畜牧兽医学报

引物/探针名称 Primer/probe name	序列（5’→3’） Sequence
NDV-2471F NDV-2751R NDV-2751P-FAM	ACHATCAGYTGGTGCAACCC CRGGRTCCAGAATYTTCATCA CAGGCGATGATGTCTATGATGGAGGC

引物/探针名称 Primer/probe name

序列（5’→3’） Sequence

NDV-2471F

NDV-2751R

NDV-2751P-FAM

ACHATCAGYTGGTGCAACCC

CRGGRTCCAGAATYTTCATCA

CAGGCGATGATGTCTATGATGGAGGC

引物/探针名称 Primer/probe name	序列（5’→3’） Sequence
NDV-2471F NDV-2751R NDV-2751P-FAM	ACHATCAGYTGGTGCAACCC CRGGRTCCAGAATYTTCATCA CAGGCGATGATGTCTATGATGGAGGC

引物/探针名称 Primer/probe name

序列（5’→3’） Sequence

NDV-2471F

NDV-2751R

NDV-2751P-FAM

ACHATCAGYTGGTGCAACCC

CRGGRTCCAGAATYTTCATCA

CAGGCGATGATGTCTATGATGGAGGC

稀释度Dilution	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4
Ct值	19.06	22.39	25.20	28.22

稀释度Dilution

10^-1

10^-2

10^-3

10^-4

Ct值

19.06

22.39

25.20

28.22

稀释度Dilution	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4
Ct值	19.06	22.39	25.20	28.22

稀释度Dilution

10^-1

10^-2

10^-3

10^-4

Ct值

19.06

22.39

25.20

28.22

样品编号 Sample No.	Ct值 Ct value	样品编号 Sample No.	Ct值 Ct value
1	28.401	10	28.622
2	28.534	11	28.575
3	28.895	12	28.291
4	28.752	13	27.985
5	28.521	14	28.973
6	28.456	15	28.826
7	28.658	$x ¯$ ±s	28.56±0.25
8	28.319
9	28.716	CV	0.90%

样品编号

Sample No.

Ct值

Ct value

样品编号

Sample No.

Ct值

Ct value

28.401

28.622

28.534

28.575

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28.752

27.985

28.521

28.973

28.456

28.826

28.658

x ¯

±s

28.56±0.25

28.319

28.716

0.90%

样品编号 Sample No.	Ct值 Ct value	样品编号 Sample No.	Ct值 Ct value
1	28.401	10	28.622
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样品编号

Sample No.

Ct值

Ct value

样品编号

Sample No.

Ct值

Ct value

28.401

28.622

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28.456

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±s

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温度Temperature	时间 Time	Ct值（ $x ¯$ ±s） Ct value	P值 P value
4 ℃	第0天	28.56±0.25	-
第3天	28.67±0.21	0.496 7
第5天	28.03±0.50	0.211 1
第7天	28.55±0.20	0.921 7
25 ℃	第0天	28.56±0.25	-
第3天	28.68±0.26	0.524 3
第5天	28.54±0.31	0.923 6
第7天	28.45±0.42	0.694 1
-20 ℃	第0天	28.56±0.25	-
1个月	28.67±0.16	0.381 9
2个月	28.60±0.14	0.734 1
3个月	28.93±0.29	0.165 9
4个月	28.68±0.49	0.714 8
5个月	28.29±0.17	0.120 5
6个月	28.58±0.33	0.925 3

温度Temperature

时间

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第0天

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新城疫病毒P基因假病毒的构建与初步应用

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王海鸣 ¹^,² , 郭通 ²^,³ , 丁雨 ² , 李阳 ² , 龚振兴 ¹ , 王静静 ² , 刘华雷 ²

畜牧兽医学报 | 预防兽医 2026,57(3): 1605-1612

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畜牧兽医学报 |预防兽医 2026 , 57 (3) : 1605 -1612

新城疫病毒P基因假病毒的构建与初步应用

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王海鸣¹^,², 郭通²^,³, 丁雨², 李阳², 龚振兴¹, 王静静², 刘华雷²

作者信息

^1.宁夏大学动物科技学院，银川 750021

^2.中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室，青岛 266032

^3.青岛农业大学动物医学院，青岛 266109

通讯作者:

王静静，主要从事畜禽重要疫病防控，E-mail： shui21@163.com

刘华雷，主要从事重大动物疫病防控技术研究，E-mail： hualeiliuwy@163.com

作者简介:

王海鸣，硕士生，主要从事预防兽医学研究，E-mail： whm20000903@163.com

Construction and Application of Newcastle Disease Virus P Gene Pseudovirus

Haiming WANG¹^,², Tong GUO²^,³, Yu DING², Yang LI², Zhenxing GONG¹, Jingjing WANG², Hualei LIU²

Affiliations

^1.College of Animal Science and Technology，Ningxia University，Yinchuan 750021，China

^2.Avian Disease Surveillance Room，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032，China

^3.College of Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China

Corresponding Author:

WANG Jingjing， E-mail： shui21@163.com

LIU Hualei， E-mail： hualeiliuwy@163.com

出版时间: 2026-03-23 doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.03.036

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摘要

收起

旨在构建一种安全、有效的新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）假病毒，用于NDV核酸检测的质量控制。通过RT-PCR扩增NDV P基因，连接至慢病毒表达载体PLV-Puro，构建了Puro-NDV/P。提取Puro-NDV/P质粒及2个辅助质粒，共转染293T细胞，成功构建了含有NDV P基因的假病毒颗粒。将构建的假病毒颗粒适当稀释后冻干，制备为RNA阳性质控品，并进行标定、均一性及稳定性检验。通过构建成功的NDV P基因假病毒建立Taqman荧光定量PCR检测方法。结果显示，随机抽取15份阳性质控品进行荧光RT-PCR检测，Ct值变异系数（CV）为0.90%，均一性良好；对制备好的阳性质控品测定其拷贝数为6.58×10² copies·μL^-1。将质控品置于4 ℃、25 ℃短期保存（1周）、-20 ℃长期保存（6个月），经荧光RT-PCR检测Ct值无显著变化，稳定性良好。建立了基于NDV P基因假病毒的实时荧光RT-PCR检测方法。该试验所制备的NDV假病毒具有均一性好、稳定性强等优点，可用于NDV核酸检测试剂盒研发、评估和质控，为NDV标准化检测提供了可靠工具。

关键词

新城疫病毒 / 假病毒 / 阳性质控品 / 荧光RT-PCR

Abstract

收起

This study aimed to construct a safe and effective Newcastle disease virus （NDV） pseudovirus for the quality control of NDV nucleic acid detection. The P gene of NDV was amplified by RT-PCR and linked to the lentiviral expression vector PLV-Puro to construct Puro-NDV/P. Puro-NDV/P plasmids and two helper plasmids were extracted， and a total of 293T cells were transfected， and pseudovirus particles containing NDV P genes were successfully constructed. The constructed pseudovirus particles were properly diluted and lyophilized to prepare RNA-positive quality controls， and calibrated， uniformity and stability tested. A Taqman fluorescence quantitative PCR detection method was established by successfully constructing NDV P gene pseudovirus. The results showed that 15 positive quality control products were randomly selected for fluorescence RT-PCR detection， and the Ct value coefficient of variation （CV） was 0.90%， which was good uniformity. The copy number of the prepared positive quality control products was 6.58×10² copies·μL^-1. The quality controls were stored at 4 ℃， 25 ℃ for short-term storage （1 week）， and -20 ℃ for a long time （6 months）， and the Ct value was detected by fluorescence RT-PCR without significant change， and the stability was good. A real-time fluorescence RT-PCR detection method based on NDV P gene pseudovirus was established. The NDV pseudovirus prepared in this test has the advantages of good uniformity and stability， and can be used for the research and development， evaluation and quality control of NDV nucleic acid detection kits， providing a reliable tool for the standardized detection of NDV.

Key words

Newcastle disease virus / pseudovirus / positive control / fluorescent quantitative RT- PCR

引用本文

王海鸣, 郭通, 丁雨, 李阳, 龚振兴, 王静静, 刘华雷. 新城疫病毒P基因假病毒的构建与初步应用. 畜牧兽医学报, 2026 , 57 (3) : 1605 -1612 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.03.036

Haiming WANG, Tong GUO, Yu DING, Yang LI, Zhenxing GONG, Jingjing WANG, Hualei LIU. Construction and Application of Newcastle Disease Virus P Gene Pseudovirus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2026 , 57 (3) : 1605 -1612 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.03.036

正文

收起

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）强毒株引起的禽类烈性传染病，世界动物卫生组织（WOAH）将其列为法定报告的动物疫病。NDV属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）正禽腮腺炎病毒属（Orthoavulavirus），基因组为单股负链RNA，包括6个基因片段，其中NP、P基因最为保守，常作为NDV核酸检测的靶基因。目前，NDV检测主要依赖病毒分离鉴定和核酸检测，核酸检测因其高效性和准确性而得到广泛应用。在核酸检测过程中，阳性质控品可监控整个流程，确保检测结果的可靠性和准确性。与传统质粒质控品和RNA标准品相比，假病毒具有类似真实病毒的结构，可避免 RNA降解和交叉污染，具有较好的稳定性。与新城疫病毒相比，虽然二者在结构上相似，但假病毒不具备复制能力^［1］，因此更安全，可以在BSL-2实验室中操作。假病毒在高致病性病原微生物核酸检测领域发挥了重要作用。在新冠疫情期间，由于新型冠状病毒（SARS-CoV-2）具有高度传染性及生物安全风险，科研人员利用慢病毒载体构建了SARS-CoV-2假病毒，其被广泛应用于新冠病毒核酸检测试剂评价与质控，确保了试剂盒检测的准确性和检测人员的人身安全^［2］。用于构建假病毒的载体主要包括慢病毒（lentivirus，LV）、腺病毒（adenovirus，ADV）和腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）。在三种常用的病毒载体中，慢病毒载体由于其效率高、插入基因容量大和稳定性好，是制备假病毒的首选包装系统。因此，本研究选用慢病毒载体，以新城疫病毒较为保守的P基因为靶基因，构建了NDV的P基因假病毒颗粒作为阳性质控品，并对质控品进行均一性和稳定性检验。该研究制备的阳性质控品，可用于NDV核酸检测试剂盒研发、评估和质控，为NDV标准化检测提供了可靠工具。

1　材料与方法

收起

1.1　感受态、细胞株及质粒

DH5α感受态细胞购自生工生物工程（上海）有限公司；293T细胞为本实验室保存；慢病毒基因过表达载体PLV-Puro以及慢病毒包装辅助载体Ph1、Ph2购自英茂盛业生物科技有限公司。

1.2　主要试剂

XbaⅠ、XhoⅠ限制性核酸内切酶、Recombinant DNaseI、PCR试剂盒、荧光RT-PCR试剂盒、切胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清购自北京擎科生物科技有限公司；Polyfect-C转染试剂购自英茂盛业生物科技有限公司；全自动核酸提取试剂盒购自天隆科技有限公司。

1.3　NDV假病毒的构建

将重组质粒Puro-NDV/P以及辅助质粒Ph1、Ph2共转染至293T细胞。转染后48 h收集细胞上清液，用Recombinant DNase I去除细胞上清液中残留DNA，并利用文献［3］中NDV通用引物探针进行荧光PCR检测，引物探针序列见（表1）。将荧光PCR检测为阴性的细胞上清液提取RNA后进行荧光RT-PCR鉴定^［3］，反应程序：反转录42 ℃ 5 min；预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃ 5 s，退火温度59 ℃ 40 s，扩增设置40个循环，每个循环结束后进行荧光信号的采集。保留鉴定为阳性的细胞上清液，使用PEG慢病毒纯化试剂对假病毒进行纯化。

1.4　NDV假病毒阳性质控品的制备

1.4.1　预冻干浓度筛选

利用无菌 PBS将纯化的假病毒进行10^-1~10^-4稀释。分别取200 μL的样品提取RNA，进行荧光RT-PCR扩增。记录检测Ct值，选择适当稀释度假病毒与脱脂乳1∶1混匀后进行分装，1mL·瓶^-1，冻干后置于-20 ℃冰箱保存。

1.4.2　阳性质控品均一性评价

随机抽取15份阳性质控品进行均一性检验。取1 mL PBS复溶冻干的假病毒，提取RNA，采用荧光RT-PCR方法进行测定。通过分析15个检测结果的Ct值变异程度评价质控品的均一性：若Ct值的变异系数（CV）小于5 %，表明质控品具有良好的均一性；若Ct值存在显著差异（CV>5%），则说明存在样品分装不均或冻干工艺不稳定等问题，需进一步优化制备工艺。

1.4.3　阳性质控品的定量

用无菌水将假病毒颗粒依次进行10、100、1 000倍稀释，通过数字PCR仪对冻干后的NDV假病毒阳性质控品进行定值，计算其拷贝数。

1.4.4　阳性质控品稳定性评价

短期稳定性试验：取冻干NDV假病毒阳性质控品分别放置于4 ℃和25 ℃环境下储存一周，于第3天、第5天、第7天各取1瓶阳性质控品，复溶后提取RNA，进行荧光RT-PCR检测，每次做3个重复。根据检测Ct值利用SAS 8.2中配对t检验计算P值，进行差异显著性分析。P≤0.05表明差异显著，P>0.05表明差异不显著。

长期稳定性试验：将NDV假病毒阳性质控品置于-20 ℃冰箱中储存6个月，每月各抽取1瓶，复溶后提取RNA，进行荧光RT-PCR检测，每次做3个重复。根据检测Ct值计算P值，进行差异显著性分析。

1.5　实时荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

1.5.1　实时荧光RT-PCR特异性评价

方法特异性通过检测已制备的NDV假病毒阳性质控品及实验室保存的禽流感病毒（AIV）、鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）和禽腺病毒（FAV）六种病原核酸来进行评价。

1.5.2　实时荧光RT-PCR敏感性试验

将数字PCR仪定值后的假病毒颗粒进行10倍倍比稀释后进行荧光RT-PCR检测，评价方法的敏感性。

1.5.3　临床应用

采用实时荧光RT-PCR方法对实验室收集保存的50份禽类拭子进行NDV核酸检测，以制备好的NDV假病毒阳性质控品制备3份作为阳性对照进行荧光RT-PCR检测。

2　结果

收起

2.1　NDV假病毒的构建

将NDV P基因与PLV-Puro载体连接、转化，构建重组质粒Puro-NDV/P，并与辅助包装质粒Ph1、Ph2共转染293T细胞。转染后48 h收集细胞上清液，经Recombinant DNaseI去除细胞液中残留DNA，随后提取细胞液RNA进行荧光RT-PCR检测，出现典型的S型扩增曲线（图1）。

2.2　NDV假病毒阳性质控品的制备

2.2.1　预冻干浓度筛选

将纯化后的假病毒进行10倍倍比稀释，取10^-1~10^-4稀释度样品提取核酸，进行荧光RT-PCR检测（图2），检测Ct值见（表2）。综合考虑阳性质控的检测Ct值和制备成本，选择10^-3稀释度样品冻干，制备为NDV假病毒阳性质控品。

2.2.2　阳性质控品均一性评价

随机抽取冻干后的15份样品，复溶后提取RNA进行荧光RT-PCR检测。检测结果显示，15份样品经检测平均Ct值为28.56±0.25，CV值为0.90%（图3、表3），表明样品间的离散程度低，所制备样品均一性良好。

2.2.3　阳性质控品的定量

用1 mL PBS溶解冻干后的阳性质控品，提取RNA后进行10倍倍比稀释，取10⁰~10^-3稀释度样品进行反转录数字PCR，测定阳性质控品拷贝数为6.58×10² copies·μL^-1。

2.2.4　阳性质控品稳定性评价

将制备的阳性质控品放置于4 ℃冰箱、25 ℃温箱中储存一周，以及-20 ℃冰箱储存6个月，分别于不同时间点取1瓶阳性质控品，进行荧光RT-PCR检测，每次做3个重复，计算平均Ct值，并与第0天阳性质控品Ct值进行比较，评价阳性质控品短期和长期储存的稳定性。结果显示NDV阳性质控品在4 ℃、25 ℃保存一周，以及-20 ℃保存6个月，检测Ct值均无显著差异（表4）。说明制备的阳性质控品可在4 ℃、25 ℃环境下稳定存放7 d，可在-20 ℃冰箱稳定存放至6个月。

2.3　NDV假病毒阳性质控品荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

2.3.1　特异性评价

采用建立的实时荧光RT-PCR方法对已制备的NDV P假病毒阳性质控品及实验室保存的AIV、IBV、ILTV、FAV、IBDV进行检测，仅检测出NDV P假病毒其余禽类常见传染病病毒均没有出现非特异性扩增，证明该方法具有良好的特异性。

2.3.2　敏感性结果

将已知拷贝数的NDV假病毒病毒液RNA采用倍比稀释（10倍倍比稀释成4个浓度），对6.58×10⁴~6.58×10¹ copies·μL^-1的稀释样品进行荧光RT-PCR检测，结果见图5。建立的NDV P假病毒荧光RT-PCR方法最低能检测到6.58×10² copies·μL^-1。

2.3.3　临床应用

采用建立的NDV假病毒荧光RT-PCR方法对50份临床拭子进行NDV病毒核酸检测，检测结果见图6，3份NDV假病毒阳性质控品及2份阳性样品均被检出，其余样本检测结果均为阴性，说明建立的NDV假病毒阳性质控品荧光RT-PCR方法具有良好的应用前景。

3　讨论

收起

假病毒，也称为假型病毒，根据其用途分为两类，一类是包装有外源基因片段的重组病毒颗粒^［4］，另一类是用于表达外源蛋白的重组病毒颗粒。由于假病毒具有安全性高和与真病毒结构相似等优点，常作为活病毒的替代品，用于病原学研究和诊断试剂研发^{［2，5⁃6］}。慢病毒、腺病毒和腺相关病毒均可用于构建假病毒。其中，慢病毒包装系统转染效率高、基因整合能力稳定，是制备假病毒的常用包装系统。本研究利用慢病毒包装系统，构建了包含P基因的NDV假病毒，经检验证实其具有良好的均一性和稳定性，可用于NDV核酸检测的质量控制。国内外先后用慢病毒表达载体构建了新冠病毒^［7］、埃博拉病毒^［4］、乙型脑炎病毒^［8］、禽流感病毒^［9］、尼帕病毒^［10］、基孔肯雅热病毒^［11］等高致病性病原的假病毒，避免了使用原始活病毒可能带来的生物安全风险。与腺病毒或腺相关病毒载体相比，慢病毒载体具有更大的基因容量，但其制造成本较高，并且依赖于靶细胞的分裂活性。Sena-Esteves等^［12］通过优化293T细胞的转染条件和培养基成分，显著提高了慢病毒假病毒的产量，这为未来大规模生产NDV假病毒提供了参考方案。

本研究利用NDV假病毒制备了NDV阳性质控品，并验证了质控品的均一性和稳定性。结果表明，制备的阳性质控品荧光RT-PCR检测Ct值的变异系数仅为0.90%，表明质控品具有良好的均一性。此外，质控品在4 ℃、25 ℃环境下贮存7 d及-20 ℃冰箱中储存6个月，荧光RT-PCR检测Ct值无显著变化（P>0.05），证实其稳定性良好。黄益曼等^［13］制备的尼帕病毒假病毒可在-80 °C下稳定储存6个月，而Neto等^［14］的研究表明冻干处理的埃博拉和马尔堡假病毒在4 ℃环境下可稳定保存12个月以上，这些研究表明适当的储存条件对维持假病毒稳定性至关重要。

新城疫是严重危害养禽业的重要疫病之一，该病于1926年首次发现于印度尼西亚，后来迅速蔓延至其他地区，并造成全球首次新城疫大流行，随后由于鹦鹉和鸽等观赏性鸟类的国际贸易分别造成了全球第二次和第三次新城疫大流行。20世纪90年代以来，基因VII型NDV的出现导致了全球第四次新城疫大流行^{［15⁃16］}。目前，已有多家实验室针对新城疫病毒建立了一系列病原学检测方法。新城疫病毒NP和P基因较为保守，本研究制备了包含P基因的假病毒，可用于建立新城疫病毒通用核酸检测方法，而F基因是区分NDV强弱毒的关键基因，通常作为NDV强弱毒鉴别检测的靶基因。未来可制备包含多基因片段的NDV假病毒，以期能够更全面地满足NDV核酸检测需求。

4　结论

收起

本研究构建了NDV P基因假病毒，制备了NDV假病毒阳性质控品，经试验证实质控品具有良好的均一性和稳定性，可用于NDV检测方法建立、试剂盒研发，以及NDV核酸检测流程质控，为NDV标准化检测提供了可靠工具。

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国家重点研发计划(2022YFD1800600)

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2026年第57卷第3期

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doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.03.036

接收时间：2025-06-10
首发时间：2026-09-16
出版时间：2026-03-23

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收稿日期：2025-06-10

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国家重点研发计划(2022YFD1800600)

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^1.宁夏大学动物科技学院，银川 750021

^2.中国动物卫生与流行病学中心禽病监测室，青岛 266032

^3.青岛农业大学动物医学院，青岛 266109

通讯作者:

王静静，主要从事畜禽重要疫病防控，E-mail： shui21@163.com

刘华雷，主要从事重大动物疫病防控技术研究，E-mail： hualeiliuwy@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

引物/探针名称 Primer/probe name	序列（5’→3’） Sequence
NDV-2471F NDV-2751R NDV-2751P-FAM	ACHATCAGYTGGTGCAACCC CRGGRTCCAGAATYTTCATCA CAGGCGATGATGTCTATGATGGAGGC

引物/探针名称 Primer/probe name

序列（5’→3’） Sequence

NDV-2471F

NDV-2751R

NDV-2751P-FAM

ACHATCAGYTGGTGCAACCC

CRGGRTCCAGAATYTTCATCA

CAGGCGATGATGTCTATGATGGAGGC

稀释度Dilution	10^-1	10^-2	10^-3	10^-4
Ct值	19.06	22.39	25.20	28.22

稀释度Dilution

10^-1

10^-2

10^-3

10^-4

Ct值

19.06

22.39

25.20

28.22

样品编号 Sample No.	Ct值 Ct value	样品编号 Sample No.	Ct值 Ct value
1	28.401	10	28.622
2	28.534	11	28.575
3	28.895	12	28.291
4	28.752	13	27.985
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6	28.456	15	28.826
7	28.658	$x ¯$ ±s	28.56±0.25
8	28.319
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样品编号

Sample No.

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样品编号

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28.534

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28.521

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28.658

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28.56±0.25

28.319

28.716

0.90%

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4 ℃	第0天	28.56±0.25	-
第3天	28.67±0.21	0.496 7
第5天	28.03±0.50	0.211 1
第7天	28.55±0.20	0.921 7
25 ℃	第0天	28.56±0.25	-
第3天	28.68±0.26	0.524 3
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第7天	28.45±0.42	0.694 1
-20 ℃	第0天	28.56±0.25	-
1个月	28.67±0.16	0.381 9
2个月	28.60±0.14	0.734 1
3个月	28.93±0.29	0.165 9
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5个月	28.29±0.17	0.120 5
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