畜牧兽医学报

引物名称 Primer name	引物序列（5’ →3’） Primer sequence （5' to 3'）	片段大小/bp Fragment size/bp
PCR1-F	CCGTTTAGCTTCTCCTGCATCAC	935
PCR1-R	GCCGCAAGAAACTCTGAATCC
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PCR4-F	CCAGCATGGATCCTCCACAG	1 432
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PCR5-F	GGATTAAGACAGTGTGGCCTACAAG	1 445
PCR5-R	GCCTGAAACGCATTTCCATGAC
PCR6-F	GAGCTGTACAAGGCTAGCAAGG	728
PCR6-R	GATCACGCTACACCGACCC
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虫株 Strain	代次 Generation	接种形式 Inoculationform	接种剂量/只 Inoculationdosage/per	鸡只数量 Chickennumbers	卵囊获取途径 Access tooocysts	荧光率/% Fluorescencerate	筛选方式Selection strategy
Et-VP2	1	merozoites	3×10⁵	3	粪便 Feces	0.02	FACS
2	oocysts	365	4	粪便 Feces	29.05	FACS
3	sporangia	3 000	4	粪便 Feces	>95	FACS
4	sporangia	3 000	4	粪便 Feces	>95	FACS
5	oocysts	2 000	4	粪便 Feces	>95	-
6	oocysts	2 000	4	粪便 Feces	>95	-
7	oocysts	2 000	4	粪便 Feces	>95	-

虫株 Strain	代次 Generation	接种形式 Inoculationform	接种剂量/只 Inoculationdosage/per	鸡只数量 Chickennumbers	卵囊获取途径 Access tooocysts	荧光率/% Fluorescencerate	筛选方式Selection strategy
Et-VP2	1	merozoites	3×10⁵	3	粪便 Feces	0.02	FACS
2	oocysts	365	4	粪便 Feces	29.05	FACS
3	sporangia	3 000	4	粪便 Feces	>95	FACS
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7	oocysts	2 000	4	粪便 Feces	>95	-

表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫的构建与鉴定

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刘跃辉 ¹ , 孙颖颖 ² , 王浩迪 ¹ , 索静霞 ² , 宋铭忻 ¹ , 刘贤勇 ²

畜牧兽医学报 | 预防兽医 2026,57(2): 1008-1016

收起

畜牧兽医学报 |预防兽医 2026 , 57 (2) : 1008 -1016

表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫的构建与鉴定

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刘跃辉¹, 孙颖颖², 王浩迪¹, 索静霞², 宋铭忻¹, 刘贤勇²

作者信息

^1.东北农业大学动物源性人兽共患病黑龙江省重点实验室，哈尔滨 150030

^2.中国农业大学动物医学院，北京 100193

通讯作者:

宋铭忻，主要从事兽医寄生虫学与寄生虫病学研究，E-mail： songmx@neau.edu.cn

刘贤勇，主要从事艾美耳球虫发育调控相关研究，E-mail： liuxianyong@cau.edu.cn

作者简介:

刘跃辉和孙颖颖是同等贡献作者

刘跃辉，主要从事预防兽医学、兽医寄生虫学的研究，E-mail： lyh97163@qq.com

孙颖颖，主要从事鸡艾美耳球虫卵囊活载体疫苗的研究，E-mail： 2570035989@qq.com

Construction and Identification of a Transgenic Eimeria tenella Expressing Infectious Bursal Disease Virus VP2 Protein

Yuehui LIU¹, Yingying SUN², Haodi WANG¹, Jingxia SUO², Mingxin SONG¹, Xianyong LIU²

Affiliations

^1.Heilongjiang Key Laboratory for Zoonosis，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China

^2.College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100193，China

Corresponding Author:

SONG Mingxin， E-mail： songmx@neau.edu.cn

LIU Xianyong， E-mail： liuxianyong@cau.edu.cn

出版时间: 2026-02-23 doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.036

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摘要

收起

传染性法氏囊病严重制约家禽养殖业经济发展。因此，研发安全且高效的传染性法氏囊病疫苗成为当下备受瞩目的关键课题。为探索柔嫩艾美耳球虫作为活载体表达及递送传染性法氏囊病毒抗原的可行性，本研究构建表达该病毒VP2蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫株（Et-VP2）。构建表达质粒，酶切后核转染入柔嫩艾美耳球虫中，利用流式细胞分选技术筛选得到表达红色荧光报告基因（mCherry）的阳性虫株，在基因和蛋白水平上鉴定VP2基因的表达。结果显示，构建表达VP2蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫经雏鸡体内3次传代阳性球虫荧光率已高于95%，在球虫基因和蛋白水平上证实了外源基因的成功插入和稳定表达（后代群体荧光率均达95%），间接免疫荧光结果显示融合蛋白（Mic2-linker-VP2）定位于柔嫩艾美耳球虫子孢子顶端。本研究成功建立柔嫩艾美耳球虫稳定转染体系，为后续转基因虫株的传染性法氏囊病免疫保护研究奠定基础。

关键词

柔嫩艾美耳球虫 / 传染性法氏囊病病毒 / VP2 / mCherry / 转基因

Abstract

收起

Infectious bursal disease （IBD） severely restricts the economic development of the poultry industry. Therefore， the development of safe and efficient IBD vaccines has become a key topic of considerable interest. To explore the feasibility of using Eimeria tenella as a live vector for the expression and delivery of infectious bursal disease virus （IBDV） antigens， this study constructed a genetically modified strain of E. tenella （Et-VP2） expressing the VP2 protein of the IBDV. An expression plasmid was constructed， digested with enzymes， and then transfected into E. tenella using nuclear transfection. Flow cytometry was utilized to sort and select positive strains expressing the red fluorescent reporter gene （mCherry）， and the expression of the VP2 gene was identified at both the genetic and protein levels. Results showed that after three passages in vivo in chicks， the transgenic E. tenella expressing VP2 protein had a positive rate of fluorescence exceeding 95%， confirming successful integration and stable expression of the foreign gene at both the genetic and protein levels （with fluorescence rates reaching 95% in the offspring population）. Indirect immunofluorescence results indicated that the fusion protein （Mic2-linker-VP2） was localized at the apical end of the sporozoites of E. tenella. This study successfully established a stable transfection system for E. tenella， laying the foundation for subsequent research on the immune protection of genetically modified strains against infectious bursal disease.

Key words

Eimeria tenella / infectious bursal disease virus / VP2 / mCherry / transgenic

引用本文

刘跃辉, 孙颖颖, 王浩迪, 索静霞, 宋铭忻, 刘贤勇. 表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫的构建与鉴定. 畜牧兽医学报, 2026 , 57 (2) : 1008 -1016 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.036

Yuehui LIU, Yingying SUN, Haodi WANG, Jingxia SUO, Mingxin SONG, Xianyong LIU. Construction and Identification of a Transgenic Eimeria tenella Expressing Infectious Bursal Disease Virus VP2 Protein[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2026 , 57 (2) : 1008 -1016 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.036

正文

收起

传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）作为威胁全球养禽业的重要病原体，其VP2蛋白是诱导宿主免疫保护的关键抗原^［1］。当前商业化疫苗面临超强毒株免疫逃逸和母源抗体干扰等挑战，而基因工程疫苗如病毒活载体、亚单位疫苗和DNA疫苗虽各有优势，但仍存在表达效率或免疫原性不足的问题^［2⁃3］。VP2蛋白的构象依赖性中和表位是疫苗研发的核心靶点，如何高效递送VP2抗原成为突破现有技术瓶颈的关键。

球虫病由艾美耳属寄生虫（Eimeria）引起，转基因球虫技术的发展为多价疫苗开发提供了新路径^［4⁃6］。球虫具有严格宿主特异性，其基因组可容纳外源抗原基因，且感染过程能模拟自然免疫^［7］。前期研究已成功将禽流感抗原M2e定位至柔嫩艾美耳球虫基因组（E. tenella）ETH2_0942600和ETH2_0942700的3’UTR区域内（转染载体T-DNA插入球虫基因组HG994969.1：2 704 213~2 705 255），且未影响编码完整性，为异源抗原表达奠定了基础^［8⁃10］。在艾美耳球虫反向遗传操作体系的构建过程中，调控元件的优化以及转染与筛选效率的提升是两个关键的突破性进展，极大地推动了该体系的完善和发展^［11］。近些年，顶复门原虫中一些与入侵相关的组分成为研究的焦点。余瑛等^［12］研究结果显示，与堆型艾美耳球虫（E. acervuline）表面抗原蛋白1（EaSag1）抗原呈递系统相比，球虫微线体蛋白Mic2（EaMic2）在诱导宿主产生特异性免疫保护反应方面展现出更高的效率优势^［13］。本研究计划以转基因柔嫩艾美耳球虫（Et-M2e）为受体虫株，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术实现外源基因的定点整合，构建表达VP2基因的转基因柔嫩艾美耳球虫（Et-VP2），旨在探究柔嫩艾美耳球虫作为重组活卵囊疫苗载体的可行性。

1　材料与方法

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1.1　材料

1.1.1　球虫卵囊及实验动物

野生柔嫩艾美耳球虫（Et-WT）、转基因柔嫩艾美耳球虫（Et-M2e）北京株、转基因堆型艾美耳球虫（Ea-VP2）卵囊由中国农业大学国家原虫实验室索勋教授课题组保存，每两个月进行一次传代以保证球虫卵囊活力，置于4℃冰箱保存备用。卵囊传代的1周龄AA肉鸡购自北京爱拔益加家禽育种有限公司。

1.1.2　主要试剂

Q5^®高保真DNA聚合酶、Kpn I-HF等购自北京百灵克生物科技有限公司；Monoclonal ANTI-FLAG^®M2 antibody produced in mouse购自Sigma公司；FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体、HRP偶联山羊抗鼠二抗购自碧云天生物技术有限公司。

1.1.3　基因序列

将VP2基因利用GenSmart™ Codon Optimization密码子优化工具进行球虫密码子偏好性优化并于北京擎科生物科技有限公司合成，网站设计针对Et-M2e虫株T-DNA插入位点的单向导gRNA（5’-GCATGCAAATGGCTCTAC- ACA-3’），SpCas9环状质粒由实验室保存。

1.2　方法

1.2.1　重组质粒的设计与构建

设计表达质粒p5'AMic2linkerVP2m3'A-U6gR，包含VP2基因、mCherry荧光报告基因及针对球虫Et-M2e虫株T-DNA插入位点的gRNA。重组质粒的设计和子孢子核转染模式图（图1）。通过PCR扩增获得各相应片段，经同源重组连接后，Kpn I-HF酶切线性化后备用。

1.2.2　柔嫩艾美耳球虫子孢子的转染

采用Percoll密度梯度离心法提取转基因柔嫩艾美耳球虫（Et-M2e）子孢子，取子孢子原液计数至4×10⁵个，2 000 g·min⁻¹离心5 min沉淀备用。从-20 ℃冰箱取出核转缓冲液I和II，融化后混匀。取新电转杯，蒸馏水清洗备用。吸取80 μL核转缓冲液，吹打子孢子沉淀，加入5 μL Kpn I-HF酶、7.5 μL目的片段酶切后胶回收产物和7.5 μL环状SpCas9质粒，混匀后加入电转杯。启动核转仪，按程序运行至“OK”字样，表示完成。取出电转杯，加入500 μL DMEM培养基，混匀后转移至EP管。

1.2.3　阳性球虫的流式筛选和传代

核转后的子孢子通过泄殖腔接种至1周龄禁食禁水12 h的无球虫鸡。接虫后5 d清粪，收取6 d至8 d的粪便，饱和食盐水漂浮法富集和纯化球虫卵囊。用倒置荧光显微镜观察，若卵囊发红光则转染成功。通过荧光激活细胞分选技术（fluorescent activated cell sorting，FACS）筛选红色光卵囊，并多次传代于无球虫鸡，最终获得稳定表达Et-VP2的阳性转基因柔嫩艾美耳球虫卵囊。

1.2.4　球虫的基因组鉴定和重测序分析

对野生型柔嫩艾美耳球虫（Et-WT）和第4代转基因虫株（Et-VP2）孢子化卵囊进行处理。收集不少于1×10⁶个卵囊的PBS悬液，沉淀后采用CTAB法提取球虫基因组DNA。设计引物（表1）对Et-VP2基因组PCR鉴定。适量的转基因虫株（Et-VP2）委托上海派森诺生物科技有限公司进行二代重测序分析。

1.2.5　Western blot鉴定转基因柔嫩艾美耳球虫VP2蛋白表达

收集转基因球虫样本，以野生型柔嫩艾美耳球虫（Et-WT）和表达VP2转基因堆型艾美耳球虫（Ea-VP2）分别为阴性和阳性对照，经RIPA裂解、低温离心后取上清测蛋白浓度。蛋白样品加入上样缓冲液后保存。按目标蛋白分子量灌胶，电泳分离后转膜。转膜后用5%脱脂奶粉封闭，依次孵育抗Flag和GAPDH的一抗（1∶2 000）和HRP偶联山羊抗鼠二抗（1∶2 000），用ECL显色并成像检测。

1.2.6　间接免疫荧光鉴定VP2蛋白在转基因柔嫩艾美耳球虫表达定位

子孢子经蒸馏水和甘氨酸润洗的层析柱分离，低速离心重悬后接种含HFF细胞孔板，培养后依次固定、通透、封闭，经抗Flag标签小鼠源单克隆抗体一抗和FITC标记山羊抗小鼠IgG抗体二抗孵育，防荧光淬灭剂封片后4 ℃保存。

2　结果

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2.1　重组质粒的构建

构建表达质粒p5'AMic2linkerVP2m3'A-U6gR（9 201 bp），Kpn I-HF酶切线性化质粒大小为7 340 bp，此外测序结果显示VP2、mCherry和gRNA基因序列正确连接，结果表明该重组质粒构建成功并酶切成功，环状SpCas9质粒大小10 508 bp，与实际大小相符（图2）。

2.2　转基因阳性虫株的筛选与稳定性

核转染后的子孢子经泄殖腔接种于无球虫鸡体内，流式细胞分选术记录到第1代转基因球虫Et-VP2荧光率为0.02%，经过3次传代操作并结合流式筛选后，荧光率显著提升，已高于95%，且第4至7代荧光率均保持95%以上（表2）。在荧光显微镜镜检（100×）观察前3代的卵囊，发现荧光率与流式分选结果基本相符（图3）。

2.3　表达Et-VP2的转基因球虫在基因组水平的鉴定

本研究通过PCR和基因组重测序分析技术鉴定VP2基因在转基因柔嫩艾美耳球虫（Et-M2e）基因组的整合位置。PCR结果显示，在插入位点未扩增出5’和3’同源臂（图4a），而鉴定出VP2（1 359 bp）和mCherry（705 bp）基因，说明转染质粒成功存在于球虫基因组（图4b）。基因重测序结果预测VP2基因可能整合在柔嫩艾美耳球虫基因组HG994969.1的2 705 529位置（图4c），后对此位置进行了PCR验证，核酸电泳显示的条带大小与预期大小相符，说明VP2基因成功整合转基因柔嫩艾美耳球虫（Et-M2e）基因组中（图4d）。

2.4　表达Et-VP2的转基因球虫在蛋白水平的鉴定

Western blot鉴定转基因球虫Mic2-linker-VP2融合蛋白表达，在86 ku大小处印迹出条带，与预期蛋白大小相符（图5）。

2.5　异源VP2在转基因柔嫩艾美耳球虫中表达位置的鉴定

通过IFA技术分析VP2蛋白在转基因柔嫩艾美耳球虫（Et-M2e）中的表达位置。荧光显微镜（1 000×）观察结果显示，与Et-WT对照组相比，在球虫子孢子的囊泡内存在Mic2-linker-VP2融合蛋白表达，其主要分布在子孢子的顶端（图6）。

3　讨论

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传染性法氏囊病（IBD）导致禽类死亡率上升，更因免疫抑制问题而增加鸡群对其他病原体易感性，给养禽业带来沉重经济负担，VP2蛋白作为关键性致病抗原，成为疫苗研发的核心靶点^{［14⁃15］}。至今，研究学者已成功实现将VP2蛋白介入细菌（乳酸菌、沙门菌等）、真菌（酵母等）和病毒（疱疹病毒等）表达系统中并成功表达^{［16⁃17］}。艾美耳球虫是研究寄生虫生物学和免疫学特征的模式生物，被认为是表达病原体抗原的疫苗递送载体，其会在鸡和哺乳动物中引发外来抗原特异性免疫反应^［18］。随着球虫反向遗传技术的不断发展，转基因球虫已成功从瞬时转染跨越至稳定转染阶段，2012年索勋课题组系统全面地比较分析转基因柔嫩艾美耳球虫及其受体-野生型柔嫩艾美耳球虫结果显示两者虽存在一定的株间差异，但转基因柔嫩艾美耳球虫的生物学特性未发生显著改变，指示可对球虫进行基因操作^［19］。

大量研究指出，CRISPR/Cas9系统能够有效应用于球虫基因组的编辑与改造，为球虫的遗传操作提供了新的工具和可能性^{［11，20］}。本研究尝试利用CRISPR/Cas9技术将IBDV VP2基因定点整合至柔嫩艾美耳球虫基因组的特定位点。然而，在预期的T-DNA插入位点未检测到同源臂相关的扩增产物。通过全基因组重测序发现，VP2基因实际整合于基因组序列HG994969.1的第2 705 529位点，较预期插入位点后移约100 bp。该结果提示目的基因的插入可能并未通过经典的同源重组机制介导，而可能依赖于微同源介导的末端连接（MMEJ）或非同源末端连接（NHEJ）等修复途径，这也反映出在球虫中开展精准基因编辑可能面临修复机制不确定性的挑战。该结果强调在球虫中进行CRISPR/Cas9编辑后需通过测序手段确认整合位点，并提示未来应优化同源臂设计或结合抑制NHEJ策略，以提高定点整合的准确性。为提高整合效率和精准度，未来研究可考虑采用更长同源臂模板、引入同源重组增强因子，或探索球虫中DNA修复通路的调控机制。本试验中转基因柔嫩艾美耳球虫（Et-VP2）3代荧光率升高至95%，后代群体稳定表达，推测该整合位点适配于柔嫩艾美耳球虫的基因组，这为球虫遗传操作提供数据支持。

顶复门原虫在入侵宿主时其中一些分泌器官发挥着很关键的作用，微线体便是其中重要的一员，微线体分泌的蛋白参与细胞膜的黏附、入侵和协助形成纳虫空泡^{［21⁃22］}。考虑到能否将外源蛋白与微线体蛋白联合表达的策略，通过微线体的外分泌作用实现抗原的表达。本试验通过柔性基因linker连接堆型艾美耳球虫微线体蛋白Mic2与VP2基因，将其导入柔嫩艾美耳球虫（Et-M2e），结果显示在基因和蛋白水平上均能表达，此结果揭示球虫可作为表达外源蛋白的活载体的可行性。结果也表明顶复门原虫中微线体蛋白表达存在一定的保守性。间接免疫荧光试验观察到Mic2和VP2蛋白能在球虫表达，主要分布于子孢子的顶端，这与先前研究结果一致^{［12，23］}。本研究结果为球虫疫苗研究提供科学依据。

4　结论

收起

本研究成功构建并鉴定了一株表达IBDV VP2蛋白的转基因柔嫩艾美耳球虫（Et-VP2），实现外源基因的稳定整合与表达。该研究为利用球虫作为疫苗载体提供了科学依据，为开发新型传染性法氏囊病疫苗奠定了基础。

基金

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“十四五”国家重点研发计划项目(2023YFD1802400)

参考文献

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文献

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2026年第57卷第2期

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doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.036

接收时间：2025-06-23
首发时间：2026-09-16
出版时间：2026-02-23

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出版历史

收稿日期：2025-06-23

基金

“十四五”国家重点研发计划项目(2023YFD1802400)

作者信息

^1.东北农业大学动物源性人兽共患病黑龙江省重点实验室，哈尔滨 150030

^2.中国农业大学动物医学院，北京 100193

通讯作者:

宋铭忻，主要从事兽医寄生虫学与寄生虫病学研究，E-mail： songmx@neau.edu.cn

刘贤勇，主要从事艾美耳球虫发育调控相关研究，E-mail： liuxianyong@cau.edu.cn

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/xmsyxb/CN/10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.036

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

引物名称 Primer name	引物序列（5’ →3’） Primer sequence （5' to 3'）	片段大小/bp Fragment size/bp
PCR1-F	CCGTTTAGCTTCTCCTGCATCAC	935
PCR1-R	GCCGCAAGAAACTCTGAATCC
PCR2-F	CAAGGCAACAGGTTACTGTAGGT	803
PCR2-R	GGAGTAGCAGCTCTTCTTTGCAG
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PCR3-R	GGTTGTATGTGCTTGTCTCGC
PCR4-F	CCAGCATGGATCCTCCACAG	1 432
PCR4-R	CCCAAAAGCCCCAGCAATCTTC
PCR5-F	GGATTAAGACAGTGTGGCCTACAAG	1 445
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PCR7-F	CCGGAATTGCGAGAAAAGATTTGC	3 097
PCR7-R	GGTTGTATGTGCTTGTCTCGC
PCR8-F	GGAGATTGTGACAAGCAAGAGC	2 769
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引物名称

Primer name

引物序列（5’ →3’）

Primer sequence （5' to 3'）

片段大小/bp

Fragment size/bp

PCR1-F

CCGTTTAGCTTCTCCTGCATCAC

935

PCR1-R

GCCGCAAGAAACTCTGAATCC

PCR2-F

CAAGGCAACAGGTTACTGTAGGT

803

PCR2-R

GGAGTAGCAGCTCTTCTTTGCAG

PCR3-F

GCGCAACGAATTCTCGTATGC

1 552

PCR3-R

GGTTGTATGTGCTTGTCTCGC

PCR4-F

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1 432

PCR4-R

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1 445

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2 769

PCR8-R

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虫株 Strain	代次 Generation	接种形式 Inoculationform	接种剂量/只 Inoculationdosage/per	鸡只数量 Chickennumbers	卵囊获取途径 Access tooocysts	荧光率/% Fluorescencerate	筛选方式Selection strategy
Et-VP2	1	merozoites	3×10⁵	3	粪便 Feces	0.02	FACS
2	oocysts	365	4	粪便 Feces	29.05	FACS
3	sporangia	3 000	4	粪便 Feces	>95	FACS
4	sporangia	3 000	4	粪便 Feces	>95	FACS
5	oocysts	2 000	4	粪便 Feces	>95	-
6	oocysts	2 000	4	粪便 Feces	>95	-
7	oocysts	2 000	4	粪便 Feces	>95	-

虫株

Strain

代次

Generation

接种形式

Inoculationform

接种剂量/只

Inoculationdosage/per

鸡只数量

Chickennumbers

卵囊获取途径

Access tooocysts

荧光率/%

Fluorescencerate

筛选方式Selection strategy

Et-VP2

merozoites

3×10⁵

粪便 Feces

0.02

FACS

oocysts

365

粪便 Feces

29.05

FACS

sporangia

3 000

粪便 Feces

>95

FACS

sporangia

3 000

粪便 Feces

>95

FACS

oocysts

2 000

粪便 Feces

>95

oocysts

2 000

粪便 Feces

>95

oocysts

2 000

粪便 Feces

>95