畜牧兽医学报

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物种 Species	登录号 Accession No.
人 Homo sapiens	NM_021205.6	NP_067028.1
牛 Bos taurus	NM_001098147.1	NP_001091616.1
猪 Sus scrofa	XM_021072737.1	XP_020928396.1
鼠 Mus musculus	NM_133955.5	NP_598716.1

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基因名称 Gene	基因型 Genotype	头胎产羔数 The first-parity litter size
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基于山羊40K液相芯片鉴定的RHOU基因调控山羊产羔数的机制探究

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谢蓓伊庭 , 沈阳阳 , 安振江 , 孟春花 , 刘丰慧 , 张俊 , 张建丽 , 曹少先 , 李隐侠 , 钱勇

畜牧兽医学报 | 生物技术与繁殖 2026,57(1): 258-269

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畜牧兽医学报 |生物技术与繁殖 2026 , 57 (1) : 258 -269

基于山羊40K液相芯片鉴定的RHOU基因调控山羊产羔数的机制探究

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谢蓓伊庭，硕士生，主要从事动物遗传育种与繁殖相关研究，E-mail：eating0314@163.com

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谢蓓伊庭, 沈阳阳, 安振江, 孟春花, 刘丰慧, 张俊, 张建丽, 曹少先, 李隐侠, 钱勇

作者信息

江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏省畜禽精准育种工程研究中心，农业农村部种养结合重点实验室，南京 210014

通讯作者:

李隐侠，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：liyxmh@jaas.ac.cn

钱勇，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：jaasqy@163.com

作者简介:

谢蓓伊庭，硕士生，主要从事动物遗传育种与繁殖相关研究，E-mail：eating0314@163.com

Mechanism Investigation of RHOU Gene Regulation on Goat Litter Size Based on the Goat 40K Liquid Chip

Beiyiting XIE, Yangyang SHEN, Zhenjiang AN, Chunhua MENG, Fenghui LIU, Jun ZHANG, Jianli ZHANG, Shaoxian CAO, Yinxia LI, Yong QIAN

Affiliations

Key Laboratory of Crop and Animal Integrated Farming of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Jiangsu Province Engineering Research Center for Precision Animal Breeding，Institute of Animal Science，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China

Corresponding Author:

LI Yinxia， E-mail： liyxmh@jaas.ac.cn

QIAN Yong， E-mail：jaasqy@163.com

出版时间: 2026-01-23 doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.01.022

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摘要

收起

旨在筛选与山羊产羔数关联的候选基因，探究RHOU基因调控山羊产羔数的分子机制。本研究利用GenoBaits^®山羊40K液相芯片对337只正在选育的波尔山羊与海门山羊的杂交群体进行SNP 基因分型，结合头胎产羔表型进行全基因组关联分析；PCR方法克隆山羊RHOU基因编码区，进行序列和结构特征分析；分离山羊卵巢大、小卵泡和卵巢颗粒细胞，采用RT-qPCR、CCK-8、ELISA等方法检测基因表达水平、细胞增殖及雌激素水平。结果鉴定到山羊第28号染色体的44 302 456处即RHOU基因上游177 365 bp处的C/T突变与头胎产羔数显著关联；克隆得到山羊RHOU基因编码区全长768 bp，编码255个氨基酸残基，与其他哺乳动物高度同源；RHOU基因在山羊各组织中广泛表达，在卵巢组织中极显著高表达（P<0.01），且在小卵泡中的表达水平极显著高于大卵泡（P<0.01）；过表达RHOU基因显著降低细胞增殖能力（P<0.05）和细胞增殖标志基因PCNA（P<0.05）、MKI67（P<0.01）的mRNA表达水平，显著下调山羊卵巢颗粒细胞中CYP19A1基因表达水平和培养液中E2浓度（P<0.05）。本研究基于山羊40K液相芯片鉴定到RHOU基因与山羊产羔数显著关联，研究发现其通过负调控山羊卵巢颗粒细胞增殖，降低颗粒细胞CYP19A1的表达，抑制E2的合成从而调控山羊的产羔性能。

关键词

山羊40K液相芯片 / RHOU / 细胞增殖 / 雌激素合成

Abstract

收起

The study aimed to screen candidate genes associated with litter size in goats and investigate the molecular mechanism by which the RHOU gene regulates goat litter size. The GenoBaits^® Goat 40K liquid chip was used to perform SNP genotyping on a hybrid population of 337 Boer goats and Haimen goats under selection， and a genome-wide association study was conducted in combination with the first-parity litter size phenotype. The coding region of the goat RHOU gene was cloned by the PCR method， and its sequence and structural characteristics were analyzed. The large and small follicles and ovarian granulosa cells of goats were isolated， and methods such as RT-qPCR， CCK-8， and ELISA were used to detect gene expression levels， cell proliferation， and estrogen levels. A C/T mutation on chromosome 28 （position 44 302 456， 177 365 bp upstream of RHOU） was significantly associated with first-parity litter size. The cloned RHOU coding region spanned 768 bp， encoding 255 amino acids with high homology to other mammals. The RHOU gene was widely expressed in various tissues of goats， and its expression was extremely significantly higher in ovarian tissue （P<0.01）， and the expression level in small follicles was extremely significantly higher than that in large follicles （P<0.01）. Overexpression of the RHOU gene significantly reduced cell proliferation ability （P<0.05） and the mRNA expression levels of cell proliferation marker genes PCNA （P<0.05） and MKI67 （P<0.01）， and significantly down-regulated the expression level of the CYP19A1 gene and the E2 concentration in the culture medium of goat ovarian granulosa cells （P<0.05）. This study identified that the RHOU gene was significantly associated with goat litter size based on the goat 40K liquid chip. The study found that it regulates goat litter performance by negatively regulating the proliferation of goat ovarian granulosa cells， reducing the expression of CYP19A1 in granulosa cells， and inhibiting the synthesis of E2.

Key words

goat 40K liquid chip / RHOU / cell proliferation / estrogen synthesis

引用本文

谢蓓伊庭, 沈阳阳, 安振江, 孟春花, 刘丰慧, 张俊, 张建丽, 曹少先, 李隐侠, 钱勇. 基于山羊40K液相芯片鉴定的RHOU基因调控山羊产羔数的机制探究. 畜牧兽医学报, 2026 , 57 (1) : 258 -269 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.01.022

Beiyiting XIE, Yangyang SHEN, Zhenjiang AN, Chunhua MENG, Fenghui LIU, Jun ZHANG, Jianli ZHANG, Shaoxian CAO, Yinxia LI, Yong QIAN. Mechanism Investigation of RHOU Gene Regulation on Goat Litter Size Based on the Goat 40K Liquid Chip[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2026 , 57 (1) : 258 -269 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.01.022

正文

收起

产羔性能是衡量山羊经济效益的重要指标之一，受多个潜在基因调控^［1⁃3］。在不同山羊品种中已鉴定到多个基因的遗传变异对产羔数有显著的影响，如Zhang^［4］等发现细胞分裂周期蛋白25A（CDC25A）基因核心启动子区g.51731829A>C突变与山羊产羔数显著关联，AA型个体的产羔数显著优于其他基因型；KISS1基因g.2540 C>T突变与印度山羊产羔数显著关联，CT和TT型个体的产羔数显著高于CC型^［5］。然而，可能还存在其他影响山羊产羔性能的未知基因。随着SNP基因分型技术的不断发展和应用，开展全基因组关联分析（GWAS）鉴定与经济性状显著关联的候选基因和遗传变异变得更加高效和快捷^［6］。液相芯片是一种用于SNP分型和全基因组关联分析的高效工具，通常包含数万个在基因组上均匀分布的SNPs位点，可实现对个体基因组的全面扫描^［7］。在绵羊方面，张嘉良等^［8］基于50K液相芯片进行8个绵羊群体遗传结构分析和羊毛性状的选择信号分析；在家驴方面，设计一款40K液相芯片用于家驴早期的分子标记辅助选择、品种鉴定等^［9］。本研究利用山羊40K液相芯片通过关联分析鉴定到RHOU基因（ras homolog family member U）与山羊头胎产羔数显著关联，但是RHOU如何调控山羊的产羔性能尚未可知。

RHOU也称为WRCH1（Wnt反应性Cdc42同系物1），是Rho GTPase家族中的一员，在细胞骨架重组、细胞迁移、增殖和信号转导等过程中发挥重要作用^{［10⁃11］}。在体外培养的细胞中，RHOU可调控粘着斑的形成，控制细胞的黏附与迁移^{［12⁃13］}，同时还参与紧密连接的形成和上皮形态发生^［14］。以神经嵴细胞的上皮间质转化过程为例，上调RHOU会影响细胞极性和迁移，而下调RHOU则会正向调控细胞的粘附过程^［15］。RHOU蛋白作用于肌动蛋白细胞骨架，刺激细胞形成纤毛状突起，同时还能刺激静止细胞重新进入细胞周期^［16］。RHOU还在多种生物模型的发育过程中发挥作用：在非洲爪蟾和鸡胚胎中，RHOU及其最近缘蛋白THOV受Wnt信号诱导，分别调控神经嵴细胞的迁移和特化阶段^［17］。在斑马鱼心脏形态发生期间，Wnt信号刺激房室管中RHOU的表达，其功能缺失会损害房室管形成和心脏环化的过程^［18］。在繁殖发育方面，RHOU在多种脊椎动物胚胎的早期发育阶段均有表达^［19］，例如在鸡胚中，RHOU在Hamburger-Hamilton 5期的原条和Hensen结中表达，在前神经板中也能检测到其存在^［20］。

本研究通过全基因组关联分析方法筛选出RHOU基因与山羊产羔数显著关联。然而，从当前研究现状来看，RHOU基因在调控动物繁殖领域的研究仍处于相对薄弱阶段，关于其在山羊上的序列特征、表达模式等研究更是鲜有报道。为进一步解析RHOU基因调控山羊产羔性能的分子机制，本研究拟克隆山羊RHOU基因编码区，深入分析其序列和结构特征，探究其在山羊各组织中的表达模式，并重点解析其对山羊卵巢颗粒细胞功能包括细胞增殖、雌激素合成能力的影响，初步阐明其调控山羊卵泡发育及产羔性能的潜在分子机制，为揭示山羊繁殖性能的调控机制提供新的思路。

1　材料与方法

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1.1　试验材料

试验所用山羊为正在选育的波尔山羊（Boer goats）和海门山羊（Haimen goats）的杂交群体，来自江苏绿羊谷养殖科技发展有限公司，统一饲养管理，营养和饲养管理条件一致，其产羔记录由该公司提供。使用EDTA-K2抗凝管采取337只成年的选育群母羊颈静脉血液2 mL，寄往石家庄博瑞迪生物技术有限公司进行GenoBaits^®山羊40K液相芯片（型号：PHR0176_Ch40K_V1.0）的SNP基因分型。随机选取选育群成年山羊母羊3只，屠宰后收集心、肝、脾、肺、肾、卵巢和腿肌组织，放入-80 ℃冰箱中保存备用。试验中用来分离卵巢颗粒细胞的山羊卵巢取自海安屠宰场，放于37℃生理盐水中，4 h以内带回实验室，分离大、小卵泡和卵巢颗粒细胞^［21］。

1.2　基因组SNPs测定、数据处理及关联分析

利用Plink（V1.90）软件对337只山羊基因组中的SNPs位点进行质控，质控标准参考史露露等^［22］的研究，质控后的SNPs位点采用混合线性模型与产羔记录表型进行全基因组关联分析。GWAS显著性阈值采用Bonferroni校正法设定，即P<1.11×10^-6（0.05/45，023），同时参考suggestive阈值P<2.22×10⁻⁵（1/45，023）。模型如下：

y=Xα+Zβ+Wμ+e

式中，y为目标位点基因型的效应量；α为所有固定效应构成的向量；β表示标记效应，SNP；μ表示随机效应，这里指个体的亲缘关系；e表示随机残差效应向量；X、Z、W分别表示α、β、μ的结构矩阵。

1.3　试验过程中使用的试剂

试验中RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis kit（+gDNA wiper）和real-time PCR试剂盒 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、2×Phanta Master Mix（Dye Plus）、Lipofectmine3000转染试剂、CCK-8试剂盒均购自南京诺唯赞生物科技有限公司，DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。

1.4　卵巢颗粒细胞的分离、培养和细胞转染

将从屠宰场中带回的卵巢取出并置于大烧杯中，用大量生理盐水冲洗3遍至清澈；手术剪剪掉卵巢周围组织，置于烧杯中；生理盐水冲洗两次，75%酒精冲洗20 s后迅速捞出，生理盐水再次冲洗3次；选取3~5 mm大小，表面光滑透亮的卵泡，用5 mL注射器搭配5.5号输液针头抽取卵泡液，打入装有PBS（含1%双抗）的15 mL离心管中；1 000 r·min^-1离心5 min，弃掉上清，加入5 mL PBS重悬，再离心5 min，重复两次；清洗后的细胞弃掉上清，细胞沉淀用预热的DMEM/F-12（含1%双抗）培养基重悬细胞并将细胞接种于6孔板中，置于37 ℃、5% CO₂细胞培养箱中培养；24 h后观察细胞贴壁情况，吸出1 mL培养基弃掉，加入1 mL新鲜培养液；48 h后观察细胞情况，PBS清洗2次，更换新鲜培养液，进行后续试验。

分离的卵巢颗粒细胞使用含有10%胎牛血清（FBS，Sigma）和1%青霉素-链霉素混合液（penicillin-streptomycin solution，100×）的DMEM/F12（上海源培生物科技股份有限公司）培养基在37 ℃、5% CO₂培养箱中恒温培养。铺板至12孔板，利用Lipofectmine 3000转染pcDNA3.1（+）和pcDNA3.1-RHOU，开展后续试验。

1.5　RNA提取和逆转录

采用RNA提取试剂盒提取山羊组织、大小卵泡、山羊卵巢颗粒细胞的mRNA，Nanodrop2000测定RNA的浓度和纯度；用逆转录试剂盒合成cDNA的第一链，备用。

1.6　引物的合成、PCR扩增

根据山羊RHOU预测序列（序列号：XM_018042530.1）、CYP19A1预测序列（序列号：NM_001285747.1）、MKI67预测序列（序列号：XM_005698601.3）、PCNA预测序列（序列号：XM_005688167.3）用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，用于山羊RHOU基因编码区的扩增、表达载体构建和山羊RHOU基因组织表达谱的鉴定。内参基因GAPDH序列参考文献［23］。引物由南京擎科生物科技有限公司合成，基因对应的引物名称、引物序列、片段长度等相关信息见表1。

1.7　生物信息学分析

利用DNAMAN 6.0、Snapgene 6.0软件对山羊RHOU基因核苷酸和氨基酸序列与其他哺乳动物进行比对，参考物种序列见表2。

1.8　RT-qPCR

采用RT-qPCR方法检测RHOU基因在山羊各组织的表达模式、过表达山羊RHOU卵巢颗粒细胞中RHOU基因（RHOU过表达效率检测）表达水平、RHOU基因在山羊大卵泡和小卵泡中的表达水平。20 μL反应体系包括1 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，2 × ChamQ Universal SYBR PCR Master Mix 10 μL，最后加ddH₂O补齐至20 μL。反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s （40个循环）；熔解曲线：95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s。每个组织样品及GAPDH内参基因各设置３孔重复，采用2^-ΔΔCt法分析处理数据。

1.9　 RHOU基因过表达载体的构建

限制性内切酶Xho I和Hind III 双酶切质粒pcDNA3.1（+）和PCR扩增获得的RHOU基因胶回收产物，37 ℃ 3 h后，1%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收后将酶切后的质粒和基因片段用T4连接酶16 ℃过夜连接，转化感受态细胞DH5α后取适量涂于含Amp抗性的琼脂板中，37 ℃过夜培养，挑取单克隆，测序鉴定得到过表达载体pcDNA3.1-RHOU。

1.10　CCK-8检测

将96孔板中转染pcDNA3.1（+）的对照组山羊卵巢颗粒细胞和pcDNA3.1-RHOU 的试验组山羊卵巢颗粒细胞分别于24、48 h后加入CCK-8溶液，利用酶标仪在450 nm处测定吸光度（OD值），分析RHOU基因对山羊卵巢颗粒细胞增殖的影响。

1.11　E2含量测定

在12孔板中培养转染pcDNA3.1（+）的对照组山羊卵巢颗粒细胞和pcDNA3.1-RHOU的试验组山羊卵巢颗粒细胞，48 h后收取细胞培养液，将收集的培养液采用雌二醇（Estradiol，E2）试剂盒（北方生物技术研究所，北京）进行测定。显色终止后，利用酶标仪在450 nm波长测定吸光值（OD值）。

1.12　数据分析

采用GraphPad Prism 8.0软件执行T检验对不同处理的两组数据进行统计学处理分析，“ns”、“*”和“**”分别表示差异不显著（P>0.05）、差异显著（P<0.05）和差异极显著（P<0.01）。

2　结果

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2.1　选育山羊基因组SNP测定及质量控制

使用山羊40K-GBTS 芯片对337个正在选育的山羊群体个体进行SNP检测，其中个体检出率为100%，原始数据经过质控获得45 023个SNPs位点用于后续分析，常染色体上所有SNPs分布情况（图1）表明，变异位点主要分布在基因间区（占比54.86%）和内含子区（占比37.76%）。

2.2　全基因组关联分析及候选基因SNPs鉴定

基于山羊40K SNPs芯片技术，采用混合线性模型对337个杂交山羊样本的头胎产羔数表型和质控后约40K SNPs分子标记进行全基因组关联分析。结果显示，1个SNP位点与选育山羊的头胎产羔数显著关联，位于28号染色体（图2）。

将此显著的SNP进行注释发现，该位点位于第28号染色体（NCBI序列号：NC_030835.1）的44 302 456处，位于RHOU基因上游177 365 bp处的C/T突变。SPSS软件分析结果再一次确认了RHOU基因44 302 456位的C/T突变与杂交山羊头胎产羔数的显著关联（表3）。

2.3　山羊RHOU基因CDS区的扩增

提取山羊卵巢组织RNA，逆转录得到cDNA，并以此cDNA为模板，P1为引物（表1）进行PCR扩增，得到特异性条带1条（图3）。测序发现扩增产物大小与预测结果一致，与引物源序列的一致性为99.39%，说明该扩增产物为山羊RHOU基因的CDS区。

2.4　山羊RHOU基因CDS区序列分析

测序分析发现山羊CDS区全长768 bp，碱基组成分析发现山羊RHOU基因CDS区序列中A、T、G、C碱基含量分别为20.19%、17.32%、31.11%和31.38%，其中A＋T含量为37.51%，G＋C含量为62.49%。与NCBI网站中山羊RHOU基因预测序列（登录号：XM_018042530.1）比对发现，本研究扩增的山羊RHOU基因序列与预测序列的相似性为99.61%，有3处碱基发生了突变，包括第378 bp处T>C突变，引起第129位氨基酸由Gly变为Arg；第385 bp处的G>C突变，引起第160位氨基酸由Ser变为Thr；以及未造成氨基酸改变的478 bp处T>A突变。山羊RHOU CDS核苷酸序列与人、牛、猪和小鼠的核苷酸序列相似性分别为88.93%、97.14%、90.22%和85.50%（图4）。

2.5　山羊RHOU氨基酸序列分析

测序获得的山羊RHOU基因编码255个氨基酸残基，蛋白序列比对发现，RHOU蛋白与人、牛、猪和小鼠的氨基酸序列相似性分别为96.47%、98.43%、94.12%和88.24%（图5）。

2.6　山羊RHOU基因组织表达模式

为了检测RHOU基因在山羊各组织的表达模式，以GAPDH基因为内参，RT-qPCR检测发现RHOU基因在山羊各组织中广泛表达，其中在卵巢中高表达，并极显著高于其他组织（P<0.01，图6）。

2.7　 RHOU基因参与调控卵泡的发育

分离山羊卵巢中的大卵泡和小卵泡，提取RNA， RT-qPCR方法检测大、小卵泡中RHOU的表达水平。结果发现RHOU在大卵泡中的mRNA表达水平极显著低于小卵泡（P<0.01，图7）。

2.8　山羊RHOU基因过表达载体构建和效率的检测

以山羊卵巢组织 cDNA为模板，利用引物P1（表1）扩增山羊RHOU基因CDS区。扩增产物用Xho I和Hind III双酶切，克隆到过表达载体pcDNA3.1（+）中，转化DH5α感受态细胞，提取质粒并进行酶切鉴定，结果显示目的片段成功连接到载体中（图8A）。

分离山羊卵巢颗粒细胞，将pcDNA3.1空载（对照组）和pcDNA3.1-RHOU载体（试验组）转染至山羊卵巢颗粒细胞中，24 h后收集对照组和试验组细胞，提取RNA。RT-qPCR检测发现，试验组细胞中RHOU的mRNA表达水平极显著高于对照组（P<0.01，图8B），表明所构建载体在山羊卵巢颗粒细胞中成功过表达RHOU基因。

2.9　 RHOU基因对山羊卵巢颗粒细胞增殖的影响

采用CCK-8试剂盒检测RHOU基因对山羊卵巢颗粒细胞增殖的影响，结果显示，过表达山羊RHOU基因24、48 h后，试验组与对照组的OD_{450 nm}值均显著下降（P<0.05，图9A）。RT-qPCR检测显示，与对照组相比，过表达山羊RHOU基因后山羊卵巢颗粒细胞中调控细胞增殖的标志基因PCNA的mRNA表达水平显著降低（P<0.05，图9B），MKI67的mRNA表达水平极显著降低（P<0.01，图9C）。

2.10　 RHOU基因调控山羊颗粒细胞E2合成

为了进一步探究RHOU调控山羊繁殖性能的机制，在山羊卵巢颗粒细胞中过表达RHOU基因，RT-qPCR检测发现，与对照组相比，过表达山羊RHOU基因后山羊颗粒细胞中CYP19A1基因表达水平极显著下降（P<0.01，图10A）。ELISA方法检测过表达RHOU后培养液中E2的含量，结果发现，与对照组相比，过表达RHOU极显著下调培养液中E2浓度（P<0.01，图10B），说明RHOU基因参与调控山羊卵巢颗粒细胞中雌激素的合成。

3　讨论

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RHOU基因属于非经典的RhoGTPase成员之一，最初被鉴定为Wnt非经典通路的靶基因，与经典的Rho GTPase （RhoA、Rac1和Cdc42）相比具有N端和C端延伸结构域，并通过C端棕榈酰方式与膜结构结合，诱导小鼠乳腺上皮细胞发生转化^［24］。目前其功能方面的研究主要集中在调控细胞迁移、细胞骨架和组织器官发育等方面^{［12，16］}，在繁殖调控方面的研究较少。本研究前期通过40K山羊液相芯片采用全基因组关联分析鉴定到RHOU基因与山羊产羔数显著关联。相似的，Brazert等^［25］发现RHOU参与人颗粒细胞的功能调控。综上，说明RHOU基因参与调控动物的繁殖性能。已有研究表明，Rho GTPase家族成员在不同组织中的表达存在显著差异，且部分成员于特定组织内发挥着独特作用^{［26⁃28］}。本研究发现，RHOU基因在山羊各组织中均广泛表达，其中在卵巢组织中的表达水平相对较高，且在小卵泡中的表达水平极显著高于大卵泡，推测RHOU基因可能通过调控卵巢功能影响山羊的繁殖性能。前人研究发现，Rho GTPase中的成员Cdc42，其在卵巢中的表达水平以及卵母细胞膜的分布随着卵泡激活显著增强^［29］，Rho GTP酶成员MIRO1参与调控猪卵母细胞的成熟^［30］，推测RHOU基因可能通过调控山羊卵巢的功能影响其产羔性能。

雌二醇（E2）是维持母羊卵泡正常发育、排卵和繁殖力的主要类固醇激素，多羔母羊（胎产羔数≥2只）血清中E2含量显著高于单羔母羊^{［31⁃33］}，而CYP19A1基因是卵巢颗粒细胞中E2合成的限速酶^［34］。酪蛋白激酶1α通过调节小鼠卵巢颗粒细胞中CYP19A1的表达来介导雌二醇的分泌^［35］；转录因子SMAD4和miR-10b通过靶向CYP19A1，促进卵巢颗粒细胞中E2的释放^［36］。本研究发现，在山羊卵巢颗粒细胞中过表达RHOU后E2水平极显著下调，且调控E2合成的关键酶CYP19A1的mRNA表达水平显著下调，说明RHOU通过负调控CYP19A1表达影响山羊卵巢颗粒细胞中E2合成。

RHO家族蛋白在细胞增殖调控进程中扮演着关键角色，能够通过激活PAK1和JNK1通路，参与细胞增殖的调控^［37］。CCK-8试剂通过在450 nm处测定细胞的吸光度值间接反映细胞增殖能力^［38］，PCNA通过与DNA聚合酶δ或p21相互作用调节DNA合成，被用作增殖或再生标志物^{［39⁃40］}，MKI67基因负责编码抗原Ki-67，与促进细胞增殖紧密相关^{［41⁃42］}，以上3种方法均可用于检测细胞增殖的能力。本研究发现过表达RHOU基因后，细胞增殖的标志基因MKI67、PCNA的表达水平均出现了显著下降。24、48 h时CCK-8法检测所得的细胞吸光度值显著下调，说明RHOU调控山羊卵巢颗粒细胞的增殖。Slaymi^［43］等研究发现，RHOU基因能抑制肠道上皮细胞生长，其表达对非经典Wnt信号敏感且在结肠、直肠癌中减少，本研究结果与其研究结论一致。由此表明，RHOU基因可能通过调控卵巢颗粒细胞增殖进而影响雌激素合成，调控山羊的产羔数，但其具体的作用机制仍有待进一步探究。

4　结论

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本试验通过全基因组关联分析筛选出RHOU基因与山羊产羔数显著关联。克隆获得山羊RHOU基因编码区序列，全长768 bp，编码256个氨基酸。RHOU基因在山羊卵巢中表达水平最高，小卵泡中的表达量极显著高于大卵泡；成功构建山羊RHOU基因过表达载体，转染山羊卵巢颗粒细胞显示RHOU基因负调控其增殖水平，可通过降低颗粒细胞CYP19A1的表达从而抑制E2的合成进而调控山羊繁殖性能。

基金

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江苏省种业振兴揭榜挂帅项目(JBGS［2021］114)

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文献

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2026年第57卷第1期

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doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.01.022

接收时间：2025-05-07
首发时间：2026-09-16
出版时间：2026-01-23

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出版历史

收稿日期：2025-05-07

基金

江苏省种业振兴揭榜挂帅项目(JBGS［2021］114)

作者信息

江苏省农业科学院畜牧研究所，江苏省畜禽精准育种工程研究中心，农业农村部种养结合重点实验室，南京 210014

通讯作者:

李隐侠，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：liyxmh@jaas.ac.cn

钱勇，主要从事动物遗传育种与繁殖研究，E-mail：jaasqy@163.com

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/xmsyxb/CN/10.11843/j.issn.0366-6964.2026.01.022

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

引物 Primer	基因 Gene	引物序列（5′→3′） Primers sequence	退火温度/℃ Tm	产物长度/bp Products length	用途 Usage
P1	RHOU	F： ATAAAGCTTACCTACCCGACCGCCTTTGT R： ATACTCGAGACTTTCACCCTGGACACC	63	1 190	CDS扩增及表达载体构建
P2	RHOU	F： GTCAGTGAGAAATGGGTGC R： TGTAGGAGGTGGCTTTGAT	60	187	RT-qPCR
P3	CYP19A1	F： ATCCCGATTTGGCAGTAA R： TGTAAAGAAAGGTCGAACAG	60	109	RT-qPCR
P4	MKI67	F： GAGGTGGCTCAGGTTCGT R： TCGGATCTGGGTTTCATA	60	114	RT-qPCR
P5	PCNA	F： AAGTGCTGGAGGCGCTTAA R： TTGGACATGCTGGTGAGG	60	190	RT-qPCR
P6	GAPDH	F： TCGGAGTGAACGGATTCG R： ATCTCGCTCCTGGAAGATG	60	227	RT-qPCR

引物

Primer

基因

Gene

引物序列（5′→3′）

Primers sequence

退火温度/℃

产物长度/bp

Products length

用途

Usage

RHOU

F： ATAAAGCTTACCTACCCGACCGCCTTTGT

R： ATACTCGAGACTTTCACCCTGGACACC

1 190

CDS扩增及表达载体构建

RHOU

F： GTCAGTGAGAAATGGGTGC

R： TGTAGGAGGTGGCTTTGAT

187

RT-qPCR

CYP19A1

F： ATCCCGATTTGGCAGTAA

R： TGTAAAGAAAGGTCGAACAG

109

RT-qPCR

MKI67

F： GAGGTGGCTCAGGTTCGT

R： TCGGATCTGGGTTTCATA

114

RT-qPCR

PCNA

F： AAGTGCTGGAGGCGCTTAA

R： TTGGACATGCTGGTGAGG

190

RT-qPCR

GAPDH

F： TCGGAGTGAACGGATTCG

R： ATCTCGCTCCTGGAAGATG

227

RT-qPCR

物种 Species	登录号 Accession No.
人 Homo sapiens	NM_021205.6	NP_067028.1
牛 Bos taurus	NM_001098147.1	NP_001091616.1
猪 Sus scrofa	XM_021072737.1	XP_020928396.1
鼠 Mus musculus	NM_133955.5	NP_598716.1

物种

Species

登录号 Accession No.

核苷酸登录号

Nucleotide No.

氨基酸登录号

Amino acid No.

人 Homo sapiens

NM_021205.6

NP_067028.1

牛 Bos taurus

NM_001098147.1

NP_001091616.1

猪 Sus scrofa

XM_021072737.1

XP_020928396.1

鼠 Mus musculus

NM_133955.5

NP_598716.1

基因名称 Gene	基因型 Genotype	头胎产羔数 The first-parity litter size
RHOU	TT TC CC	2.19±1.25^a 2.30±1.33^ab 1.65±0.80^c

基因名称

Gene

基因型

Genotype

头胎产羔数

The first-parity litter size

RHOU

2.19±1.25^a

2.30±1.33^ab

1.65±0.80^c

物种 Species	登录号 Accession No.
物种 Species	核苷酸登录号 Nucleotide No.	氨基酸登录号 Amino acid No.
人 Homo sapiens	NM_021205.6	NP_067028.1
牛 Bos taurus	NM_001098147.1	NP_001091616.1
猪 Sus scrofa	XM_021072737.1	XP_020928396.1
鼠 Mus musculus	NM_133955.5	NP_598716.1