹^,^*

作者信息

¹ 华北理工大学基础医学院, 河北省慢性病重点实验室, 河北唐山 063000

² 华北理工大学公共卫生学院, 河北唐山 063000

³ 华北理工大学附属医院, 河北唐山 063000

黄璐瑶,女,硕士研究生研究方向:心肌保护机制

通讯作者:

^*习瑾昆,女,博士,教授,博士生导师研究方向:心肌保护机制 Tel:(0315)8816018

Astragaloside Inhibits Mitochondrial Autophagy Induced by Zinc Deficiency and Exerts Myocardial Protective Effect

Luyao HUANG¹, Bingyu WANG², Bohan XING¹, Yonggui HE³, Huan ZHENG¹, Guobin ZHANG¹, Jinkun XI¹^,^*

Affiliations

¹ Basic School of Medicine, Hebei Key Laboratory for Chronic Diseases, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China

² School of Public Health, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China

³ Affiliated Hospital, North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, China

出版时间: 2025-05-01 doi: 10.11669/cpj.2025.10.006

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摘要

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目的黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)是中药黄芪的主要活性成分之一,广泛应用于治疗心血管疾病。锌离子(zinc ion,Zn²⁺)螯合剂四吡啶甲基乙二胺[N,N,N',N'-tetrakis(2-pyridylmethyl)ethylenediamine,TPEN]能够诱导线粒体过度自噬并导致心肌细胞损伤。本研究旨在探讨AS-Ⅳ是否能够抑制由缺Zn²⁺诱导的FUN14结构域蛋白1(fun14 domain containing 1,FUNDC1)介导的线粒体自噬,从而减少H9c2心肌细胞的损伤,并探讨潜在的细胞内信号传导机制。方法 H9c2心肌细胞常规培养;TPEN建立缺锌模型。随机分为control组、TPEN组、TPEN+AS-Ⅳ组和AS-Ⅳ组。CCK8法检测细胞活性;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测细胞毒性;Zn²⁺检测试剂盒检测细胞内Zn²⁺含量;荧光显微镜和荧光酶标仪检测线粒体Zn²⁺、溶酶体及线粒体膜电位水平的变化;Western blot法检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1A/1B轻链3(microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3,LC3Ⅱ/Ⅰ)、FUNDC1、泛素结合蛋白P62(sequestosome-1,P62/SQSTM1)、线粒体外膜移位酶20(translocase of the outer membrane 20,TOM20)的表达水平;LC3、FUNDC1免疫荧光分析;FUNDC1 siRNA转染。结果与control组相比,10 μmol·L^-1TPEN处理4 h导致细胞活性降低,LDH释放增加,细胞内Zn²⁺含量减少;线粒体Rhodzin-3和高氯酸四甲基罗丹明乙酯(tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate,TMRE)的红色荧光强度均明显减少,溶酶体Lyso tracker的红色荧光强度明显增加;LC3Ⅱ/Ⅰ和FUNDC1的蛋白表达明显增加,P62和TOM20的蛋白表达减少;LC3和FUNDC1的绿色荧光蛋白表达明显增多;50 μmol·L^-1AS-Ⅳ预处理2 h能够明显抑制上述过程。通过siRNA沉默FUNDC1进一步增强了AS-Ⅳ抑制自噬的作用,以上结果差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 AS-Ⅳ能够通过增加H9c2细胞内的Zn²⁺,抑制TPEN诱导的由FUNDC1介导的线粒体过度自噬,抑制mPTP的开放,进而发挥心肌保护作用。

关键词

黄芪甲苷 / 四吡啶甲基乙二胺 / 锌离子 / 线粒体自噬 / FUN14结构域蛋白1 / 心肌保护

Abstract

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OBJECTIVE Astragaloside Ⅳ (AS-Ⅳ) is one of the main active ingredients of astragaloside, which is widely used in treating cardiovascular diseases. The zinc ion (Zn²⁺) chelating agent N, N, N', N'-tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine (TPEN) can induce excessive mitochondrial autophagy and lead to myocardial cell injury. This study investigated whether AS-Ⅳ could inhibit mitochondrial autophagy mediated by fun14 domain containing 1 (FUNDC1) induced by zinc deficiency, thereby reducing the damage of H9c2 cardiomyocytes, and exploring the potential intracellular signal transduction mechanism. METHODS H9c2 cardiomyocytes were cultured using routine methods, and a zinc deficiency model was induced by TPEN. The cells were then randomly assigned to the control group, TPEN group, TPEN+AS-Ⅳ group, and AS-Ⅳ group. Cell viability was assessed using the CCK8 method; cytotoxicity was measured with lactate dehydrogenase (LDH) kits. A zinc ion detection kit was utilized to quantify intracellular zinc content. The changes in mitochondrial Zn²⁺, lysosome and mitochondrial membrane potential were detected by fluorescence microscopy and fluorescence enzyme labeling. The expression levels of autophagy-related proteins microtubule-associated protein 1A/1B light chain 3 (LC3 Ⅱ/Ⅰ), FUNDC1, sequestosome-1 (P62/SQSTM1), and translocase of the outer membrane 20 (TOM20) were detected by Western blot. Immunofluorescence analysis was performed for LC3 and FUNDC1; FUNDC1 siRNA transfection was conducted. RESULTS Compared with the control group, treatment with 10 μmol·L^-1 TPEN for 4 h significantly decreased cell viability, increased LDH release, and reduced intracellular zinc content. The red fluorescence intensity of mitochondrial Rhodzin-3 and tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate significantly decreased, while the red fluorescence intensity of lysosomal Lyso Tracker significantly increased. The protein expressions of LC3 and FUNDC1 were markedly elevated, whereas the protein expressions of P62 and TOM20 decreased. The expression of LC3 Ⅱ/Ⅰ and FUNDC1's green fluorescent protein is significantly increased. Pretreatment with 50 μmol·L^-1 AS-Ⅳ for 2 h significantly suppressed the aforementioned processes. Silencing FUNDC1 with siRNA further enhanced AS-Ⅳ's inhibitory effect on autophagy, with statistically significant differences (P<0.05). CONCLUSION By increasing Zn²⁺ in H9c2 cells, AS-Ⅳ can inhibit TPEN-induced mitochondrial hyperautophagy mediated by FUNDC1 and inhibit the opening of mPTP, thus playing a myocardial protective role.

Key words

astragaloside Ⅳ / TPEN / Zn²⁺ / mitophagy / FUNDC1 / myocardial protection

引用本文

黄璐瑶, 王冰玉, 邢博翰, 贺永贵, 郑桓, 张国彬, 习瑾昆. 黄芪甲苷抑制缺锌诱导的线粒体自噬发挥心肌保护作用. 中国药学杂志, 2025 , 60 (10) : 1039 -1049 . DOI: 10.11669/cpj.2025.10.006

Luyao HUANG, Bingyu WANG, Bohan XING, Yonggui HE, Huan ZHENG, Guobin ZHANG, Jinkun XI. Astragaloside Inhibits Mitochondrial Autophagy Induced by Zinc Deficiency and Exerts Myocardial Protective Effect[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2025 , 60 (10) : 1039 -1049 . DOI: 10.11669/cpj.2025.10.006

正文

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黄芪甲苷(astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)是提取自黄芪的主要活性成分之一,具有抑制炎症、调节能量代谢、降低氧化应激和细胞凋亡等一系列药理作用,因此被广泛应用于治疗心血管疾病^[1]。线粒体自噬是指特定的细胞自噬过程,当线粒体受损时,它能够有选择性地清除受损的线粒体,导致缺陷细胞器逐渐积聚,并随后启动线粒体自噬的过程^[2-3]。自噬过度可能导致细胞死亡和心肌受损^[4]。研究显示,AS-Ⅳ可以通过靶向miRNA-1来抑制细胞凋亡和自噬,从而保护脂多糖诱导的心功能障碍^[5]。同时,AS-Ⅳ可能通过抑制内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)相关蛋白葡萄糖调节蛋白78/94(glucose regulatory protein 78/94, GRP78/94)和肌醇需求酶1(inositol-requiring enzyme 1, IRE1)的表达,阻止线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)开放,并发挥心肌线粒体保护作用^[6]。Zn²⁺是人体必需的营养素,参与许多生理过程,如氧化应激、细胞周期进展、DNA复制、DNA损伤修复、细胞凋亡和衰老等^[7]。课题组前期研究表明,锌离子(Zn²⁺)能够抑制衣霉素(tunicamycin,TM)诱导的ERS,阻止mPTP的开放,进而保护H9c2细胞^[8]。由于mPTP是AS-Ⅳ与Zn²⁺心肌保护的共同靶点,因此二者的关系需进一步探究。白藜芦醇可以增加细胞内Zn²⁺抑制四吡啶甲基乙二胺(TPEN)诱导的心肌细胞发生线粒体自噬^[9]。线粒体自噬受体FUN14结构域蛋白1(FUNDC1)在心脏中的表达水平较高,在调节线粒体质量控制系统的稳态中起着关键作用,在心血管疾病中起重要作用。不同部位FUNDC1的不同表达水平及其磷酸化状态通过促进或抑制线粒体自噬,但TPEN对H9c2细胞发生FUNDC1介导的线粒体自噬状态尚不清楚。由于AS-Ⅳ与Zn²⁺及自噬的关系尚不明确,因此本实验探讨AS-Ⅳ是否通过增加细胞内Zn²⁺抑制过度自噬,发挥心肌细胞保护作用。

1 材料

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1.1 细胞

H9c2心肌细胞(美国ATCC菌种收藏中心)。

1.2 药品及主要试剂

AS-Ⅳ(中国食品药品检定研究院,批号:110781-202118);TPEN(美国Sigma-Aldrich公司,批号:SLBS4304);Lyso tracker染料、BCA蛋白测定试剂盒、增强化学发光底物试剂盒、免疫荧光染色二抗稀释液(碧云天生物技术研究所);TMRE染料、Rhodzin-3染料、Mito tracker green染料(美国Thermo Fisher Scientific公司);Anti-rabbit IgG(H+L)、F(ab')₂ Fragment(Alexa Fluor 488 Conjugate)、微管相关蛋白轻链3(LC3)Ⅱ/Ⅰ、泛素结合蛋白P62、FUNDC1、anti-alpha-Actinin(美国Cell Signaling Technology公司);TOM20、GAPDH(武汉三鹰生物技术有限公司);CCK8细胞增殖试剂盒(北京亿奥邦生物科技研究有限公司);乳酸脱氢酶试剂盒、锌离子检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);抗荧光衰减封片剂(含DAPI)、体积分数4%组织细胞固定液、牛血清白蛋白BSA-V(北京索莱宝科技有限公司);DMEM培养基(美国Gibco公司);特级胎牛血清(李记生物技术有限公司);即用型正常山羊血清(武汉博士德生物工程有限公司);曲拉通X-100(北京博奥拓达科技有限公司);Lipofectamine 3000转染试剂、Opti-MEM培养基(Invitrogen Life技术公司);FUNDC1 siRNA(安徽通用生物股份有限公司)。

1.3 仪器

电泳转膜装置(美国Bio-Rad公司);高速低温离心机(德国Eppendorf公司);台式L-420低速离心机(湖南湘仪实验仪器公司);荧光酶标仪Spectra Max M5(美国Molecular Devices公司);奥林巴斯BX53荧光显微镜(日本Olympus Corporation公司)。

2 方法

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2.1 细胞培养

H9c2心肌细胞使用含有体积分数为10%FBS、1×10⁵ u·mL^-1青霉素和100 mg·mL^-1链霉素的DMEM培养基,在37 ℃,5%CO₂恒温孵箱中培养。当瓶内细胞密度达到80%左右时,使用体积分数为0.25%胰蛋白酶消化细胞,1 min后加入完全培养基进行重悬并传代。

2.2 实验分组

随机分为如下几组:control组、TPEN组(10 μmol·L^-1的TPEN孵育4 h)、TPEN+AS-Ⅳ组(50 μmol·L^-1的AS-Ⅳ孵育2 h,10 μmol·L^-1的TPEN孵育4 h)和AS-Ⅳ组(50 μmol·L^-1的AS-Ⅳ孵育2 h)。

2.3 CCK8检测细胞活性

细胞生长至80%~90%融合后,用生理盐水轻轻冲洗细胞2~3次,加入200 μL体积分数0.25%胰蛋白酶消化,加入4 mL培养基终止消化进行重悬,于室温下1 500 r·min^-1离心3 min后进行计数,按每孔5 000个细胞的稀释种入96孔板,再培养24~48 h。药物处理后每孔加入10 μL CCK8溶液,在细胞培养箱中孵育1 h。最后使用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光度。

2.4 LDH试剂盒检测细胞毒性

将细胞接种于六孔板中,细胞密度约90%时,药物刺激结束后,收集细胞上清液。1 000 r·min^-1离心5 min后,作为待测样本。空白孔、标准孔、对照孔依次加入25、5、5 μL双蒸水。然后将20 μL 0.2 μmol·mL^-1丙酮酸标准液加入标准孔,将20 μL待测样本加入测定孔和对照孔。每个孔均加25 μL基质缓冲液,测定孔加入5 μL辅酶,37 ℃孵育15 min。随后在每个孔中加入25 μL的2,4-二硝基苯肼混匀,并再次37 ℃孵育15 min。最后,在每个孔中均匀地添加250 μL的0.4 mol·L^-1NaOH溶液,并室温放置5 min,在酶标仪450 nm处测定各孔的吸光度值,并根据公式进行计算。

2.5 锌离子试剂盒检测细胞内锌含量

当细胞密度达到约90%时,进行加药处理。取25 μL的细胞样品与250 μL Tris缓冲液和25 μL锌贡试剂混合,以含有24 μmol·L^-1硫酸锌的标准溶液作为对照。充分混合后,在37 ℃下孵育5 min,在波长为630 nm处测量吸光度,从而测定Zn²⁺含量。

2.6 荧光酶标仪检测线粒体内Zn²⁺、溶酶体及线粒体膜电位的变化

按每孔5 000个细胞稀释种入96孔板,细胞生长至80%~90%融合后,进行药物处理。使用Rhodzin-3(终物质的量浓度:2 μmol·L^-1)、Lyso tracker(终物质的量浓度:50 nmol·L^-1)及高氯酸四甲基罗开明乙酯(TMRE)(终物质的量浓度:100 nmol·L^-1)染料预染细胞,在37 ℃恒温培养箱中孵育20 min后,每孔更换100 μL空白培养基。利用Spectra Max M5测量线粒体Zn²⁺在546和576 nm激发发射波长处的荧光,溶酶体探针在577和590 nm激发发射波长处的荧光以及线粒体膜电位探针在549和574 nm激发发射波长处的荧光。

2.7 Western blot法检测LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、TOM20、FUNDC1的蛋白表达

细胞生长至80%~90%融合后,加药处理。用生理盐水冲洗细胞3次,每个组加入100 μL细胞裂解液,冰上裂解20 min,待裂解完成后,将细胞刮取至EP管中。超声破碎后12 000 r·min^-1离心、4 ℃、15 min,取上清弃沉淀进行蛋白定量。电泳90 V、30 min,120 V、60 min;转膜300 mA、90 min;封闭1 h;一抗4 ℃摇床过夜。Tris缓冲盐Tween洗涤缓冲液(TBST)洗3次,每次10 min,4 ℃摇床孵育二抗2 h;再用TBST洗3次;最后ECL显色。

2.8 荧光显微镜检测LC3、FUNDC1、Rhodzin-3、Lyso tracker、TMRE的荧光强度

在12孔板中放入细胞爬片,细胞计数后接种于每个小孔,于培养箱中培养24~48 h。根据实验分组进行细胞加药处理,使用体积分数4%组织细胞固定液室温固定15 min。生理盐水洗3次,每次5 min。取9.5 mL生理盐水、500 μL即用型正常山羊血清、30 μL曲拉通X-100混合于15 mL离心管中配制封闭缓冲液,室温封闭1 h。另取9.5 mL生理盐水、30 μL曲拉通X-100、0.1 g牛血清白蛋白BSA-V混合于15 mL离心管中配制抗体稀释液,LC3和FUNDC1按比例稀释(一抗-抗体稀释液=1∶200),加入一抗,冰箱4 ℃过夜。配置二抗(二抗-免疫荧光染色二抗稀释液=1∶1 000)避光室温孵育2 h。将细胞爬片置于滴有少量抗荧光衰减封片剂(含DAPI)的载玻片上,细胞面朝下,晾干后使用荧光显微镜拍摄。

细胞爬片上的细胞生长至80%~90%融合后,加药处理。使用Rhodzin-3(终物质的量浓度:2 μmol·L^-1)、Lyso tracker(终物质的量浓度:50 nmol·L^-1)及TMRE(终物质的量浓度:100 nmol·L^-1)染料预染细胞,在37 ℃恒温培养箱中孵育20 min。将细胞爬片置于载玻片上,使用荧光显微镜拍摄。

2.9 FUNDC1 siRNA转染

在转染前24 h,将(0.5~2)×10⁵个细胞接种在400 μL无双抗培养基中。转染时,细胞融合度为30%~50%。使用Opti-MEM分别稀释siRNA和Lipofectamine 3000,轻轻颠倒混匀试剂,并在室温下静置5 min。将混合转染试剂和siRNA稀释液进行轻轻吹吸3~5次混匀,室温下静置20 min。将转染复合物加入细胞中,前后轻摇细胞板使其均匀混合。最后将细胞板置于37 ℃、5%CO₂培养箱中培养18~48 h。在转染4~6 h后,更换新鲜的培养基。

2.10 统计学分析

采用完全随机设计的单因素方差分析(One-way ANOVA)进行多组均值的组间差异比较,绘图使用GraphPad Prism 9软件,统计学分析则使用SPSS 26.0软件。

3 结果

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3.1 CCK8法检测各组细胞活性

为了确定缺Zn²⁺的最佳浓度,培养基中加入不同终物质的量浓度的TPEN(0.01、0.1、1、10和100 μmol·L^-1),培养12 h,结果见图1A,与control组相比,10 μmol·L^-1 TPEN处理组细胞活力显著降低。为了确定缺Zn²⁺的最佳时间,使用含10 μmol·L^-1 TPEN的培养基,对细胞进行0至12 h的不同时长培养,结果见图1B,TPEN诱导缺Zn²⁺4 h时,细胞活力明显下降。因此,后续实验中选择10 μmol·L^-1 TPEN处理细胞4 h。

为了确定AS-Ⅳ对正常H9c2心肌细胞活力的影响,培养基中加入不同终物质的量浓度的AS-Ⅳ(25、50、75和100 μmol·L^-1),并进行了12 h的培养。结果见图1C,25、50、75 μmol·L^-1 AS-Ⅳ对正常H9c2心肌细胞未表现出显著影响,而100 μmol·L^-1 AS-Ⅳ则对正常H9c2心肌细胞造成了一定程度的损伤。

为了确定AS-Ⅳ抑制缺Zn²⁺的最佳时间与浓度,不同终物质的量浓度AS-Ⅳ(25、50和75 μmol·L^-1)进行0.5、1、2及4 h的不同时长预处理,结果见图1D,与TPEN组相比,50 μmol·L^-1AS-Ⅳ处理2 h显著逆转TPEN引起的影响,使细胞活力显著提高。因此,后续实验选择50 μmol·L^-1AS-Ⅳ预处理2 h。

进一步观察AS-Ⅳ对缺Zn²⁺引起的细胞活性的影响,见图1E,与对照组相比,TPEN使细胞活性明显降低,AS-Ⅳ明显抑制TPEN引起的变化,说明AS-Ⅳ减轻缺Zn²⁺引起的细胞活性降低(P<0.05)。

3.2 乳酸脱氢酶(LDH)评估心肌细胞损伤程度

LDH作为心肌损伤的标志物,为了探究各组H9c2心肌细胞的毒性,采用微板法检测LDH的变化。结果见图2,与control组相比,TPEN使LDH的漏出水平明显增高,说明缺Zn²⁺增加细胞毒性;AS-Ⅳ明显抑制TPEN引起的变化,使LDH的水平显著降低,说明AS-Ⅳ能够抑制缺Zn²⁺引起的毒性增高(P<0.05)。

3.3 测定AS-Ⅳ对细胞游离Zn²⁺的影响

为了探究AS-Ⅳ是否通过增加细胞内Zn²⁺发挥心肌保护作用,使用Zn²⁺检测试剂盒观察各组锌含量变化。结果见图3,与control组相比,TPEN使锌含量明显下降,说明锌缺乏降低细胞游离Zn²⁺水平;AS-Ⅳ明显抑制TPEN引起的变化,细胞游离Zn²⁺水平明显增高,说明AS-Ⅳ的心肌保护作用可能与Zn²⁺有关(P<0.05)。

3.4 荧光显微镜和荧光酶标仪检测H9c2细胞Rhodzin-3的荧光强度

为了观察AS-Ⅳ对线粒体内Zn²⁺水平的影响,使用线粒体Zn²⁺特异性荧光染料Rhodzin-3和线粒体特异性荧光染料Mito tracker green预染细胞进行共定位。结果见图4,与control组相比,TPEN使红色荧光强度明显下降,并减少二者共定位,说明缺Zn²⁺降低线粒体Zn²⁺水平;AS-Ⅳ明显抑制TPEN引起的变化,使红色荧光强度明显增高,并增强二者共定位,说明AS-Ⅳ可能通过增加线粒体内Zn²⁺发挥心肌保护作用(P<0.05)。

3.5 荧光显微镜和荧光酶标仪检测H9c2细胞Lyso tracker的荧光强度

使用溶酶体特异性荧光染料Lyso tracker和线粒体特异性荧光染料Mito tracker green预染细胞进行共定位。结果见图5,与control组相比,TPEN使红色荧光强度明显增高,并增加二者的共定位,说明缺锌增加线粒体自噬溶酶体;AS-Ⅳ明显抑制TPEN引起的变化,使红色荧光强度明显降低,并减少二者共定位,说明AS-Ⅳ能够抑制缺Zn²⁺引起的线粒体自噬溶酶体的增加(P<0.05)。

3.6 荧光显微镜和荧光酶标仪检测H9c2细胞TMRE的荧光强度

使用线粒体膜电位特异性荧光染料TMRE预染细胞。结果见图6,与control组相比,TPEN使红色荧光强度明显降低,表明缺锌导致线粒体膜电位降低,即mPTP开放;AS-Ⅳ明显抑制了TPEN引起的变化,使红色荧光强度显著增加。这表明AS-Ⅳ能够抑制TPEN引起的线粒体膜电位降低,阻止mPTP的开放,从而发挥心肌保护作用(P<0.05)。

3.7 Western blot检测自噬蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、P62、TOM20、FUNDC1的表达和荧光显微镜检测LC3、FUNDC1的荧光强度

为了确定缺Zn²⁺是否引起自噬,用Western blot检测自噬相关蛋白的表达水平,见图7A,与control组相比,TPEN使LC3Ⅱ/Ⅰ的表达增高、P62的表达降低;由图7B可见,荧光显微镜检测LC3的绿色荧光蛋白表达也明显增多;说明缺Zn²⁺诱导心肌细胞发生自噬。AS-Ⅳ明显抑制TPEN引起的变化,使LC3Ⅱ/Ⅰ的表达明显降低、P62的表达明显增高;由图7B可见,荧光显微镜检测LC3的绿色荧光蛋白表达也明显减少;说明AS-Ⅳ抑制缺Zn²⁺引起的细胞过度自噬。为了探究缺Zn²⁺是否引起线粒体自噬及其可能信号转导通路,Western blot法检测线粒体自噬相关蛋白的表达水平。

如图7A所示,与control组相比,TPEN使TOM20的表达明显降低、FUNDC1的表达明显增高;由图7C可见,荧光显微镜检测FUNDC1的绿色荧光蛋白表达也明显增多;说明缺Zn²⁺诱导心肌细胞发生FUNDC1介导的线粒体自噬。AS-Ⅳ明显抑制TPEN引起的变化,使TOM20的表达明显增高、FUNDC1的表达明显降低;由图7C可见,荧光显微镜检测FUNDC1的绿色荧光蛋白表达也明显减少;说明AS-Ⅳ抑制缺Zn²⁺诱导的线粒体自噬可能与FUNDC1介导的线粒体自噬有关(P<0.05)。

3.8 FUNDC1 siRNA进一步证实AS-Ⅳ通过FUNDC1抑制缺Zn²⁺诱导的线粒体自噬

为了验证FUNDC1是否参与缺Zn²⁺诱导的线粒体自噬,首先进行3种FUNDC1 siRNA的筛选(si-183、si-281、si-467),Western blot结果显示(图8A),其中si-467沉默效果大于50%,故后续实验采用si-467沉默FUNDC1。结果见图8B,与control组相比,TPEN使LC3 Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达增高、P62和TOM20的蛋白表达降低,说明缺Zn²⁺诱导H9c2心肌细胞发生线粒体自噬;AS-Ⅳ明显抑制TPEN引起的变化,使LC3 Ⅱ/Ⅰ的表达明显降低、P62的表达明显增高,说明AS-Ⅳ抑制缺Zn²⁺诱导的线粒体自噬;与TPEN+AS-Ⅳ组相比,FUNDC1 siRNA组使LC3 Ⅱ/Ⅰ和FUNDC1的蛋白表达降低、P62和TOM20的蛋白表达增高;LC3(图8C)和FUNDC1(图8D)的免疫荧光结果与Western blot一致;进一步说明AS-Ⅳ通过FUNDC1抑制缺Zn²⁺诱导的线粒体自噬(P<0.05)。

4 讨论

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中医药在治疗心血管疾病方面具有悠久的历史和重大的影响。药物天然活性成分的作用方式以及新药开发,是当前中医药研究的热点。AS-Ⅳ是黄芪中最主要的天然成分,具有心血管保护作用。有研究表明,AS-Ⅳ能够保护缺血和缺氧心肌细胞免受损伤,同时缓解血管内皮功能障碍,减少心肌细胞凋亡,并降低患心血管疾病风险^[10-11]。

目前,越来越多的人开始采取补充微量元素的做法以改善心血管疾病。在心肌缺血再灌注损伤后,心肌细胞内Zn²⁺大量减少导致线粒体功能紊乱和ERS,因此,在这一过程中锌稳态失调成为危险因素^[12]。由于生活方式、年龄和疾病介导的因素影响,缺锌现象非常普遍,发展中国家多达四分之一的人口受到影响^[13]。

在本研究中,为了探究AS-Ⅳ与Zn²⁺的关系,应用CCK8和LDH分别检测各组H9c2细胞的活力和毒性,应用Zn²⁺检测试剂盒以及Rhodzin-3AM染料观察细胞和线粒体游离Zn²⁺的变化。结果显示,与TPEN组相比,经过AS-Ⅳ处理后的H9c2细胞活力增高、毒性降低,线粒体Zn²⁺水平也随之增加。因此可以推测AS-Ⅳ对心肌的保护作用可能与Zn²⁺有关。

细胞内锌受到严格调节,在许多情况下,Zn²⁺可以调节并刺激自噬;另一方面,自噬受损可能会改变细胞内的Zn²⁺稳态^[14]。课题组前期研究表明,Zn²⁺超载可以通过PINK1/Parkin通路诱导线粒体自噬^[15]。细胞内自噬泡数量受损对自噬过程产生的影响在早期(自噬体与溶酶体融合之前)和晚期(自噬体与溶酶体融合及之后)呈现相反趋势。LC3是自噬的标志物,在一般情况下,LC3以未脂质化的溶解形式存在于细胞质中,即LC3Ⅰ。当自噬过程发生时,会经过酶解转变成膜型LC3Ⅱ,LC3Ⅱ蛋白能促使自噬体与溶酶体融合,完成受损线粒体的降解。在本研究中,与control组相比,TPEN使溶酶体明显增多。因此,主要研究AS-Ⅳ对缺Zn²⁺引起过度自噬的影响。最新的研究结果显示,白藜芦醇可以通过增加细胞内Zn²⁺的水平促进早期自噬,抑制ERS并阻止mPTP的打开^[16]。此外,白藜芦醇还能够通过增加细胞内Zn²⁺的含量抑制缺Zn²⁺导致的线粒体过度自噬,在心肌细胞中发挥保护作用^[9]。然而AS-Ⅳ在缺Zn²⁺条件下与自噬的关系还需进一步探究。

mPTP是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体,是一种非特异性通道,由外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage dependent anion channels,VDAC)、内膜的腺嘌呤核苷酸转位酶(adenine-nucleotide translocase,ANT)以及亲环素D(cyclophilin D,CypD)等组成。mPTP的开关对于维持线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)发挥着重要作用^[17]。有研究表明,线粒体Zn²⁺可以通过调节mPTP控制线粒体自噬^[18]。TMRE是一种线粒体特异性染料,可在完整的线粒体中聚集,当线粒体膜电位降低时会导致TMRE积聚减少。TMRE荧光强度变化反映了线粒体膜电位动态,可推断mPTP的开放程度。当线粒体发生去极化时就会触发FUNDC1介导线粒体发生自噬。由于TPEN处理可以使H9c2细胞TMRE红色荧光强度明显降低,说明引起线粒体去极化,膜电位降低^[9]。因此,为了探究AS-Ⅳ是否通过Zn²⁺抑制mPTP的开放影响自噬,本研究检测了TMRE的变化,与TPEN组相比,AS-Ⅳ处理使TMRE红色荧光强度明显增高,抑制了mPTP的开放,且FUNDC1 siRNA组进一步增强了AS-Ⅳ的作用,说明FUNDC1参与缺Zn²⁺诱导的线粒体自噬,抑制FUNDC1的表达可以减少线粒体自噬水平,发挥心肌保护作用。

由于使用Zn²⁺的螯合剂TPEN可以诱导细胞过度自噬,从而使LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达增加、P62蛋白和TOM20蛋白表达降低^[9]。经AS-Ⅳ处理后观察其变化,Western blot结果显示,与TPEN组相比,AS-Ⅳ明显逆转TPEN的作用,并使LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达减少、P62蛋白和TOM20蛋白表达均有所增加,说明AS-Ⅳ能够抑制TPEN诱导的线粒体自噬。目前线粒体自噬的研究发现了两种机制:泛素依赖性途径和非泛素依赖性途径。在非泛素依赖性途径中,外膜上含有LC3互作结构域的蛋白质可以直接与LC3结合,从而启动线粒体自噬。这些受体主要包括NIP3样蛋白X(nip3-liked protein X,NIX)、BCL2相互作用蛋白3(bcl2-interacting protein 3,BNIP3)受体和FUNDC1受体^[19]。本实验重点研究FUNDC1受体在AS-Ⅳ抑制TPEN诱导的线粒体自噬中的作用。

FUNDC1具有三螺旋跨膜结构,主要由酪蛋白激酶2(casein kinase 2,CK2)、Src激酶和Unc-51样自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)以及磷酸甘油酸变位酶5(phosphoglycerate mutase 5,pGAM5)进行调节^[20]。在正常氧含量条件下,FUNDC1高度磷酸化;而在缺氧和线粒体氧化磷酸化解偶联剂(FCCP)刺激下被去磷酸化。去磷酸化的FUNDC1对LC3有更好的亲和力,并促进自噬体定位到受损线粒体。此外,在缺氧时,ULK1和Unc-51样自噬激活激酶2(unc-51 like autophagy activating kinase 2,ULK2)被招募到受损的线粒体中,与FUNDC1结合并增强其与LC3的相互作用,诱导线粒体自噬^[21]。为了验证AS-Ⅳ抑制TPEN诱导的自噬是否与FUNDC1介导的线粒体自噬有关,本研究采用siRNA沉默FUNDC1,并观察其蛋白表达情况。结果显示,与对照组相比,TPEN处理后FUNDC1的蛋白表达显著增加;而与TPEN+AS-Ⅳ组相比,FUNDC1 siRNA组的LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达明显减少,说明AS-Ⅳ抑制TPEN诱导的自噬与FUNDC1介导的线粒体自噬有关。

综上所述,AS-Ⅳ能够通过增加H9c2细胞内的Zn²⁺,抑制TPEN诱导的由FUNDC1介导的线粒体过度自噬,抑制mPTP的开放,进而发挥心肌保护作用(图9)。AS-Ⅳ对心肌细胞早期自噬的影响是本研究后续研究的重点。这些研究成果将有助于进一步探索AS-Ⅳ和微量元素在心肌保护中的关键作用,为该领域提供新的思路。

基金

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国家自然科学基金项目资助(82270303)
河北省自然科学基金项目资助(H2024209078)
河北省硕士在读研究生创新能力培养资助项目资助(CXZZSS2024054)

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文献

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2025年第60卷第10期

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doi: 10.11669/cpj.2025.10.006

接收时间：2024-07-15
首发时间：2025-11-09
出版时间：2025-05-01

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出版历史

收稿日期：2024-07-15

基金

国家自然科学基金项目资助(82270303)

河北省自然科学基金项目资助(H2024209078)

河北省硕士在读研究生创新能力培养资助项目资助(CXZZSS2024054)

作者信息

¹ 华北理工大学基础医学院, 河北省慢性病重点实验室, 河北唐山 063000

² 华北理工大学公共卫生学院, 河北唐山 063000

³ 华北理工大学附属医院, 河北唐山 063000

通讯作者:

^*习瑾昆,女,博士,教授,博士生导师研究方向:心肌保护机制 Tel:(0315)8816018

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/zgyxzz/CN/10.11669/cpj.2025.10.006

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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