畜牧兽医学报

引物 Primer	引物序列（5′→3′） Sequence	片段长度/bp Length	用途 Usage
miR-370 stem-loop	CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCAGGTT	—	成熟miRNAs反转录
miR-219a stem-loop	CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGGGACGT	—
miR-7136 stem-loop	CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCTCCACA	—
miR-9860 stem-loop	CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCGGTCCA	—
Mature miR-370-F	GCCGAGGCCTGCTGGGGTGG	64	成熟miRNAs 定量PCR
Mature miR-219a-F	GCCGAGAGAGTTGAGTCTGG	64
Mature miR-7136-F	GCCGAGTCTGGTCCAGACAC	64
Mature miR-9860-F	GCCGAGTTGCCCGAGAGCT	64
Common miRNA-R	CTCAACTGGTGTCGTGGA	—
Pri-miR-370-F	TCTCGAATCAGATTGGTGGC	145	初级miRNAs 定量PCR
Pri-miR-370-R	CAGGCACTCGTGAGCTGTGTA
Pri-miR-219a-F	TCAGACATTCGGCCCCTTGT	140
Pri-miR-219a-R	CTCGAGAATTGCGTTTGGAC
Pre-miR-370-F	AAGACAGAGAAGCCAGGTCAC	75	前体miRNAs 定量PCR
Pre-miR-370-R	GACAGACCAGGTTCCACCCC
Pre-miR-219a-F	CCGCGGCTCTTGATTGTC	76
Pre-miR-219a-R	GCTCGGGACGTCCAGACT
miR-370 promoter-F	CGGGGTACCCGGACGAGCTAATGTATGCTGA	314	荧光素酶报告载体构建
miR-370 promoter-R	CCGCTCGAGTCTGTGATATCGCCGTGTCTATA
miR-219a promoter-F	CGGGGTACCCCACGGACTGAAGGAGAGGA	320
miR-219a promoter-R	CCGCTCGAGCACAAGGGGCCGAATGTCT
miR-370 promoter-F1	AACGACCCTCCGCTGCTG	150	染色质免疫沉淀
miR-370 promoter-R1	CTCCCACCGCCACCCCTG
miR-219a promoter-F2	TCCCCGTCCCCTTCCTT	200
miR-219a promoter-R2	CATGCGGAAGCAGGGAC

引物 Primer	引物序列（5′→3′） Sequence	片段长度/bp Length	用途 Usage
miR-370 stem-loop	CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACCAGGTT	—	成熟miRNAs反转录
miR-219a stem-loop	CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGGGACGT	—
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Pre-miR-370-R	GACAGACCAGGTTCCACCCC
Pre-miR-219a-F	CCGCGGCTCTTGATTGTC	76
Pre-miR-219a-R	GCTCGGGACGTCCAGACT
miR-370 promoter-F	CGGGGTACCCGGACGAGCTAATGTATGCTGA	314	荧光素酶报告载体构建
miR-370 promoter-R	CCGCTCGAGTCTGTGATATCGCCGTGTCTATA
miR-219a promoter-F	CGGGGTACCCCACGGACTGAAGGAGAGGA	320
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miR-370 promoter-R1	CTCCCACCGCCACCCCTG
miR-219a promoter-F2	TCCCCGTCCCCTTCCTT	200
miR-219a promoter-R2	CATGCGGAAGCAGGGAC

KLF5抑制氧化应激状态下猪卵泡颗粒细胞中miR-370与miR-219a的转录

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郭震楠 ¹ , 吕世政 ¹ , 萧宗贤 ¹ , 吴启吉 ¹ , 包雨加 ¹ , 李清 ¹ , 李齐发 ¹ , 李琦琦 ² , 杜星 ¹

畜牧兽医学报 | 生物技术与繁殖 2026,57(1): 234-245

收起

畜牧兽医学报 |生物技术与繁殖 2026 , 57 (1) : 234 -245

KLF5抑制氧化应激状态下猪卵泡颗粒细胞中miR-370与miR-219a的转录

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郭震楠¹, 吕世政¹, 萧宗贤¹, 吴启吉¹, 包雨加¹, 李清¹, 李齐发¹, 李琦琦², 杜星¹

作者信息

^1.南京农业大学动物科技学院，南京 210095

^2.江苏农林职业技术学院畜牧兽医学院，镇江 212400

通讯作者:

杜星，副研究员，主要从事动物遗传育种与表观遗传调控研究，E-mail：duxing@njau.edu.cn

作者简介:

郭震楠，硕士，主要从事表观遗传调控研究，E-mail：gzn@stu.njau.edu.cn

KLF5 Inhibits the Transcription of miR-370 and miR-219a in Sow Follicular Granulosa Cells under Oxidative Stress

Zhennan GUO¹, Shizheng LÜ¹, Zongxian XIAO¹, Qiji WU¹, Yujia BAO¹, Qing LI¹, Qifa LI¹, Qiqi LI², Xing DU¹

Affiliations

^1.College of Animal Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China

^2.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry，Zhenjiang 212400，China

Corresponding Author:

DU Xing，E-mail：duxing@njau.edu.cn

出版时间: 2026-01-23 doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.01.020

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摘要

收起

旨在探究猪卵泡颗粒细胞中miR-370和miR-219a响应氧化应激的表达模式及调控机制，为研发内源性小分子调节物抑制氧化应激、促进卵泡发育提供理论依据。本研究以原代猪卵泡颗粒细胞为试验材料，利用150 μmol·L^-1 H₂O₂构建体外氧化应激模型。结合RNA-seq与RT-qPCR试验明确氧化应激对miR-370和miR-219a转录的调控作用。基于生物信息学分析和组织表达谱构建鉴定二者保守性和组织表达分布。利用FACS和ELISA试验鉴定二者对颗粒细胞氧化应激和凋亡的影响。构建猪KLF5表达载体，通过WB试验鉴定表达效率，进一步结合RT-qPCR、荧光素酶活性检测和ChIP等试验鉴定KLF5抑制氧化应激状态下颗粒细胞中miR-370和miR-219a转录的机制。结果表明，氧化应激抑制miR-370和miR-219a转录，导致二者初体、前体和成熟表达水平均极显著下调（P<0.01）。特征分析发现二者高度保守且在卵巢组织高表达。相关性分析发现二者表达水平与SOD活性呈极显著正相关（P<0.01），与MDA水平呈极显著负相关（P<0.01），提示二者具有抗氧化功能。过表达二者可有效缓解氧化应激引起的ROS累积、低SOD活性、高MDA水平和高凋亡率，且二者功能存在协同效应。预测发现二者启动子区存在转录因子KLF5结合位点，过表达KLF5极显著抑制二者转录和启动子活性（P<0.01），但对结合位点突变型报告载体的荧光素酶活性并无显著影响。进一步通过ChIP证实KLF5与二者启动子区直接结合，且氧化应激可提高其结合丰度。综上所述，氧化应激通过促进KLF5的表达与转录因子活性抑制具有抗氧化功能的miR-370和miR-219a转录，加剧颗粒细胞氧化损伤。

关键词

猪 / 卵泡颗粒细胞 / 氧化应激 / miRNA / KLF5

Abstract

收起

The aim of this study was to investigate the expression pattern and regulatory mechanism of miR-370 and miR-219a in sow follicular granulosa cells （GCs） under oxidative stress， and provide theoretical basis for the use of endogenous small molecule regulators to inhibit oxidative stress and promote follicular development. In this study， primary sow GCs were used as experimental materials and an in vitro oxidative stress GC model was established using 150 μmol·L^-1 H₂O₂. The regulatory effect of oxidative stress on the transcription of miR-370 and miR-219a was analyzed by RNA-seq and RT-qPCR. Their conservation and expression distribution were detected by bioinformatics analysis and tissue expression profiling. FACS and ELISA were performed to detect the effect of two miRNAs on the oxidative stress and apoptosis of sow GCs. The overexpression plasmid of KLF5 was constructed and its expression efficiency was verified by WB. Furthermore， RT-qPCR， luciferase activity analysis and ChIP were conducted to identify the mechanism by which KLF5 inhibits the transcription of two miRNAs in sow GCs under oxidative stress. The results showed that， oxidative stress inhibits the transcription of miR-370 and miR-219a， resulting in down-regulation of their pri-， pre- and mature expression levels （P<0.01）. Characterization analysis revealed that both miRNAs are conserved and highly expressed in ovary. Correlation analysis revealed that their expression levels were significantly positively correlated with SOD activity （P<0.01）， significantly negatively correlated with MDA level （P<0.01）， suggesting that they have anti-oxidative capacity. Overexpression of two miRNAs effectively and synergistically alleviated the oxidative stress-induced ROS accumulation， low SOD activity， high MDA levels， and high apoptosis rate. Prediction analysis found that their promoters contain potential KLF5 binding sites， and overexpression of KLF5 significantly inhibited their transcription and promoter activities （P<0.01）， while had no effect on the luciferase activities of the reporter vectors containing mutant KLF5 binding sites. ChIP results confirmed that KLF5 directly bound to their promoters， and its expression and binding enrichment were elevated by oxidative stress. In summary， oxidative stress inhibits the transcription of antioxidant miRNAs （miR-370 and miR-219a） by inducing the expression and transcription factor activity of KLF5， which exacerbates the oxidative damage of sow GCs.

Key words

sow / follicular granulosa cells / oxidative stress / miRNA / KLF5

引用本文

郭震楠, 吕世政, 萧宗贤, 吴启吉, 包雨加, 李清, 李齐发, 李琦琦, 杜星. KLF5抑制氧化应激状态下猪卵泡颗粒细胞中miR-370与miR-219a的转录. 畜牧兽医学报, 2026 , 57 (1) : 234 -245 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.01.020

Zhennan GUO, Shizheng LÜ, Zongxian XIAO, Qiji WU, Yujia BAO, Qing LI, Qifa LI, Qiqi LI, Xing DU. KLF5 Inhibits the Transcription of miR-370 and miR-219a in Sow Follicular Granulosa Cells under Oxidative Stress[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2026 , 57 (1) : 234 -245 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.01.020

正文

收起

卵泡发育对于维持雌性哺乳动物排卵等生殖活动至关重要^［1］，且已被证实是包括母猪在内多种畜禽繁殖力形成早期的主要内源决定因素之一^［2］。卵泡发育命运（成熟排卵或闭锁退化）直接决定了母猪繁殖力的高低^［3⁃4］，并在一定程度上影响了养猪业的经济效益。目前研究表明颗粒细胞（granulosa cells，GC）的正常状态（增殖）和功能（类固醇激素合成）是卵泡健康发育的前提，而其状态或功能异常则导致卵泡闭锁，甚至引发不孕不育和生殖障碍类疾病^［5⁃10］。因此，解析颗粒细胞状态和功能的调控机制对于鉴定卵泡发育关键因子、提高母猪繁殖力意义重大。

作为体内普遍存在的生理现象，氧化应激（oxidative stress）是响应体内外多种应激刺激的共同作用机制^［11］。其功能具有双向性，即适度氧化应激有助于维持机体免疫、信号转导、能量代谢和细胞适应性，而严重氧化应激则引起活性氧簇（ROS）过量产生，造成氧化还原系统失衡，导致氧化损伤并引发衰老和相关疾病^{［12⁃15］}。研究发现，卵泡快速发育过程中微环境剧烈变化（缺氧和激素刺激等）导致氧化应激可引起卵泡液中抗氧化物含量降低、氧化损伤标志物水平升高，这不利于颗粒细胞增殖和卵母细胞发育^［16］。体内外试验证实，过量ROS累积引起颗粒细胞和卵母细胞氧化应激损伤，通过抑制颗粒细胞类固醇激素合成阻碍卵泡发育，并通过影响卵母细胞成熟和质量降低其受精能力和胚胎发育潜力^［17-18］。在猪卵泡中，相关研究发现氧化应激也可造成类似影响^［19］，且团队前期研究证实氧化应激不仅损害颗粒细胞正常状态和功能，还会引起转录组发生剧烈变化，其中包含一系列差异表达的miRNAs^［20］。然而，这些miRNAs响应氧化应激的表达调控机制尚不清楚，其在猪卵泡颗粒细胞中是否具有调控氧化应激的功能仍需进一步探索。

基于上述发现，本研究首先构建猪卵泡颗粒细胞体外氧化应激模型，随后联合生物信息学分析和多种分子生物学方法鉴定关键miRNAs的抗氧化功能，同时探究其响应氧化应激的表达模式与转录调控机制，以期为利用内源性小分子调节物抑制氧化应激、促进卵泡发育和改善母猪繁殖力提供理论依据和实践靶点。

1　材料与方法

收起

1.1　试验材料

试验用杜长大三元母猪源自江苏省南京市竹顺生物科技有限公司，随机选择80头180 d且体重约为100 kg的健康母猪，屠宰后收集双侧卵巢用于颗粒细胞分离与体外培养。另外随机选择3头猪分别采集心、肝、脾、肺、肾、脂肪、肌肉和卵巢组织并置于液氮罐中保存。

主要试剂：DMEM/F12培养基、胎牛血清FBS、青链霉素、PBS、Opti-MEM培养基购自Gibco；Lipofectamine^TM3000转染试剂购自Roche；H₂O₂购自国药集团化学试剂有限公司；PCR扩增酶、DH5α感受态菌株购自南京擎科生物科技有限公司；无内毒素质粒试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；cDNA反转录试剂盒、定量PCR试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒、荧光素酶报告基因检测试剂盒购自南京喏唯赞生物科技股份有限公司；Western与IP细胞裂解液以及ROS、SOD和MDA检测试剂盒购自上海碧云天生物科技股份有限公司；KLF5抗体购自上海生物工程股份有限公司（货号：D260534）；GAPDH抗体购自ORIGENE公司（货号：TA802519）；引物合成和DNA测序由上海生物工程股份有限公司完成；miRNA mimics交由上海吉玛制药技术有限公司合成。

1.2　细胞培养、处理与转染

利用预热的75%乙醇和生理盐水反复轻柔冲洗新鲜采集的猪卵巢组织，以彻底去除表面血渍及潜在的残留污染源。分离3~5 mm直径健康卵泡中的颗粒细胞并将其接种于含1%青链霉素和10% FBS的DMEM/F12培养基中，置于含5% CO₂的37 ℃湿式培养箱中培养36~48 h，待细胞牢固贴壁且密度达到90%时进行消化并接种于6孔板中继续培养16 h，待细胞密度达到70%左右时进行相应处理与转染。

为构建猪卵泡颗粒细胞体外氧化应激模型，细胞牢固贴壁后更换为无血清DMEM/F12培养基培养12 h，随后加入终浓度为150 μmol·L^-1的H₂O₂继续培养2 h直至在电镜下观察到细胞形态学发生明显变化，对照组则加入等量PBS，每组设置3个重复孔。细胞形态变化的判定依据如下，正常颗粒细胞具有稳定细胞形态，边缘清晰平滑且无明显锯齿状，细胞未破碎或内部产生液泡。反之，氧化应激状态下的颗粒细胞轮廓不清晰，细胞边缘呈锯齿状，内部产生大量液泡，丧失正常形态甚至出现细胞破碎的现象。

细胞转染按照Lipofectamine^TM3000转染试剂说明书提供方法进行，利用Opti-MEM培养基分别稀释被转染物（质粒或miRNA mimics）和转染试剂，充分混匀后室温孵育15 min，随后逐滴加入细胞中继续培养48 h，每组设置3个重复孔。质粒转染体系为每孔1.6 μg，miRNA mimics转染细胞终浓度为100 nmol·L^-1。本研究涉及的mimics序列信息如下，mimic NC：TTCTCCGAACGTGTCACGTTT；miR-370 mimic：GCCTGCTGGGGTGGAACCTGGT；miR-219a mimic：AGAGTTGAGTCTGGACGTCCCG。

1.3　生物信息学分析

利用NCBI GenBank数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查询不同物种miR-370和miR-219a的初体、前体和成熟序列以及猪KLF5基因编码序列。通过Ensembl数据库（http：//www.ensembl.org/index.html）查询不同物种miR-370和miR-219a的染色体定位和邻近编码基因。颗粒细胞氧化应激转录组测序数据来源于团队前期研究^［20］。猪miRNAs组织表达高通量数据来源于Chen等^［21］的研究。利用JASPAR数据库（http：//jaspar.genereg.net/）分析猪miR-370和miR-219a启动子上潜在的转录因子结合位点。

1.4　RNA提取与反转录定量PCR（RT-qPCR）

利用Trizol法提取猪不同组织和体外培养卵泡颗粒细胞的总RNA，质检合格后选取1 μg总RNA进行反转录，反转录程序按照诺唯赞cDNA合成试剂盒说明书提供步骤进行，成熟miRNAs的反转录依赖特异性茎环引物。利用Primer 5.0软件设计定量引物，经检测合格后进行qPCR反应，反应体系和程序参考霍泱安等^［22］的方法进行。反应结束后获得原始数据并通过-2^∆∆Ct法计算目的基因的相对表达水平，GAPDH和U6分别作为KLF5和miRNAs的内参基因。本研究所涉及引物序列见表1。

1.5　流式细胞术检测细胞凋亡率与ROS水平

收集2×10⁵个经处理或转染培养完成后的颗粒细胞，加入500 μL预冷1×Binding Buffer轻柔重悬，随后依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，轻柔混匀后室温避光孵育10 min，孵育完成后使用流式细胞仪检测细胞凋亡率（Q2和Q3细胞百分率）。

细胞ROS水平检测过程如下，利用无血清培养基稀释DCFH-DA并加入处理或转染培养完成后的颗粒细胞中，置于37 ℃培养箱中孵育30 min，孵育完成后利用无血清培养基轻柔冲洗3次去除未进入细胞的DCFH-DA，最后使用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。

1.6　ELISA检测SOD活性与MDA水平

将处理或转染完成后的颗粒细胞进行裂解，离心后收集细胞上清液，通过BCA法检测蛋白浓度，分别按照碧云天超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒和脂质氧化丙二醛（MDA）水平检测试剂盒中说明书提供方法进行定量检测分析。

1.7　载体构建与荧光素酶活性检测

委托上海生物工程股份有限公司根据猪KLF5编码序列（NM_001097489）合成其全长DNA序列，在T4连接酶的作用下与线性化pcDNA3.1（+）载体进行连接并转化至DH5α感受态细胞中，后经涂板、挑取单克隆以及Sanger测序最终获得阳性重组质粒，并将其命名为pcDNA3.1-KLF5；设计引物扩增包含野生型KLF5潜在结合位点的miR-370和miR-219a启动子序列，双酶切后在T4连接酶的作用下与线性化pGL3-Basic载体进行连接，经转化、涂板、单克隆测序最终获得野生型报告载体（WT）。以野生型报告载体为模板，通过诺唯赞同源重组试剂盒提供的方法对KLF5潜在结合位点进行定点突变，经单克隆测序最终获得突变型报告载体（MT）。所用引物序列见表1。

收集处理或转染完成后的颗粒细胞，利用诺唯赞荧光素酶报告基因检测试剂盒提供的方法分别检测各样本中萤火虫荧光活性与海肾荧光活性。相对荧光活性定义为萤火虫荧光活性与海肾荧光活性的比值。每组包含3个独立重复样本。

1.8　蛋白印迹试验（Western blot）

使用预冷PBS清洗细胞3次，加入细胞裂解液并置于冰上静置30 min，刮取细胞裂解物并在4 ℃环境下12 000 r·min^-1离心10 min，离心结束后收集蛋白上清液。通过BCA法检测蛋白浓度，经过变性处理后按每孔15 μg蛋白上样量进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后在冰浴条件下将蛋白转印至PVDF膜，随后浸入封闭液室温轻摇封闭2 h，加入目标蛋白抗体（1∶1 000稀释）并置于4 ℃环境中静置过夜，次日使用TBST清洗3次后加入对应IgG-HRP二抗（1∶2 000稀释）进行孵育。室温孵育1.5 h后滴加ECL显色液，反应1~3 min后置于化学发光仪中进行蛋白印迹成像拍照。

1.9　染色质免疫沉淀（ChIP）

ChIP试验具体过程参考团队前期研究的方法进行^［23］。经1%甲醛溶液交联颗粒细胞15 min后加入5 mol·L^-1甘氨酸淬灭15 min，收集细胞内容物并添加目标蛋白抗体下拉蛋白/染色质复合物，后经超声处理、解交联和DNA纯化后通过PCR鉴定与目标蛋白互作的染色质片段和富集水平。IgG抗体下拉产物作为阴性对照，未经处理的染色质作为总样本对照（Input），所用引物序列见表1。

1.10　数据分析

所有数据均采用Excel 2023软件进行汇总且以“平均值±标准误（SEM）”形式表示，结果使用GraphPad Prism v8.0软件进行绘图。利用IBM SPSS v26.0软件对数据进行统计分析，分别采用t检验（针对两个组别）和one-way ANOVA（针对3个及以上组别）进行显著性分析，P<0.05指代差异显著（以*或不同小写字母表示），P<0.01指代差异极显著（以**或不同大写字母表示），0.05<P<0.1表示具有相应变化趋势。

2　结果

收起

2.1　猪卵泡颗粒细胞中miR-370和miR-219a响应氧化应激表达下调

结合细胞形态学观察、细胞凋亡率检测、ROS富集分析以及ELISA试验等分析结果显示，150 μmol·L^-1 H₂O₂处理导致体外培养的猪卵泡颗粒细胞形态皱缩且膜完整性受损（图1A），同时显著促进细胞凋亡（P<0.05）（图1B），显著提高细胞内ROS累积（P<0.05）（图1C），极显著下调SOD活性（P<0.01）且极显著上调MDA水平（P<0.01）（图1D），以上结果表明猪卵泡颗粒细胞体外氧化应激模型建立成功。基于转录组测序发现，氧化应激显著下调猪7号染色体上4个miRNAs（miR-7136、miR-219a、miR-9860和miR-370）的表达丰度（P<0.05）（图1E）。进一步利用RT-qPCR试验证实猪卵泡颗粒细胞中miR-370与miR-219a响应氧化应激表达极显著下调（P<0.01），而miR-7136与miR-9860表现出下调趋势（图1F），提示miR-370与miR-219a潜在发挥抗氧化功能。

2.2　miR-370和miR-219a高度保守且在猪卵巢组织中高表达

鉴于目前对miR-370和miR-219a的基本特征知之甚少，本研究首先查询不同物种二者的前体序列与成熟序列。经比对分析发现，不同物种miR-370前体序列的一致性高达97.33%，成熟序列完全一致；不同物种miR-219a前体序列的一致性高达97.37%，成熟序列的一致性高达96.36%（图2A）。染色质定位分析发现，二者在不同物种中具有高度保守的染色体定位和相同的邻近编码基因，其中miR-370位于RTL1和DIO3基因间，miR-219a位于HSD17B8和RING1基因间（图2B）。以上结果表明miR-370和miR-219a在不同物种中进化高度保守。Chen等^［18］通过高通量测序构建了猪miRNA组织表达谱，发现miR-370在脾、肾和卵巢组织中高表达，miR-219a在卵巢组织中特异性高表达（图2C）。进一步检测miR-370和miR-219a在试验猪心、肝、脾、肺、肾、脂肪、肌肉和卵巢组织中的表达分布，结果显示，二者的组织表达模式与前期高通量测序结果一致且均在卵巢组织中高表达（图2D）。

2.3　过表达miR-370和miR-219a抑制猪卵泡颗粒细胞氧化应激损伤

为验证miR-370和miR-219a是否具有抗氧化功能，本研究首先通过相关性分析发现二者的表达水平与猪卵泡颗粒细胞中SOD活性呈极显著正相关（P<0.01），而与MDA水平呈极显著负相关（P<0.01）（图3A，B）。随后将miR-370 mimics和miR-219a mimics单独或共同转染进入猪卵泡颗粒细胞体外氧化应激模型，结合ROS水平检测、ELISA试验和细胞凋亡率分析结果显示，过表达miR-370或miR-219a可显著降低H₂O₂诱导的ROS累积（P<0.05）（图3C，D）、极显著上调SOD活性（P<0.01）且极显著下调MDA水平（P<0.01）（图3E），同时显著抑制H₂O₂诱导细胞凋亡（图3F）。值得注意的是，同时过表达二者可最大程度挽救H₂O₂诱导猪卵泡颗粒细胞氧化应激。以上结果表明，miR-370和miR-219a具有抗氧化功能，过表达二者可显著抑制猪卵泡颗粒细胞氧化应激损伤。

2.4　转录因子KLF5响应氧化应激抑制猪卵泡颗粒细胞中miR-370和miR-219a转录

为解析氧化应激抑制miR-370和miR-219a表达的机制，本研究首先通过RT-qPCR试验发现，二者初体（Pri）和前体（Pre）的表达水平在氧化应激模型中均极显著下调（P<0.01）（图4A），提示氧化应激对二者的调控发生在转录水平。结合转录组测序数据与生物信息学分析发现转录因子KLF5潜在介导氧化应激对二者转录的调控（图4B），且H₂O₂处理可极显著上调KLF5 mRNA和蛋白表达水平（P<0.01）（图4C，D）。为鉴定KLF5对miR-370和miR-219a转录的调控作用，研究随后将KLF5过表达载体转染进入体外培养的猪卵泡颗粒细胞，通过RT-qPCR试验发现，过表达KLF5极显著抑制二者初体、前体和成熟的表达水平（P<0.01）（图4E-G）。为进一步验证KLF5是否调控miR-370和miR-219a的转录活性，试验分别构建了包含野生型KLF5结合位点（KBS）的二者启动子区荧光素酶报告载体（miR-370-WT和miR-219a-WT），并利用定点突变技术分别将miR-370启动子-711~-702区域和miR-219a启动子-163~-154区域的KBS序列转换为AAAAAAAAAA（miR-370-MT和miR-219a-MT）（图4H）。分别将上述报告载体与KLF5过表达载体共转进入颗粒细胞，荧光素酶活性检测结果显示，过表达KLF5极显著抑制野生型载体荧光素酶活性（P<0.01），而对KBS突变型载体的荧光素酶活性并未产生显著影响（图4I）。最后，通过ChIP试验证实KLF5可与二者启动子区上KBS直接结合，且氧化应激显著提高KLF5在二者启动子上的富集丰度（图4J）。综合上述结果表明，KLF5作为转录抑制因子抑制氧化应激状态下猪卵泡颗粒细胞中miR-370和miR-219a的转录。

3　讨论

收起

除氧化还原系统外，氧化应激还受到多种表观因子的调控^［24］。其中，miRNAs作为一类长度为18~25 nt且在体内广泛分布的内源性非编码RNA已被证实通过多种途径深度参与哺乳动物不同细胞类型的氧化应激过程^{［25， 26］}。近期研究发现，miRNAs通过调控氧化应激在雌性哺乳动物卵泡颗粒细胞中发挥关键功能。例如，miR-642a-5p通过靶向抑制FoxO1表达引起人和大鼠卵泡颗粒细胞氧化应激损伤、卵巢功能受损，最终导致早发性卵巢功能不全^［27］；miR-181a通过靶向抑制TGFBR1表达引起小鼠卵巢氧化应激损伤并导致颗粒细胞凋亡^［28］；miR-15c-3p通过靶向抑制IGF2BP3表达和AKT-Raf1-ERK1/2通路活性加剧鸡卵泡颗粒细胞氧化应激并导致其脂质储存和孕酮分泌功能紊乱^［29］。然而，在猪卵泡颗粒细胞中相关研究较少，目前仅鉴定了两个具有促进氧化应激功能的miRNAs，即miR-192和miR-23a。miR-192被证实通过靶向抑制ACVR2A表达诱导猪卵泡颗粒细胞氧化应激损伤^［30］。miR-23a则作为小激活RNA促进lncRNA NORHA转录间接诱导猪卵泡颗粒细胞凋亡和氧化应激。另外，miR-23a启动子上g.-398C>T突变不仅影响颗粒细胞对氧化应激的应答，同时还与母猪繁殖性状显著关联^［31］。本研究结合相关性分析和功能验证发现，miR-370和miR-219a能够缓解H₂O₂处理引起的猪卵泡颗粒细胞氧化应激，同时降低细胞凋亡率，首次证实二者在猪卵泡颗粒细胞中具有抗氧化功能，但其功能靶点和作用机制尚不清楚，仍需进一步研究。

本研究结合序列比对和染色质定位分析发现，miR-370和miR-219a在不同物种间进化高度保守且具有相同的染色质定位，这与前人发现miRNAs具有高度进化保守性特征一致，同时提示二者功能具有潜在的种间相似性。现阶段研究表明二者主要参与成骨分化、血管形成、神经发育、免疫应答、多种疾病以及癌症发生^{［32⁃35］}，且功能途径主要依赖miRNAs的经典作用机制，即通过碱基互补配对原则直接结合靶mRNA 3′-UTR并抑制后者稳定性或翻译过程。尽管通过公开高通量数据和本研究组织表达谱分析发现二者在卵巢组织中高表达，但其在雌性哺乳动物卵巢组织中的功能却鲜有研究，仅有Zhou等^［36］指出miR-370通过靶向抑制GLI1表达抑制小鼠卵泡颗粒细胞凋亡并促进雌二醇合成。有趣的是，除本研究在猪卵巢组织中的发现外，二者的抗氧化功能在其他物种部分细胞类型中也被证实。例如，miR-370通过靶向抑制BACH1表达缓解线粒体功能异常引起的大脑皮层细胞氧化应激损伤，进而维持突触的正常功能^［37］；miR-370通过靶向抑制TLR4表达抑制氧化型低密度脂蛋白引起的巨噬细胞氧化应激和炎症反应^［38］；miR-219a通过阻碍p66shc介导ROS产生抑制肝细胞氧化应激并缓解酒精肝损伤^［39］。综合上述研究发现表明二者的抗氧化功能具有潜在普遍性。

与编码基因和其它非编码基因相同，miRNAs的转录也受到转录因子调控^［40］。本研究证实在猪卵泡颗粒细胞中，转录因子KLF5通过直接靶向结合miR-370和miR-219a启动子抑制二者转录。KLF5属于Krüppel-like锌指转录因子家族成员，该家族共包含18个转录因子，可通过特异性识别并结合启动子GC富集元件调控靶基因转录^［41］。前人研究表明，KLF5在不同病理过程中调控miR-29a、miR-155和miR-200等多个miRNAs转录^［42-43］。本研究在猪卵巢组织的生理过程中建立了KLF5与miRNAs的直接联系，但该调控模式在猪卵巢组织中，尤其是在氧化应激条件下是否具有普遍性尚未明确。另外，本研究还发现氧化应激促进猪卵泡颗粒细胞中KLF5表达并提高其转录因子活性，这与近期在人、猪和小鼠心肌细胞氧化应激研究中的发现一致^［44-45］，暗示FoxO1等应激效应因子潜在介导氧化应激对KLF5表达和活性的促进作用。有趣的是，Li和Yang等^［46-47］分别在骨髓间充质干细胞和鳞状上皮细胞中发现KLF5响应氧化应激表达下调，而上述过程主要依赖DNA甲基化、蛋白乙酰化和泛素化降解等表观调控途径。以上结果表明，氧化应激对KLF5表达的调控存在双向性，其最终结果可能由不同调控物或调控模式决定。

4　结论

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本研究明确了氧化应激对猪卵泡颗粒细胞中miR-370和miR-219a转录的抑制作用，证实该过程由响应氧化应激的转录抑制因子KLF5介导完成。此外，发现miR-370和miR-219a具有抗氧化能力，能有效缓解猪卵泡颗粒细胞氧化应激损伤。研究结果为利用内源性小分子调节物抑制氧化应激、促进卵泡发育以及改善母猪繁殖力提供了理论依据和实践靶点。

基金

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国家自然科学基金(32372839)
江苏省自然科学基金(BK20231475)

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文献

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2026年第57卷第1期

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doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.01.020

接收时间：2025-06-03
首发时间：2026-09-16
出版时间：2026-01-23

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收稿日期：2025-06-03

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国家自然科学基金(32372839)

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作者信息

^1.南京农业大学动物科技学院，南京 210095

^2.江苏农林职业技术学院畜牧兽医学院，镇江 212400

通讯作者:

杜星，副研究员，主要从事动物遗传育种与表观遗传调控研究，E-mail：duxing@njau.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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