畜牧兽医学报

基因名称 Gene name	引物序列（5’→3’） Prime Sequence	产物长度/bp Size
gK	F： GCATACACAACGGTTGAGAC； R： GGAATCTACTCGCCAGGACG	2 216
gG	F： CTGACCGCTAGCCCATACAG； R： TCCAGTGCAAGTTCGTCCTC	1 416
gE	F： CAGTATCGGACACGGACTGG； R： CGGGTTGACTGGAAACGGTA	1 894
gC	F： AGACTGTCGCCTCGAAACTG； R： TTGGTCAACACTGCAAAGCG	1 983
gL	F： ACTGTAACAGCGTCTCACCG； R： TACCGGAGACAGAAGAGGGG	1 377
gN	F： ATTGCAAGGAATCGAGGCCA； R： TACTTCTTCGCCTCCTCCGA	692
gM	F： CCCCACAACCATCGACAGAA； R： GCTGAGATCGCATCCGTACA	1 722
gD	F： TACCGCTGGCCAAAGTACAG； R： TAGTCTGTTCGAGGCGGAGA	1 850
gB	F： GACAGTCGATGCTTCTATGCC； R： ATGCAATCCTACATCGCCGT^［22］	2 799
gH	F： TGCTTCTTTGACGGAGCCAT； R： CCGAGACGGCAAGTTCTCTT	2 617
gI	F： CCTCCAGAAGACTCGGAGGA； R： CCGGAACGTTTCTGGGATCA	1 789
TK	F： CATGACTACAATTTTGCCC； R： ACGAACCCATATCAGCATT^［22］	1 251
UL32	F： GGTATGAGATGTAGCGATGG； R： GGTAGTTTAGTTTAGCATCGGTA^［22］	2 023
ICP4₁	F： TGCTTTTCCTGCAGCGTCTA； R： TCTTGTCTCAGAACGTGCCC	2 244
ICP4₂	F： CGTGAGTGAGGAAGGGG； R： GGTACAGACGGGTCGGT^［22］	2 668
ICP4₃	F： GGCATCCCGTACTCTTCGAG； R： TCACTCGGGTCTTGTTCTGC	1 272

基因名称 Gene name	引物序列（5’→3’） Prime Sequence	产物长度/bp Size
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菌株名 Strain name	GenBank登陆号 GenBank accession No.	国家 Country	年 Year
VFAR-043	MG775218	秘鲁Peru	2014
USDA reference	JN542534	美国USA	2012
LJS09	JX458822	中国China	2009
WG	JX458823	中国China	2012
CSW-1	JX646899	澳大利亚Australia	1970
30678/14/Ko	MH937565	韩国South Korea	2014
ACC78/	JN804826	澳大利亚Australia	2011
4787/80	KP677885	意大利Italy	1980
193435/07	KP677883	意大利Italy	2007
A489	KY423284	美国USA	2017
27_CSW-1/V1-99	MF156852	澳大利亚Australia	2016
J2	MF417808	美国USA	2017
Rus/Ck/Penza/2013/2701	MF405080	俄罗斯Russia	2013
ILTV.319/19	MK895002	澳大利亚Australia	2019
ck/CH/LHLJ/120305	MT876619	中国China	2012
40798/10/Ko	MH937566	韩国South Korea	2010
7b	MN335811	澳大利亚Australia	2016
CAN/QC-2236832	OL354140	加拿大Canada	2019
CAN/QC-2301711	OK646550	加拿大Canada	2020
CAN/ON-2462242	OK624781	加拿大Canada	1987
CAN/ON-2462241	OK573459	加拿大Canada	2021
live attenuated strain
A20	JN596963	澳大利亚Australia	2011
K317	JX458824	中国China	2012
LT Blen	JQ083493	美国USA	2011
Laryngo Vac	JQ083494	美国USA	2011
Poulvac ILT（R）	KP677882	意大利Italy	2015
Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643	MF405079	俄罗斯Russia	2017
Nobilis Laringovac（R）	KP677881	意大利Italy	2015

菌株名 Strain name	GenBank登陆号 GenBank accession No.	国家 Country	年 Year
VFAR-043	MG775218	秘鲁Peru	2014
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LJS09	JX458822	中国China	2009
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4787/80	KP677885	意大利Italy	1980
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J2	MF417808	美国USA	2017
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live attenuated strain
A20	JN596963	澳大利亚Australia	2011
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Poulvac ILT（R）	KP677882	意大利Italy	2015
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Nobilis Laringovac（R）	KP677881	意大利Italy	2015

组别 Groups	免疫毒株和剂量 Immunizing strain and dose	攻毒毒株 Challenge strain	发病率/% Incidence rate	保护率/% Protection rate of vaccination
G1	No vaccine	WF03	90	-
G2	FJ19， 0.2 dose/bird	WF03	0	100 （10/10）
G3	K317， 0.2 dose/bird	WF03	30	70 （7/10）
G4	No vaccine	WG	80	-
G5	FJ19， 0.2 dose/bird	WG	20	80 （8/10）
G6	K317， 0.2 dose/bird	WG	0	100 （10/10）
G7	No vaccine	No challenge	0	-

组别 Groups	免疫毒株和剂量 Immunizing strain and dose	攻毒毒株 Challenge strain	发病率/% Incidence rate	保护率/% Protection rate of vaccination
G1	No vaccine	WF03	90	-
G2	FJ19， 0.2 dose/bird	WF03	0	100 （10/10）
G3	K317， 0.2 dose/bird	WF03	30	70 （7/10）
G4	No vaccine	WG	80	-
G5	FJ19， 0.2 dose/bird	WG	20	80 （8/10）
G6	K317， 0.2 dose/bird	WG	0	100 （10/10）
G7	No vaccine	No challenge	0	-

攻毒后时间 Days postchallenge	免疫剂量 Immunizingdose	实时PCR Ct值 Ct values of real-time PCR
第1天 Day 1	1 dose/bird	N^a	35.8^b	35.2	N	36.8	36.4	N	N	N	N
0.2 dose/bird	N	N	N	N	N	N	N	N	N	N
No Vaccine^c	22.91	24.86	25.16	26.09	25.97	27.12	25.53	26.4	25.17	25.61
第3天 Day 3	1 dose/bird	N	34.74	N	N	N	N	37.69	33.07	N	N
0.2 dose/bird	N	36.19	N	N	N	N	36.23	N	N	N
No vaccine	25.45	25.67	25.22	25.1	22.82	24.46	24.46	24.78	22.85	24.67
第5天 Day 5	1 dose/bird	N	33.47	N	N	N	N	36.93	36.15	N	N
0.2 dose/bird	N	37.11	N	N	N	N	32.76	N	N	N
No vaccine	29.89	33.79	32.56	32.9	31.57	30.75	31.86	26.37	29.60	31.27
第8天 Day 8	1 dose/bird	N	N	N	N	N	N	37.90	N	N	N
0.2 dose/bird	N	31.18	37.2	N	N	N	N	N	N	N
No vaccine	N	36.84	37.48	34.99	36.06	N	N	-^d	-	-
第11天 Day 11	1 dose/bird	N	N	N	N	N	N	N	N	N	N
0.2 dose/bird	N	N	N	N	N	N	N	N	N	N
No vaccine	N	N	N	N	N	N	N	-	-	-
第14天 Day 14	1 dose/bird	N	N	N	N	N	N	N	N	N	N
0.2 dose/bird	N	N	N	N	N	N	N	N	N	N
No vaccine	N	N	N	N	N	N	N	-	-	-

攻毒后时间 Days postchallenge	免疫剂量 Immunizingdose	实时PCR Ct值 Ct values of real-time PCR
第1天 Day 1	1 dose/bird	N^a	35.8^b	35.2	N	36.8	36.4	N	N	N	N
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No vaccine	N	N	N	N	N	N	N	-	-	-

鸡传染性喉气管炎弱毒株FJ19株的关键基因遗传演化分析及作为候选疫苗株的安全性、有效性评价

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王晨燕 ¹ , 张巍嘉 ¹ , 柳珊 ² , 李亚杰 ² , 赵丽霞 ² , 刘云涛 ² , 侯博 ¹

畜牧兽医学报 | 预防兽医 2026,57(2): 994-1007

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畜牧兽医学报 |预防兽医 2026 , 57 (2) : 994 -1007

鸡传染性喉气管炎弱毒株FJ19株的关键基因遗传演化分析及作为候选疫苗株的安全性、有效性评价

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王晨燕¹, 张巍嘉¹, 柳珊², 李亚杰², 赵丽霞², 刘云涛², 侯博¹

作者信息

^1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病疾病防治工程技术研究中心，福州 350013

^2.瑞普（保定）生物药业有限公司，保定 071030

通讯作者:

侯博，主要从事兽医传染病防控技术研究，E-mail： houbohouwei@126.com

作者简介:

王晨燕，主要从事兽医传染病防控技术研究，E-mail： 15396022617@163.com

Phylogenetic Analysis of Key Genes and Evaluation of Safety and Efficacy as a Vaccine Candidate Strain for the Attenuated FJ19 Strain of Avian Infectious Laryngotracheitis Virus

Chenyan WANG¹, Weijia ZHANG¹, Shan LIU², Yajie LI², Lixia ZHAO², Yuntao LIU², Bo HOU¹

Affiliations

^1.Fujian Animal Disease Control Technology Development Center，Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Fujian Academy of Agricultural Sciences，Fuzhou 350013，China

^2.Ringpu （Baoding） Biological Pharmaceutical Co. Ltd. ，Baoding 071030，China

Corresponding Author:

HOU Bo， E-mail： houbohouwei@126.com

出版时间: 2026-02-23 doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.035

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摘要

收起

本研究旨在分析鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）弱毒株FJ19株的部分关键抗原基因及毒力基因的遗传演化特点，评估FJ19株对SPF鸡的安全性和免疫原性，为ILTV FJ19株弱毒活疫苗的开发提供参考依据。通过将FJ19株进行多次尿囊腔途径接种适应后，对其关键抗原和毒力基因进行测序分析，点眼或口服接种14日龄SPF鸡观察其安全性，并且通过点眼或口服途径免疫14日龄SPF鸡21 d后用ILTV强毒株攻毒评价保护效果，测定免疫持续期等验证FJ19株作为弱毒活疫苗的潜力。结果显示：将FJ19株在10日龄SPF鸡胚以尿囊腔途径接种连续传代适应后，收获P0、P1、P2、P3代病毒液的EID₅₀分别为10^5.0、10^6.5、10^6.9、10^6.5·mL^-1。核酸序列分析结果表明：FJ19株主要免疫原性基因gB-gC-gD-UL32和毒力相关基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN与弱毒株K317、Nobilis Laringovac^®、LT Blen、Poulvac ILT^®、Laryngo Vac和我国2009年分离株LJS09株、2012年分离株ck/CH/LHLJ/120305株、2019年分离强毒株WF03的亲缘关系较近。安全性试验显示，FJ19株以10^4.0EID₅₀·羽^-1的剂量（10羽份）点眼接种14日龄SPF鸡后有40%出现轻度眼炎症状，而口服接种SPF鸡未表现出明显的临床症状；当以10^4.0EID₅₀·羽^-1的剂量气管途径接种21日龄SPF鸡时有30%鸡出现一过性的呼吸道反应，未发生严重的ILTV感染典型症状。免疫后强毒攻毒结果显示，FJ19株以0.2羽份或1羽份的剂量点眼或口服途径免疫14日龄SPF鸡21 d后，采用ILTV强毒株以10^4.0EID₅₀·只^-1的剂量气管攻毒后，所有免疫组的鸡均获得了至少90%的保护，未观察到明显的临床症状，而未免疫攻毒组至少有90%的鸡出现了严重的ILTV感染典型症状，FJ19株免疫后的免疫持续期至少可达6个月。ILTV FJ19株采用尿囊腔途径接种可获得高滴度病毒含量，其主要抗原基因和毒力基因与我国早期分离株和疫苗株相比未发生明显变异，通过动物试验证实点眼或口服该弱毒株对14日龄SPF鸡具有良好的安全性和免疫有效性，且免疫持续期可达6个月，通过口服接种不影响其安全性和免疫有效性。因此，ILTV弱毒株FJ19株不仅适应尿囊腔接种途径收获病毒，且具备良好的安全性和免疫有效性，还可适应口服接种途径进行免疫，是一株理想的具有潜力的弱毒疫苗候选毒株。

关键词

传染性喉气管炎 / 弱毒株 / 遗传进化 / 安全性 / 有效性

Abstract

收起

This study aimed to analyze the genetic relatedness of key antigenic and virulence genes in the attenuated FJ19 strain of infectious laryngotracheitis virus （ILTV）， and to evaluate its safety and immunogenic efficacy in specific-pathogen-free （SPF） chickens， thereby providing valuable groundwork for the development of an attenuated live vaccine derived from the ILTV FJ19 strain. The ILTV FJ19 strain was adapted through allantoic cavity inoculation in chicken embryos， with sequencing confirming immunogenic and virulence genes. Safety tests were assessed in 14-day-old SPF chickens. Protective efficacy was demonstrated by challenging vaccinated chickens （ocular/oral routes at 14 days） with virulent ILTV strain at 21 days post-vaccination （dpv）. Vaccine durability was also determined. After serial passages in 10-day-old SPF chicken embryos via allantoic cavity inoculation， the EID₅₀ values of harvested P0， P1， P2， and P3 viral suspensions were 10^5.0， 10^6.5， 10^6.9， and 10^6.5·mL^-1， respectively. Genetic and phylogenetic analysis revealed： key immunogenic genes （gB， gC， gD， UL32） and virulence-associated genes （gE， gI， TK， ICP4， gG， gH， gK， gL， gM， gN） of FJ19 strain clustered closely with attenuated strains K317， Nobilis Laringovac^®， LT Blen， Poulvac ILT^®， Laryngo Vac and Chinese virulent isolates LJS09 （2009）， ck/CH/LHLJ/120305 （2012）， WF03 （2019）. Safety assessment demonstrated： Ocular inoculation （10^4.0 EID₅₀ per bird） caused mild conjunctivitis in 40% of 14-day SPF chickens， while oral administration showed no symptoms. Intratracheal challenge （10^4.0 EID₅₀ per bird） of FJ19 strain in 21-day-old SPF chickens caused transient respiratory reactions in a minority （30%）， with no severe ILTV-specific symptoms. Efficacy evaluation confirmed： Immunization （0.2 or 1 dose via ocular/oral routes） provided at least 90% protection against intratracheal challenge with virulent WF03 （10^4.0 EID₅₀ per bird） at 21 dpv， with no clinical signs in immunized groups. However， at least 90% of unimmunized virus-challenged chickens developed characteristic severe ILTV infection symptoms. Vaccine-induced immunity persisted for ≥6 months. The results demonstrated that： The ILTV strain FJ19 achieves high-titer cultivation via allantoic cavity inoculation. Its major antigenic and virulence genes show no significant variation compared to early Chinese isolates and vaccine strains. The FJ19 strain demonstrated excellent safety and immunogenicity in 14-day-old SPF chickens， immunity duration reached 6 months， with oral administration maintaining safety and efficacy. Thus， adaptation to allantoic cavity inoculation of FJ19 strain yielded a virus suspension with optimal safety and immunogenicity， the attenuated ILTV FJ19 strain represents an ideal candidate for oral attenuated live vaccine development.

Key words

infectious laryngotracheitis / attenuated strain / phylogenetic analysis / safety / efficacy

引用本文

王晨燕, 张巍嘉, 柳珊, 李亚杰, 赵丽霞, 刘云涛, 侯博. 鸡传染性喉气管炎弱毒株FJ19株的关键基因遗传演化分析及作为候选疫苗株的安全性、有效性评价. 畜牧兽医学报, 2026 , 57 (2) : 994 -1007 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.035

Chenyan WANG, Weijia ZHANG, Shan LIU, Yajie LI, Lixia ZHAO, Yuntao LIU, Bo HOU. Phylogenetic Analysis of Key Genes and Evaluation of Safety and Efficacy as a Vaccine Candidate Strain for the Attenuated FJ19 Strain of Avian Infectious Laryngotracheitis Virus[J]. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2026 , 57 (2) : 994 -1007 . DOI: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.035

正文

收起

传染性喉气管炎病毒（infectious laryngotracheitis virus，ILTV）属于疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科传染性喉气管炎病毒属。ILTV感染鸡后引起传染性喉气管炎（infectious laryngotracheitis，ILT），主要危害成年鸡和产蛋鸡，造成死亡或产蛋下降，世界上许多国家都有该病的发病报道。ILTV是一种双链DNA病毒，基因组大小约155 kb，与其他疱疹病毒一样，该基因组包括长独特区、短独特区以及两端的反向重复序列等结构，编码大量糖蛋白以及与毒力和病毒复制相关的蛋白。

ILTV最早于1925年在美国被首次发现，1959年我国首次在贵阳市发现该病毒。2019年4月开始山东省多个地区发生了多起商品肉鸡、地方品种肉鸡等感染ILTV的病例，临床主要表现为严重的咳血、呼吸困难以及呼吸道粘膜出血和充血^［1］。近年来仍不断有养殖场发生ILTV感染的报道^［1⁃4］，国内不同地区分离获得的ILTV分离株基因遗传进化存在差异。2018—2021年，山东部分地区的商品肉鸡场分离获得23株ILTV分离株，gB同源性分析显示与常用的 ILTV疫苗株遗传关系相对较近^［5］。湖北省某肉鸡养殖场分离获得的ILTV毒株gJ蛋白存在T441P点突变，可导致6周龄鸡死亡^［6］。2021年贵州省分离的ILTV GZNY202112株TK以及gD基因遗传进化分析显示与澳大利亚原产疫苗株CSW-1、V1-99亲缘关系最近^［7］。对ILTV BT临床分株进行了TK、ICP4、gB、UL32基因序列分析表明该毒株与国内其他流行毒株相似性大于97%，属于同一进化分支，与美国强毒株1874C5和国内标准强毒株WG株差异较大，但与K317、Serva、Laeyngo和LTBlen等弱毒疫苗株保持一致^［8］。

ILT临床防控选用弱毒活疫苗接种可达到良好的免疫效果，主要是可激发良好的细胞免疫。ILTV弱毒疫苗株的选育主要通过两种途径获得，一是将强毒株通过连续鸡胚传代或组织培养进行毒力致弱，二是从自然感染的亚临床症状鸡群分离获得自然弱毒株。通过鸡胚或细胞传代致弱方式获得制备疫苗用弱毒株存在着毒株毒力返强等不确定性，而自然弱毒株具有毒性低、副作用小、免疫原性好等优点。SA2株是从澳大利亚分离到的一株自然弱毒株，已被开发制备为SA2株活疫苗，于1965年开始在澳大利亚广泛应用，获得满意结果，是目前国际上公认较好的疫苗用毒株^［9］。当前我国唯一生产的ILTV活疫苗K317株是通过致弱获得，该疫苗在推广使用时，不得用于5周龄以下的鸡，且具有明显的副作用，并且疫苗生产时经绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane，CAM）途径接种鸡胚导致疫苗生产效率不高。为应对当前我国肉鸡和小日龄鸡的ILTV感染，开发具有自主知识产权的、适应尿囊腔接种生产的无毒力返强的、高效安全、可饮水免疫的新型ILT疫苗是预防和控制ILTV感染和ILT暴发的重要手段。本研究对分离鉴定的自然弱毒株FJ19株通过繁殖性能测定、抗原基因和毒力基因遗传演化分析，安全性、点眼和口服接种的免疫有效性、与K317疫苗有效性比较等方面，综合评估FJ19毒株作为弱毒疫苗候选毒株的潜力。

1　材料与方法

收起

1.1　主要试剂与材料

含1%庆大霉素的胰蛋白磷酸盐肉汤（TPB），购自Sigma公司；1-5 ^TM 2×High Fidelity master Mix购自MCLAB公司；DNA胶回收试剂盒购自Thermo Fisher公司，平末端载体pClone007 试剂盒购自擎科生物科技有限公司；DNA提取试剂盒购自Qiagen公司；荧光定量PCR试剂和病毒DNA提取试剂盒（磁珠法）购自南京诺维赞生物科技股份有限公司；SPF种蛋购自济南斯帕法斯家禽有限公司，SPF鸡用SPF种蛋自行孵化和饲养；引物、探针合成以及基因测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2　试验病毒毒株

ILTV强毒株WF03株（专利号：ZL202110385416.X）^［10］和ILTV天然弱毒株FJ19株（鸡胚绒毛尿囊膜接种）均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。ILTV强毒株王岗株（WG）（国家兽医微生物菌（毒）种保藏中心，保藏编号：CVCC AV195）由瑞普（保定）生物药业有限公司保存。WF03株、王岗株、FJ19株的无菌检验、外源病毒检验、支原体检验均符合中华人民共和国兽药典三部（2020年版）的质量标准。K317毒株为商品化市售疫苗。FJ19株的每羽份病毒含量暂定为10³ EID₅₀/羽份。弱毒株接种或强毒株攻毒后，当动物出现咳血、张口呼吸（严重喘气）、严重眼炎中的任一临床症状，则判定为ILTV感染发病；对出现的死亡鸡随时解剖，观察喉头、气管等有血凝块或黄色酪状物栓塞时判定该只鸡为ILTV感染发病。

1.3　ILTV弱毒FJ19株尿囊腔途径接种的适应、扩繁与ILTV病毒EID₅₀测定

将保存的原始ILTV弱毒FJ19株病毒液（采用鸡胚绒毛尿囊膜接种途径获得）以TPB连续10倍稀释，取10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释度采用鸡胚尿囊腔途径接种10日龄SPF鸡胚，每个稀释度接种6枚，接种量为0.2 mL·胚^-1，继续孵化7 d，每日检查鸡胚存活情况，弃去24 h内死亡鸡胚，7 d后对存活鸡胚和死亡鸡胚检查绒毛尿囊膜，绒毛尿囊膜出现灰白色病斑则判定为阳性。取最高稀释度的阳性绒毛尿囊膜以1∶5的比例加入预冷的PBS进行研磨，反复冻融3次，12 000 r·min^-1，4 ℃离心10 min，取上清病毒液采用同样方式继续传代4次以适应尿囊腔途径接种，将第5次收获的阳性病毒液记为FJ19株P0代。

采用尿囊腔途径以一定倍数稀释后接种10日龄SPF鸡胚，7 d后收获绒毛尿囊膜并按照上述方法制备病毒液，依次传代制备不同代次的病毒液，分别记为P1代、P2代、P3代等，并按照中华人民共和国兽药典三部（2020年版）进行无外源病毒、无支原体、无菌检验。

所有待测EID₅₀的ILTV病毒液以TPB连续稀释成10^-3.6、10^-4.2、10^-4.8、10^-5.4和10^-6.0 5个稀释度，从高稀释度到低稀释度经CAM接种病毒液，每个稀释度接种6枚胚，每胚接种0.2 mL，置37 ℃继续孵化7 d，每天检查鸡胚存活情况并作记录。同时取6个SPF鸡胚以同样方式接种TPB作为阴性对照。弃去接种后24 h内的死亡鸡胚，每个稀释度应至少有4个鸡胚存活，阴性对照鸡胚在接种后第2~7日不应该有死亡出现，试验才有效。接种24 h后死亡的鸡胚判定感染阳性，接种第7日后对所有存活鸡胚进行检查，当鸡胚绒毛尿囊膜有明显增厚出现白色病斑，判为感染阳性。采用Reed-Muench法计算鸡胚半数感染量EID₅₀，重复测定3次，至少2次测定试验成立，结果才有效。

1.4　ILTV FJ19株的主要免疫原基因和毒力基因的扩增与测序

将100 mL ILTV FJ19株P1代病毒液以45 000 r·min^-1，4 ℃离心4.5 h，弃去上清后将沉淀物使用DNA提取试剂盒按照说明书提取基因组DNA后，采用表1中的引物分别对免疫原性基因gB、UL32、gD、gC和参与毒力形成的基因TK、ICP4、gG、gE、gI、gH、gL、gK、gM、gN进行PCR扩增。反应体系：1-5 ^TM2×High Fidelity master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 21 μL；反应条件：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共30个循环；72 ℃ 5 min。扩增结束后，将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将目的条带切胶并利用DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。

将回收到的PCR产物连接到平末端载体pClone007中转化感受态细胞DH5α后涂布含氨苄抗生素的平板，每个基因均筛选5个克隆子（菌液）送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.5　病毒FJ19株关键抗原基因和毒力基因遗传演化分析

从NCBI下载ILTV国内外主要分离株和疫苗株的基因组序列（表2），使用DNAStar软件和Geneious软件对参考毒株和分离毒株的免疫原性基因gB、UL32、gC、gD和毒力相关基因TK、ICP4、gG、gE、gI、gH、gL、gK、gM、gN进行分析和串联拼接，对拼接后的序列采用MEGA7软件中的ClastalW算法对所有序列进行多重序列比对后，以邻接（Neighbor-Joining，NJ）法中重复数1 000计算bootstrap值构建免疫原性基因gB-gC-gD-UL32和毒力相关基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN的进化树，重点关注ILTV FJ19病毒基因序列与国内外的弱毒株A20（NCBI登录号：JN596963）、K317（NCBI登录号：JX458824）、LT Blen（NCBI登录号：JQ083493）、Laryngo Vac（NCBI登录号：JQ083494）、Poulvac ILT^®（NCBI登录号：KP677882）、Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643（NCBI登录号：MF405079）、Nobilis Laringovac^®（NCBI登录号：KP677881）之间的遗传进化的亲缘关系。

1.6　病毒FJ19株对SPF鸡的安全性评价

将测定过EID₅₀的FJ19株P0代病毒液以10羽份、1羽份和0.2羽份的剂量采用点眼和口服途径分别接种14日龄SPF鸡，每个剂量每个途径各接种10只鸡，同时另取10羽鸡不接种作为空白对照。另取21日龄SPF鸡10只，每只鸡经气管接种10羽份（0.2 mL）的FJ19株的病毒液，同时另取10只鸡不接种作为空白对照。每日对所有鸡进行观察两次，共观察14 d，每天记录每只鸡的临床表现和发病情况。

1.7　病毒FJ19株不同剂量免疫的排毒检测

将测定过EID₅₀的FJ19株P0代病毒液以10羽份、1羽份、0.2羽份的剂量以点眼途径和口服途径免疫14日龄SPF鸡，每个剂量每个途径各免疫5只鸡，同时另取10羽鸡不免疫作为空白对照。免疫后的第1、3、5、8、11和14天每只鸡采集口咽拭子和泄殖腔拭子，放入含2 mL PBS的5 mL离心管中，-70 ℃保存，采集的不同拭子按照中华人民共和国行业标准（NY/T 556—2020，鸡传染性喉气管炎诊断技术）进行样品前处理和核酸提取，用荧光定量PCR方法检测ILTV FJ19株的免疫后排毒情况，根据标准曲线计算每个样品的拷贝数。

1.8　病毒FJ19株与商品化K317疫苗的免疫有效性比较

将商品化的K317疫苗和FJ19株病毒液按照《中国兽药典三部（2020版）》推荐的点眼免疫途径分别免疫14日龄SPF鸡20羽，免疫剂量为0.2羽份·鸡^-1。免疫21 d后，取免疫K317疫苗和FJ19株的鸡各10羽和未免疫鸡10羽，采用气管攻毒方式以王岗株攻毒（每鸡0.2 mL病毒液含ILTV病毒10^4.0EID₅₀）；另取免疫K317疫苗和FJ19株的鸡各10羽和未免疫鸡10羽，采用气管攻毒方式以WF03株攻毒（每鸡0.2 mL病毒液含ILTV病毒10^4.0EID₅₀），同时以未免疫不攻毒的10羽鸡作为阴性对照。攻毒后，每日对所有鸡进行观察两次，共观察14 d，每天记录每只鸡的发病情况。

1.9　病毒FJ19株口服和点眼免疫的免疫保护效果比较

参照中华人民共和国兽药典（2020版）K317毒株质量标准所规定的每羽份病毒含量，将FJ19株免疫14日龄SPF鸡，以0.2羽份·鸡^-1的剂量通过点眼和口服途径各免疫10羽，以1羽份·鸡^-1的剂量通过点眼和口服途径各免疫10羽。免疫21 d后，连同未免疫的鸡10羽，以气管攻毒方式进行WF03株攻毒（每鸡0.2 mL病毒液含ILTV病毒10^4.0EID₅₀），另取未免疫不攻毒的10羽鸡作为阴性对照。在攻毒后的第1、3、5、8、11和14天每组随机采集5只鸡（攻毒对照10只鸡全部采集）的口咽拭子和泄殖腔拭子，用荧光定量PCR方法检测ILTV排毒情况，同时每日对所有鸡进行观察两次，共观察14 d，每天记录每羽鸡的发病情况。

1.10　病毒FJ19株的免疫持续期测定

将70羽14日龄SPF鸡分为2组，其中一组30羽，以点眼方式接种FJ19、接种剂量均为每羽鸡10^3.0 EID₅₀；另一组40羽，不免疫接种。免疫接种后4、5和6月时，两组分别取10羽鸡以强毒株ILTV WF03株进行气管攻毒，攻毒剂量0.2 mL·羽^-1，病毒含量为10^4.0 EID₅₀，攻毒后每日对所有鸡进行观察两次，共观察14 d，每天记录每羽鸡的发病情况。最后一次攻毒后的第4、8、11和14天采集口咽拭子，用荧光定量PCR方法检测ILTV排毒情况。

1.11　ILTV荧光定量PCR的检测

利用2.3中构建并测序正确的gC克隆子扩大培养后提取质粒，测定质粒浓度后以10倍倍比连续稀释，制备不同浓度的标准质粒。利用病毒DNA提取试剂盒（磁珠法）提取病毒DNA，采用标准中ILTV的荧光定量PCR检测引物（gCU771：5’- CCTTGCGTTTGAATTTTTCTGT-3’和gCL873：5’-TTCGTGGGTTAGAGGTCTGT-3’）、探针（gCprobe817：5’-FAM-CAGCTCGGTGACCCC- ATTCTA-BHQ1-3’）和方法对不同样品中的ILTV进行检测^［11］，当样品Ct值≤35，且出现标准的S形扩增曲线，判为阳性；当样品无Ct 值或Ct值>38，且无标准扩增曲线，判为阴性；当样品Ct值在“35<Ct值≤38”，且扩增曲线均呈标准的S形曲线，判为可疑，同时以标准质粒稀释后设定ILTV标准曲线。

2　结果

收起

2.1　FJ19株适应尿囊腔途径接种

经鸡胚绒毛尿囊膜接种收获的FJ19株病毒液经多次克隆、纯化以及尿囊腔接种适应，FJ19株P0代开始已完全适应尿囊腔接种，绒毛尿囊膜产生了明显的灰白色病斑等典型病变（图1），病毒含量测定表明P0、P1、P2、P3代收获的病毒液分别为10^5.0 EID₅₀·mL^-1、10^6.5 EID₅₀·mL^-1、10^6.9 EID₅₀·mL^-1、10^6.5 EID₅₀·mL^-1，可作为候选疫苗株，P1代开始已达到工业化疫苗生产的标准，且各代病毒液的纯净性检验结果符合中华人民共和国兽药典（2020年版）规定。

2.2　FJ19株的关键免疫原基因和毒力基因的遗传演化分析

对串联的免疫原性基因gB-gC-gD-UL32的遗传进化分析显示：FJ19株与中国2009年的分离株LJS09株、2012年的分离株ck/CH/LHLJ/120305株、2019年的分离强毒株WF03、疫苗株K317和Nobilis Laringovac^®处在一个较大的进化分支上，但与疫苗株Poulvac ILT^®、Laryngo Vac和LT Blen处在同一个分支上且亲缘关系最近（图2A）；而与国内早期分离的强毒株王岗株（WG）和弱毒株A20、Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643、ILTV.319/19处在不同分支上，遗传关系最远。通过对FJ19株与参考毒株的基因序列比对显示：gB基因与参考毒株的相似性为99.73%~100%，其中与WF03株和王岗株（WG）的相似性分别为99.92%和99.73%；gC基因与参考毒株的相似性为99.68%~100.00%，与WF03株和王岗株的相似性均为100%；gD基因与参考毒株的相似性为99.08%~100.00%，与WF03株和王岗株的相似性均分别为100%和99.08%；UL32基因与参考毒株的相似性为99.89%~100.00%，与WF03株和王岗株的相似性均分别为100%和99.89%。

对串联的毒力相关基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN的遗传进化分析显示：FJ19株与弱毒株K317、Nobilis Laringovac^®、LT Blen和强毒株WF03和我国2012年分离株ck/CH/LHLJ/120305、2009年分离株LJS09或澳大利亚2016年分离株7b株的亲缘关系同处在一个较大分支，亲缘关系较近，其次与弱毒株Poulvac ILT^®和Laryngo Vac的亲缘关系较近，与强毒株王岗株和澳大利亚弱毒株A20和ILTV.319/19的亲缘关系最远（图2B）。通过FJ19株与参考毒株的基因序列比对显示：gE基因与参考毒株的相似性为99.47%~100.00%，与WF03株和王岗株的相似性均分别为99.93%和99.87%；gI 基因与参考毒株的相似性为98.81%~100.00%，与WF03株和王岗株的相似性均分别为100%和98.99%；TK基因与参考毒株的相似性为99.63%~100.00%，与WF03株和王岗株的相似性均分别为100%和99.63%；ICP4基因与参考毒株的相似性为98.75%~99.98%，与WF03株和王岗株的相似性均分别为99.96%和99.80%；gG基因与参考毒株的相似性为98.29%~99.89%，与WF03株和王岗株的相似性均分别为99.89%和98.29%；gH基因与参考毒株的相似性为99.59%~100.00%，与WF03株和王岗株的相似性均分别为100%和99.59%；gK基因与参考毒株的相似性为99.71%~100.00%，与WF03株和王岗株的相似性均为100%；gL基因与参考毒株的相似性为99.44%~100.00%，与WF03株和王岗株的相似性均为100%；gM基因与参考毒株的相似性为99.66%~100.00%，与WF03株和王岗株的相似性均分别为100%和99.92%；gN基因与参考毒株的相似性为99.44%~100.00%，与WF03株和王岗株的相似性均分别为100%和99.44%。

2.3　FJ19株对14日龄SPF鸡的安全性

将毒株FJ19病毒液以10倍剂量（10⁴EID₅₀）点眼接种14日龄SPF鸡，在接种后第3~7天有4只鸡陆续出现了轻微的眼炎和流泪（图3），3 d内均全部恢复，在整个观察期内未出现死亡、咳血、咳嗽、喘气、张口呼吸等ILTV感染的典型呼吸道症状，精神状态正常。气管途径注射接种10羽份病毒液（0.2 mL含10⁴EID₅₀）的21日龄SPF鸡，未出现死亡和咳血、严重喘气和呼吸困难的临床症状，在接种后第3~5天仅有30%的鸡出现了短暂的一过性轻微的呼吸道反应。口服途径接种不同剂量的鸡和空白对照鸡在整个观察期内均未观察到ILTV感染后的典型临床症状。

2.4　病毒FJ19株不同剂量免疫的排毒检测

通过荧光定量PCR方法对FJ19株以10羽份、1羽份、0.2羽份的剂量经点眼和口服途径免疫14日龄SPF鸡后的口咽拭子和泄殖腔拭子进行检测，结果发现：口咽拭子的病毒量远高于泄殖腔拭子（图4）；其次接种剂量越高，排毒高峰出现越早，10羽份和1羽份接种组在接种后1 d口咽途径开始出现明显排毒，接种后第3和5天排毒达到高峰，0.2羽份点眼接种在接种后第3和5天排毒达到高峰，而口服接种在接种后第5和8天排毒达到高峰（图4）。

2.5　病毒FJ19株与商品化K317疫苗的免疫原性比较

将病毒FJ19株与商品化K317疫苗点眼免疫14日龄SPF鸡21 d，采用强毒王岗株和WF03株进行攻毒，结果显示强毒王岗株攻毒对照组发病率为80%，主要临床表现为严重的眼炎、呼吸困难和死亡；而WF03株攻毒对照组发病率90%，主要表现为张口呼吸和死亡，两组攻毒对照组均成立。FJ19株和商品化K317疫苗免疫的鸡经王岗株攻毒后的保护率分别为80%和100%，经WF03株攻毒后的保护率分别为100%和70%（见表3）。

2.6　病毒FJ19株口服和点眼免疫的免疫保护效果比较

病毒FJ19株以0.2羽份或1羽份经点眼或口服途径免疫14日龄SPF鸡21 d后，WF03株攻毒结果显示：攻毒对照组发病率90%，主要表现为死亡、咳血和严重的张口呼吸等特异性的ILTV感染症状（其中3只鸡出现死亡），而0.2羽份和1羽份剂量的点眼或口服组的攻毒保护率均达100%，未观察到明显的特异性临床症状。对攻毒后的强毒排毒检测结果显示：强毒株主要以口咽途径排毒，排毒量较高，泄殖腔排毒量很低（数据未展示）；而0.2羽份和1羽份经点眼或口服途径免疫的鸡基本不排毒（表4）。

2.7　FJ19株的免疫持续期

以1羽份点眼接种14日龄SPF鸡在免疫后4、5和6月时以WF03强毒株攻毒，结果显示：未免疫未攻毒鸡未观察到可见的特异性临床症状，未免疫的鸡在攻毒后的观察期内的发病率分别为90%（9/10），100%（10/10）、80%（8/10），表现为咳血和张口呼吸等特异性临床症状，未见死亡；而免疫的鸡在攻毒后的观察期内发病率分别为0%（0/10），0%（0/10）、10%（1/10）。采用荧光定量PCR检测口咽拭子排毒结果显示：免疫鸡除攻毒后发病的鸡具有较高的排毒量外，其余鸡均未有明显排毒。对免疫后6个月的免疫攻毒鸡和攻毒对照鸡进行荧光定量PCR检测显示在攻毒4 d后免疫鸡和攻毒对照鸡的口咽拭子荧光定量平均Ct值分别为37.27和22.61，其阳性率分别为1/10和10/10。因此，FJ19株免疫14日龄的SPF鸡，其免疫持续不少于6个月。

3　讨论

收起

近年来，我国多地养殖场陆续报告鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）感染病例，涉及肉鸡和蛋鸡多个品种，其不论是严重感染还是温和型感染都给生产带来了严重的威胁和损失。疫苗接种和生物安全管理被认为是控制ILT的有效策略。K317弱毒株是目前我国动物生物制品企业生产ILTV弱毒活疫苗的唯一毒株，主要通过绒毛尿囊膜途径接种SPF鸡胚后收获绒毛尿囊膜研磨，经一系列生产工艺制备成冻干疫苗。该疫苗在临床使用时具有明显的副作用，比如较为严重的眼炎，且不得用于5周龄以下的鸡。此外，在生产工艺中采用鸡胚绒毛尿囊膜接种易出现鸡胚使用率不高和疫苗生产效率低下等问题。因此急需对小日龄鸡安全性高、有效性好、免疫持续期长，使用方便（可饮水免疫），生产工艺相对简单和培养滴度高的新的ILTV弱毒活疫苗株。

为解决K317大规模生产效率问题，疫苗企业不断尝试用鸡胚尿囊腔接种法生产弱毒苗，有报道称采用尿囊腔接种和采用鸡胚绒毛尿囊膜接种二者收获的病毒含量差异不显著，均符合弱毒活疫苗的质量标准要求^［12］。本研究将前期分离、纯化获得的FJ19株在10日龄SPF鸡胚以尿囊腔途径接种连续传代适应后，收获P1、P2和P3代病毒液的EID₅₀分别为10^6.5·mL^-1、10^6.9·mL^-1和10^6.5·mL^-1，已达到工业化生产制备疫苗的条件，证明FJ19株已经完全适应尿囊腔途径接种鸡胚，且具有足够的病毒滴度，因此该结果为FJ19株的大规模化和高效生产奠定了坚实基础。

糖蛋白gB、gC和gD以及UL32是ILTV重要的保护性抗原，可以诱导中和抗体和细胞免疫反应，并且还可以增强先天性和特异性免疫反应，是重要的免疫原蛋白^{［5，10⁃11，13⁃16］}。FJ19株的免疫原性基因gB-gC-gD-UL32的遗传进化分析显示与疫苗株Poulvac ILT^®、Laryngo Vac和LT Blen处在同一个分支上且亲缘关系最近（图2A），与中国2009年的分离株LJS09株、2019年的分离强毒株WF03、疫苗株K317和Nobilis Laringovac^®处在一个较大的进化分支上，而与国内早期分离的强毒株王岗株（WG）和弱毒株A20、ILTV.319/19处在不同分支上，遗传关系最远。糖蛋白gE/gI对于ILTV病毒在细胞间扩散具有显著的作用^［16］。TK基因是ILTV的主要毒力基因^［17］，缺失TK可以使ILTV致病力减弱但仍具有免疫原性^［18］，ICP4基因参与激活病毒早/晚期基因的表达，与病毒毒力存在关联^［19］，糖蛋白gC是ILTV主要的表面抗原蛋白^［20］，糖蛋白gG也是ILTV的毒力因子^［21］，此外还有报道糖蛋白gD、gB、gH、gL、gK、gM、gN等参与了疱疹病毒致病性的形成^{［22⁃25］}。因此，对串联的毒力相关基因gE-gI-TK-ICP4-gG-gH-gK-gL-gM-gN的遗传进化分析显示：FJ19弱毒株与疫苗株K317、Nobilis Laringovac^®、LT Blen、强毒株WF03和2009年分离株LJS09或澳大利亚2016年分离株7b株的亲缘关系同处在一个较大分支，亲缘关系较近，其次与弱毒株Poulvac ILT^®和Laryngo Vac的亲缘关系较近，与强毒株王岗株和澳大利亚弱毒株A20和ILTV.319/19的亲缘关系最远（图2B）。因此表明弱毒FJ19株与当前我国分离的ILTV强毒株和国内外使用的商品化活疫苗毒株的亲缘关系较近，无显著的基因突变或变异。

安全性是ILTV疫苗株首要考虑的问题。商品化的K317疫苗经1羽份点眼免疫35日龄的SPF鸡，可出现典型的眼炎等临床症状，有报道将K317株喉头气管注射接种8周龄SPF鸡后（10^4.2 EID₅₀·羽^-1），未出现死亡，但部分鸡在感染7 d后出现呼吸困难，发病鸡剖检可见喉头分泌物增多，气管有黏液^［2］。本研究将FJ19弱毒株通过10羽份剂量点眼接种14日龄SPF鸡，仅有40%鸡出现了轻微的眼炎或流泪；通过气管注射途径接种21日龄SPF鸡，未出现死亡、咳血、严重喘气和呼吸困难等严重的临床症状，仅在接种后3~5 d有30%的鸡出现一过性轻微的呼吸道反应。SA2株是从澳大利亚分离到的ILTV自然弱毒株，是目前国际上公认较好的疫苗株^［9］，该疫苗株经绒毛尿囊膜培养获得的病毒液通过气管注射接种55日龄SPF鸡（约10^4.0 EID₅₀·羽^-1），结果有20%的鸡出现死亡^［26］。因此，与ILTV疫苗株K317株和SA2株相比，FJ19株在SPF鸡表现出良好的安全性。

ILTV疫苗的有效性至关重要。作为国际上公认较好的疫苗株SA2株^［9］，其具有良好的有效性。SA2株经绒毛尿囊膜培养获得的病毒液点眼免疫（大于10^7.0 EID₅₀·羽^-1）7和15日龄雏鸡，36日龄时用王岗株（WG）强毒株攻毒可100%获得保护，对照组鸡100％发病；同样用SA2株点眼免疫1月龄以上鸡，WG株攻毒后同样可获得100%保护，对照组100%发病，其中死亡率为40%^［26］。由于鸡点眼免疫鸡胚源性（chicken embryo origin，CEO）ILTV疫苗会出现不良反应，而通过口服方式同时接种CEO疫苗和chIL-2不仅显著减轻疫苗对鸡的副作用，还能减少组织（特别是气管和结膜）中的病毒载量^［27］。英特威商品化的疫苗Nobilis BioTrach（鸡胚源）可饮水免疫，在免疫接种后4~5 d即可对鸡群产生保护力。将ILTV A20弱毒疫苗通过饮水途径大规模免疫肉鸡群后，拭子中的ILTV基因拷贝数在免疫7天后最高^［28］。本研究中将0.2羽份弱毒株FJ19株点眼接种14日龄SPF鸡，21 d后采用WG株或WF03株强毒株攻毒的免疫保护率分别达到80%和100%，同样14日龄SPF鸡采用0.2羽份口服接种可达到与点眼接种同样的免疫保护力。通过荧光定量PCR方法对攻毒的WF03强毒株排毒检测表明，点眼或口服免疫均可以有效阻止ILTV强毒的复制和排毒，攻毒后第11天不论采用何种接种方式均未在口咽和泄殖腔拭子中检测到核酸。结果表明与商品化K317疫苗株相比（每羽份大于10^2.7EID₅₀），FJ19株弱毒株具有良好的有效性，接种后可有效阻止ILTV强毒株的复制和排毒，显示其作为疫苗候选株的潜力。

目前，市场上ILTV的基因工程疫苗已推广使用，ILTV重组病毒载体活疫苗虽无潜伏感染、无毒力返强等优点，但免疫效力与ILT减毒活疫苗相比还有待提高，这主要是由于对ILT免疫保护依靠T细胞免疫^［29］，攻毒结果显示鸡胚源性（CEO）ILTV弱毒苗免疫组（点眼免疫）的气管黏膜上皮保持完整，强毒株病毒可被迅速清除，组织源性（tissue culture origin，TCO）弱毒苗（点眼免疫）和rHVT-LT（胚内免疫）免疫组病毒清除受限，气管上皮完整性中度破坏^［30］。同样，采用威多妙喉痘（Vectormune^® FP-LT）^［31］或FPV-LT （Vectormune^®）疫苗^［32］免疫鸡群，强毒株攻毒后仅能提供部分保护，而鸡胚源性ILTV疫苗不论是临床症状减轻还是病毒复制载量下降方面，均显示单次免疫的效果最佳^［33］。FJ19株是鸡胚源性ILTV弱毒株，经点眼或口服途径免疫，对强毒攻击均具有优秀的保护效果，疫苗免疫后可以清除强毒并且阻止强毒株的复制，同时在免疫后4、5和6月采用强毒攻毒，仍然表现出良好的保护效果。因此，相比基因工程疫苗而言，弱毒FJ19株作为传统弱毒疫苗仍然具有良好的应用前景。

4　结论

收起

ILTV FJ19弱毒株经尿囊腔途径接种适应鸡胚后，EID₅₀显著提升，达到了疫苗产业化生产质量要求，经点眼或口服途径接种14日龄SPF鸡和气管注射21日龄SPF鸡证明FJ19株具有足够的安全性，并用强毒株攻毒显示出FJ19株具有优秀的免疫保护效果，可以阻止气管中强毒株的复制和排毒，并且在免疫后6个月强毒攻毒仍然具有良好的保护效果。综上所述，FJ19株可作为ILTV弱毒疫苗候选毒株，具有良好的安全性和有效性，可以通过口服（饮水）途径接种，在产业化生产中可适应尿囊腔途径接种且具有高滴度的EID₅₀，未来将按照我国新兽药注册管理办法等规章制度进一步完善实验室研究，开展更多相关临床试验进行验证FJ19株作为弱毒疫苗毒株的潜力。

基金

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河北省中央引导地方科技专项项目(246Z2905G)
福建省农业科学院优秀科技创新人才专项(YCZX202508)

参考文献

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文献

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排序方式：

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2026年第57卷第2期

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doi: 10.11843/j.issn.0366-6964.2026.02.035

接收时间：2025-06-16
首发时间：2026-09-16
出版时间：2026-02-23

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收稿日期：2025-06-16

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河北省中央引导地方科技专项项目(246Z2905G)

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^1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病疾病防治工程技术研究中心，福州 350013

^2.瑞普（保定）生物药业有限公司，保定 071030

通讯作者:

侯博，主要从事兽医传染病防控技术研究，E-mail： houbohouwei@126.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

基因名称 Gene name	引物序列（5’→3’） Prime Sequence	产物长度/bp Size
gK	F： GCATACACAACGGTTGAGAC； R： GGAATCTACTCGCCAGGACG	2 216
gG	F： CTGACCGCTAGCCCATACAG； R： TCCAGTGCAAGTTCGTCCTC	1 416
gE	F： CAGTATCGGACACGGACTGG； R： CGGGTTGACTGGAAACGGTA	1 894
gC	F： AGACTGTCGCCTCGAAACTG； R： TTGGTCAACACTGCAAAGCG	1 983
gL	F： ACTGTAACAGCGTCTCACCG； R： TACCGGAGACAGAAGAGGGG	1 377
gN	F： ATTGCAAGGAATCGAGGCCA； R： TACTTCTTCGCCTCCTCCGA	692
gM	F： CCCCACAACCATCGACAGAA； R： GCTGAGATCGCATCCGTACA	1 722
gD	F： TACCGCTGGCCAAAGTACAG； R： TAGTCTGTTCGAGGCGGAGA	1 850
gB	F： GACAGTCGATGCTTCTATGCC； R： ATGCAATCCTACATCGCCGT^［22］	2 799
gH	F： TGCTTCTTTGACGGAGCCAT； R： CCGAGACGGCAAGTTCTCTT	2 617
gI	F： CCTCCAGAAGACTCGGAGGA； R： CCGGAACGTTTCTGGGATCA	1 789
TK	F： CATGACTACAATTTTGCCC； R： ACGAACCCATATCAGCATT^［22］	1 251
UL32	F： GGTATGAGATGTAGCGATGG； R： GGTAGTTTAGTTTAGCATCGGTA^［22］	2 023
ICP4₁	F： TGCTTTTCCTGCAGCGTCTA； R： TCTTGTCTCAGAACGTGCCC	2 244
ICP4₂	F： CGTGAGTGAGGAAGGGG； R： GGTACAGACGGGTCGGT^［22］	2 668
ICP4₃	F： GGCATCCCGTACTCTTCGAG； R： TCACTCGGGTCTTGTTCTGC	1 272

基因名称

Gene name

引物序列（5’→3’）

Prime Sequence

产物长度/bp

Size

F： GCATACACAACGGTTGAGAC； R： GGAATCTACTCGCCAGGACG

2 216

F： CTGACCGCTAGCCCATACAG； R： TCCAGTGCAAGTTCGTCCTC

1 416

F： CAGTATCGGACACGGACTGG； R： CGGGTTGACTGGAAACGGTA

1 894

F： AGACTGTCGCCTCGAAACTG； R： TTGGTCAACACTGCAAAGCG

1 983

F： ACTGTAACAGCGTCTCACCG； R： TACCGGAGACAGAAGAGGGG

1 377

F： ATTGCAAGGAATCGAGGCCA； R： TACTTCTTCGCCTCCTCCGA

692

F： CCCCACAACCATCGACAGAA； R： GCTGAGATCGCATCCGTACA

1 722

F： TACCGCTGGCCAAAGTACAG； R： TAGTCTGTTCGAGGCGGAGA

1 850

F： GACAGTCGATGCTTCTATGCC； R： ATGCAATCCTACATCGCCGT^［22］

2 799

F： TGCTTCTTTGACGGAGCCAT； R： CCGAGACGGCAAGTTCTCTT

2 617

F： CCTCCAGAAGACTCGGAGGA； R： CCGGAACGTTTCTGGGATCA

1 789

F： CATGACTACAATTTTGCCC； R： ACGAACCCATATCAGCATT^［22］

1 251

UL32

F： GGTATGAGATGTAGCGATGG； R： GGTAGTTTAGTTTAGCATCGGTA^［22］

2 023

ICP4₁

F： TGCTTTTCCTGCAGCGTCTA； R： TCTTGTCTCAGAACGTGCCC

2 244

ICP4₂

F： CGTGAGTGAGGAAGGGG； R： GGTACAGACGGGTCGGT^［22］

2 668

ICP4₃

F： GGCATCCCGTACTCTTCGAG； R： TCACTCGGGTCTTGTTCTGC

1 272

菌株名 Strain name	GenBank登陆号 GenBank accession No.	国家 Country	年 Year
VFAR-043	MG775218	秘鲁Peru	2014
USDA reference	JN542534	美国USA	2012
LJS09	JX458822	中国China	2009
WG	JX458823	中国China	2012
CSW-1	JX646899	澳大利亚Australia	1970
30678/14/Ko	MH937565	韩国South Korea	2014
ACC78/	JN804826	澳大利亚Australia	2011
4787/80	KP677885	意大利Italy	1980
193435/07	KP677883	意大利Italy	2007
A489	KY423284	美国USA	2017
27_CSW-1/V1-99	MF156852	澳大利亚Australia	2016
J2	MF417808	美国USA	2017
Rus/Ck/Penza/2013/2701	MF405080	俄罗斯Russia	2013
ILTV.319/19	MK895002	澳大利亚Australia	2019
ck/CH/LHLJ/120305	MT876619	中国China	2012
40798/10/Ko	MH937566	韩国South Korea	2010
7b	MN335811	澳大利亚Australia	2016
CAN/QC-2236832	OL354140	加拿大Canada	2019
CAN/QC-2301711	OK646550	加拿大Canada	2020
CAN/ON-2462242	OK624781	加拿大Canada	1987
CAN/ON-2462241	OK573459	加拿大Canada	2021
live attenuated strain
A20	JN596963	澳大利亚Australia	2011
K317	JX458824	中国China	2012
LT Blen	JQ083493	美国USA	2011
Laryngo Vac	JQ083494	美国USA	2011
Poulvac ILT（R）	KP677882	意大利Italy	2015
Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643	MF405079	俄罗斯Russia	2017
Nobilis Laringovac（R）	KP677881	意大利Italy	2015

菌株名

Strain name

GenBank登陆号

GenBank accession No.

国家

Country

年

Year

VFAR-043

MG775218

秘鲁Peru

2014

USDA reference

JN542534

美国USA

2012

LJS09

JX458822

中国China

2009

JX458823

中国China

2012

CSW-1

JX646899

澳大利亚Australia

1970

30678/14/Ko

MH937565

韩国South Korea

2014

ACC78/

JN804826

澳大利亚Australia

2011

4787/80

KP677885

意大利Italy

1980

193435/07

KP677883

意大利Italy

2007

A489

KY423284

美国USA

2017

27_CSW-1/V1-99

MF156852

澳大利亚Australia

2016

MF417808

美国USA

2017

Rus/Ck/Penza/2013/2701

MF405080

俄罗斯Russia

2013

ILTV.319/19

MK895002

澳大利亚Australia

2019

ck/CH/LHLJ/120305

MT876619

中国China

2012

40798/10/Ko

MH937566

韩国South Korea

2010

MN335811

澳大利亚Australia

2016

CAN/QC-2236832

OL354140

加拿大Canada

2019

CAN/QC-2301711

OK646550

加拿大Canada

2020

CAN/ON-2462242

OK624781

加拿大Canada

1987

CAN/ON-2462241

OK573459

加拿大Canada

2021

live attenuated strain

A20

JN596963

澳大利亚Australia

2011

K317

JX458824

中国China

2012

LT Blen

JQ083493

美国USA

2011

Laryngo Vac

JQ083494

美国USA

2011

Poulvac ILT（R）

KP677882

意大利Italy

2015

Rus/Ck/Tatarstan/2009/1643

MF405079

俄罗斯Russia

2017

Nobilis Laringovac（R）

KP677881

意大利Italy

2015

组别 Groups	免疫毒株和剂量 Immunizing strain and dose	攻毒毒株 Challenge strain	发病率/% Incidence rate	保护率/% Protection rate of vaccination
G1	No vaccine	WF03	90	-
G2	FJ19， 0.2 dose/bird	WF03	0	100 （10/10）
G3	K317， 0.2 dose/bird	WF03	30	70 （7/10）
G4	No vaccine	WG	80	-
G5	FJ19， 0.2 dose/bird	WG	20	80 （8/10）
G6	K317， 0.2 dose/bird	WG	0	100 （10/10）
G7	No vaccine	No challenge	0	-

组别

Groups

免疫毒株和剂量

Immunizing strain and dose

攻毒毒株

Challenge strain

发病率/%

Incidence rate

保护率/%

Protection rate of vaccination

No vaccine

WF03

FJ19， 0.2 dose/bird

WF03

100 （10/10）

K317， 0.2 dose/bird

WF03

70 （7/10）

No vaccine

FJ19， 0.2 dose/bird

80 （8/10）

K317， 0.2 dose/bird

100 （10/10）

No vaccine

No challenge

攻毒后时间 Days postchallenge	免疫剂量 Immunizingdose	实时PCR Ct值 Ct values of real-time PCR
第1天 Day 1	1 dose/bird	N^a	35.8^b	35.2	N	36.8	36.4	N	N	N	N
0.2 dose/bird	N	N	N	N	N	N	N	N	N	N
No Vaccine^c	22.91	24.86	25.16	26.09	25.97	27.12	25.53	26.4	25.17	25.61
第3天 Day 3	1 dose/bird	N	34.74	N	N	N	N	37.69	33.07	N	N
0.2 dose/bird	N	36.19	N	N	N	N	36.23	N	N	N
No vaccine	25.45	25.67	25.22	25.1	22.82	24.46	24.46	24.78	22.85	24.67
第5天 Day 5	1 dose/bird	N	33.47	N	N	N	N	36.93	36.15	N	N
0.2 dose/bird	N	37.11	N	N	N	N	32.76	N	N	N
No vaccine	29.89	33.79	32.56	32.9	31.57	30.75	31.86	26.37	29.60	31.27
第8天 Day 8	1 dose/bird	N	N	N	N	N	N	37.90	N	N	N
0.2 dose/bird	N	31.18	37.2	N	N	N	N	N	N	N
No vaccine	N	36.84	37.48	34.99	36.06	N	N	-^d	-	-
第11天 Day 11	1 dose/bird	N	N	N	N	N	N	N	N	N	N
0.2 dose/bird	N	N	N	N	N	N	N	N	N	N
No vaccine	N	N	N	N	N	N	N	-	-	-
第14天 Day 14	1 dose/bird	N	N	N	N	N	N	N	N	N	N
0.2 dose/bird	N	N	N	N	N	N	N	N	N	N
No vaccine	N	N	N	N	N	N	N	-	-	-

攻毒后时间

Days postchallenge

免疫剂量

Immunizingdose

实时PCR Ct值

Ct values of real-time PCR

点眼途径Ocular routes

口服途径Oral routes

第1天

Day 1

1 dose/bird

N^a

35.8^b

35.2

36.8

36.4

0.2 dose/bird

No Vaccine^c

22.91

24.86

25.16

26.09

25.97

27.12

25.53

26.4

25.17

25.61

第3天

Day 3

1 dose/bird

34.74

37.69

33.07

0.2 dose/bird

36.19

36.23

No vaccine

25.45

25.67

25.22

25.1

22.82

24.46

24.78

22.85

24.67

第5天

Day 5

1 dose/bird

33.47

36.93

36.15

0.2 dose/bird

37.11

32.76

No vaccine

29.89

33.79

32.56

32.9

31.57

30.75

31.86

26.37

29.60

31.27

第8天

Day 8

1 dose/bird

37.90

0.2 dose/bird

31.18

37.2

No vaccine

36.84

37.48

34.99

36.06

-^d

第11天

Day 11

1 dose/bird

0.2 dose/bird

No vaccine

第14天

Day 14

1 dose/bird

0.2 dose/bird

No vaccine