畜牧兽医学报

名称缩写 Abbreviation	名称或注释 Name or annotation	变化倍数 Fold Change	P值 P value
ATP1A1	钠/钾转运ATP酶亚基α-1	3.593 4	0.038 1
COL7A1	Ⅶ型胶原蛋白α-1链	2.549 4	0.039 8
IGF2R	胰岛素样生长因子2受体	0.586 0	0.000 8
IGFBP3	胰岛素样生长因子结合蛋白3	0.349 3	0.020 1
MMP3	基质金属蛋白酶3	0.268 0	0.028 7

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通路ID Pathway ID	通路名称 Pathway name	与该通路相关的差异蛋白的数目 Number of differential proteins associated with the pathway	P值 P value	代表性蛋白质 Typical protein
hsa03050	蛋白酶体 Proteasome	7	0.002 1	PSMB2、PSMA3
hsa03320	PPAR信号通路 PPAR signaling pathway	4	0.010 8	APOA1、ME1
hsa04512	细胞外基质受体相互作用 ECM-receptor interaction	8	0.000 1	COL1A1、COL6A1
hsa04510	粘着斑 Focal adhesion	10	0.002 3	ACTN4、FLNA

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梅花鹿鹿茸干细胞共培养对人皮肤成纤维细胞抗衰老影响及其蛋白组学研究

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李雄智 , 刘振 , 胡肖 , 张迪 , 黄聪 , 周李生 , 孙伟丽 , 刘可园 , 赵海平

畜牧兽医学报 | 遗传育种 2026,57(2): 769-779

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畜牧兽医学报 |遗传育种 2026 , 57 (2) : 769 -779

梅花鹿鹿茸干细胞共培养对人皮肤成纤维细胞抗衰老影响及其蛋白组学研究

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李雄智，硕士生，主要从事特种经济动物研究，E-mail： xiongzhi8670@163.com

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李雄智，硕士生，主要从事特种经济动物研究，E-mail： xiongzhi8670@163.com

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李雄智, 刘振, 胡肖, 张迪, 黄聪, 周李生, 孙伟丽, 刘可园, 赵海平

作者信息

青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109

通讯作者:

赵海平，主要从事特种动物干细胞研究，E-mail： zhperic@163.com

作者简介:

李雄智，硕士生，主要从事特种经济动物研究，E-mail： xiongzhi8670@163.com

Effects of Sika Deer Velvet Antler Stem Cell Co-culture on Anti-aging in Human Dermal Fibroblasts and a Proteomic Study

Xiongzhi LI, Zhen LIU, Xiao HU, Di ZHANG, Cong HUANG, Lisheng ZHOU, Weili SUN, Keyuan LIU, Haiping ZHAO

Affiliations

College of Animal Science and Technology，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China

Corresponding Author:

ZHAO Haiping， E-mail： zhperic@163.com

出版时间: 2026-02-23 doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.017

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摘要

收起

旨在探索梅花鹿鹿茸干细胞（reserve mesenchyme cells，RMCs）对过氧化氢诱导衰老的人皮肤成纤维细胞（human dermal fibroblasts， HDFs）的抗衰老作用及分子机制。本研究采用200 µmol·L^-1 H₂O₂处理构建HDFs衰老模型，并通过SA‑β‑gal染色验证模型成功建立，通过与RMCs共培养后，检测衰老HDFs的细胞增殖与迁移能力、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量；进一步利用4D‑DIA蛋白质组学技术，鉴定共培养条件培养基与衰老HDFs条件培养基中的差异蛋白，并进行生物信息学富集分析。细胞功能检测表明，与模型组相比，RMCs共培养组HDFs的增殖与迁移能力显著提高（P<0.01），同时SOD活性显著提高（P<0.05），MDA含量降低（P<0.05）。在共培养条件培养基中鉴定289种差异蛋白，其中ATP1A1、COL7A1、IGF2R及MMP3等关键分子的表达发生显著改变。KEGG富集分析揭示蛋白酶体、PPAR信号通路、细胞外基质–受体相互作用及粘着斑通路为主要调控轴。本研究结果提示，梅花鹿RMCs可通过减轻氧化应激改善衰老细胞功能，推测RMCs可能通过增强蛋白酶体介导的损伤蛋白清除、激活PPARγ抑制炎症与氧化应激，促进COL7A1‑依赖的真皮‑表皮连接重建与抑制MMP3介导的ECM降解，共同维护HDFs的稳态与功能。本研究为鹿茸干细胞分泌产物的皮肤抗衰老策略提供了理论基础。

关键词

鹿茸干细胞 / 人皮肤成纤维细胞 / 细胞共培养 / 抗衰老 / 条件培养基 / 蛋白质组学

Abstract

收起

This study aimed to investigate the anti-aging effects and underlying molecular mechanisms of reserve mesenchyme cells （RMCs） derived from the velvet antler of the sika deer on hydrogen peroxide-induced senescent human dermal fibroblasts （HDFs）. An HDF senescence model was established by treatment with 200 µmol·L^-1 H₂O₂ and confirmed via SA‑β‑galactosidase staining. Senescent HDFs were then co‑cultured with RMCs， and subsequent assays evaluated cell proliferation， migration， superoxide dismutase （SOD） activity， and malondialdehyde （MDA） content. The 4D-DIA proteomics technology was used to identify differential proteins between co-culture medium and senescent HDF medium， and bioinformatics enrichment analysis was performed. Functional analyses revealed that， compared with the model group， RMCs co‑culture significantly enhanced HDFs proliferation and migration （P<0.01）， increased SOD activity （P<0.05）， and decreased MDA levels （P<0.05）. Using 4D‑DIA proteomics， 289 differentially expressed proteins were identified in the conditioned media of the co‑culture versus senescent HDF alone， with key molecules such as ATP1A1， COL7A1， IGF2R， and MMP3 showing significant expression changes. KEGG enrichment analysis highlighted the proteasome， PPAR signaling pathway， extracellular matrix-receptor interaction， and focal adhesion pathways as principal regulatory axes. These findings suggest that velvet-antler-derived RMCs from the sika deer alleviate oxidative stress-induced dysfunction in senescent HDFs. It was speculated that RMCs may exert their effects by enhancing proteasome‑mediated clearance of damaged proteins， activating PPARγ to suppress inflammation and oxidative stress， promoting COL7A1‑dependent dermal-epidermal junction reconstruction， and inhibiting MMP3‑mediated extracellular matrix degradation， thus maintaining HDF homeostasis and function. This work provides experimental evidence and a theoretical foundation for developing deer antler-derived secretome-based strategies for skin anti‑aging.

Key words

antler stem cells / human dermal fibroblasts / cell co-culture / anti-aging / conditioned medium / proteomics

引用本文

李雄智, 刘振, 胡肖, 张迪, 黄聪, 周李生, 孙伟丽, 刘可园, 赵海平. 梅花鹿鹿茸干细胞共培养对人皮肤成纤维细胞抗衰老影响及其蛋白组学研究. 畜牧兽医学报, 2026 , 57 (2) : 769 -779 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.017

Xiongzhi LI, Zhen LIU, Xiao HU, Di ZHANG, Cong HUANG, Lisheng ZHOU, Weili SUN, Keyuan LIU, Haiping ZHAO. Effects of Sika Deer Velvet Antler Stem Cell Co-culture on Anti-aging in Human Dermal Fibroblasts and a Proteomic Study[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2026 , 57 (2) : 769 -779 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.017

正文

收起

鹿茸是唯一能够完全再生的哺乳动物器官，鹿茸形成区干细胞的增殖驱动了该过程的发生，鹿茸干细胞具有极强的再生潜能^［1⁃3］，近年来成为组织工程与抗衰老研究的热点。鹿茸是鹿类动物的一种快速生长的动物组织^［4⁃5］，驱动鹿茸快速生长的储备间充质细胞（reserve mesenchyme cells，RMCs）是鹿茸干细胞（antler stem cells，ASCs）的一种^［6⁃7］。ASCs能分泌丰富的生长因子和细胞因子，参与组织修复与抗衰老过程。多项研究表明，ASCs条件培养（conditioned medium，CM）上清中含有VEGF、EGF、TGF-β等活性分子，可促进伤口愈合与骨组织再生，并通过旁分泌小泡调节受体细胞的再生程序^［8］。SFRP4、LUM等再生调控蛋白在ASC条件培养液中高丰度表达，提示其分泌产物可通过Wnt和TGF-β信号通路促进组织再生^［9］。这些研究提示ASCs分泌丰富的细胞因子，可通过调节旁分泌发挥再生、抗氧化和抗衰老作用。

皮肤衰老是内源性因素与紫外线、污染等引起的外源性因素共同作用的结果，主要表现为真皮厚度减少、皱纹增多、弹性下降与屏障功能受损^［10］。人类真皮层中的成纤维细胞（human dermal fibroblasts，HDFs）是合成胶原蛋白、弹性蛋白及其他细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要细胞^［11］。随着年龄增长或氧化应激增高，HDFs的增殖能力下降、细胞骨架重组出现障碍，并分泌促炎因子和降解酶（如MMPs），形成衰老相关分泌表型（SASP），从而加速ECM降解并导致皮肤松弛^［11］。因此，成纤维细胞衰老导致的功能失调是皮肤衰老的关键驱动因素之一。

为探究鹿茸干细胞对皮肤衰老的影响，本研究构建了HDFs衰老模型，并将RMCs与衰老HDFs进行共培养，以模拟细胞间的旁分泌和接触依赖性信号传递，揭示RMCs对衰老HDFs的功能调控。同时，结合4D-DIA蛋白质组学技术，检测共培养组与仅衰老HDFs组条件培养基中蛋白表达的差异，并进一步分析相关的信号通路及生物学过程，旨在系统阐明鹿茸干细胞对衰老的人类皮肤成纤维细胞的抗衰老作用及其分子机制。

1　材料与方法

收起

1.1　试验材料

HDFs细胞系来源于中国科学院动物研究所国家干细胞资源库；采集4岁雄性梅花鹿（Cervus nippon）15~20 d二杠茸，按照孙红梅等^［12］的方法培养RMCs细胞系用于后续试验。均于完全培养基（DMEM+10%胎牛血清+1%双抗）中，37 ℃、5%CO₂细胞培养箱中培养。

1.2　主要试剂

胎牛血清（FBS）、二甲基亚砜（DMSO）和过氧化氢（H₂O₂）均购于默克生命科学公司；DMEM基础培养基、青霉素-链霉素溶液（100×，双抗）均购于赛默飞世尔科技公司；胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）和维生素C（Vc）均购于北京索莱宝科技有限公司；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒、细胞计数试剂盒-8（CCK-8，WST-8法）、Western及IP细胞裂解液、丙二醛（MDA）含量检测试剂盒（TBA法）均购自上海碧云天生物技术有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒（WST-8法）购自苏州格瑞锐思生物科技有限公司。

1.3　试验方法

1.3.1　HDFs衰老模型建立

按照潘长伟等^［13］的方法建立HDFs细胞衰老模型。具体操作为：P3代HDFs细胞按每孔1×10⁵个细胞的细胞密度接种于12孔板中，放置于37 ℃、5%CO₂细胞培养箱中培养24 h。弃去培养基后，空白组每孔加入1 mL无血清培养基，模型组每孔加入1 mL含 200 µmol·L^-1 H₂O₂的无血清培养基处理1 h，处理结束后用无血清培养基洗2次去除H₂O₂并加入DMEM完全培养基持续培养。处理后在48、96 h进行衰老表型鉴定，每组3个平行样，进行β-半乳糖苷酶染色法检测HDFs衰老模型是否成功建立。

1.3.2　β-半乳糖苷酶染色法检测HDFs细胞衰老

β-半乳糖苷酶染色试验分组同“1.3.1”分组一样。吸弃培养基经PBS洗两次，加入500 µL β-半乳糖苷酶染色固定液室温固定15 min，吸弃染色固定液后用PBS洗3次，然后用500 µL染色工作液37℃、5% CO₂孵育过夜，PBS洗涤后，倒置显微镜下对HDF细胞拍照计数，衰老细胞比例=（染色阳性细胞数/所计总细胞数）×100%。

1.3.3　试验分组

将试验细胞分为4组，每组3个重复：①空白组（无血清DMEM培养的HDFs）；②模型组（200 µmol·L^-1 H₂O₂处理1 h后的HDFs用无血清DMEM培养）；③Vc处理组（200 µmol·L^-1 H₂O₂处理1 h后的HDFs+维生素C溶于无血清DMEM，终浓度50 µg·mL^-1）；④共培养组（200 µmol·L^-1 H₂O₂处理1 h后的HDFs+RMCs用无血清DMEM共培养）。共培养采用0.4 µm孔径Transwell小室间接共培养，HDFs于Transwell小室的下室经200 µmol·L^-1 H₂O₂ 1 h处理后，将RMCs加入Transwell小室的上室中，共培养比例为HDF∶RM=3∶1。

1.3.4　Transwell共培养形态学观察

采用0.4 µm孔径的Transwell小室在12孔板中建立间接共培养体系，下室接种HDFs，上室接种RMCs。共培养48 h后进行形态学记录：先弃去培养基并以 PBS清洗2次；下室细胞用4%多聚甲醛室温固定10 min，取出上室（insert上膜面）细胞用4%多聚甲醛固定30 min；固定后用PBS 洗涤 2次并分别用结晶紫进行染色（下室、上室染色时间均为10 min），随后用蒸馏水洗去多余染液并自然晾干，显微观察。

1.3.5　CCK-8检测HDFs细胞增殖

HDFs接种于12孔板（每孔1×10⁴个细胞），孵育24 h后按“1.3.3”试验分组各自处理方案培养，使用CCK-8试剂盒检测细胞活力。分组处理后，分别于0、24、48、72和96 h向相应的孔中加入10 µL CCK-8试剂，孵育1 h后于450 nm波长下测定吸光度（OD值）。以第0 h吸光度为基准，计算相对增殖情况。

1.3.6　细胞划痕试验

HDFs接种于12孔板（每孔1×10⁵个细胞）培养至90%融合，用无菌移液器尖端在细胞单层上垂直画直线刮痕，PBS洗2次去除细胞碎片后，按“1.3.3”试验分组各自处理方案培养。分组处理后，记录划痕0、72 h的显微镜图像，使用ImageJ软件测量划痕宽度，计算愈合率。

1.3.7　氧化应激指标检测

超氧化物歧化酶（SOD）：HDFs接种于12孔板（每孔5×10⁴个细胞），孵育24 h后按“1.3.3”试验分组处理48 h后，收集各试验分组中的HDFs到离心管内进行细胞SOD的指标检测，1 000 r·min^-1离心弃上清，加入1 mL提取液在4 ℃超声破碎，12 000 r·min^-1 4 ℃离心10 min，取上清于冰上待测。严格按照SOD活性检测试剂盒说明书操作后，用酶标仪于450 nm处测定各管吸光值。丙二醛（MDA）：HDFs接种于12孔板（每孔5×10⁴个细胞），孵育24 h后按“1.3.3”试验分组处理48 h后，收集各试验分组中的HDFs到离心管内进行细胞的MDA的指标检测，1 000 r·min^-1离心弃上清，加入1 mL提取液，150 µL细胞裂解液裂解细胞，12 000 r·min^-1 4 ℃离心10 min，取上清待测。严格按照MDA含量检测试剂盒说明书操作后，用酶标仪于532 nm处测定各管吸光值。

1.3.8　统计学处理

利用GraphPad Prism软件分析数据。结果以“平均值±标准差（mean±SD）”表示，组间差异采用单因素方差分析（One-Way-ANOVA）进行比较，两组间差异采用独立样本t检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。*表示P<0.05，**表示P<0.01。

1.4　蛋白质组学分析

1.4.1　蛋白质提取与质量控制

将“1.3.3”试验分组中的模型组和共培养组培养48 h的条件培养基上清液体收集，4 ℃、1 000 r·min^-1离心10 min，0.22 µm滤膜过滤，-20 ℃保存。培养基上清中蛋白首先用SDT裂解液（4% SDS， 0.1 mol·L^-1 Tris-HCl， pH 7.6）提取，BCA法（Thermo Fisher， Waltham， MA， USA）定量后取20 µg上样，4%~20%梯度SDS-PAGE（180 V， 45 min）并以考马斯亮蓝R-250染色，确认蛋白条带完整。随后在56 °C用0.01 mol·L^-1 DTT 还原1.5 h，加入0.02 mol·L^-1 IAA在室温避光中烷基化30 min；用胰蛋白酶（酶∶底物=1∶50）37 ℃消化15~18 h。消化产物经MCX脱盐（OmniSolution， OS-MCX-1ML）、真空浓缩后重悬于0.1%甲酸水中，掺入iRT肽进行保留时间校正；所有样品上机前均做小型LC-MS/MS检测，确保肽段丰度与消化效率一致，剔除潜在离群点。

1.4.2　数据处理

消化肽在 Evosep One系统上进行纳升流速色谱分离，Bruker timsTOF质谱仪以DIA模式（100~1 700 m·z^-1，4个TIMS窗口均100 ms，PASEF碎裂能20~59 eV）采集原始数据。DIA数据用 Spectronaut 19（Biognosys， Zürich， Switzerland）处理，参数：dynamic iRT、MS2干扰校正、cross-run normalization 开启；允许2个 missed cleavages；固定修饰Carbamidomethyl（C），可变修饰 Oxidation（M）、Acetyl（Protein N-term）；Q Value cutoff =0.01（FDR<1%）。对蛋白定量强度值加1后取log₂并进行 Z-score 标准化，随后使用 Python 3.9（scikit-learn 1.2）对两组共6个样本进行主成分分析（PCA），随后以FC>1.5或<0.67且P<0.05为阈值筛选差异蛋白。

1.4.3　差异表达蛋白的功能分析

为了解这些差异表达蛋白在生物学过程中的富集情况，对筛得的差异蛋白进行GO和KEGG富集分析。GO采用Fisher精确检验（P<0.05）筛选BP、MF、CC三大分类下显著条目；KEGG通过对差异蛋白在7大通路类别（细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理、人类疾病、代谢、有机系统、药物开发）中的富集程度绘制气泡图。

2　结果

收起

2.1　成功构建HDFs衰老模型

为建立氧化应激诱导的衰老模型，在H₂O₂处理后的48与96 h进行了β-半乳糖苷酶染色，染色结果显示，H₂O₂促进HDFs衰老，与各自空白组相比，在48与96 h的模型组阳性着色细胞数均极显著增加（P<0.01），表明HDFs经200 µmol·L^-1 H₂O₂处理1 h后可形成稳定的衰老表型，见图1。

2.2　Transwell共培养细胞形态观察

为说明采用的间接共培养体系，图2给出12孔板Transwell小室的上下室细胞的结晶紫染色显微照片。示意图显示下室种植HDFs、上室（insert）种植RMCs，膜孔径为0.4 µm。图2A、B分别为下室HDF与上室RMCs（取出insert后在膜面拍摄）的代表视野。共培养为间接、经膜分泌物交流的体系，后续功能学变化均基于此体系下的间接交互。

2.3　RMCs共培养对衰老HDFs细胞增殖与迁移功能的影响

CCK-8结果显示，处理72 h以前，除空白组外，各组无显著差异。处理96 h，相对空白组，模型组衰老HDFs增殖能力极显著减弱（P<0.01）；与模型组相比，Vc组和共培养组均极显著促进衰老HDFs增殖（P<0.01），见图3A。

划痕试验结果表明，划痕72 h后，相比空白组，模型组衰老HDFs迁移能力极显著减弱（P<0.01）；与模型组相比，Vc组和共培养组均极显著促进衰老HDFs划痕愈合（P<0.01），见图3B。

2.4　RMCs共培养对衰老HDFs细胞内氧化应激指标的影响

SOD检测结果显示，相比模型组，空白组与Vc组SOD活力极显著升高（P<0.01）；相比模型组，共培养组SOD活力显著升高（P<0.05），见图4A。

MDA检测结果显示：相比模型组，空白组与Vc组MDA含量极显著降低（P<0.01）；相比模型组，共培养组MDA含量显著降低（P<0.05），见图4B。

2.5　差异表达蛋白定量分析

对处理后48 h的条件培养上清进行4D-DIA蛋白组学分析，共鉴定并定量蛋白2 037个，前两主成分清晰区分两组且组内聚合，支持数据质量与组间差异（图5A）；在两组不同处理的条件培养基蛋白组中，共筛选出289个差异表达蛋白，其中78个上调表达、211个下调表达（图5B）；绘制了火山图来展示详细情况（图5C）；与抗衰老相关具有代表性的蛋白有ATP1A1、COL7A1、IGF2R、IGFBP3、MMP3（蛋白缩写对应的描述详见表1）。

2.6　差异表达蛋白的GO功能注释

对两组比对发现的289个差异蛋白进行GO分析，结果涉及10种分子功能（molecular function， MF）、2种细胞组分（cellular component， CC）、10种生物学过程（biological process，BP）（图5D）。在分子功能（MF）分类中，结合过程涉及蛋白164个、分子功能调节因子活性（45个）、结构分子活性（22个）、分子传感器活性（14个）和转运体活性（11个）等；在细胞组成（CC）分类中，细胞解剖结构实体涉及蛋白249个，蛋白质复合物（60个），提示差异蛋白广泛分布于多种细胞结构与复合体中；在生物过程（BP）分类中，生物调节涉及蛋白123个、生物过程调节（117个）、响应刺激（105个）、多细胞有机体过程（97个）、发育过程（83个）等。

2.7　差异表达蛋白的KEGG通路注释与富集分析

对两组比对发现的差异表达蛋白进行KEGG通路分析，其中显著富集排名前20位的有补体和凝血级联、肌肉细胞骨架、ECM-受体相互作用、人乳头瘤病毒感染和蛋白酶体等通路（图5E），与抗衰老相关的信号通路有4条（表2）。

3　讨论

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本研究通过过氧化氢构建人皮肤成纤维细胞（HDFs）的衰老模型，探究鹿茸干细胞（RMCs）与衰老HDFs共培养对衰老HDFs的抗衰老作用。结果显示，与衰老HDFs模型组相比，RMCs与衰老HDFs共培养后，HDFs的增殖能力和迁移能力显著增强，表明RMCs促进了HDFs的细胞活性。推测可能是RMCs通过分泌生长因子、细胞因子或外泌体等旁分泌产物来调节HDFs的功能。已有研究表明，鹿茸干细胞及其分泌的外泌体可以被成纤维细胞摄取，进而促进其迁移、增殖和胶原合成^{［14⁃15］}。同时，与模型组相比，共培养组HDFs的超氧化物歧化酶（SOD）活力显著升高，脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量显著降低，表明RMCs提高了HDFs的抗氧化能力。这与鹿茸干细胞来源的分泌物具有清除自由基的效应一致，鹿茸干细胞的条件培养基富含细胞因子、微小核糖核酸等，能够有效清除DPPH自由基，并促进人角质形成细胞和真皮成纤维细胞增殖^{［15⁃17］}。此外，间充质干细胞来源的细胞培养基能够降低活性氧（ROS）的生成和基质金属蛋白酶（MMP）水平，并上调HDFs中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的表达，在氧化应激条件下保护I型胶原蛋白合成，从而起到延缓皮肤老化的目的^{［18⁃19］}，这与本研究结果RMCs与衰老HDFs共培养组抗氧化能力增强相符。因此，RMCs可能通过分泌细胞因子或外泌体等，激活HDFs的信号通路，不仅促进细胞增殖和迁移，而且增强其抵抗氧化和修复损伤的能力，从而起到抗衰老作用。

本研究收集了衰老HDFs的培养基上清及RMCs与衰老HDFs共培养组的培养基上清，进行蛋白质组学分析，共鉴定出289个差异蛋白（涉及ATP1A1、COL7A1、IGF2R、MMP3等关键分子）。ATP1A1编码钠/钾泵（Na⁺/K⁺-ATP酶）的α1亚基，该蛋白对维持细胞离子平衡和能量代谢至关重要^［20］。在衰老的人源成纤维细胞和神经细胞中，Na⁺/K⁺-ATP酶活性显著降低，导致离子稳态紊乱和膜电位部分去极化，进而触发DNA损伤反应并引起细胞周期停滞，促进细胞衰老^［21］。共培养组ATP1A1上调可能是RMCs增强了衰老的HDFs的Na⁺/K⁺-ATP酶活性，进而抑制细胞衰老；COL7A1编码Ⅶ型胶原蛋白α-1链，是真皮—表皮结合部位锚定纤维的关键成分，有利于重建真皮—表皮连接并改善皮肤结构^［22］。在人皮肤成纤维细胞中，过表达COL7A1可上调真皮—表皮连接区相关基因及抗氧化应答因子，改善衰老成纤维细胞的形态和迁移能力，并抑制SA-β-gal染色，且COL7A1表达增强还能改善皮肤屏障功能、降低氧化应激标志物，并通过多条衰老相关信号通路（如TGF-β、Wnt）协同作用，从而显著延缓组织衰老^{［23⁃24］}。共培养组中COL7A1上调，推测RMCs增加了衰老HDFs中该锚定纤维蛋白的表达量，进而增强细胞外基质（ECM）的合成、改善细胞形态，降低氧化应激并延缓细胞衰老；IGF2R是胰岛素生长因子2受体，在人源成纤维细胞的多代连续传代中，IGF2R表达水平与细胞倍增数呈正相关，并伴随衰老标志物（SA-β-gal、p21/p53）升高，表明IGF2R随复制性衰老上调^［25］。共培养组IGF2R下调可能反映RMCs延缓了衰老HDFs的衰老表型；MMP3为一种基质金属蛋白酶，在人和小鼠成纤维细胞的衰老模型中显著上调，促进ECM的降解与重塑，形成促炎和促纤维化的衰老相关分泌表型（SASP），加剧组织老化^{［26⁃27］}。共培养组中MMP3下调，提示RMCs可能减少了衰老HDFs的胶原降解，有助于维持ECM稳态并发挥一定的抗炎作用。上述蛋白变化表明，RMCs共培养可能调控衰老HDFs的细胞能量代谢和生长信号，平衡ECM的合成与降解，并发挥抗炎和抗氧化作用，从而抑制细胞老化表型。

本研究对差异蛋白进行了KEGG富集分析，在显著富集且排名前20位的信号通路中，与抗衰老相关的包括Proteasome（蛋白酶体）、PPAR signaling pathway（PPAR信号通路）、ECM-receptor interaction（细胞外基质-受体相互作用）和Focal adhesion（粘着斑）等4条通路。在人胚肺成纤维细胞（WI38）中，部分抑制蛋白酶体活性即可触发衰老样表型，表现为永久性增殖停滞和SA-β-gal阳性染色增加，提示蛋白酶体对维持细胞稳态并延缓衰老具有重要作用^［28］。此外，蛋白酶体活性增强可更有效清除氧化损伤蛋白，从而对氧化和化学应激表现出更强的抵抗能力，并延缓衰老进程^{［29⁃30］}。因此推测，RMCs共培养可能通过影响蛋白酶体通路促进HDFs的蛋白质稳态调节，清除错误折叠与受损蛋白，从而延缓细胞衰老。激活PPARγ可下调NF-κB信号通路，减轻与年龄相关的慢性炎症和活性氧（ROS）积累，从而在多种组织中发挥抗衰老作用并延缓组织功能衰退^{［31⁃33］}。上调PPARγ表达可显著降低人皮肤成纤维细胞早期衰老模型的SA-β-gal活性并恢复抗氧化平衡，表明激活该通路可延缓细胞衰老^［34］。推测RMCs共培养可能通过影响PPAR信号通路来调节抗炎反应、减少活性氧积累，从而提高HDFs的抗衰老能力。衰老细胞分泌高水平的基质金属蛋白酶（MMPs），导致胶原蛋白等ECM成分过度降解，进而通过整合素介导的信号转导加强细胞的衰老表型^{［35⁃37］}。补充或改善ECM中的胶原蛋白或纤连蛋白含量，可激活整合素-FAK等细胞存活信号，显著降低成纤维细胞的SA-β-gal染色率并延缓衰老进程^［38］。相反，抑制FAK活性会诱导DNA损伤反应，上调p53/EZH2通路并触发细胞衰老^［39］。生物信息学分析将“细胞-基质粘附”列为最显著的衰老相关富集类别，衰老成纤维细胞中可观察到黏着斑增大、FAK激活和细胞迁移能力下降，说明调控焦点粘着斑的动力学会影响衰老进程^{［40⁃41］}。细胞外基质-受体相互作用和黏着斑相关蛋白的改变提示，RMCs的分泌物可能影响细胞-基质相互作用与迁移能力，这与本研究在划痕试验中观察到的迁移能力恢复一致。推测RMCs共培养可能影响细胞外基质-受体相互作用与粘着斑这两条通路，减缓ECM成分的降解、调节整合素及粘着斑信号，从而延缓HDFs的衰老进程。本研究提示，鹿茸干细胞共培养可能通过增强蛋白酶体介导的蛋白质清除、激活PPARγ以降低炎症和氧化应激，同时通过修复ECM结构并调节整合素-FAK信号以维持细胞-基质的黏附稳定，从而多个层面协同延缓人皮肤成纤维细胞的衰老进程。

4　结论

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本研究结果表明，梅花鹿来源的鹿茸干细胞（RMCs）通过共培养显著改善H₂O₂诱导衰老的人皮肤成纤维细胞（HDFs）的功能状态：RMCs共培养能恢复衰老HDFs的增殖与迁移能力，并改善细胞氧化应激指标（提高SOD活性、降低MDA含量）。基于条件培养上清的4D-DIA蛋白质组学分析，鉴定出若干与蛋白酶体功能、PPAR信号通路和细胞外基质-受体相互作用相关的差异蛋白，提示RMCs可能通过调节细胞蛋白稳态与细胞外基质环境来发挥其抗衰老作用。综上所述，本研究为鹿茸干细胞的抗衰老潜能提供了功能学与分子学的初步证据，并为后续基于RMCs分泌产物的抗衰老皮肤修复策略提供了理论依据。

基金

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青岛农业大学高层次人才引进项目(1121009)
山东省现代农业产业技术体系特种经济动物产业技术体系项目(SDAIT-21-23)
青岛市关键技术攻关及产业化示范类项目(23-1-4-xxgg-21-nsh)

参考文献

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2026年第57卷第2期

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doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.017

接收时间：2025-07-18
首发时间：2026-09-16
出版时间：2026-02-23

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收稿日期：2025-07-18

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青岛农业大学动物科技学院，青岛 266109

通讯作者:

赵海平，主要从事特种动物干细胞研究，E-mail： zhperic@163.com

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科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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