畜牧兽医学报

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型实时荧光RT-PCR盔甲RNA阳性质控品的构建

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朱向东 ¹ , 孙伟珊 ² , 曹琪 ² , 尹春博 ¹ , 杨丹 ¹ , 李硕 ² , 邓钰蓱 ² , 李文钢 ¹

畜牧兽医学报 | 研究简报 2026,57(3): 1759-1765

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畜牧兽医学报 |研究简报 2026 , 57 (3) : 1759 -1765

猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型实时荧光RT-PCR盔甲RNA阳性质控品的构建

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朱向东¹, 孙伟珊², 曹琪², 尹春博¹, 杨丹¹, 李硕², 邓钰蓱², 李文钢¹

作者信息

^1.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402

^2.天津测易生物科技有限公司，天津 301600

通讯作者:

李文钢，主要从事动物疫病防控技术研究，E-mail： Liwengang0102@163.com

作者简介:

朱向东，高级兽医师，博士，主要从事动物病毒学、分子生物学和生猪综合防控技术研究，E-mail： xiangdongzhu87@163.com

Construction of an Armored RNA Positive Control for Real-time RT-PCR Detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Genotype 2

Xiangdong ZHU¹, Weishan SUN², Qi CAO², Chunbo YIN¹, Dan YANG¹, Shuo LI², Yuping DENG², Wengang LI¹

Affiliations

^1.Tianjin Animal Disease Prevention and Control Center，Tianjin 300402，China

^2.Tianjin Ceyi Biotechnology Co. ，Ltd. ，Tianjin 301600，China

Corresponding Author:

LI Wengang， E-mail： Liwengang0102@163.com

出版时间: 2026-03-23 doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.03.049

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摘要

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本研究旨在利用MS2噬菌体外壳蛋白自组装并包封外源核酸的特性，制备用于猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型（porcine reproductive and respiratory syndrome virus genotype 2， PRRSV-2） RT-qPCR 检测阳性质控品，并探究其稳定性及耐RNase特性。选取PRRSV-2的特异性靶基因（ORF7保守区），插入pET28a（+）/CP-A重组质粒PAC位点下游构建重组载体，经原核表达、硫酸铵沉淀及凝胶过滤层析纯化，获得20~28 nm均一的MS2病毒样颗粒；通过全能核酸酶消化及RT-qPCR，验证其热稳定性和抗RNase能力。结果显示：成功构建含MS2噬菌体外壳蛋白、PAC位点和PRRSV-2靶基因的重组载体，纯化后形成包封靶基因的盔甲RNA，可耐受RNase降解，37 ℃无菌条件下稳定存在7 d。该盔甲RNA可作为PRRSV-2 RT-qPCR阳性质控品，相比传统合成核酸，优势在于：1）模拟真实病毒核酸状态，监控全检测流程；2）耐RNase能力强；3）3批次批内及批间变异系数均<2%；4）37 ℃稳定保存7 d，为PRRSV-2检测提供可靠质控工具。

关键词

猪繁殖与呼吸综合征病毒 / 基因2型 / 盔甲RNA / 实时荧光RT-PCR / 质控品 / 病毒样颗粒 / MS2 噬菌体

Abstract

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This study aimed to prepare a positive control for RT-qPCR detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus genotype 2 （PRRSV-2） by utilizing the property of MS2 phage capsid protein to self-assemble and encapsulate exogenous nucleic acids into armored RNA， and to investigate its stability and RNase resistance. The specific target gene （conserved region of ORF7） of PRRSV-2 was inserted downstream of the PAC site in the pET28a（+）/CP-A recombinant plasmid to construct a recombinant vector. Through prokaryotic expression， ammonium sulfate precipitation， and gel filtration chromatography purification， uniform MS2 virus-like particles （VLPs） with a diameter of 20-28 nm were obtained. Benzonase nuclease digestion and RT-qPCR were used to verify its thermal stability and RNase resistance. The recombinant vector containing MS2 phage capsid protein， PAC site， and PRRSV-2 target gene was successfully constructed. After purification， armored RNA encapsulating the target gene was formed， which was resistant to RNase degradation and stable for 7 days at 37 ℃ under sterile conditions. This armored RNA can serve as a positive control for PRRSV-2 RT-qPCR detection. Compared with traditional synthetic nucleic acids， its advantages include： 1） simulating the nucleic acid state of real viruses and monitoring the entire detection process； 2） strong RNase resistance； 3） intra- and inter-batch coefficients of variation （CV） of <2% among 3 batches； 4） stable storage at 37 ℃ for 7 days. It provides a reliable quality control tool for PRRSV-2 detection.

Key words

porcine reproductive and respiratory syndrome virus （PRRSV） / genotype 2 / armored RNA / real-time RT-PCR / quality control product / virus-like particles （VLPs） / MS2 bacteriophage

引用本文

朱向东, 孙伟珊, 曹琪, 尹春博, 杨丹, 李硕, 邓钰蓱, 李文钢. 猪繁殖与呼吸综合征病毒基因2型实时荧光RT-PCR盔甲RNA阳性质控品的构建. 畜牧兽医学报, 2026 , 57 (3) : 1759 -1765 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.03.049

Xiangdong ZHU, Weishan SUN, Qi CAO, Chunbo YIN, Dan YANG, Shuo LI, Yuping DENG, Wengang LI. Construction of an Armored RNA Positive Control for Real-time RT-PCR Detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Genotype 2[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2026 , 57 (3) : 1759 -1765 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.03.049

正文

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猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是严重危害全球养猪业的重要烈性传染病，以妊娠母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道症状为主要特征，自1987年首次报道以来，对生猪产业造成巨大经济损失^［1］。PRRSV分离株主要为基因1型（PRRSV-1）和基因2型（PRRSV-2），其中，PRRSV-2是我国优势流行毒株^［2］。PRRSV属于动脉炎病毒科，具有高变异性，导致疫苗交叉保护能力有限，且缺乏特效治疗药物，因此早期精准诊断至关重要^［3］。PRRSV ORF7基因编码核衣壳（N）蛋白，占病毒粒子的40%，是早期诊断的理想靶标^［4］。目前检测方法中，实时荧光RT-PCR因快速、灵敏、特异被广泛应用^［5］，但市售试剂盒的合成核酸质控品存在无法模拟病毒结构、稳定性差等缺陷。近年来，病毒样颗粒（VLPs）技术通过MS2噬菌体衣壳蛋白自组装形成盔甲RNA，可包封并保护靶RNA免受降解，已成功用于多种病原检测^［6⁃7］。本研究基于PRRSV-2 ORF7基因构建盔甲RNA阳性质控品，旨在解决传统质控品的技术局限，为PRRSV-2精准检测提供可靠工具。

1　材料与方法

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1.1　菌株、质粒和主要试剂

试验所用克隆菌株DH5α、表达菌株BL21（DE3），以及两端引入HindⅢ和NotⅠ酶切位点的A基因、NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点的CP基因均由通用生物（安徽）股份有限公司合成；限制性内切酶（NotⅠ、NcoⅠ、BamHⅠ、HindⅢ）、T4 DNA连接酶、Protein Marker、RNAiso Plus核酸提取试剂、PrimeScript^TM RT Master Mix反转录试剂、PerfectStart® II Probe qPCR Mix荧光探针PCR试剂、Universal Nuclease（GMP Grade）全能核酸酶（GMP级）（货号：LN201-01）购自北京全式金生物技术有限公司；变性蛋白电泳预制胶（货号：PG01510-S）、蛋白上样缓冲液（货号：P1041）、考马斯亮蓝染色套装（染色液+脱色液）（货号：P1305）等，均购自北京索莱宝科技有限公司；猪繁殖与呼吸综合征病毒美洲经典株（PRRSV VR2332）核酸标准物质，标准物质编号为GBW（E）090930，定值核酸拷贝数浓度为（2.06±0.31）×10⁴ 拷贝·µL^-1，购自北京普天同创生物科技有限公司商城分公司。

1.2　引物

根据PRRSV株13GXYL-1（GenBank：KJ850329.1）ORF7保守区设计引物与探针，上游引物PRRSV-F1（5′-CGCGGATCCATGCCAMAT-AACAAMGGCAG-3′，含BamHⅠ位点）、下游引物PRRSV-R1（5′-CCAAGCTTTCATGCTGAGGGT-GACGCT-3′，含HindⅢ位点）、探针PRRSV-P（FAM-5′-CCCAACAGAGCCAGTCCAG-3′-BHQ-1）。引物、探针及携带PRRSV ORF7基因（372 bp）靶序列的pUC57载体均由通用生物（安徽）股份有限公司合成。

1.3　重组载体构建

先用NcoⅠ/BamHⅠ双酶切pET28a（+）载体与CP基因片段，酶切产物纯化后经T4 DNA连接酶连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，通过菌落PCR与测序验证正确后，获得重组质粒pET28a（+）/CP；随后用HindⅢ/NotⅠ双酶切该质粒与A基因片段，同样经连接、转化及酶切鉴定，最终得到pET28a（+）/CP-A载体。以pUC57为模板，用 PRRSV-F1/PRRSV-R1引物扩增ORF7基因，将扩增产物与pET28a（+）/CP-A载体均用BamHⅠ/HindⅢ双酶切后连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，经双酶切与测序验证无误，获得重组载体pET28a（+）/CP-PRRSV-A。

1.4　重组蛋白的表达与盔甲RNA纯化

将重组质粒pET28a（+）/CP-PRRSV-A，质粒转化至BL21（DE3）菌株，待菌体OD_{600 nm}达0.5~0.7时，加入0.3 mmol·L^-1 IPTG于25 ℃振荡诱导表达14 h，菌体经超声破碎（200 W，10 s/10 s，20 min）后取上清液，经0.45 µm滤器过滤，按镍离子亲和层析柱步骤纯化。取纯化的盔甲RNA蛋白，用变性蛋白电泳预制胶进行SDS-PAGE电泳（上样量10 µL，稳压150 V，50 min）。

1.5　盔甲RNA透射电镜观察

取纯化盔甲RNA，磷钨酸染色（2%染料，4 min）后自然晾干，在Hitachi ht7700透射电镜（120 000×）下观察VLPs形态与粒径。

1.6　盔甲RNA核酸酶消化和残余核酸检测

用0.01 mol·L^-1 PB缓冲液透析盔甲RNA，取1 mL透析液加入300 U全能核酸酶（Mg²⁺终浓度2 mmol·L^-1），37 ℃孵育8 h；分别取消化产物直接检测、提取RNA后反转录为cDNA再检测，通过实时荧光RT-PCR验证靶序列包封效果。

1.7　盔甲RNA耐核糖核酸酶（ribonuclease，RNase）攻击检测

将600 μL核酸酶消化后的盔甲 RNA 分为对照组（无RNase）与处理组（加10 μL 1 mg·L^-1 RNase，37 ℃孵育60 min），每组3个重复；两组均提取RNA并反转录，通过实时荧光RT-PCR（比较Ct值）与1.5%琼脂糖电泳验证耐酶性。

1.8　盔甲RNA阳性质控品的制备与效能检验

测定重组质粒pET28a（+）/CP-PRRSV-A的浓度计算其核酸拷贝数，10倍倍比稀释（10⁶~10¹ copies·µL^-1），构建实时荧光RT-PCR标准曲线。确定盔甲RNA中包封靶基因的核酸拷贝数。将盔甲RNA溶液用DEPC处理水进行稀释，得到RNA拷贝数为10⁵ copies·µL^-1盔甲RNA溶液，经0.22 μm滤器过滤除菌，按照1.0 mL·管^-1无菌分装至1.5 mL的红色盖螺帽管中，共制备3批（PRRSV/P-1，PRRSV/P-2，PRRSV/P-3），均置于-20 ℃±5 ℃环境保存，作为阳性质控品。3批阳性质控品中各随机抽取3管进行均匀性试验，以PRRSV VR2332核酸标准物质为阳性参照，用实时荧光RT-PCR检测核酸含量并分析Ct值变化；取同一批次4管阳性质控品进行稳定性试验，对照组4 ℃保存，试验组3组分别于37 ℃保存3、5、7 d，通过实时荧光RT-PCR检测核酸含量并分析Ct值变化。

2　结果

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2.1　重组蛋白的表达纯化与盔甲RNA形态特征

双酶切与测序验证显示，pET28a（+）/CP-PRRSV-A载体构建正确；SDS-PAGE结果显示，纯化产物在15 ku处出现单一蛋白条带，无杂蛋白（图1A）。透射电镜观察可见，盔甲RNA为完整二十面体VLPs，直径20~28 nm（图1B）。

2.2　盔甲RNA功能验证

全能核酸酶消化后，直接检测盔甲RNA无荧光信号，表明残留核酸已完全降解；提取RNA反转录后检测Ct值为17.03，证实VLPs有效包封ORF7靶序列（图2A）。耐RNase试验中，处理组与对照组Ct值无显著性差异（图2B），琼脂糖电泳条带亮度一致（图2C），表明盔甲RNA可抵御RNase降解。

2.3　盔甲RNA阳性质控品的制备与检验

经计算，重组质粒pET28a（+）/CP-PRRSV-A的初始浓度为1.56×10⁷ copies·µL^-1。经10倍梯度稀释后形成10⁶~10 copies·µL^-1的浓度构建的标准曲线，回归方程为y=3.434 9x+13.52，相关系数R²=0.998 5。对于经过100倍稀释的盔甲RNA样本，测得其Ct值为20.25，根据标准曲线计算得出其浓度为1.1×10⁷ copies·µL^-1。制备3批盔甲RNA阳性质控品，批号分别为PRRSV/P-1、PRRSV/P-2、PRRSV/P-3，每批100支。均匀性试验显示，3批质控品批内CV分别为0.39%（PRRSV/P-2311）、1.43%（PRRSV/P-2312）、0.96%（PRRSV/P-2313），批间平均CV为0.99%，均小于2%（图3A）。稳定性试验显示，37 ℃保存3、5、7 d的质控品Ct值与4 ℃对照组无显著差异，表明其在37 ℃下可稳定保存7 d（图3B）。

3　讨论

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PRRSV是危害我国养猪业的重要病原，且近年病毒基因组变异与重组加剧，凸显快速精准诊断对疫病防控的重要性^［8］。实时荧光RT-PCR可在感染极早期精准检测PRRSV-2，但其检测质量需依赖优质质控品把控，病毒样颗粒（盔甲RNA）是理想的创新型质控材料^［9］。本研究将PRRSV-2 ORF7基因插入pET28a（+）/CP-A重组质粒PAC位点下游，构建pET28a（+）/CP-PRRSV-A重组载体，经原核表达纯化获得包封靶基因的盔甲RNA；全能核酸酶处理验证其耐RNase降解能力，制备的3批阳性质控品（-20 ℃±5 ℃保存）批内、批间变异系数均小于2%，37 ℃条件下可稳定保存7 d，能有效监控核酸提取、逆转录及扩增全流程，且相较于何嘉敏等^［10］选用的PRRSV M基因，本研究选取的ORF7基因保守性更强，直接参与病毒RNA合成与颗粒装配，更能模拟病毒自然状态^［11］。但本研究尚未验证其在不同品牌实时荧光RT-PCR试剂盒中的通用性，也缺乏-80 ℃超低温或室温下的长期储存稳定性数据，未来需进一步优化其兼容性并评估在临床样本混合检测中的抗干扰能力。

4　结论

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MS2噬菌体外壳蛋白体外可包封PRRSV N蛋白基因靶序列，形成兼具热稳定性与耐RNase特性的病毒样颗粒（盔甲RNA），该盔甲RNA能监控荧光RT-PCR提取、反转录及扩增全流程，可作为PRRSV荧光RT-PCR检测阳性质控品，保障检测结果准确性。

基金

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天津市科技计划项目(24ZYCGSN01410)
天津市生猪产业技术体系创新团队猪重大疫病监测与预警岗位项目(ITTPRS2021004)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

排序方式：

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2026年第57卷第3期

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doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.03.049

接收时间：2025-06-26
首发时间：2026-09-16
出版时间：2026-03-23

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收稿日期：2025-06-26

基金

天津市科技计划项目(24ZYCGSN01410)

天津市生猪产业技术体系创新团队猪重大疫病监测与预警岗位项目(ITTPRS2021004)

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^1.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402

^2.天津测易生物科技有限公司，天津 301600

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李文钢，主要从事动物疫病防控技术研究，E-mail： Liwengang0102@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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