中国药学杂志

Compound	Sensitivity	Fold change
dC	1.25 ng·mL^-1	19.53	64
dA	156.25 pg·mL^-1	1.22	128
dG	1.25 ng·mL^-1	9.77	128

Compound	Sensitivity	Fold change
dC	1.25 ng·mL^-1	19.53	64
dA	156.25 pg·mL^-1	1.22	128
dG	1.25 ng·mL^-1	9.77	128

Compound	Formula	t_R/min	m/z(Calculated)	m/z(Observed)	δ/×10^-6	m/z(MS/MS fragments)
Luc-dC 1 adduct	C₂₄H₂₁N₃O₈	31.84	480.140 1	480.140 8	1.46	364.092 8 [M+H-116]⁺,253.048 8 [X+H]⁺,112.050 9 [Base+H]⁺
Luc-dC 2 adduct	C₂₄H₂₁N₃O₈	33.96	480.140 1	480.140 0	-0.21	364.093 0 [M+H-116]⁺,253.049 6 [X+H]⁺,112.051 0 [Base+H]⁺
Luc-dA 1 adduct	C₂₅H₂₁N₅O₇	32.34	504.151 4	504.151 8	0.79	388.104 1 [M+H-116]⁺,253.049 2 [X+H]⁺,136.061 9 [Base+H]⁺
Luc-dA 2 adduct	C₂₅H₂₁N₅O₇	36.68	504.151 4	504.151 6	-0.13	388.104 3 [M+H-116]⁺,253.049 6 [X+H]⁺,136.062 0 [Base+H]⁺
Luc-dG 1 adduct	C₂₅H₂₁N₅O₈	31.99	520.146 3	520.146 8	0.10	404.099 1 [M+H-116]⁺, 253.049 6 [X+H]⁺,152.056 8 [Base+H]⁺
Luc-dG 2 adduct	C₂₅H₂₁N₅O₈	33.74	520.146 3	520.146 3	0.00	404.099 3 [M+H-116]⁺, 253.049 5 [X+H]⁺,152.056 8 [Base+H]⁺

Compound	Formula	t_R/min	m/z(Calculated)	m/z(Observed)	δ/×10^-6	m/z(MS/MS fragments)
Luc-dC 1 adduct	C₂₄H₂₁N₃O₈	31.84	480.140 1	480.140 8	1.46	364.092 8 [M+H-116]⁺,253.048 8 [X+H]⁺,112.050 9 [Base+H]⁺
Luc-dC 2 adduct	C₂₄H₂₁N₃O₈	33.96	480.140 1	480.140 0	-0.21	364.093 0 [M+H-116]⁺,253.049 6 [X+H]⁺,112.051 0 [Base+H]⁺
Luc-dA 1 adduct	C₂₅H₂₁N₅O₇	32.34	504.151 4	504.151 8	0.79	388.104 1 [M+H-116]⁺,253.049 2 [X+H]⁺,136.061 9 [Base+H]⁺
Luc-dA 2 adduct	C₂₅H₂₁N₅O₇	36.68	504.151 4	504.151 6	-0.13	388.104 3 [M+H-116]⁺,253.049 6 [X+H]⁺,136.062 0 [Base+H]⁺
Luc-dG 1 adduct	C₂₅H₂₁N₅O₈	31.99	520.146 3	520.146 8	0.10	404.099 1 [M+H-116]⁺, 253.049 6 [X+H]⁺,152.056 8 [Base+H]⁺
Luc-dG 2 adduct	C₂₅H₂₁N₅O₈	33.74	520.146 3	520.146 3	0.00	404.099 3 [M+H-116]⁺, 253.049 5 [X+H]⁺,152.056 8 [Base+H]⁺

基于液相色谱-质谱技术的芦西丁-DNA加合物快速筛查研究

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杨静 ¹^,² , 王慎兴 ²^,³ , 王丹 ¹^,² , 吴春勇 ³ , 黄青 ²^,^* , 袁耀佐 ²^,^*

中国药学杂志 | 论著 2024,59(4): 338-345

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中国药学杂志 | 论著 2024, 59(4): 338-345

基于液相色谱-质谱技术的芦西丁-DNA加合物快速筛查研究

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杨静¹^,², 王慎兴²^,³, 王丹¹^,², 吴春勇³, 黄青²^,^*, 袁耀佐²^,^*

作者信息

¹ 南京中医药大学药学院, 南京 210023

² 江苏省食品药品监督检验研究院, 南京 210019

³ 中国药科大学药学院, 南京 211198

杨静,女,硕士研究生研究方向:药物分析与质量控制

通讯作者:

*黄青,女,博士,主任药师研究方向:药物分析与药物质量控制 Tel:(025)86251121;

袁耀佐,男,博士,主任药师研究方向:药物分析与药物质量控制 Tel:(025)86251120

Rapid Screening of Lucidin-DNA Adducts Based on LC-MS/MS

YANG Jing¹^,², WANG Shenxing²^,³, WANG Dan¹^,², WU Chunyong³, HUANG Qing²^,^*, YUAN Yaozuo²^,^*

Affiliations

¹ School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

² Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210019, China

³ School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China

出版时间: 2024-02-22 doi: 10.11669/cpj.2024.04.007

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摘要

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目的建立基于液相色谱-三重四级杆质谱(LC-QQQ-MS)及液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)技术的DNA加合物通用型“发现-确证”分析策略,研究茜草中潜在遗传毒性物质芦西丁(lucidin,Luc)与3种2'-脱氧核苷的直接反应性和代谢反应性,筛查和确证可能的Luc特异性DNA加合物。方法采用与DNA加合物具有相同质谱碎裂模式的3种2'-脱氧核苷,建立和优化三重四极杆质谱中性丢失和伪中性丢失扫描模式下未知DNA加合物的非靶向筛查方法,以及高分辨数据依赖性扫描模式下的加合物靶向确证方法。将Luc与2'-脱氧核苷在Ⅰ相代谢激活和未激活条件下分别孵育,筛查生成的特异性DNA加合物,再通过特征性质谱碎裂离子进行结构验证。结果优化后的伪中性丢失扫描对脱氧核苷脱糖基的检测灵敏度可达pg·mL^-1级别。在Luc与脱氧核苷体外孵育模型中,发现并确证了6种Luc-DNA加合物,包含2种2'-脱氧胞苷(dC)加合物、2种2'-脱氧腺苷(dA)加合物、2种2'-脱氧鸟苷(dG)加合物,并对其结构进行了表征。Luc-DNA加合物的生成随着Luc暴露量、暴露时间的增加而升高,存在显著的剂量-反应、时间-反应关系,且该种结合无需代谢激活即可发生。结论所建立的DNA加合物“发现-确证”策略灵敏度高、准确性好,能够提供分子水平上加合物的结构信息,适用于评估Luc暴露所致的DNA损伤,为其毒性机理研究和再评价提供了有力数据支持,也为中草药中潜在遗传毒性成分快速筛查提供了重要的方法参考。

关键词

DNA加合物 / 遗传毒性 / 茜草 / 芦西丁 / 筛查

Abstract

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OBJECTIVE To develop a generalized “discovery-confirmation” strategy for DNA adducts based on liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (LC-QQQ-MS) and liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (LC-HRMS), study the direct and metabolic reactivity of the potentially genotoxic substance lucidin (Luc) with three 2'-deoxynucleosides in Rubia cordifolia L., and screen and confirm possible Luc-specific DNA adducts. METHODS Three 2'-deoxynucleosides with the same fragmentation pathways with DNA adducts in mass spectrometry were used to develop and optimize a non-targeted screening method for unknown DNA adducts in QQQ-MS neutral loss and pseudo-neutral loss scanning modes, as well as a confirmatory method for adduct targeting in HRMS data-dependent scanning mode. Luc was incubated with 2'-deoxynucleoside under phase I metabolically activated and inactivated conditions, respectively, and the resulting specific DNA adducts were screened and then structurally verified by characteristic MS spectra of fragmentations. RESULTS The optimized pseudo-neutral loss scanning is sensitive to the detection of deoxyribonucleoside deglycosylation at the pg·mL^-1 level. Six Luc-DNA adducts, containing two 2'-deoxycytidine (dC) adducts, two 2'-deoxyadenosine (dA) adducts, and two 2'-deoxyguanosine (dG) adducts, were identified and confirmed in vitro incubation model of Luc and 2'-deoxynucleoside, and their structures were characterized. Luc-DNA adduct production increased with increasing Luc exposure and exposure time, and there were significant dose-response and time-response relationships, and the binding did not require metabolic activation to occur. CONCLUSION The established discovery-confirmation strategy for DNA adducts is highly sensitive and accurate. It can provide structural information of the adducts at the molecular level. This is suitable for the assessment of DNA damage caused by the presence of Luc and provides strong data support for the study and re-evaluation of its toxicity mechanism. It also offers an important methodological reference for the rapid screening of potential genotoxic components in Chinese herbal medicines.

Key words

DNA adduct / genetic toxicity / Rubia cordifolia L. / lucidin / screening

引用本文

杨静, 王慎兴, 王丹, 吴春勇, 黄青, 袁耀佐. 基于液相色谱-质谱技术的芦西丁-DNA加合物快速筛查研究. 中国药学杂志, 2024 , 59 (4) : 338 -345 . DOI: 10.11669/cpj.2024.04.007

YANG Jing, WANG Shenxing, WANG Dan, WU Chunyong, HUANG Qing, YUAN Yaozuo. Rapid Screening of Lucidin-DNA Adducts Based on LC-MS/MS[J]. Chinese Pharmaceutical Journal, 2024 , 59 (4) : 338 -345 . DOI: 10.11669/cpj.2024.04.007

正文

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茜草为茜草科植物茜草(Rubia cordifolia L.)的干燥根及根茎,其药效活性成分主要为蒽醌类化合物,临床使用广泛,常用于外伤出血、关节痹痛、经闭瘀阻等^[1]。除药用外,茜草也是文献报道中最早使用的染料之一^[2],由于染色能力出众,颜色鲜艳,这一类蒽醌化合物长期以来也被作为天然食用色素用于食品中^[3]。

然而,近年来对茜草色素的一些安全性研究表明,其中某些蒽醌化合物具有潜在的毒副作用和安全隐患,如芦西丁(lucidin,Luc)、茜根定(rubiadin)、羟基茜草素(pupurin)等(图1),在Ames试验^[4]和转基因动物试验^[5]中均产生了阳性结果,表现出潜在的遗传毒性。天然产物中组分繁多、含量不一,现有的遗传毒性评价方法如Ames试验在应用于中草药时,易因基质干扰出现假阴性或假阳性,难以识别具体的潜在遗传毒性成分,无法从分子水平上的信息溯源具体的遗传毒物。因此,开发一种准确、高效、通用性强的遗传毒性物质快速筛查方法是一个亟待解决的问题。

DNA加合物是内、外源性化学物质或其亲电代谢产物与DNA碱基上的亲核位点共价结合形成的化合物,是DNA化学损伤最重要也是最普遍的形式^[6]。DNA加合物的形成是癌症发展的早期起始事件,是化学致癌物遗传毒性的新型生物标志物靶标。从技术原理而言,对DNA加合物的检测可能是一种适于中草药中遗传毒性成分快速筛查的有效手段。目前在中草药中发现了多种可引起DNA加合物的遗传毒性成分,如马兜铃属药材中的马兜铃酸^[7]、千里光属药材中的吡咯里西啶类生物碱^[8]、肉豆蔻中的苯烯基类化合物^[9]等。

³²P后标记法^[10]、免疫学检测方法^[11]是DNA加合物检测的经典方法。但这两种方法无法提供DNA加合物的结构信息,在检测的特异性、定量准确性和操作风险上存在不足。近些年来,随着色谱分离技术的进步和质谱的发展,色谱-质谱联用法已逐渐成为分析DNA加合物最重要的技术手段^[12]。DNA加合物在质谱中,极易由于脱氧核苷部分β-糖苷键断裂,产生的m/z 116.0(m/z 116.047 4,高分辨质谱)的脱糖基中性丢失,这种特殊的中性丢失碎裂模式可作为DNA加合物快速扫描策略的主要特征信号^[13](图2)。通过该技术对加合物进行检测,可提供关于化合物潜在遗传毒性机制的重要信息。

本研究以茜草色素中可能具有遗传毒性的蒽醌类化合物Luc为研究对象,基于串联四级杆质谱和高分辨质谱两类质谱平台,以具有加合物亲核性反应位点的脱氧核糖核苷(DNA的基本单位脱氧核糖核苷酸去磷酸化的产物)构建快速孵育体系,建立了DNA加合物“发现-确证”快速筛查新策略。尝试对Luc与脱氧核苷特异性-DNA加合物进行快速筛查和确证,探讨Luc与脱氧核苷的体外直接反应性和代谢反应性,以期为此类蒽醌类茜草色素的安全性研究提供参考依据。

1 仪器与试剂

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ExionLC^TM型超高效液相色谱系统串联Qtrap 6500+型三重四极杆质谱仪(美国AB SCIEX公司);UltiMate 3000型超高效液相色谱系统(美国Dionex公司)串联Q-Exactive^TM组合型四极杆Orbitrap^TM质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);XSE205型电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司);Milli-Q型纯水仪(美国Millipore公司)。

Luc(上海诗丹德标准技术服务有限公司,批号:ST05450120,纯度≥98%);2'-脱氧腺苷·一水合物(dA, 批号:D7400,纯度≥99%)、2'-脱氧鸟苷·一水合物(dG, 批号:D7145,纯度≥99%)、2'-脱氧胞苷(dC, 批号:D3897,纯度≥99%)(美国Sigma公司);烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH,瑞士Roche公司,批号:10107824001);混合性别人源肝微粒体(瑞德肝脏疾病研究有限公司,批号:X008061);甲酸铵、甲酸(质谱纯);甲醇、二甲基亚砜(色谱纯);其他试剂均为分析纯。

2 实验方法

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2.1 溶液配制

2.1.1 脱氧核苷贮备液及工作液

精密称取dA、dG、dC对照品适量,分别用甲醇溶液溶解并定容,得到1 mg·mL^-1浓度的dA、dG、dC贮备液,-20 ℃保存,备用。临用前,用50 mmol·L^-1的磷酸盐缓冲溶液逐级稀释至相应浓度,即得脱氧核苷工作液。

2.1.2 Luc贮备液及工作液

精密称取Luc对照品适量,用DMSO溶解并定容,得50 mmol·L^-1浓度的芦西丁贮备液,-20 ℃保存,备用。临用前,用甲醇逐级稀释至相应浓度,即得Luc系列工作液。

2.2 Luc与脱氧核苷的孵育

代谢激活组:孵育体系总体积250 μL,包含50 mmol·L^-1磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)、10 mmol·L^-1 MgCl₂、2 mg·mL^-1人源肝微粒体、4 mmol·L^-1的dA、dG、dC,Luc浓度分别为5、10、25 μmol·L^-1。涡旋振荡1 min,37 ℃、250 r·min^-1预孵育5 min,加入NADPH溶液(终浓度1 mmol·L^-1)启动反应,于1.5 h加入同等体积的甲醇-乙腈(1∶1)混合溶液终止反应,剧烈振荡15 min,离心(转速22 000 r·min^-1,温度4 ℃,时间15 min,下同),上清液过0.2 μm微孔滤膜,进样分析。不同孵育时间下Luc与脱氧核苷反应时,体系中Luc浓度25 μmol·L^-1,分别暴露0、0.5、1.5、3.5 h。每个样品平行制备3份。

代谢非激活组:孵育体系中人源肝微粒体经高温灭活,不加入NADPH启动子,用磷酸盐缓冲溶液补足体积至250 μL,同法操作。每个样品平行制备3份。

2.3 检测条件

2.3.1 色谱条件

采用ACE EXECL C₁₈-PFP色谱柱(3 mm×100 mm,2 μm),以均含体积分数0.1%甲酸的水溶液(A)-甲醇(B)为流动相进行梯度洗脱,洗脱梯度程序如下:0~16 min,5%~12%B;16~31 min,12%~98%B;31~41 min,98%B;41~46 min,5%B。柱温30 ℃,流速0.25 mL·min^-1,进样量20 μL。

2.3.2 用于DNA加合物发现的质谱中性丢失扫描条件

质谱源区参数设置为,电喷雾离子源(ESI),离子喷雾电压(IS)5.5 kV,离子源温度(TEM)500 ℃,去簇电压(DP)20 V,碰撞能量(CE)20 V,气帘气压力(CUR)241 kPa,雾化气(GS1)和辅助气(GS2)压力均为310 kPa,碰撞气(CAD)为Medium。在中性丢失扫描模式下,采集正离子谱图。对于正常核苷,扫描范围设为m/z 150~350;对于Luc-DNA加合物,扫描范围设为m/z 400~600;中性丢失均设置为116.0。

2.3.3 用于DNA加合物发现的质谱伪中性丢失扫描条件

质谱源区参数设置同“2.3.2”项。在MRM扫描模式下,采集正离子谱图,驻留时间10 ms,设置101个MRM离子对。对于正常核苷,扫描范围为从离子对m/z 200.0→84.0至离子对m/z 300.0→184.0的101个离子对,每个离子对质荷比递增1,母离子与子离子均相差116.0。对于Luc-DNA加合物,扫描范围为从离子对m/z 450.0→334.0至离子对m/z 549.0→433.0的101个离子对,每个离子对质荷比递增1,母离子与子离子均相差116.0。

2.3.4 用于DNA加合物确证的高分辨质谱数据依赖性扫描条件

质谱源区参数设置为,ESI离子源,离子喷雾电压3.5 kV,离子源温度325 ℃,鞘气(N₂)流速40,辅助气(N₂)流速10,吹扫气(N₂)流速1,辅助气温度350 ℃;扫描方式采用数据依赖性扫描(DDA)的Full MS/ddMS²(TopN),正离子模式下采样,一级全扫描的分辨率为70 000,扫描范围m/z 100~600;数据依赖的二级扫描分辨率为17 500,碰撞能量为20~40 V混合能量。

2.4 数据处理与分析

串联四级杆质谱上的原始数据由Analyst 1.7软件采集并处理,高分辨质谱的原始数据由Xcalibur 4.3软件采集并处理。使用Origin 2021对数据进行统计分析和作图,数据均以

x -

±s表示,组间比较采用单因素方差分析或t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果与分析

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3.1 DNA加合物筛查策略的建立

3.1.1 中性丢失扫描方法的考察与优化

Luc-DNA加合物的发现采用了三重四极杆质谱仪的中性丢失和伪中性丢失两种扫描策略。由于DNA加合物中糖苷键的能量相对较低,在低碰撞能下易发生断裂。因此,可通过串联四级杆质谱的中性丢失扫描模式检测[M+H]⁺→[M+H-116]⁺来发现可能的DNA加合物。在中性丢失扫描模式下,Q1和Q3以恒定116.0的差值进行同步扫描,在Q2中施加电压,引发母离子碎裂,只有具有脱氧核糖特征中性丢失特征的碎片离子才会通过Q3并被记录为信号^[14],见图3。正常脱氧核苷结构中,脱氧核糖中性丢失的质谱碎裂模式与DNA加合物一致,因此可作替代,用于优化方法条件,提高加合物发现的检测灵敏度。

在“2.3.2”项下质谱条件中,对主要质谱参数DP电压、CE电压、离子源温度分别进行了考察。在DP电压、CE电压均为20 V,离子源温度500 ℃时各脱氧核苷的响应最强。以优化的质谱参数对系列浓度的脱氧核苷供试溶液进行测定,结果显示,中性丢失扫描模式下,在3种2'-脱氧核苷一级质谱图中,丰度最高的离子分别为m/z 228.07(2'-脱氧胞苷,dC)、252.13(2'-脱氧腺苷,dA)和268.16(2'-脱氧鸟苷,dG),该值与各脱氧核苷理论值一致,质谱识别准确性良好。dC、dA、dG的检测灵敏度分别为1.25 ng·mL^-1(S/N=3.7)、156.25 pg·mL^-1(S/N=3.9)、1.25 ng·mL^-1(S/N=3.3),所建立的串联四级杆质谱中性丢失扫描策略可较高灵敏地用于DNA加合物的发现。

3.1.2 伪中性丢失扫描方法的考察与优化

“伪”中性丢失扫描策略是中性丢失扫描策略的一种变化形式,如图3B所示,它是在整个m/z范围内对整数增量(如每次m/z增加1)的多个[M+H]⁺→[M+H-116]⁺离子对进行跃迁扫描^[15],在一针分析中,可以对100个甚至更多的离子对进行扫描。

伪中性丢失扫描中质谱源区参数与“3.1.1”项下优化的条件一致。由于该模式需在一针分析时间中同时扫描所需质量范围内100~200个离子对,因此进一步对不同驻留时间(10、20、50 ms)下各脱氧核苷的响应进行了考察,发现在同时扫描100个离子对时,不同驻留时间下,各脱氧核苷的响应差异不明显。考虑到一针可同时检测的MRM离子对越多,对未知m/z的DNA加合物筛查愈有利,最终优选10 ms驻留时间。以上述优化的质谱参数对系列浓度的脱氧核苷供试溶液测定,结果显示,伪中性丢失扫描模式下,3种脱氧核苷均在理论中性丢失对应的MRM对处(dC、dA、dG分别对应m/z 228.0→112.0、m/z 252.0→136.0、m/z 268.0→152.0)表现出了最高的响应峰,质谱识别准确性良好。dA的检测灵敏度为1.22 pg·mL^-1(S/N=4.9),dG的检测灵敏度为9.77 pg·mL^-1(S/N=3.9),dC的检测灵敏度为19.53 pg·mL^-1(S/N=3.6),建立的串联四级杆质谱伪中性丢失扫描策略可高灵敏地用于DNA加合物的发现。

3.1.3 方法比较

对两种用于DNA加合物发现的扫描策略进行比较,伪中性丢失扫描对正常脱氧核苷的检测灵敏度明显优于中性丢失扫描,两者相差约64~128倍(表1)。这是由于伪中性丢失扫描下,在Q1中对前体离子先进行了筛选,排除了大量干扰离子,使质谱的化学背景降低,待测化合物的信噪比显著提高,从而极大提升了DNA加合物发现的灵敏度。

在目标质量范围的宽度设置上,伪中性丢失扫描受到扫描速度限制,无法在保证高灵敏度同时达到中性丢失扫描的质量范围宽度,因此对未知DNA加合物的筛查,需要多针分析以覆盖更宽泛的质量范围,这增加了分析时间,且对样品量有一定要求,在对少量珍贵样品(如细胞提取样品)检测时应尤为注意。此外,由于四极杆分辨隔离能力有限,在伪中性丢失扫描下,响应最强的MRM±2通道中均出现了假阳性峰(±1通道中假阳性峰的响应约为主通道的36%,±2通道约为17%),在对未知加合物进行识别和结构确证时,应注意区分。鉴于灵敏度上的优势,后续以伪中性丢失扫描策略用于发现Luc-DNA加合物。

3.2 DNA加合物确证策略的建立

采用高分辨轨道阱质谱的Full MS/ddMS²扫描模式对发现的DNA加合物进行结构确证(图3C)。该模式下,首先在设定的m/z范围内进行完整的MS扫描,并对强度前5(Top5)的离子以及伪中性丢失模式下发现的潜在加合物母离子强制触发MS²分析。在一针分析中,基于高质量精度MS¹和MS²数据,对未知DNA加合物进行结构鉴定,并通过提取MS¹精确分子量的峰面积进行定量。以“2.3.4”项下条件对脱氧核苷供试溶液进行检测,结果显示,3种2'-脱氧核苷一级全扫描的[M+H]⁺离子分别为m/z 228.097 7(dC)、m/z 252.108 8(dA)、m/z 268.103 9(dG),在触发的二级扫描模式中,dC、dA、dG在二级质谱图中产生的主要特征碎片离子分别为m/z 112.050 9(胞嘧啶)、m/z 136.061 9(腺嘌呤)和m/z 152.056 8(鸟嘌呤),3者均为脱氧核苷结构中的糖苷键断裂得到的特征碱基碎片,母离子、特征碎片离子的质量与理论值相比,精密度误差均小于5×10^-6,满足对可能的DNA加合物进一步结构确证的要求。

3.3 Luc-DNA加合物的发现

对Luc与脱氧核苷孵育样品,按伪中性丢失扫描的条件进行检测,提取离子流色谱图(EIC)见图4,伪中性丢失扫描模式下,共发现了9个未知中性丢失化合物峰。对于上述串联四级杆质谱上发现的可能DNA加合物,进一步在高分辨质谱的数据依赖采集模式下对其结构进行确证。

3.4 Luc-DNA加合物的初步确证

按“2.2”项下制备Luc与脱氧核苷反应性样品,按“2.3.4”项下条件进行检测,根据文献[16]报道和加合物的结构特点对上述发现的中性丢失化合物进一步结构确证。理论上,DNA加合物的二级质谱图中可观测到加合物离子[M+H]⁺及其碎裂产生的脱糖基特征离子[M-dR+H]⁺、化合物自身的特征离子[X+H]⁺和对应碱基的特征离子[Base+H]⁺(图3C)。

峰1和峰6(图4A)在正离子模式下的准分子离子峰[M+H]⁺为m/z 480.140 8和480.140 0,计算其分子式为C₂₄H₂₁N₃O₈;两者的主要二级碎片离子均相似(图5):m/z 364.092 8对应[M+H-dR]⁺,分子式C₁₉H₁₄N₃O₅,为母离子脱去1分子脱氧核糖所得,该碎片离子可进一步碎裂形成胞嘧啶碱基(m/z 112.050 9)和Luc蒽醌母核(m/z 253.048 8);一级二级离子的质量误差均小于5×10^-6,两者鉴定为Luc-dC 1和Luc-dC 2加合物。

峰3和峰9(图4B)的准分子离子峰[M+H]⁺为m/z 504.151 8和504.151 6,计算其分子式为C₂₅H₂₁N₅O₇;两者的主要二级碎片离子均相似(图5):m/z 388.104 1对应[M+H-dR]⁺,分子式为C₂₀H₁₄N₅O₄,为母离子脱去1分子脱氧核糖所得,该碎片离子可进一步碎裂形成腺嘌呤碱基(m/z 136.061 9)和Luc的蒽醌母核(m/z 253.049 2);一级二级离子的质量误差均小于5×10^-6,两者鉴定为Luc-dA 1和Luc-dA 2加合物。

峰2和峰4(图4C)的准分子离子峰[M+H]⁺为m/z 520.146 8和520.146 3,计算其分子式C₂₅H₂₁N₅O₈;两者的主要二级碎片离子均相似(图5):m/z 404.099 1对应[M+H-dR]⁺,分子式C₂₀H₁₄N₅O₅,为母离子脱去1分子脱氧核糖所得,该碎片离子可进一步碎裂形成鸟嘌呤碱基(m/z 152.056 8)和Luc蒽醌母核(m/z 253.049 6);一级二级离子的质量误差均小于5×10^-6,两者鉴定为Luc-dG 1和Luc-dG 2加合物。

在Luc与脱氧核苷的反应性样品中,共识别并鉴定了6种Luc特异性的DNA加合物,包含Luc-dC加合物2种、Luc-dA加合物2种、Luc-dG加合物2种(表2)。据推测,相同相对分子质量的3对加合物可能为Luc与脱氧核苷共价结合时所产生的不同手性的同分异构体^[17],有关其具体构型,有待进一步确认。

3.5 Luc与脱氧核苷的反应性

3.5.1 Luc与脱氧核苷反应的底物浓度依赖性

Ⅰ相代谢反应体系中,不同浓度Luc与脱氧核苷孵育1.5 h后,6种Luc-DNA加合物在体外肝微粒体孵育模型中均有检出,且无论Ⅰ相CYP酶介导的代谢过程是否被激活,加合物生成量与Luc浓度间均表现出了明显的浓度依赖性关系(图6)。相较于低底物浓度点(Luc浓度为5 μmol·L^-1),高底物孵育浓度点(25 μmol·L^-1)样品中dA和dC加合物的生成量增加了5~9倍,dG加合物的生成量增加了5~8倍。从上述的实验结果可知,Luc可以不通过代谢激活,直接与脱氧核苷反应生成DNA加合物。

3.5.2 Luc与脱氧核苷反应的孵育时间依赖性

Luc浓度为25 μmol·L^-1时,Ⅰ相代谢反应体系中加合物含量随孵育时间变化的曲线见图7,在0.5~3.5 h不同孵育时间点的样品中均检出了6种Luc-DNA加合物。代谢非激活情况下,Luc-dA 2、dG 2和dC 2加合物的含量随孵育时间增加;而Luc-dA 1、dG 1、dC 1加合物则在1.5 h后,含量趋于稳定或平缓下降。代谢激活情况下,不同孵育时间下代谢激活组的各加合物生成量以及生成速率均低于代谢非激活组,对于Luc-dA 2、dG 2和dC 2加合物,其在0.5 h时增长速率就开始变缓,而对于dA 1、dG 1、dC 1加合物,加合物含量在0.5 h就开始了缓慢下降。按公式1计算代谢激活后加合物含量的减少程度(%)。结果发现,与代谢非激活实验组相比,代谢激活后加合物的生成速率明显减慢,加合物生成量相对减少。

公式(1)$代谢激活后加合物含量的减少程度（％） = （代谢激活组加合物含量－代谢非激活组加合物含量）／代谢非激活组加合物含量 \times 100 \%$

4 讨论

收起

本实验基于串联四级杆质谱和高分辨质谱平台,将两种平台的优劣势互补,以同DNA加合物具有相同质谱碎裂特征的正常脱氧核苷对照品为研究对象,成功建立和优化了DNA加合物质谱分析的发现和确证策略。其中,串联四级杆质谱由于灵敏度高,特异性强,该质谱平台下的伪中性丢失和中性丢失扫描策略,尤其是伪中性丢失扫描,十分适合对未知DNA加合物进行高精度的非靶向发现。对于高分辨质谱平台,其精确质量测量的能力结合数据依赖性的扫描模式,能够精确地对DNA加合物进行鉴定,确定母离子和特征碎片离子的元素组成,提高鉴定结果的可信度,适合对发现的可能DNA加合物进行确证。

本研究成功将建立的两种加合物筛查策略和一种加合物确证策略,应用于Luc与脱氧核苷反应生成DNA加合物的发现、确证工作中。首次发现Luc与脱氧核苷可直接生成DNA加合物,识别并鉴定了6种Luc-DNA加合物,包含2种Luc-dA加合物、2种Luc-dG加合物和2种Luc-dC加合物。对于Luc的dA和dG加合物,有文献^[18]使用³²P-后标记法对其进行了初步的研究,但该方法不能提供DNA加合物的结构信息,对此,本研究给出了有依据的结构推测;而Luc的dC加合物尚无相关报道,为本研究首次发现并对其结构进行确证。

在Ⅰ相代谢非激活的情况下,Luc与脱氧核苷直接孵育后,Luc-DNA加合物的生成均表现出了与底物浓度的显著正相关和与孵育时间的相关性,这佐证了Luc与脱氧核苷直接结合生成DNA加合物的能力。本研究发现,Luc与脱氧核苷可直接反应生成加合物,体外Ⅰ相代谢反应对加合物的生成存在影响,代谢激活后Luc加合物的生成速率明显减慢,影响因素较多,如可能由于Luc被代谢底物含量减少或Luc代谢物与脱氧核苷结合,均能导致上述结果。考虑到Luc-DNA加合物孵育的实验模型为体外肝微粒体代谢模型,可能与体内真实代谢情况存在一定差异,因此在体内广泛而持久的代谢条件下,DNA加合物的形成和清除情况、最终传递风险的程度,有待于进一步深入研究。后续将参考本课题组Luc的体外代谢稳定性实验结果^[19],选取与人具有相似代谢特征的实验动物模型,进行加合物和代谢的体内研究和体内外相关性研究。本研究可为中草药中潜在遗传毒性成分的快速筛查提供重要的方法参考。

基金

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江苏省市场监督管理局科技计划项目资助(KJ21125050)
江苏省市场监督管理局科技计划项目资助(KJ207558)

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文献

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2024年第59卷第4期

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doi: 10.11669/cpj.2024.04.007

接收时间：2023-01-16
首发时间：2025-11-13
出版时间：2024-02-22

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收稿日期：2023-01-16

基金

江苏省市场监督管理局科技计划项目资助(KJ21125050)

江苏省市场监督管理局科技计划项目资助(KJ207558)

作者信息

¹ 南京中医药大学药学院, 南京 210023

² 江苏省食品药品监督检验研究院, 南京 210019

³ 中国药科大学药学院, 南京 211198

通讯作者:

*黄青,女,博士,主任药师研究方向:药物分析与药物质量控制 Tel:(025)86251121;

袁耀佐,男,博士,主任药师研究方向:药物分析与药物质量控制 Tel:(025)86251120

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/zgyxzz/CN/10.11669/cpj.2024.04.007

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

Compound	Sensitivity		Fold change
Compound	Neutral loss scanning	Pseudo-neutral loss scanning/pg·mL^-1	Fold change
dC	1.25 ng·mL^-1	19.53	64
dA	156.25 pg·mL^-1	1.22	128
dG	1.25 ng·mL^-1	9.77	128